ITMI20112238A1 - Ceppi di batteri probiotici produttori di vitamina b12 - Google Patents

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ITMI20112238A1
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lactobacillus reuteri
dsm
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vitamin
dsmz
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Giovanni Mogna
Luca Mogna
Gian Paolo Strozzi
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Probiotical Spa
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Description

DESCRIZIONE "Ceppi di batteri probiotici produttori di Vitamina B12"
La presente invenzione si riferisce a una composizione comprendente almeno un ceppo di batteri probiotico appartenente alla specie Lactobacillus reuteri come produttore di vitamina B12 . In particolare, la presente invenzione si riferisce a selezionati ceppi di batteri appartenenti alla specie Lactobacillus reuteri come produttori di Vitamina B12. Infine, la presente invenzione si riferisce a una composizione alimentare o un integratore o una composizione farmaceutica comprendente un ceppo di batteri appartenente alla specie Lactobacillus reuteri .
E<'>noto che la Cobalamina (vitamina B12) svolge un ruolo importante nella produzione dei globuli rossi ed à ̈ essenziale per un buon funzionamento del sistema nervoso. Inoltre, à ̈ noto che alla Cobalamina (vitamina B12) possono fare riferimento quattro forme chimiche in funzione del tipo di gruppo chimico (R) che si lega allo ione cobalto nella sua formula di struttura. Il gruppo (R) può' essere:
- cianidrico, -CN (cianocobalamina)
- ossidrilico, -OH (idrossicobalamina)
- metilico, -CH3 (metilcobalamina)
- 5-deossiadenosile (5'-deossiadenosilcobalamina) .
Le forme metabolicamente attive sono la metil- e la 5'-deossiadenosilcobalamina .
L'idrossicobalamina à ̈ la forma naturale con cui la vitamina B12 viene di solito assunta nella dieta.
Tuttavia, per l'impiego a uso alimentare e farmaceutico di tale vitamina, si deve ricorrere alla forma più stabile che à ̈ rappresentata dalla cianocobalamina la quale viene sintetizzata per via chimica. La Cianocobalamina non esiste in natura salvo in rari casi.
Pertanto, la cianocobalamina prodotta per via sintetica e' un artefatto che si forma durante i processi industriali di estrazione in quanto si utilizza la papaia, una proteasi che viene attivata dall'aggiunta di CN- . In pratica, durante i processi industriali di sintesi si opera la trasformazione dell'idrossicobalamina in cianocobalamina perche" quest "ultima forma della vitamina B12 Ã ̈ piu" stabile all'aria e piu" facilmente cristallizzabile favorendo cosi" le rese di produzione. Per questa ragione, la maggioranza dei prodotti alimentari, integratori alimentari e prodotti farmaceutici contengono la cianocobalamina.
Pertanto, la possibilità' di produrre la vitamina B12 per via naturale, sottoforma di idrossicobalamina, in alternativa alla vitamina B12 prodotta per via sintetica, sottoforma di cianocobalamina, e" vista con molto interesse e risponde a una esigenza molto sentita da parte degli operatori del settore.
Pertanto, rimane la necessita" di poter disporre di un metodo per la produzione, per via naturale, di vitamina B12 .
In particolare, rimane la necessita" di poter disporre di un metodo per la produzione, per via naturale, di idrossicobalamina .
Infine, Ã ̈ noto che la carne contiene vitamina B12.
Tuttavia, per le persone che non consumano i prodotti a base di carne, come ad esempio i vegetariani, può risultare difficile approvigionarsi di una quantità giornaliera di vitamina B12 sufficiente al fabbisogno giornaliero .
Pertanto, poter disporre di prodotti alimentari, non a base di carne, ricchi in vitamina B12 consentirebbe ai vegetariani di poter assumere, in maniera più facile, una dose giornaliera di vitamina B12 sufficiente al fabbisogno giornaliero .
Forma un oggetto della presente invenzione un ceppo di batteri probiotico appartenente alla specie Lactobacillus reuteri, come riportato nella unita rivendicazione.
Forma un altro oggetto della presente invenzione un selezionato ceppo di batteri probiotico appartenente alla specie Lactobacillus reuteri, come riportato nella unita rivendicazione .
Forma un altro oggetto della presente invenzione una composizione alimentare o un integratore o una composizione farmaceutica, come riportato nella unita rivendicazione .
Forma un altro oggetto della presente invenzione una composizione farmaceutica per uso nel trattamento preventivo e/o curativo di soggetti affetti da una patologia o uno stato di malessere dovuti a una carenza o deficit di vitamina B12 , come riportato nella unita rivendicazione .
Forma un altro oggetto della presente invenzione una composizione farmaceutica per uso nel trattamento preventivo e/o curativo di soggetti affetti da anemia perniciosa, come riportato nella unita rivendicazione.
Forma un altro oggetto della presente invenzione una composizione farmaceutica per uso nel trattamento di soggetti che assumono vitamina C, come riportato nella unita rivendicazione.
Ulteriori realizzazioni preferite della presente invenzione saranno di seguito riportate e illustrate senza voler limitare in alcun modo la portata della presente invenzione .
La Tabella 1 mostra i valori di concentrazione (valore medio su più prove) di vitamina B12 (espressi in Î1⁄4g/litro) misurati a OD600 .
La Richiedente dopo un'intensa attività di ricerca ha selezionato, tra i ceppi di batteri probiotici scelti dal gruppo comprendente i ceppi di batteri appartenenti alla specie Lactobacillus reuteri, solo quelli che erano in grado di produrre la vitamina B12.
Il ceppo, come produttore di vitamina B12, Ã ̈ scelto dal gruppo comprendente o, alternativamente, consiste di:
- Lactobacillus reuteri DSM 23877 - (LRE01),
- Lactobacillus reuteri DSM 23878 - (LRE02),
- Lactobacillus reuteri DSM 23879 - (LRE03),
- Lactobacillus reuteri DSM 23880 - (LRE04).
Vantaggiosamente, il ceppo e' il Lactobacillus reuteri DSM 23878 (LRE02) . Il ceppo Lactobacillus reuteri DSM 23878 (LRE02) e' in associazione con almeno un ceppo scelto dal gruppo comprendente:
- Lactobacillus reuteri ATCC 55730,
- Lactobacillus reuteri DSM 17938, e
- Lactobacillus reuteri DSM 16143;
In una realizzazione, il ceppo Lactobacillus reuteri DSM 23 878 (LRE02) e' in associazione con almeno un ceppo scelto dal gruppo comprendente:
- Lactobacillus reuteri ATCC 55730,
- Lactobacillus reuteri DSM 17938.
In una realizzazione preferita, la composizione alimentare o nutraceutica o un integratore o una composizione farmaceutica comprende almeno un ceppo di batteri, scelti tra quelli sopra citati.
Preferibilmente, la composizione alimentare o l'integratore o la composizione farmaceutica può comprendere due ceppi o tre ceppi, scelti tra quelli sopra citati .
Vantaggiosamente, la composizione alimentare nutraceutica o l'integratore o la composizione farmaceutica comprende o, alternativamente, consiste dei ceppi Lactobacillus reuteri ATCC 55730, Lactobacillus reuteri DSM 17938 o, alternativamente, comprende o consiste dei tre ceppi Lactobacillus reuteri ATCC 55730, Lactobacillus reuteri DSM 17938 e Lactobacillus reuteri DSM 16143.
La composizione alimentare o nutraceutica o un integratore o una composizione farmaceutica può comprendere o, alternativamente, consistere:
i) il ceppo Lactobacillus reuteri ATCC 55730 e Lactobacillus reuteri DSM 23878 (LRE02),o
ii) il ceppo Lactobacillus reuteri DSM 17938 e Lactobacillus reuteri DSM 23878 (LRE02), o
iiì) il ceppo Lactobacillus reuteri DSM 16143 e Lactobacillus reuteri DSM 23878 (LRE02), o
iv) i tre ceppi Lactobacillus reuteri ATCC 55730, Lactobacillus reuteri DSM 17938 e Lactobacillus reuteri DSM 23878 (LRE02), o
v) i tre ceppi Lactobacillus reuteri DSM 23878 (LRE02), Lactobacillus reuteri DSM 17938 e Lactobacillus reuteri DSM 16143, o
vi) i tre ceppi Lactobacillus reuteri DSM 23878 (LRE02), Lactobacillus reuteri ATCC 55730 e Lactobacillus reuteri DSM 16143.
Le suddette specie di batteri sono presenti in una quantità compresa da 0,1 a 75% in peso, preferibilmente da 0,5 al 15% in peso; ancora più preferibilmente da 1 a 10% in peso, rispetto al peso totale della composizione o integratore. Tuttavia, detta percentuale rispetto al peso totale della composizione, dipende dalla tipologia merceologica della composizione o integratore. Ad esempio, in una capsula la quantità di dette specie di batteri à ̈ preferibilmente superiore al 40%.
In una realizzazione preferita, la composizione contiene batteri in una concentrazione compresa da 1x10<6>a 1x10<11>CFU/g di miscela, preferibilmente da 1x10<8>a 1x10<10>CFU/g di miscela.
In una realizzazione preferita, la composizione contiene batteri in una concentrazione compresa da 1x10<6>a 1x10<11>UFC/dose, preferibilmente da 1x10<8>a 1x10<10>UFC/dose.
La dose può essere compresa da 0,2 a 10 g, ad esempio e' di 0,25 g, 1 g, 3 g, 5 g o 7 g.
I batteri probiotici utilizzati nella presente invenzione possono essere in forma solida, in particolare sotto forma di polvere, polvere disidratata, sprayzzata o liofilizzata .
In una realizzazione preferita dell'invenzione, la composizione alimentare o l'integratore o la composizione farmaceutica può inoltre comprendere anche fibre prebiotiche e carboidrati ad azione bifidogena quali ad esempio inulina, frutto-oligosaccaridi (FOS), gaiatto e trans-galatto-oligosaccaridi (GOS e TOS) , glucooligosaccaridi (GOSOÌ), xilo-oligosaccaridi , (XOS), chitosan-oligosaccaridi (COS), soia-oligosaccaridi (SOS), isomalto-oligosaccaridi (IMOS), amido resistente, pectine, psyllium, arabino-galattani , gluco-mannani , galattomannani, xilani, lattosaccarosio, lattulosio, lattitolo e vari altri tipi di gomme, fibra di acacia, di carruba, di avena, di bamboo, fibre di agrumi e, in generale, fibre contenenti una porzione solubile e una insolubile, in rapporto variabile tra di loro.
Vantaggiosamente, detta fibra à ̈ scelta dal gruppo comprendente FOS, inulina e fibre di agrumi, preferibilmente in un rapporto in peso da 1:3 a 3:1.
La quantità delle fibre prebiotiche e/o dei carboidrati ad azione bifidogena, se presenti, risulta compresa in peso dallo 0,5 al 75%, preferibilmente dall'1% al 40% ed ancora più preferibilmente dal 2 al 20% rispetto al peso totale della composizione. In questo caso si ha un integratore ad attività' simbiotica.
In una realizzazione preferita, la composizione alimentare o l'integratore o la composizione farmaceutica può inoltre comprendere uno o più additivi o eccipienti fisiologicamente accettabili.
In una realizzazione preferita dell'invenzione, la composizione alimentare o l'integratore o la composizione farmaceutica può inoltre comprendere anche altri ingredienti e/o componenti attivi quali vitamine, minerali, peptidi bioattivi, sostanze ad attività antiossidante, ipocolesterolemizzante , ipoglicemizzante , antiinf iammatoria, edulcoranti in una quantità in peso generalmente compresa da 0,001% al 10% in peso, preferibilmente da 0,5 al 5% in peso, comunque dipendente dal tipo dì componente attivo e dalla sua eventuale dose giornaliera consigliata, rispetto al peso totale della composizione .
La composizione alimentare o l'integratore o la composizione farmaceutica della presente invenzione sono preparate mediante le tecniche già note e alla portata del tecnico del settore che e' in grado di utilizzare i macchinari e le apparecchiature note e la metodica piu' idonea .
In una realizzazione preferita la composizione alimentare o l'integratore o la composizione farmaceutica possono contenere elementi o sostanze ad attività antiossidante di cui sopra in una quantità in peso compresa da 0,0001% a 30% rispetto al peso della composizione finale, in funzione della concentrazione delle sostanze ad attività antiossidante e/o della dose giornaliera raccomandata (RDA), ove definita.
Il selenio può essere presente in forma di sodio seleniato, L-seleniometionina , sodio selenito, selenito acido di sodio, acido selenioso, nonché in forma di microrganismi, ad esempio lieviti, arricchiti in selenio, in una quantità in peso compresa da 0,0005% a 0,005% rispetto al peso della composizione finale, in ogni caso sufficiente ad apportare un quantitativo di selenio preferibilmente compreso da 10 pg a 150 pg .
Vantaggiosamente, trovano applicazione i ceppi depositati dalla Società BIOMAN S.r.l., Via Alfieri 18, 10100 Torino, Italia, quali:
- Lactobacillus buchneri LB26BM, depositato in data 05/04/2004 presso la DSMZ e avente numero di deposito DSM 16341, e/o
- Lactobacillus ferintoshensis LB6BM, depositato in data 17/01/2004 presso la DSMZ e avente numero di deposito DSM 16144, e/o
- Lactobacillus reuteri LB2BM, depositato in data 17/01/2004 presso la DSMZ e avente numero di deposito DSM 16143, e/o
in associazione con i ceppi produttori di vitamina B12 della presente invenzione.
Detti ceppi, infatti, sono in grado di accumulare all'interno della cellula elevati quantitativi di selenio, soprattutto in forma organica, se cresciuti in presenza di un'opportuna fonte di selenio nel terreno di coltura.
In un'altra realizzazione preferita, la composizione alimentare o l'integratore o la composizione farmaceutica possono contenere il glutatione. In particolare, il glutatione nella forma antiossidante si riferisce al glutatione ridotto (o GSH). In una realizzazione preferita, la composizione comprende il glutatione in forma ridotta e il selenio in una quantità' in peso compresa da 0,5% al 25%, rispetto al peso della composizione finale, in associazione con i ceppi produttori di vitamina B12 della presente invenzione.
Vantaggiosamente, poiché il glutatione può essere parzialmente inattivato se assunto per via orale, la composizione può comprendere 1'amminoacido solforato cisteina e/o N-acetilcisteina e/o loro miscele.
In una realizzazione della presente invenzione, la composizione alimentare o l'integratore o la composizione farmaceutica può' contenere i batteri probiotici sopra citati della presente invenzione, in forma microincapsulata, cioà ̈ rivestiti con una composizione contenente almeno un lipide (composizione lipidica) , preferibilmente di origine vegetale.
Alternativamente, la composizione alimentare o l'integratore o la composizione farmaceutica può' comprendere i batteri probiotici sopra citati della presente invenzione come batteri microincapsulati e batteri non micro incapsulati.
Detta composizione lipidica comprende almeno un lipide, e detto almeno un lipide e' di origine vegetale.
Vantaggiosamente, detto lipide di origine vegetale à ̈ scelto dal gruppo comprendente grassi saturi.
Vantaggiosamente, vengono utilizzati i grassi saturi aventi un punto di fusione inferiore a 75°C, preferibilmente compreso da 45 a 65°C.
In una realizzazione preferita, detti grassi saturi sono scelti dal gruppo comprendente mono- e di-gliceridi di acidi grassi saturi, i poligliceroli esterificati con acidi grassi saturi e gli acidi grassi saturi liberi. Preferibilmente, detti grassi saturi sono scelti tra il poligliceril distearato, il gliceril palmitostearato o i grassi vegetali idrogenati di origine non laurica.
In una prima realizzazione, i batteri probioticì sopra citati della presente invenzione sono mono rivestiti.
In pratica, viene realizzato un singolo rivestimento con uno stesso lipide. Vantaggiosamente, il singolo rivestimento e' a base di poligliceril di stearato (nome commerciale Plurol Stearique WL 1009).
I batteri probiotici sopra citati della presente invenzione mono rivestiti vengono messi nella composizione alimentare o nell' integratore o nella composizione farmaceutica della presente invenzione.
In una seconda realizzazione, i batteri probiotici sopra citati della presente invenzione sono doppiamente rivestiti. In pratica, viene realizzato, in successione, un doppio rivestimento con due lipidi diversi tra loro. Vantaggiosamente, i due lipidi sono scelti tra un grasso di palma idrogenato (Tf=60°C) e un dipalmito-stearato di glicerolo (Tf=57-60°C) vengono sprayzzati sul liofilizzato in successione, cioà ̈ sul liofilizzato viene applicata una doppia ricopertura: la prima con il grasso di palma idrogenato (ad esempio con Revel C) e la seconda con il dipalmito-stearato di glicerolo (ad esempio Precirol Ato 5) in un rapporto in peso 3:1 tra loro, vantaggiosamente 2:1, ad esempio 2/3 in peso del primo e 1/3 in peso del secondo .
In una realizzazione preferita, la composizione farmaceutica à ̈ indicata per uso nel trattamento preventivo e/o curativo di soggetti affetti da una patologia o da uno stato di malessere dovuti a stati carenziali o deficit di vitamina B12 .
In un'altra realizzazione preferita, la composizione farmaceutica à ̈ indicata per uso nel trattamento preventivo e/o curativo di soggetti affetti da anemia perniciosa.
L'anemia perniciosa à ̈ una malattia provocata da una carenza o deficit di vitamina B12, come ad esempio la cobalamina. Questa malattia à ̈ caratterizzata da anemia megaloblastica e disturbi del sistema nervoso.
In questi casi à ̈ importante valutare anche la concentrazione di vitamina B12 e acido folico in quanto anche la carenza di quest'ultimo provoca un quadro di anemia megaloblastica senza, però, interessare il sistema nervoso .
Pertanto, nel caso di anemia perniciosa risulta essere molto importante migliorare il quadro anemico somministrando una composizione farmaceutica comprendente almeno un ceppo produttore di vitamina B12 della presente invenzione scelto dal gruppo comprendente: Lactobacillus reuteri ATCC 53609, Lactobacillus reuteri DSM 20016, Lactobacillus reuteri ATCC 55730, Lactobacillus reuteri DSM 17938, Lactobacìllus reuteri DSM 16143, Lactobacillus reuteri NCIMB 701359, Lactobacillus reuteri DSM 23877 -(LRE01), Lactobacillus reuteri DSM 23878 (LRE02), Lactobacillus reuteri DSM 23879 (LRE03), e Lactobacillus reuteri DSM 23880 - (LRE04), in associazione con almeno un ceppo di batteri produttore di acido folico scelto dal gruppo comprendente:
- un ceppo di batteri appartenente alla specie Bifidobacterium adolescentis , preferibilmente il Bifidobacterium adolescentis depositato al DSMZ il 21.07.2004 e avente numero di accesso DSM 16595;
- un ceppo di batteri appartenente alla specie Bifidobacterium catenulatum/pseudocatenulatum, preferibilmente il Bifidobacterium catenulatum/pseudocatenulatum depositato al DSMZ il 15.06.2006 e avente numero di accesso DSM 18350;
- un ceppo di batteri appartenente alla specie Bifidobacterium animalis subsp. lactis, preferìbilmente il Bifidobacterium animalis subsp. lactis depositato al DSMZ il 15.06.2006 e avente numero di accesso DSM 18352;
- un ceppo di batteri appartenente alla specie Bifidobacterium breve, preferibilmente il Bifidobacterium breve depositato al DSMZ il 21.07.2004 e avente numero di accesso DSM 16596; - un ceppo di batteri appartenente alla specie Bifidobacterium pseudocatenulatum, preferibilmente il Bifidobacterium pseudocatenulatum depositato al DSMZ il 21.07.2004 e avente numero di accesso DSM 16597, Bifidobacterium pseudocatenulatum depositato al DSMZ il 21.07.2004 e avente numero di accesso DSM 16598 e Bifidobacterium catenulatum/pseudocatenulatum depositato al DSMZ il 15.06.2006 e avente numero di accesso DSM 18353.
I ceppi di cui sopra sono stati depositati dalla Società Anidral Srl (adesso Probiotical SpA Via Mattei 3, Novara 28100 Italia) in data 21.07.2004 e 15.06.2006 presso il DSMZ in Germania.
I ceppi Lactobacillus reuteri DSM 23877 -(LRE01), Lactobacillus reuteri DSM 23878 -(LRE02), Lactobacillus reuteri DSM 23879 - (LRE03) e Lactobacillus reuteri DSM 23880 -(LRE04) sono stati depositati dalla Società' Probiotical SpA Via Mattei 3, Novara 28100 Italia in data 0508.2010 presso il DSMZ in Germania.
In un'altra realizzazione preferita, la composizione farmaceutica à ̈ indicata per uso nel trattamento di soggetti che assumono vitamina C in quanto l'assunzione di alte quantità di vitamina C (maggiore di 1 g) possono, col tempo, generare stati carenziali di cobalamina. Questo à ̈ dovuto al fatto che la vitamina C, in presenza di ferro, si può comportare da ossidante e formare radicali liberi che danneggiano la cobalamina ed il fattore intrinseco. Pertanto una composizione alimentare o un integratore o una composizione farmaceutica della presente invenzione trova valida applicazione per quelle persone che assumono giornalmente dosi di vitamina C.
Quindi, l'impiego di ceppi di batteri probiotici e produttori di vitamina B12 (sotto forma di idrossicobalamina che à ̈ la forma naturale che viene maggiormente assunta con la dieta) , à ̈ una alternativa vantaggiosa rispetto all'impiego di alimenti o integratori o farmaci che contengono la vitamina B12 sotto forma di cianocobalamina .
Tutte le composizioni sopra citate o integratori della presente invenzione, possono essere formulati in forma solida, liofilizzata o essiccata, ad esempio in polvere o granuli .
Inoltre, una forma farmaceutica d'interesse à ̈ la compressa o capsule rigide o molli.
Per quanto concerne la compressa, questa può comprendere una parte interna comprendente i ceppi di batteri e una parte esterna di rivestimento. Il rivestimento può comprendere polimeri solubili in acqua e/o polimeri in grado di resistere alle variazioni del pH dello stomaco e consentire il passaggio nel tratto intestinale.
In una realizzazione preferita, il ceppo di batteri probiotico scelto dal gruppo comprendente i ceppi di batteri appartenenti alla specie Lactobacillus reuteri, come produttore di vitamina B12.
In un'altra realizzazione preferita, il ceppo produttore di vitamina B12 e' scelto dal gruppo comprendente: Lactobacillus reuteri ATCC 55730, Lactobacillus reuteri DSM 17938 e Lactobacillus reuteri DSM 16143.
In un'altra realizzazione preferita, una composizione alimentare o un integratore o una composizione farmaceutica comprende almeno un ceppo di batteri produttore di vitamina B12, preferibilmente e' inoltre presente almeno un ulteriore ceppo di batteri in grado di accumulare all'interno delle cellule batteriche il selenio, preferibilmente detto ceppo di batteri e' scelto dal gruppo comprendente: Lactobacillus buchneri LB26BM, depositato in data 05/04/2004 presso la DSMZ e avente numero di deposito DSM 16341, Lactobacillus ferintoshensis LB6BM, depositato in data 17/01/2004 presso la DSMZ e avente numero di deposito DSM 16144, e Lactobacillus reuteri LB2BM, depositato in data 17/01/2004 presso la DSMZ e avente numero di deposito DSM 16143.
In un'altra realizzazione preferita, detta composizione inoltre comprende glutatione in forma ridotta.
In un'altra realizzazione detta composizione inoltre comprende un ulteriore ceppo di batteri in grado di produrre acido folico, preferibilmente detto ceppo scelto dal gruppo comprendente: un ceppo di batteri appartenente alla specie Bifidobacterium adolescentis , preferibilmente il Bifidobacterium adolescentis depositato al DSMZ il 21.07.2004 e avente numero di accesso DSM 16595; un ceppo di batteri appartenente alla specie Bifidobacterium catenulatum/pseudocatenulatum, preferibilmente il Bifidobacterium catenulatum/pseudocatenulatum depositato al DSMZ il 15.06.2006 e avente numero di accesso DSM 18350; un ceppo di batteri appartenente alla specie Bifidobacterium animalis subsp . lactis, preferibilmente il Bifidobacterium animalis subsp. lactis depositato al DSMZ il 15.06.2006 e avente numero di accesso DSM 18352; un ceppo di batteri appartenente alla specie Bifidobacterium breve, preferibilmente il Bifidobacterium breve depositato al DSMZ il 21.07.2004 e avente numero di accesso DSM 16596; un ceppo di batteri appartenente alla specie Bifidobacterium pseudocatenulatum, preferibilmente il Bifidobacterium pseudocatenulatum depositato al DSMZ il 21.07.2004 e avente numero di accesso DSM 16597, Bifidobacterium pseudocatenulatum depositato al DSMZ il 21.07.2004 e avente numero di accesso DSM 16598 e Bifidobacterium catenulatum/pseudocatenulatum depositato al DSMZ il 15.06.2006 e avente numero di accesso DSM In un'altra realizzazione preferita, detta composizione farmaceutica e' indicata per uso nel trattamento preventivo e/o curativo di soggetti affetti da una patologia o da uno stato di malessere dovuti a stati carenziali o deficit di vitamina B12.
In un'altra realizzazione preferita, detta composizione farmaceutica e' indicata per uso nel trattamento preventivo e/o curativo di soggetti affetti da anemia perniciosa .
In un'altra realizzazione preferita, detta composizione farmaceutica e' indicata per uso nel trattamento di soggetti che assumono vitamina C.
In un'altra realizzazione preferita, detta composizione o integratore può' comprendere detti ceppi di batteri produttori di vitamina B12 e/o detti ceppi di batteri in grado di accumulare i selenio e/o detti ceppi di batteri produttori di acido folico rivestiti con una composizione contenente almeno un lipide, preferibilmente di origine vegetale, detto lipide essendo scelto dal gruppo comprendente grassi saturi aventi un punto di fusione inferiore a 75°C, preferibilmente compreso da 45 a 65°C.
Parte sperimentale - Metodo microbiologico
Il presente metodo microbiologico viene utilizzato per determinare la quantità di vitamina B12 prodotta dalle cellule batteriche dei ceppi della presente invenzione.
Il metodo si basa sull'impiego del ceppo Lactobacillus delbrueckii subs . lactis (L. leichmannii) ATCC 7830-DSMZ 20355 auxotrofo per la vitamina B12 che cresce quindi proporzionalmente alla quantità di vitamina B12 presente nel mezzo colturale. Tale crescita viene determinata con la lettura spettrofotometrica della coltura alla lunghezza d'onda di 600 nm . La retta di taratura calcolata dalla crescita del Lactobacillus delbrueckii subs. lactis (L. leichmannii) in terreni contenenti quantità scalari e note di vitamina B12 viene impiegata quindi per la determinazione della cobalamina prodotta dai ceppi batteri della presente invenzione che sono stati oggetto dell 'analisi.
Metodo microbiologico
1 .1 Preparazione del ceppo auxotrofo per il calcolo della retta di taratura e delle concentrazioni di vitamina B12 prodotte .
1.1.1 II ceppo auxotrofo Lactobacillus delbrueckii subs. lactis (L. leichmannii) ATCC 7830-DSMZ 20355 viene inoculato all'1% in 15 mi di MRS brodo (MRS Difco 55,00 g e 1000 mi di acqua distillata) e addizionato all'1% con Cisteina cloroidrato (Merck cod. 1.02735.0100 - 50,00 g e 1000 mi di acqua distillata; sol. al 5%).
1.1.2 Successivamante si mette in un agitatore Vortex a vortexare .
1.1.3 II tappo a ghiera viene avvitato avendo cura di non stringerlo completamente onde permettere l'instaurarsi di un ambiente anossico. Il ceppo viene incubato in Gas-Pack provvisto di sistema per anaerobiosi Anaerocult A per 18-24 ore a 37 °C.
1.1.4 Successivamente, si procedere con il trapianto della coltura ottenuta per due volte consecutive utilizzando sempre lo stesso terreno e la medesima percentuale di inoculo .
1.1.5 Al termine del periodo di incubazione centrifugare la coltura di Lactobacillus delbrueckii subs. lactis (L. leichmannii) ATCC 7830-DSMZ 20355 a 6000 giri per 15 minuti .
1.1.6 Al termine della centrifugazione si elimina il surnatante e si lava il pellet per tre volte consecutive con 10 mi di soluzione fisiologica 0,85% NaCl.
1.1.7 Si risospende il pellet in 10 mi di soluzione fisiologica 0,85% NaCl.
1.1.8 Poi si diluisce 1:100 con soluzione fisiologica 0,85% NaCl ottenendo così l'inoculo necessario all'allestimento dei tubi, a concentrazioni note di vitamina B12, necessari per il calcolo della retta di taratura e l'allestimento dei tubi da cui viene determinata la quantità di vitamina B12 prodotta.
1.2 Prepararazione dei tubi necessari al calcolo della retta di taratura.
1.2.1 Si scioglie 7,6 g di vitamina B12 Assay Medium (Difco cod. 60179) in 100 mi di acqua ultrapura.
1.2.2 Si riscalda e si agita contemporaneamente facendo bollire per circa 2-3 minuti per dissolvere completamente tutta la polvere.
1.2.3 Si distribuisce 5 ml di vitamina B12 Assay Medium in sette provette di vetro precedentemente lavate con acqua ultrapura e messe in stufa a 100 °C per una notte. 1.2.4 Si aggiunge alle provette la soluzione stock di cianocobalamina (preparata come sotto riportato) e si porta al volume finale di 10 mi con acqua ultrapura, come sotto riportato:
- mi di soluzione stock per tubo:
0, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5
- mi di acqua ultrapura per tubo:
5, 4.5, 4, 3, 2, 1, 0
- Concentrazione di vitamina B12 per tubo (ng/ml):
0.0 0.025 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25
La soluzione stock di cianocobalamina e' cosi" preparata: i) Sciogliere 10 mg di Standard di cianocobalamina (Sigma cod. C3607) in un matraccio da 100 mi portando a volume con una soluzione di etanolo al 25% in acqua ultrapura (concentrazione finale 0,1 mg/ml).
ii) Aggiungere 1 mi della soluzione ottenuta al punto (i) a 99 mi di acqua ultrapura (concentrazione finale 1 Î1⁄4g/ml) .
iii) Aggiungere 1 ml della soluzione ottenuta al punto (ii) a 99 mi di acqua ultrapura (concentrazione finale 10 ng/ml )
iv) Aggiungere 1 ml della soluzione ottenuta al punto (iii) a 199 mi di acqua ultrapura (concentrazione finale 0 .05 ng/ml).
1.2.5 I tubi si mettono in autoclave a 121°C per 15 minuti .
1.2.6 Al termine del trattamento termico, aggiungere 100 Î1⁄4l della sospensione del Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis (L. leichmannii) ATCC 7830-DSMZ 20355, ottenuta come sopra 1.1.8, in ogni provetta.
1.2.7 Successivamante si mette in un agitatore Vortex a vortexare .
1.2.8 II tappo a ghiera viene avvitato avendo cura di non stringerlo completamente onde permettere l'instaurarsi di un ambiente anossico. Il ceppo viene incubato in Gas-Pack provvisto di un sistema per anaerobiosi Anaerocult A per 18-24 ore a 37°C.
1.2.9 Al termine del periodo di incubazione, raffreddare le provette a 4 °C per 15-20 minuti per bloccare la crescita batterica.
1.3 Calcolo della retta di taratura.
1.3.1 Si procede con l'azzeramento dello spettrofotometro a 660 nm contro 1 ml di vitamina B12 Assay medium (diluizione con 0 ng/ml di cianocobalamina) ottenuto come sopra .
1.3.2 Aggiungere 1 ml di coltura ottenuta come al punto 1.2.9 in cuvette di plastica da 1,5 mi secondo l'ordine crescente della concentrazione di cianocobalamina presente .
1.3.3 Si procede con la lettura dei valori di assorbanza alla lunghezza d'onda di 660 nm.
1.3.4 I valori di assorbanza ottenuti sono stati utilizzati per la determinazione della retta di taratura, la cui equazione servirà per l'estrapolazione dei dati relativi ai quantitativi incogniti di vitamina B12 presenti nelle colture ottenute al punto 1.4.18.
1 .4 Preparazione dei campioni per la determinazione della vitamina B12 prodotta.
1.4.1 Si scioglie 7,6 g di Vitamin B12 Assay Medium in 100 mi di acqua ultrapura.
1.4.2 Si riscalda e si agita contemporaneamente facendo bollire per circa 2-3 minuti per dissolvere completamente tutta la polvere.
1.4.3 Si distribuiscono 5 ml di vitamina B12 Assay Medium in "n" provette di vetro (n = numero di campioni da attivare x numero sub colture di attivazione) precedentemente lavate con acqua ultrapura e messe in stufa a 100 °C.
1.4.4 Si distribuiscono 5 mi di vitamina B12 Assay Medium in "n" provette di vetro (n = numero di campioni da analizzare x 5) precedentemente lavate con acqua ultrapura e messe in stufa a 100 °C per una notte.
1.4.5 Si distribuiscono 25 mi di vitamina B12 Assay medium in "n" bibbi (bottiglia di vetro Pirex, generalmente da 100 o 250 mi, idonea alla sterilizzazione in autoclave di terreni colturali) da 100 ml (n = numero di campioni da analizzare) precedentemente lavati con acqua ultrapura e messi in stufa a 100 °C.
1.4.6 Si portano le provette di cui al punto 1.4.3 al volume di 10 mi con l'aggiunta di acqua ultrapura.
1.4.7 Si portano i bibbi di cui al punto 1.4.5 al volume di 50 mi con l'aggiunta di acqua ultrapura.
1.4.8 Si mette in autoclave a 121 °C per 15 minuti.
1.4.9 Si inocula all'1% i ceppi batterci da analizzare nelle provette appartenenti al gruppo descritto di cui al punto 1.4.3.
1.4.10 Successivamante si mette in un agitatore Vortex a vortexare .
1.4.11 II tappo a ghiera viene avvitato saldamente e si procede a incubare in bagnetto termostatato per 18-24 ore a 37 °C.
1.4.12 Si trapianta la coltura ottenuta per tre volte consecutive utilizzando sempre lo stesso terreno e la medesima percentuale di inoculo.
1.4.13 Si inocula all'1% i ceppi batterici nei bibbi appartenenti al gruppo di cui al punto 1.4.5.
1.4.14 Successivamante si mette in un agitatore Vortex a vortexare .
1.4.15 II tappo a ghiera viene avvitato saldamente e si procede a incubare in bagnetto termostatato per 18-24 ore a 37 °C. 1.4.16 Al termine del periodo di incubazione, centrifugare a 6000 giri per 15 minuti.
1.4.17 Al termine della centrifugazione, si rimuove il surnatante e si lava il pellet tre volte consecutive con 10 mi di tampone Sodio fosfato 0,1 M pH 7.
1.4.18 Si risospende il pellet in 1 ml di tampone di estrazione Sodio fosfato 0,1 M pH 4,5 [Ac. Citrico] , 0,005% KCN .
11 tampone di estrazione viene preparato come segue: al) Portare a pH 4,5 100 mi di soluzione tampone Sodio fosfato 0,1 M pH 7 traminte l'aggiunta di acido citrico. a2) Aggiungere KCN in ragione dello 0,005% della soluzione ottenuta al punto al).
a3) Mettere in agitazione per 10 minuti.
1.4.19 Si mette in agitazione a 4°C con 1 g di glass beads per tre cicli da 5 minuti.
1.4.20 Al termine del periodo di agitazione, si bolle l'estratto a 100°C per 5 minuti per permettere la denaturazione delle proteine e la formazione della cianocobalamina .
1.4.21 Al termine del termo-trattamento, si diluisce l'estratto con acqua ultrapura secondo le proporzioni sotto riportate:
- diluizione: 1:2 1:5 1:101:100 1:1000
- Î1⁄4l estratto: 500200 100 10 1
- Î1⁄4l ddH20: 500800 900 990 999
1.4.22 Si aggiunge ogni diluizione ai tubi di cui al punto 1.4.4.
1.4.23 Si porta ogni tubo al volume di 10 mi con acqua ultrapura .
1.4.24 Si aggiungono 100 Î1⁄4l della sospensione del Lactobacillus delbrueckii subs . lactis (L. leichmannii) ATCC 7830-DSMZ 20355 di cui al punto 1.4.8.
1.4.25 Successivamante si mette in un agitatore Vortex a vortexare .
1.4.26 II tappo a ghiera viene avvitato avendo cura di non stringerlo completamente onde permettere l'instaurarsi di un ambiente anlssico. Il ceppo viene incubato in Gas-Pack provvisto di un sistema per anaerobiosì Anaerocult A per 18-24 ore a 37 °C.
1.4.27 Al termine del periodo di incubazione, si raffredda le provette a 4 °C per 15-20 minuti per bloccare la crescita batterica.
1.5 Determinazione della vitamina B12 prodotta.
1.5.1 Sì azzera lo spettrofotometro a 660 nm contro 1 mi di vitamina B12 Assay medium (diluizione con 0 ng/ml di cianocobalamina) come sopra ottenuta.
1.5.2 Si aggiunge 1 mi di coltura come ottenuta al punto 1.2.9 in cuvette di plastica da 1,5 mi secondo l'ordine crescente delle diluizioni dell'estratto come riportato al punto 1.4.21.
1.5.3 Si leggono i valori di assorbanza alla lunghezza d'onda di 660 nm.
1.5.4 I valori di assorbanza ottenuti sono stati utilizzati nell'equazione della retta sopra calcolata al punto 1.3.4 per il calcolo della concentrazione di vitamina B12 prodotta dai ceppi in esame. I risultati sono espressi in ng/1.
Parte sperimentale - Metodo analitico (HPLC)
Il presente metodo analitico viene utilizzato per determinare la quantità di vitamina B12 prodotta dalle cellule batteriche dei ceppi della presente invenzione. La determinazione analitica della vitamina B12, prodotta dalle colture batteriche dei ceppi della presente invenzione che sono oggetto della presente analisi, viene effettuata con metodica HPLC in fase inversa (colonna C18) utilizzando un detector UV/VIS.
Metodo analitico (HPLC)
2.1 Prepararazione di soluzioni standard per il calcolo della retta di taratura.
2.1.1 Si pesano 10 mg di Cianocobalamina Standard (Sigma cod. C3607) ed effettuare le seguenti diluizioni seriali :
2. 1.1.1 Soluzione 1 mg/ml: pesare 10 mg di Cianocobalamina Standard (Sigma cod. C3607) in un matraccio da 10 mi e portare a volume con acqua MilliQ e 25% Etanolo (l'etanolo serve ad aumentare la solubilità della cianocobalamina) .
2. 1.1.2 Soluzione 0,1 mg/ml: prelevare 1 mi della soluzione al punto 2. 2.1.1 e portarla a volume in un matraccio da 10 mi e portare a volume con acqua MilliQ. 2. 1.1.3 Soluzione 0,01 mg/ml: prelevare 1 mi della soluzione al punto 2. 2.1.2 e portarla a volume in un matraccio da 10 mi e portare a volume con acqua MilliQ. 2.1.1.4 Soluzione madre (1000 ng/ml) : prelevare 5 mi della soluzione al punto 2.2.1.3 e portarla a volume in un matraccio da 50 mi e portare a volume con acqua MilliQ. 2.1.2 Dalla soluzione madre descritta al punto 2.2.1.4 si preparano le diluizioni standard per la creazione della retta di taratura nel seguente modo:
2.1.2.1 Soluzione 1000 ng/ml o soluzione madre tal quale.
2.1.2.2 Soluzione 800 ng/ml: prelevare 4 ml di soluzione madre e portare a volume in un matraccio di 5 ml con acqua MilliQ.
2. 1.2.3 Soluzione 500 ng/ml: prelevare 5 mi di soluzione madre e portare a volume in un matraccio da 10 mi con acqua MilliQ.
2. 1.2.4 Soluzione 200 ng/ml: prelevare 1 mi di soluzione madre e portare a volume in un matraccio di 5 mi con acqua MilliQ.
2. 1.2.5 Soluzione 100 ng/ml: prelevare 1 mi di soluzione madre e portare a volume in un matraccio di 10 mi con acqua MilliQ.
2. 1.2.6 Soluzione 50 ng/ml: prelevare 1 mi di soluzione 500 ng/ml (vd. punto 2.2.23) e portare a volume in un matraccio da 10 mi con acqua MilliQ.
2.1.2.7 Soluzione 25 ng/ml: prelevare 5 mi di soluzione 50 ng/ml (cd. punto 7.2.2.6) e portare a volume in un matraccio da 10 mi con acqua MilliQ.
2 .2 Principali parametri di impostazione per la metodica HPLC .
Per il corretto utilizzo dell 'HPLC Waters 625 LC System, del software di acquisizione dati TotalChrom (Perkin Elmer) e del detector UV/VIS 785 A (Perkin Elmer) si devono seguire attentamente le indicazioni presenti
sulle procedure di utilizzo. Di seguito sono indicati i parametri fondamentali dell'analisi per determinare la quantità di Vitamina B12 prodotta dai ceppi batterici oggetto dell'analisi:
2.2.1 Parametri relativi all'HPLC:
Tipo di colonna cromatografica:
Colonna Spherisorb ODS 2 (Waters) C18 250x4.6 mm, diametro 5Î1⁄4m .
Fase mobile: Acqua MilliQ e Acetonitrile in gradiente di eluizione (come indicato nella tabella sottostante).
Gradiente di eluizione: Impostare il gradiente di eluizione, tramite tastiera presente sul controller centrale dell'HPLC Waters 625 LC System, come sotto mostrato :
Tempo % Acqua MilliQ % Acetonitrile
0 95 5
14 85 15
19 70 30
20 95 5
35 95 5
Flusso di eluizione: Impostare sul controller centrale dell'HPLC Waters 625 LC System un flusso costante di 1.0 ml/min.
Temperatura colonna: Impostare sul controller centrale dell'HPLC Waters 625 LC System una temperatura di 25 °C per il fornetto di termostatazione della colonna.
Volume iniezione: 20 Î1⁄4l di standard e campione.
2.2.2 Parametri relativi al detector UV/VIS. La lunghezza d'onda e' pari a 360 nm.
2.3 Retta di taratura.
2.3.1 Iniettare una dopo l 'altra tutte le soluzioni standard preparate come descritto nel punto 2.2.
2.3.2 Acquisire tramite software TotalChrom i relativi cromato grammi.
2.3.3 II software procede automaticamente all'integrazione dei picchi presenti su ogni cromatogramma. E' fondamentale però controllare che l'integrazione automatica effettuata dal software sia corretta. Il tempo di ritenzione della cianocobalamina à ̈ di circa 19 minuti.
2.3.4 Le aree di ogni singolo picco relativo alla vitamina B12 vengono annotate. In base al valore delle aree dei picchi in relazione alle concentrazioni di partenza si crea un grafico a dispersione.
2.3.5 La retta dì taratura generata deve avere valore di R2 > 0.99.
2.3.6 Per interpolazione sulla retta di taratura verrà calcolata la vitamina B12 presente nei campioni oggetto dell 'analisi.
2 .4 Preparazione dei campioni per la determinazione della vitamina B12 prodotta.
I campioni sono preparati seguendo la stessa metodica riportata ai punti da 1.4.1 a 1.4.20.
2.5 Determinazione della vitamina B12 prodotta.
2.5.1 20 Î1⁄4l dell'estratto preparato al punto 1.4.20 vengono iniettati in HPLC.
2.5.2 II valore dell'area del picco relativo al
campione analizzato viene interpolato sulla retta di
taratura preparata come al punto 1.4.
2.5.3 Calcolare il valore finale di vitamina B12 di
ogni singolo campione in base alla quantità di campione
iniettata (20 Î1⁄4l). I risultati sono espressi in ng/1.
La Richiedente ha eseguito il saggio HPLC (media di più prove) [concentrazione di vitamina B12 espressa in Î1⁄4g/litro] a OD600,e ha determinato i seguenti valori:
- Lactobacillus reuteri DSM 23878 (LRE02) = 45,57
- Lactobacillus reuteri ATCC 55730 = 43,02
- Lactobacillus reuteri DSM 17938 = 32,27
Tabella 1
Ceppi produttori Saggio Saggio di VITAMINA B12 Microbiologico HPLC (media di più (media di prove) più prove) [concentrazione di [concentrazione di vitamina B12 vitamina B12 espressa in espressa in ηg/litro] a OD600 ηg/litro] a OD600Lactobacillus reuteri 15.640±75% 18.030 ± 12% ATCC 55730
Lactobacillus reuteri 10.950±68 % 12.890 ± 10% DSM 17938
Lactobacillus reuteri 2.790±76% 8 .000 ± 13% DSM 16143

Claims (10)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Un ceppo di batteri probiotico appartenente alla specie Lactobacillus reuteri, come produttore di vitamina B12, scelto dal gruppo comprendente: - Lactobacillus reuteri DSM 23877 - (LRE01), - Lactobacillus reuteri DSM 23878 - (LRE02), - Lactobacillus reuteri DSM 23879 - (LRE03), - Lactobacillus reuteri DSM 23880 - (LRE04).
  2. 2. Il ceppo secondo la rivendicazione 1, in cui detto ceppo e' Lactobacillus reuteri DSM 23878 (LRE02); preferibilmente detto Lactobacillus reuteri DSM 23878 -(LRE02) e" in associazione con almeno un ceppo scelto dal gruppo comprendente : - Lactobacillus reuteri ATCC 55730, - Lactobacillus reuteri DSM 17938, e - Lactobacillus reuteri DSM 16143; ancora più preferibilmente il ceppo Lactobacillus reuteri DSM 23878 (LRE02) e' in associazione con almeno un ceppo scelto dal gruppo comprendente: - Lactobacillus reuteri ATCC 55730, Lactobacillus reuteri DSM 17938.
  3. 3. Una composizione alimentare o nutraceutìca o un integratore o una composizione farmaceutica comprendente almeno un ceppo di batteri in accordo con la rivendicazione 1 o 2.
  4. 4. La composizione alimentare o nutraceutica o un integratore o una composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 3, in cui detta composizione comprende: i) il ceppo Lactobacillus reuteri ATCC 55730 e Lactobacillus reuteri DSM 23878 (LRE02),o ii) il ceppo Lactobacillus reuteri DSM 17938 e Lactobacillus reuteri DSM 23878 (LRE02), o iii) il ceppo Lactobacillus reuteri DSM 16143 e Lactobacillus reuteri DSM 23878 (LRE02), o iv) i tre ceppi Lactobacillus reuteri ATCC 55730, Lactobacillus reuteri DSM 17938 e Lactobacillus reuteri DSM 23878 (LRE02), o v) i tre ceppi Lactobacillus reuteri DSM 23878 (LRE02), Lactobacillus reuteri DSM 17938 e Lactobacillus reuteri DSM 16143, o vi) i tre ceppi Lactobacillus reuteri DSM 23878 (LRE02), Lactobacillus reuteri ATCC 55730 e Lactobacillus reuteri DSM 16143.
  5. 5. La composizione alimentare o nutraceutica o l'integratore o la composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 4, in cui e" inoltre presente almeno un ulteriore ceppo di batteri in grado di accumulare all'interno delle cellule batteriche il selenio, preferibilmente detto ceppo di batteri e' scelto dal gruppo comprendente: Lactobacillus buchneri LB26BM, depositato in data 05/04/2004 presso la DSMZ e avente numero di deposito DSM 16341, Lactobacillus ferintoshensis LB6BM, depositato in data 17/01/2004 presso la DSMZ e avente numero di deposito DSM 16144, e Lactobacillus reuteri LB2BM, depositato in data 17/01/2004 presso la DSMZ e avente numero di deposito DSM 16143.
  6. 6. La composizione alimentare o numtraceutica o l'integratore o la composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 4 o 5, in cui e' inoltre presente il glutatione in forma ridotta.
  7. 7. La composizione alimentare o nutraceutica o l'integratore o la composizione farmaceutica secondo una qualsiasi delle rivendicazione 4-6, in cui e' inoltre presente un ulteriore ceppo di batteri in grado di produrre acido folico, preferibilmente detto ceppo e' scelto dal gruppo comprendente: un ceppo di batteri appartenente alla specie Bifidobacterium adolescentis , preferibilmente il Bifidobacterium adolescentis depositato al DSMZ il 21.07.2004 e avente numero di accesso DSM 16595; un ceppo di batteri appartenente alla specie Bifidobacterium catenulatum/pseudocatenulatum, preferibilmente il Bifidobacterium catenulatum/pseudocatenulatum depositato al DSMZ il 15.06.2006 e avente numero di accesso DSM 18350; un ceppo di batteri appartenente alla specie Bifidobacterium animalis subsp . lactis, preferibilmente il Bifidobacterium animalis subsp. lactis depositato al DSMZ il 15.06.2006 e avente numero di accesso DSM 18352; un ceppo di batteri appartenente alla specie Bifidobacterium breve, preferibilmente il Bifidobacterium breve depositato al DSMZ il 21.07.2004 e avente numero di accesso DSM 16596; un ceppo di batteri appartenente alla specie Bifidobacterium pseudocatenulatum, preferibilmente il Bifidobacterium pseudocatenulatum depositato al DSMZ il 21.07.2004 e avente numero di accesso DSM 16597, Bifidobacterium pseudocatenulatum depositato al DSMZ il 21.07.2004 e avente numero di accesso DSM 16598 e Bifidobacterium catenulatum/pseudocatenulatum depositato al DSMZ il 15.06.2006 e avente numero di accesso DSM 18353 .
  8. 8. La composizione farmaceutica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 4-7, per uso nel trattamento preventivo e/o curativo di soggetti affetti da una patologia o da uno stato di malessere dovuti a stati carenziali o deficit di vitamina B12 .
  9. 9. La composizione farmaceutica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 4-7, per uso nel trattamento preventivo e/o curativo di soggetti affetti da anemia perniciosa, o per uso nel trattamento di soggetti che assumono vitamina C.
  10. 10 . La composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 4 a 9, in cui detti ceppi di batteri produttori di vitamina B12 e/o detti ceppi di batteri in grado di accumulare i selenio e/o detti ceppi di batteri produttori di acido folico sono rivestiti con una composizione contenente almeno un lipide, preferibilmente di origine vegetale, detto lipide essendo scelto dal gruppo comprendente grassi saturi aventi un punto di fusione inferiore a 75°C, preferibilmente compreso da 45 a 65 °C .
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