CN115052976A - 新型乙酰羟酸合酶变体和包括其的微生物 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及乙酰羟酸合酶变体、编码该变体的多核苷酸、包括该变体的微生物以及利用该微生物生产L‑异亮氨酸的方法。

Description

新型乙酰羟酸合酶变体和包括其的微生物
[技术领域]
本公开涉及乙酰羟酸合酶蛋白的新型变体、编码该变体的多核苷酸、包括该变体的微生物以及利用该微生物生产L-异亮氨酸的方法。
[背景技术]
支链氨基酸，即L-缬氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸，已知增加个体中的蛋白质水平并在运动期间作为能量来源发挥重要作用，并且因此广泛用于医疗产品、食品等中。
作为生产支链氨基酸的代表性微生物，使用谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)和大肠杆菌(Escherichia coli)。在这些微生物中，支链氨基酸中的L-异亮氨酸与其它支链氨基酸如L-缬氨酸或L-亮氨酸共享其主要生物合成途径。关于L-异亮氨酸生物合成途径，糖酵解期间产生的丙酮酸(基)和由L-苏氨酸——天冬氨酸(基)(天冬氨酸)衍生的氨基酸——产生的2-酮丁酸(基)被用作前体。由这两种前体，通过乙酰羟酸合酶(AHAS)的酶促作用合成2-乙酰-2-羟基乙酸，随后通过乙酰羟酸异构还原酶生产2,3-二羟基-3-甲基戊酸(基)，以及通过二羟酸脱水酶生产2-酮-3-甲基戊酸(基)。最后，通过转氨酶的作用生产L-异亮氨酸。进一步，乙酰羟酸合酶催化丙酮酸(基)的脱羧和与另一丙酮酸(基)分子的缩合反应以生产乙酰乳酸(基)，其是缬氨酸和亮氨酸的前体。
在共享生物合成途径的支链氨基酸中，L-异亮氨酸和L-缬氨酸具有非常相似的化学结构和性质，并且副产物如正缬氨酸和α-氨基丁酸(AABA)也与L-异亮氨酸共享生物合成途径。因此，当L-异亮氨酸的生产增加时，副产物也大量产生。为此，为了以高产率和高纯度生产L-异亮氨酸，需要高纯化成本，因此有必要开发生产目标产物的能力增加同时尽可能减少副产物产生的菌株(菌种，strain)。
乙酰羟酸合酶(AHAS)是在支链氨基酸的生物合成途径中发挥重要作用的酶，并且根据微生物的种类由ilvBN、ilvGM或ilvIH基因编码。在谷氨酸棒状杆菌的情况下，AHAS由ilvBN基因编码。ilvBN基因经历支链氨基酸中的最终产物L-异亮氨酸的反馈抑制，使得该基因的表达和酶的活性被抑制。因此，优化基因的表达和调控酶的活性以生产高产率L-异亮氨酸生产菌株是非常重要的。然而，其在前研究主要关注因乙酰羟酸合酶小亚基(IlvN蛋白)的修饰而引起的反馈抑制的释放(Protein Expr Purif.2015年5月；109:106–12.、US2014-0335574、US 2009-496475、US 2006-303888、US 2008-245610)，因此揭示了相关研究的严重匮乏。
鉴于此技术背景，本发明人已做出大量工作以开发具有增强的生产L-异亮氨酸到能力的微生物，并且结果是其开发了乙酰羟酸合酶的变体，具体地，大亚基(ilvB)变体。相应地，本发明人确认了在包括该变体的微生物中L-异亮氨酸的高度生产，从而完成了本公开。
[发明内容]
[技术问题]
本公开的一个目的是提供具有乙酰羟酸合酶活性的蛋白质变体，其中SEQ ID NO:1的氨基酸序列中第136位氨基酸谷氨酰胺被除谷氨酰胺以外的氨基酸取代。
本公开的另一目的是提供编码该蛋白质变体的多核苷酸，以及包括其的载体。
本公开的再另一目的是提供包括蛋白质变体的、生产L-异亮氨酸的微生物。
本公开的再另一目的是提供生产L-异亮氨酸的方法，该方法包括在培养基中培养生产L-异亮氨酸的微生物。
[技术方案]
本公开将被更详细地描述。
同时，本公开中公开的每个描述和实施方式也可以适用于其它描述和实施方式。即，本公开中所公开的各种要素的所有组合都落入本公开的范围内。进一步，本公开的范围不受以下具体描述的限制。
进一步，本领域技术人员将认识到或能够利用不超过常规的实验确定本文描述的本公开的具体实施方式的许多等效形式。进一步，这些等效形式应被解释为落入本公开内。
本公开的一个方面提供了具有乙酰羟酸合酶活性的蛋白质变体，其中SEQ ID NO:1的氨基酸序列中第136位氨基酸谷氨酰胺被除谷氨酰胺以外的氨基酸取代。具有乙酰羟酸合酶活性的蛋白质变体可以与变体蛋白质、修饰蛋白质、乙酰羟酸合酶变体、变体乙酰羟酸合酶、修饰乙酰羟酸合酶等可互换地使用。
具体地，多肽可以是具有乙酰羟酸合酶(AHAS)活性的蛋白质变体，其中SEQ IDNO:1的氨基酸序列中第136位氨基酸谷氨酰胺被天冬酰胺、精氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、赖氨酸、缬氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸或色氨酸取代，但不限于此。
如本文所用，术语“乙酰羟酸合酶(AHAS)”指代涉及支链氨基酸的生物合成的酶，其可涉及支链氨基酸的生物合成的第一步。具体地，乙酰羟酸合酶可以催化丙酮酸(基)脱羧和与另一丙酮酸(基)分子的缩合反应以生产乙酰乳酸(基)——其是缬氨酸的前体，或者可以催化丙酮酸基脱羧和与2-酮丁酸(基)的缩合反应以生产乙酰羟基丁酸(基)——其为异亮氨酸的前体。从生产的乙酰羟基丁酸(基)开始，L-异亮氨酸可以通过被乙酰羟酸异构还原酶、二羟酸脱水酶和转氨酶B催化的顺序反应而被生物合成。
因此，乙酰羟酸合酶是支链氨基酸的生物合成途径中的重要的酶。乙酰羟酸合酶由两个基因即ilvB和ilvN编码。ilvB基因编码乙酰羟酸合酶(IlvB)的大亚基，并且ilvN基因编码乙酰羟酸合酶(IlvN)的小亚基。
如本文所用，术语“支链氨基酸”指代在侧链上具有支链烷基的氨基酸，并且其包括缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。具体地，在本公开中，支链氨基酸可以是L-异亮氨酸、L-缬氨酸或L-亮氨酸，但不限于此。
在本公开中，乙酰羟酸合酶可以源自棒状杆菌(Corynebacterium)属微生物，具体地源自谷氨酸棒状杆菌。源自谷氨酸棒状杆菌的乙酰羟酸合酶的大亚基ilvB蛋白可以是例如包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白质。包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白质可以与具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白质或由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的蛋白质可互换地使用。
进一步，尽管本公开中的乙酰羟酸合酶的大亚基ilvB蛋白被定义为包括SEQ IDNO:1的氨基酸序列的蛋白质，但其不排除可通过在SEQ ID NO:1的氨基酸序列的上游或下游添加无意义序列而发生的突变、天然发生的突变或沉默突变，并且对于本领域技术人员而言显而易见的是，只要蛋白质具有与包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白质相同或相应的活性，则其相应于本公开的乙酰羟酸合酶的大亚基ilvB蛋白。作为具体实例，本公开的乙酰羟酸合酶的大亚基ilvB蛋白可以是由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的蛋白质，或者是由与其具有80％、90％、95％、97％或99％或更高同源性或同一性的氨基酸序列组成的蛋白质。另外，明显的是，具有在部分序列中具有缺失、修饰、取代或添加的氨基酸序列的任何蛋白质可以也被包括在本公开中待突变到蛋白质的范围内，只要氨基酸序列具有上述同源性或同一性，并呈现与该蛋白质相应的功效。
换言之，尽管在本公开中被描述为“具有特定SEQ ID NO的氨基酸序列的蛋白质或多肽”或“由特定SEQ ID NO的氨基酸序列组成的蛋白质或多肽”，但明显的是，具有在部分序列中具有缺失、修饰、取代或添加的氨基酸序列的任何蛋白质也可以用于本公开，只要该蛋白质可以具有与由相应SEQ ID NO的氨基酸序列组成的多肽相同或相应的活性。例如，明显的是，任何多肽可以属于“由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的多肽”，只要其与“由SEQID NO:1的氨基酸序列组成的多肽”具有相同或相应的活性。
本公开中提供的具有乙酰羟酸合酶活性的蛋白质变体可以指代通过在上述具有乙酰羟酸合酶活性的蛋白质中的特定位置取代氨基酸而使乙酰羟酸合酶活性与修饰前的蛋白质相比超过100％的变体，或L-异亮氨酸或其类似物造成的反馈抑制被释放的变体。
如本文所用，术语“变体”指代这样的蛋白质：其保守取代和/或修饰的一个或多个氨基酸与限定序列不同，但其保留蛋白质的功能或性质。变体与确定的序列的区别在于取代、缺失或添加若干氨基酸。这种变体可以总体上通过修饰蛋白质的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸和评价修饰蛋白质的性质来确定。
换言之，变体的能力与天然蛋白质相比可以增加、不变或降低。其它变体可以包括其中已从成熟蛋白质的N端和/或C端去除一部分的变体。术语“变体”可以与诸如修饰体、修饰蛋白质、修饰多肽、突变体、突变蛋白、分歧体(divergent)、变体等术语可互换地使用，并且该术语不受限制，只要其以修饰义被使用。关于本公开的目的，变体可以是与天然野生型或未修饰蛋白质相比，蛋白质活性被增加或反馈抑制被释放的变体，但不限于此。
如本文所用，术语“保守取代”意为一种氨基酸被具有相似结构和/或化学性质的另一种氨基酸取代。这种氨基酸取代可以总体上基于残基的极性、电荷(碱性/酸性)、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性进行。
进一步，变体可以包括对多肽的性质和二级结构具有最小影响的氨基酸缺失或添加。例如，多肽可以在蛋白质的N端缀合至信号(或前导)序列，其共翻译或翻译后指导蛋白质的转移。另外，多肽还可以与另一序列或连接体缀合，以用于多肽的鉴定(识别，identification)、纯化或合成。
“用另一氨基酸取代”不受限制，只要另一氨基酸是与取代前的氨基酸不同的氨基酸。即，取代不受限制，只要从SEQ ID NO:1的氨基酸序列的N端起第136位氨基酸谷氨酰胺被除谷氨酰胺以外的氨基酸残基取代。同时，在本公开中，当使用术语“特定氨基酸被取代”时，明显的是，氨基酸被与取代前的氨基酸不同的氨基酸取代，即使没有单独指出该氨基酸被另一氨基酸取代。
可选地，蛋白质变体可以是这样的变体：其中从SEQ ID NO:1的氨基酸序列的N端起第136位氨基酸被天冬酰胺、精氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、赖氨酸、缬氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸或色氨酸取代，但不限于此。
如述，本公开的蛋白质变体与修饰前的蛋白质相比具有增强的乙酰羟酸合酶活性。
显而易见的是，从SEQ ID NO:1的序列的N-末端起第136位氨基酸被另一氨基酸取代的本公开的蛋白质变体包括其中相应于第136位的位置的氨基酸被另一氨基酸取代的蛋白质。
从SEQ ID NO:1的序列的N端起第136位氨基酸被另一氨基酸取代的蛋白质变体可以包括SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ IDNO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ IDNO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62或SEQID NO:63的氨基酸序列，具体地可以主要由SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ IDNO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:63的氨基酸序列中的任一者组成，更具体地可以由SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ IDNO:62和SEQ ID NO:63的氨基酸序列中的任一者组成，但不限于此。
进一步，蛋白质变体可以包括SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQID NO:61、SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:63中的任一种氨基酸序列，或者可以包括与SEQ IDNO:1的氨基酸序列具有80％或更高同源性或同一性的氨基酸序列，条件是从SEQ ID NO:1的氨基酸序列的N端起第136位氨基酸不变，但不限于此。具体地，本公开的变体多肽可以包括与SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ IDNO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ IDNO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62和SEQID NO:63中的任一种氨基酸序列，以及与SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQID NO:61、SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:63中的任一种氨基酸序列具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源性或同一性的多肽。进一步，显而易见的是，除了第136位氨基酸外其中还有部分被缺失(删除，deleted)、修饰、取代或添加的氨基酸序列的任何蛋白质也可以在本公开的范围内，只要该蛋白质具有这种同源性或同一性，并呈现与上述蛋白质相应的功效。
如本文所用，术语“同源性”或“同一性”指代两个给定氨基酸序列或核苷酸序列之间的匹配程度，并且可以以百分比表示。术语“同源性”和“同一性”可以通常被彼此可互换地使用。保守多核苷酸或多肽的序列同源性或同一性可以通过标准比对算法确定，并且可以与由所用程序建立的默认空位罚分(default gap penalties)联用。基本上，同源性或同一性序列可以在中等或高度严格条件下杂交，使得序列全长或全长的至少约50％、60％、70％、80％或90％或更多可以杂交。另外，考虑含有简并密码子代替杂交中的密码子的多核苷酸。
任何两个多核苷酸或多肽序列是否具有同源性、相似性或同一性可以利用已知的计算机算法如“FASTA”程序，利用例如如Pearson et al.(1988)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA85]:2444中的默认参数确定，或利用Needleman–Wunsch算法(Needleman and Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443–453)——如在EMBOSS包(EMBOSS:TheEuropean Molecular Biology Open Software Suite,Rice et al.,2000,TrendsGenet.16:276–277)(5.0.0或更新版本)(包括GCG程序包)(Devereux,J.et al.,NucleicAcids Research 12:387(1984))的Needleman程序中实施、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul,[S.][F.,][ET AL,J MOLEC BIOL 215]:403(1990)；Guide to Huge Computers,Martin J.Bishop,[ED.,]Academic Press,San Diego,1994和[CARILLO ETA/.](1988)SIAM J Applied Math 48:1073)确定。例如，National Center for BiotechnologyInformation数据库的BLAST或ClustalW可用于确定同源性、相似性或同一性。
多核苷酸或多肽的同源性、相似性或同一性可以例如通过比较序列信息被确定——利用GAP计算机程序如Needleman et al.(1970),J Mol Biol.48:443，如Smith andWaterman,Adv.Appl.Math(1981)2:482所公开。简而言之，GAP程序将相似性定义为相似的被比对的符号(即，核苷酸或氨基酸)的数量除以两个序列中的较短者中的符号总数。GAP程序的默认参数可以包括：(1)一元比较矩阵(包含数值1表示同一性，0表示非同一性)和Gribskov et al.(1986)Nucl.Acids Res.14:6745的加权比较矩阵，如Schwartz和Dayhoff,eds.,Atlas Of Protein Sequence And Structure,National BiomedicalResearch Foundation,pp.353–358(1979)所公开(或EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)替代矩阵)；(2)每个空位3.0罚分，并且每个空位中的每个符号另外0.10罚分(或空位开口罚分(gap open penalty)10，空位延长罚分(gap extension penalty)0.5)；和(3)末端空位无罚分。
进一步，任何两个多核苷酸或多肽序列是否具有同源性、相似性或同一性可以通过在限定的严格条件下通过Southern杂交实验比较序列来确定，并且限定的合适的杂交条件可以在本领域的技术范围内并且可以通过本领域技术人员公知的方法确定(例如，J.Sambrook et al.,Molecular Cloning,ALaboratory Manual,第2版，Cold SpringHarbor Laboratory press,Cold Spring Harbor,New York,1989；F.M.Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.,New York)。
本公开的另一方面提供了编码蛋白质变体的多核苷酸。
如本文所用，术语“多核苷酸”指代具有预定长度或更长的DNA或RNA链，其是通过经由共价键连接核苷酸单体而形成的核苷酸长链聚合物。更具体地，多核苷酸指代编码蛋白质变体的多核苷酸片段。
编码本公开的蛋白质变体的多核苷酸可以非限制地包括任何多核苷酸序列，只要其是编码具有乙酰羟酸合酶活性的蛋白质变体的多核苷酸序列。
在本公开中，编码具有乙酰羟酸合酶活性的蛋白质的氨基酸序列的基因可以是ilvB基因，并且可以源自谷氨酸棒状杆菌。具体地，该基因可以是编码SEQ ID NO:1的氨基酸序列的核苷酸序列，但不限于此。
具体地，编码本公开的蛋白质变体的多核苷酸可以非限制地包括任何多核苷酸序列，只要其编码其中SEQ ID NO:1的氨基酸序列中第136位氨基酸被另一氨基酸取代的蛋白质变体。例如，本公开的多核苷酸可以是这样的多核苷酸序列：编码本公开的蛋白质变体，具体地，包括SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ IDNO:62和SEQ ID NO:63中的任一种氨基酸序列的蛋白质，或与其具有同源性或同一性的多肽，但不限于此。同源性或同一性与上述相同。
另外，在编码蛋白质变体的多核苷酸中，可以在编码区中进行各种修饰，条件是其不改变多肽的氨基酸序列——由于密码子简并性或考虑到将表达该多肽的生物体所优选的密码子。
进一步，编码蛋白质变体的多核苷酸可以非限制地包括可以由已知核苷酸序列产生的探针，例如，任何探针，只要其包括这样的序列：在严格条件下与该多核苷酸序列的全部或部分的互补序列杂交，以编码其中另一氨基酸取代SEQ ID NO:1的氨基酸序列中第136位氨基酸的蛋白质变体。
术语“严格条件”意为允许多核苷酸之间特异性杂交的条件。这种条件在文献中被详细描述(例如，J.Sambrook et al.，同上)。例如，严格条件可以包括具有高同源性——40％或更高、具体地90％或更高、更具体地95％或更高、更具体地97％或更高、特别具体地99％或更高同源性——的基因彼此杂交、以及同源性低于上述同源性的基因不彼此杂交的条件、或Southern杂交的常规洗涤条件，即在60℃1X SSC,0.1％SDS，具体地60℃0.1X SSC,0.1％SDS，以及更具体地68℃0.1X SSC,0.1％SDS的相应盐浓度和温度下洗涤一次，具体地两次或三次。然而，严格条件不限于此，并且可以由本领域普通技术人员根据目的适当地控制。
尽管由于杂交的严格性可能发生核苷酸之间的错配，但要求两个多核苷酸具有互补序列。术语“互补”用于描述可以彼此杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，对于DNA，腺嘌呤与胸腺嘧啶互补，胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本公开不仅可以包括基本上相似的多核苷酸序列，还可以包括与整个序列互补的分离的多核苷酸片段。
具体地，具有同源性的多核苷酸可以利用杂交条件来检测，包括55℃的Tm值℃下杂交和上述条件。另外，Tm值可以为60℃、63℃或65℃，但不限于此，并且可以由本领域普通技术人员根据目的适当地控制。
多核苷酸杂交的适当严格性取决于多核苷酸的长度和互补程度，并且变量是本领域公知的(参见Sambrook et al.，同上，9.50-9.51、11.7-11.8)。
本公开的再另一方面提供了包括编码蛋白质变体的多核苷酸的载体。
如本文所用，术语“载体”指代DNA构建体，其包括编码目标蛋白质的多核苷酸的核苷酸序列，该核苷酸序列与适当的调控序列可操作地连接以能够实现目标蛋白质在适当宿主细胞中的表达。调控序列可以包括能够启动转录的启动子、用于调控这种转录的任何操纵子序列、编码适当mRNA核糖体结合结构域的序列以及调控转录和翻译终止的序列。在载体被转化到适当的宿主细胞后，其可以独立于宿主基因组进行复制或发挥作用，并且可以被整合到基因组本身中。
如本文所用，术语“可操作地连接”意为启动和介导编码本公开的目标蛋白质的多核苷酸的转录的启动子序列与多核苷酸序列之间的功能性连接。可操作的连接可以利用本领域已知的基因重组技术制备，并且位点特异性DNA切割和连接可以利用本领域已知的用于切割和连接的酶等制备，但不限于此。
本公开中使用的载体没有特别限制，只要其能够在宿主细胞中复制，并且可以使用本领域已知的任何载体。常用载体的实例可以包括天然或重组质粒、粘粒、病毒和噬菌体。例如，pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A、Charon21A等可以用作噬菌体载体或粘粒载体。作为质粒载体，可以使用pBR型、pUC型、pBluescriptII型、pGEM型、pTZ型、pCL型、pET型等。具体地，可以使用pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BAC载体等。
例如，可以利用用于细胞内染色体插入的载体，由突变多核苷酸替换染色体中编码目标蛋白质的多核苷酸。多核苷酸的染色体插入可以通过本领域已知的任何方法进行，例如同源重组，但不限于此。可以进一步包括选择标记以确认染色体插入。选择标记将选择用载体转化的细胞，即确认目标核酸分子的插入，并且选择标记可以包括提供可选择表型如耐药性、营养缺陷型、细胞毒剂耐性或表面蛋白表达的标记。由于只有表达选择标记的细胞能够在用选择剂处理的环境下存活或显示不同的表型，转化的细胞可以被选择。
如本文所用，术语“转化”意为包括编码目标蛋白质的多核苷酸的载体被引入宿主细胞，使得由该多核苷酸编码的蛋白质在宿主细胞中表达。只要转化的多核苷酸可以在宿主细胞中表达，则转化的多核苷酸可以被整合和布置在宿主细胞的染色体中还是其可以在染色体外存在是无关紧要的。进一步，多核苷酸包括编码目标蛋白质的DNA和RNA。多核苷酸可以以任何形式被引入，只要其可以被引入宿主细胞中并在其中表达。例如，多核苷酸可以以表达盒的形式被引入宿主细胞中，该表达盒是包括其自主表达所需的所有元件的基因构建体。通常，表达盒可以包括与多核苷酸可操作地连接的启动子、转录终止信号、核糖体结合位点和翻译终止信号。表达盒可以是可自复制的表达载体的形式。另外，多核苷酸可以被原样引入宿主细胞中并被可操作地连接至宿主细胞中表达所需的序列，但不限于此。转化方法包括将多核苷酸引入细胞的任何方法，并且可以通过根据宿主细胞选择本领域已知的合适标准技术来进行。例如，方法可以包括电穿孔、钙磷酸盐(Ca(H2PO4)2、CaHPO4或Ca3(PO4)2)沉淀、氯化钙(CaCl2)沉淀、微注射、聚乙二醇(PEG)法、DEAE-葡聚糖法、阳离子脂质体法、乙酸锂-DMSO法等，但不限于此。
本公开的再另一方面提供了包括具有乙酰羟酸合酶活性的蛋白质变体的微生物。具体地，该微生物可以是生产L-异亮氨酸的微生物，其表达本公开的具有乙酰羟酸合酶活性的蛋白质变体。
如本文所用，术语“允许被表达/待表达/表达的蛋白质”指代目标蛋白质被引入微生物或被修饰以将在微生物中被表达的状态。当目标蛋白质是存在于微生物中的蛋白质时，这意为其活性与内源活性或修饰前的活性相比增强的状态。关于本公开的目的，“目标蛋白质”可以是上述具有乙酰羟酸合酶活性的蛋白质的变体。
具体地，“蛋白质的引入”意为微生物呈现原来不具有的具体蛋白质的活性，或呈现与相应蛋白质的内源活性或修饰前的活性相比增强的活性。例如，可以将编码具体蛋白质的多核苷酸引入微生物的染色体中，或者可以将含有编码具体蛋白质的多核苷酸的载体引入微生物中以呈现其活性。进一步，“活性增强”意为微生物的具体蛋白质活性与其内源活性或修饰前的活性相比增强，或者对具体蛋白质的反馈抑制效应被释放，因此与其内源活性或修饰前的活性相比活性不被抑制。“内源活性”指代，当微生物的性状因天然或人为因素引起的遗传变异而改变时，母体菌株在转化前原来具有的具体蛋白质的活性。
具体地，本公开中的活性增强可以通过选自下列的任一种方法实现：修饰多核苷酸序列的方法，如增加细胞中编码目标蛋白质的多核苷酸的拷贝数的方法、在编码目标蛋白质的多核苷酸的表达调控序列中引入修饰的方法、用具有强活性的序列取代编码目标蛋白质的多核苷酸的表达调控序列的方法、用编码具有增强活性的蛋白质变体的多核苷酸取代染色体上编码目标蛋白质的多核苷酸的方法、或另外引入突变的方法；以及将蛋白质变体引入微生物的方法，但不限于此。编码目标蛋白质的多核苷酸可以指代目标基因。
在上述中，多核苷酸的拷贝数增加，虽然没有特别限制，可以在与载体可操作地连接的状态下进行，或者通过被插入宿主细胞内的染色体中进行。具体地，该方法可以通过下列来执行：将载体引入宿主细胞，该载体与编码本公开的蛋白质的多核苷酸可操作地连接，并且可以独立于宿主复制和发挥作用；或将载体引入宿主细胞的染色体，该载体与多核苷酸可操作地连接并能够将多核苷酸插入宿主细胞的染色体中。多核苷酸在染色体中的插入可以利用本领域已知的方法，例如通过同源重组。
接下来，用于增加多核苷酸表达的表达调控序列的修饰，虽然并不特别限于此，可以通过以下进行：经由缺失、插入、非保守或保守取代或其组合在多核苷酸序列中引起修饰从而进一步增强表达调控序列的活性，或用具有较强活性的核苷酸序列替换该多核苷酸序列。表达调控序列可以包括但不具体限于启动子、操纵子序列、编码核糖体结合结构域的序列、调控转录和翻译终止的序列等。
用具有较强活性的核苷酸序列替换以进一步增强表达调控序列的活性是连接较强的启动子，代替原始启动子，但不限于此。已知的强启动子的实例可以包括cj1至cj7启动子(韩国专利号10-0620092)、lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、λ噬菌体PR启动子、PL启动子、tet启动子、gapA启动子、SPL7启动子、SPL13(sm3)启动子(韩国专利号10-1783170)、O2启动子(韩国专利号10-1632642)、tkt启动子、yccA启动子等，但启动子不限于此。
另外，染色体上多核苷酸序列的修饰，虽然并不特别限于此，可以通过以下进行：经由缺失、插入、非保守或保守取代或其组合引起表达调控序列的修饰从而进一步增强多核苷酸序列的活性，或用经改进以具有较强活性的多核苷酸序列替换该多核苷酸序列。
蛋白质活性的这种引入和增强可以使相应蛋白质的活性或浓度相对于野生型或未修饰微生物菌株的蛋白质活性或浓度增加从至少1％、10％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、300％、400％或500％至最大1,000％或2,000％，但不限于此。
如本文所用，术语“生产L-异亮氨酸的微生物”指代，与野生型或未修饰的微生物相比，能够由培养基中的碳源生产大量L-异亮氨酸的微生物。进一步，生产L-异亮氨酸的微生物可以是重组微生物。具体地，微生物的种类没有特别限制，只要其能够生产L-异亮氨酸，并且微生物可以是属于肠杆菌(Enterobacter)属、埃希氏菌(Escherichia)属、欧文氏菌(Erwinia)属、沙雷氏菌(Serratia)属、普罗威登斯菌(Providencia)属、棒状杆菌属或短杆菌属(Brevibacterium)的微生物。更具体地，微生物可以是属于棒状杆菌属或埃希氏菌属的微生物。
更具体地，属于埃希氏菌属的微生物可以是大肠杆菌，并且属于棒状杆菌属的微生物可以是谷氨酸棒状杆菌。然而，属于棒状杆菌属或埃希氏属的任何微生物可以被无限制地使用，只要通过引入或增强具有乙酰羟酸合酶活性的蛋白质可以增加其L-异亮氨酸生产力。
在本公开中，被修饰以表达具有乙酰羟酸合酶活性的蛋白质的生产L-异亮氨酸的微生物的母体菌株没有特别限制，只要其是生产L-异亮氨酸的微生物。生产L-异亮氨酸的微生物可以是天然微生物本身或已被通过插入与L-异亮氨酸产生机制相关的外源基因或通过增强或灭活内源基因的活性而具有改善的L-异亮氨酸生产力的微生物。
本公开的再另一方面提供了生产L-异亮氨酸的方法，该方法包括在培养基中培养生产L-异亮氨酸的微生物，该微生物表达具有乙酰羟酸合酶活性的蛋白质变体。
L-异亮氨酸、包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列的具有乙酰羟酸合酶活性的蛋白质、该蛋白质的表达以及微生物与上述相同。
如本文所用，“L-异亮氨酸”可以包括L-异亮氨酸本身及其盐。
如本文所用，术语“培养”指代使微生物在适当控制的环境条件下生长。本公开的培养过程可以根据本领域已知的适当培养基和培养条件进行。培养过程可以容易由本领域技术人员根据所要选择的菌株调整以供使用。具体地，培养可以以分批、连续或补料分批模式进行，但不限于此。
如本文所用，术语“培养基”指代这样的物质：其中培养微生物所需的营养物质被混合作为主要成分，并且其提供营养物质和生长因子，包括生存和发育所必需的水。具体地，用于培养本公开的微生物的培养基和其它培养条件可以被无特别限制地使用，只要其常用于培养微生物。本公开的微生物可以在有氧条件下在含有适当碳源、氮源、磷源、无机化合物、氨基酸和/或维生素的常见培养基中培养，同时控制温度、pH等。
在本公开中，碳源可以包括碳水化合物，如葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖等；糖醇，如甘露醇、山梨醇等；有机酸，如丙酮酸、乳酸、柠檬酸等；以及氨基酸，如谷氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸等。另外，天然有机营养物质如淀粉水解物、糖蜜、黑带糖蜜(blackstrap molasses)、米糠、木薯、甘蔗糖蜜、玉米浆液(corn steep liquor)等，具体地，可以使用碳水化合物，如葡萄糖和无菌预处理糖蜜(即转化为还原糖的糖蜜)等。此外，可以非限制地以适当量使用各种其它碳源。这些碳源可以单独使用或其两种或更多种组合使用，但不限于此。
氮源可以包括无机氮源，如氨、硫酸铵、氯化铵、乙酸铵、磷酸铵、碳酸铵、硝酸铵等；氨基酸，如谷氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺等；和有机氮源，如蛋白胨、NZ-胺、肉提取物、酵母提取物、麦芽提取物、玉米浆液、酪蛋白水解物、鱼或其分解产物、脱脂豆饼或其分解产物等。这些氮源可以单独使用或其两种或更多种组合使用，但不限于此。
磷源可以包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、相应的含钠盐等。无机化合物可以包括氯化钠、氯化钙、氯化铁、硫酸镁、硫酸锰、碳酸钙等，并且另外地，可以包括氨基酸、维生素和/或合适的前体。这些组分或前体可以以分批或连续模式被添加至培养基中，但不限于此。
在本公开中，可以在微生物培养期间通过向培养基以适当方式添加诸如氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸、硫酸等化合物来调节培养基的pH。另外，在培养期间，可以使用消泡剂如脂肪酸聚乙二醇酯来抑制泡沫的形成。另外，可以将氧气或含氧气体注入培养基中以保持培养基的有氧状态；或者可以注入氮气、氢气或二氧化碳气体，或者可以不注入气体，以保持无氧或微氧状态，但培养不限于此。
培养基的温度可以为20℃至50℃，具体地30℃至37℃，但不限于此。培养可以持续直至获得期望产量的有用材料，具体地培养10小时至100小时，但不限于此。
生产方法可以进一步包括，根据培养，从培养基或微生物收集L-异亮氨酸。
L-异亮氨酸的收集可以通过以下进行：根据本公开的培养微生物的方法，例如分批、连续、补料分批方法等，利用本领域已知的适当方法，从培养基收集期望的L-异亮氨酸。例如，可以采用离心、过滤、用蛋白质结晶沉淀剂处理(盐析法)、萃取、超声、超滤、透析、各种色谱法，例如分子筛色谱法(凝胶过滤)、吸附色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法等、HPLC及其组合，但收集不限于此。
生产方法可以包括纯化过程。纯化过程可以通过利用本领域已知的适当方法进行以纯化收集的L-异亮氨酸。
本公开的再另一方面提供了增加L-异亮氨酸生产力的方法，该方法包括修饰微生物以表达具有乙酰羟酸合酶活性的蛋白质变体，其中SEQ ID NO:1的氨基酸序列中第136位氨基酸被另一氨基酸取代。
本公开的再另一方面提供了蛋白质变体用于增加L-异亮氨酸生产力的用途。
蛋白质变体和另一氨基酸与上述相同。
[有利效果]
当培养包括本公开的乙酰羟酸合酶变体的微生物时，可以以高产率生产L-异亮氨酸。因此，从工业角度来看，可以预期生产方便和生产成本降低的效果。
[具体实施方式]
在下文中，将参考以下实施例更详细地描述本公开。然而，这些实施例仅用于示例目的，并且本公开的范围不意图受这些实施例限制。
实施例1.通过人工诱变选择随机突变菌株
在本实施例中，为了获得具有增强的L-异亮氨酸生产能力的微生物突变菌株，以下列方式诱导微生物中的突变。
首先，为了在野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032菌株中引入ilvA(F383A)突变以释放L-苏氨酸脱水酶(ilvA)(作为异亮氨酸生物合成中重要的酶)的反馈抑制，制备SEQ IDNO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74和SEQ ID NO:75的引物。
利用谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032的基因组DNA作为模板以及SEQ ID NO:72和73及SEQ ID NO:74和SEQ ID NO:75的引物进行PCR。PCR利用PfuUltraTM高保真DNA聚合酶(Stratagene)进行，并且PCR条件如下：25个循环的在95℃下变性30秒，在55℃下退火30秒，以及在72℃下聚合1分钟。结果是，获得ilvA基因上游区的1,000bp DNA片段和ilvA基因下游区的1,000bp DNA片段，并且将各扩增产物利用QIAGEN的PCR纯化试剂盒纯化，并作为插入DNA片段用于载体构建。在用限制酶smaI处理后，将在65℃下热处理20分钟的pDZ载体(韩国专利号0924065)和DNA片段以1:2的摩尔浓度(M)利用Infusion Cloning试剂盒(TaKaRa)按照所提供的手册克隆，从而构建pDZ-F383A载体，用于在染色体上引入F383A突变。
通过电穿孔将构建的载体转化到谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032中。通过二次杂交过程(secondary crossover process)，获得其中染色体上各突变碱基被取代的菌株。取代是否恰当地发生主要利用以下引物组合和突变等位基因特异性扩增(Mutant AlleleSpecific Amplification)(MASA)PCR技术(Takeda et al.,Hum.Mutation,2,112–117(1993))、通过选择通过突变序列相应的引物组合(SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:76)而扩增的菌株来确定，并且所选菌株的ilvA序列利用SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:78的引物组合二次确认该突变序列来分析。
接下来，为制备其中hom(R407H)(韩国专利号10-1996769)突变被另外引入ilvA(F383A)突变引入菌株中的菌株，制备SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66和SEQID NO:67的引物。
利用从谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032提取的基因组DNA作为模板以及SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:67的引物进行PCR。PCR利用PfuUltraTM高保真DNA聚合酶(Stratagene)进行，并且PCR条件如下：25个循环的在95℃下变性30秒，在55℃下退火30秒，以及在72℃下聚合1分钟。结果是，获得hom基因上游区的1,000bp DNA片段和hom基因下游区的1,000bp DNA片段，并且将各扩增产物利用QIAGEN的PCR纯化试剂盒纯化，并作为插入DNA片段用于载体构建。同时，在用限制酶smaI处理后，将在65℃下热处理20分钟的pDZ载体(韩国专利号0924065)和通过PCR扩增的插入DNA片段以1:2的摩尔浓度(M)利用Infusion Cloning试剂盒(TaKaRa)按照所提供的手册克隆，从而构建pDZ-R407H载体，用于在染色体上引入R407H突变。
通过电穿孔将构建的载体转化到谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032ilvA(F383A)中。通过二次交联过程，获得染色体上各突变碱基被取代的菌株。取代是否恰当地发生主要利用以下引物组合和突变等位基因特异性扩增(MASA)PCR技术(Takeda et al.,Hum.Mutation,2,112–117(1993))、通过选择通过突变序列相应的引物组合(SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:69)而扩增的菌株来确定，并且所选菌株的hom序列利用SEQ ID NO:70和SEQ ID NO:71的引物组合二次确认该突变序列来分析。
具体地，将母体菌株谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032hom(R407H)ilvA(F383A)在活化培养基中培养16小时，并将活化的菌株接种到在121℃下灭菌15分钟的种子培养基中，并培养14小时，并收集5mL培养物。将收集的培养物用100mM柠檬酸缓冲剂洗涤，并向其添加N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(NTG)至最终浓度200mg/L并处理20分钟，并且用100mM磷酸盐缓冲剂洗涤。将用NTG处理的菌株铺平(plated)在最低限度培养基上并计算死亡率，结果是，死亡率为85％。将存活的细胞在种子培养基中接种并培养，并且最终选择显示优越的异亮氨酸生产能力的突变菌株，并命名为谷氨酸棒状杆菌CJILE-42(CJILE-42)。
实施例1中使用的培养基的组成如下：
<活化培养基>
牛肉提取物1％、聚蛋白胨1％、氯化钠0.5％、酵母提取物1％、琼脂2％，pH 7.2
<种子培养基>
葡萄糖5％、细菌用蛋白胨(Bactopeptone)1％、氯化钠0.25％、酵母提取物1％、尿素0.4％，pH 7.2
<最低限度培养基>
葡萄糖1.0％、硫酸铵0.4％、硫酸镁0.04％、磷酸二氢钾0.1％、尿素0.1％、硫胺素0.001％、生物素200μg/L、琼脂2％，pH 7.2
实施例2：考察生产L-异亮氨酸的随机突变菌株的L-异亮氨酸生产力
为考察实施例1中获得的突变菌株谷氨酸棒状杆菌CJILE-42的L-异亮氨酸生产力，通过下列方法培养菌株。将母体菌株和突变菌株各自接种到含有25mL生产培养基的250mL角挡烧瓶(corner-baffle flasks)中，并在32℃下在200rpm下在摇动培养箱中培养60小时以生产L-异亮氨酸。
实施例2中使用的生产培养基的组成如下：
<生产培养基>
葡萄糖10％、酵母提取物0.2％、硫酸铵1.6％、磷酸二氢钾0.1％、七水硫酸镁0.1％、七水硫酸亚铁10mg/L、一水硫酸锰10mg/L、生物素200μg/L，pH 7.2
培养完成后，利用高效液相色谱法(HPLC)测量L-异亮氨酸的产量，并且各菌株的培养基中的L-异亮氨酸浓度显示在下表1中。
[表1]
比较母体菌株与CJILE-42的L-异亮氨酸生产力
Figure BDA0003645644140000131
结果是，如表1所示，母体菌株谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032hom(R407H)ilvA(F383A)生产浓度0.2g/L的L-异亮氨酸，而根据本公开的突变菌株谷氨酸棒状杆菌CJILE-42生产浓度1.8g/L的L-异亮氨酸，表明与母体菌株相比L-异亮氨酸生产力增加约9倍或更多。
基于以上结果，对始自L-苏氨酸的L-异亮氨酸合成途径中的基因进行基因组测序。结果是，在呈现乙酰羟酸合酶(AHAS)活性的ilvBN的ilvB基因中观察到随机突变，并且此突变ilvB基因由SEQ ID NO:2表示。
由以上结果确认，通过随机诱变获得的突变菌株能够以高效率和高产率生产L-异亮氨酸，而没有反馈抑制。
实施例3：制备ilvBNC缺失菌株以比较乙酰羟酸合酶(AHAS)活性
为评价具有乙酰羟酸合酶(AHAS)活性的突变ilvB的活性，制备ilvBNC缺失菌株，其中该菌株由于缺少乙酰羟酸合酶(AHAS)活性不能将作为底物的丙酮酸(基)和2-酮丁酸(基)转化为2-乙酰-2-羟基乙酸(基)。虽然意图测量ilvB的活性，但ilvB、ilvC和ilvN基因的表达被统一调控，因为这三个基因在谷氨酸棒状杆菌中作为操纵子彼此相邻。因此，为使ilvBNC基因缺失，基于WT源ilvBNC基因的核苷酸序列信息设计了用于扩增ilvBNC基因的5'-上游区的引物对(SEQ ID NO:3和4)，以及用于扩增ilvBNC基因的3'-下游区的引物对(SEQ ID NO:5和6)。在SEQ ID NO:3和6的引物的各端，插入了XbaI限制位点(下划线)。各序列显示在下表2中。
[表2]
SEQ ID NO: 序列(5′–3′)
3 AT<u>TCTAGA</u>GGCCAAGAAGTCCGC
4 CTTGTTGCTGCTACACACATCGAGTTTCC
5 TGTAGCAGCAACAAGATTTTGGCAAAATG
6 AT<u>TCTAGA</u>GCCGAACGGCGCCCC
利用谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032hom(R407H)ilvA(F383A)的染色体作为模板以及SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的引物进行PCR。作为聚合酶，使用SolgTMPfu-X DNA聚合酶(SolGent co.,Ltd.)，并且PCR条件如下：在95℃下变性10分钟；30个循环的在95℃下变性，在56℃下退火和在72℃下聚合45秒；以及在72℃下聚合5分钟。结果是，获得ilvBNC基因的5'-上游区的500bp DNA片段和ilvBNC基因3'-下游区的500bp DNA片段。
利用扩增的两个DNA片段作为模板和SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:6的引物进行PCR。作为聚合酶，使用SolgTMPfu-X DNA聚合酶(SolGent co.,Ltd.)，并且PCR条件如下：在95℃下变性10分钟；30个循环的在95℃下变性，在56℃下退火和在72℃下聚合1分钟；以及在72℃下聚合5分钟。结果是，扩增了由于ilvBNC基因的缺失仅包括上游区和下游区的1,006bpDNA片段。
将pDZ载体和1,006bp DNA片段用限制酶XbaI处理，并利用DNA连接酶连接，然后克隆得到质粒，其被命名为pDZ-ΔilvBNC。
通过电脉冲方法将pDZ-ΔilvBNC载体引入谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032hom(R407H)ilvA(F383A)菌株中，然后在含有25mg/L卡那霉素的选择培养基中获得转化的菌株。获得WTΔilvBNC，其是通过二次交联过程将DNA片段插入染色体上而产生的ilvBNC基因缺失菌株。
实施例4：构建具有乙酰羟酸合酶(AHAS)活性的野生型ilvBNC质粒
为扩增编码乙酰羟酸合酶(AHAS)的基因(ilvBNC)，基于源自谷氨酸棒状杆菌ATCC13032hom(R407H)ilvA(F383A)的序列(SEQ ID NO:7)，在用于从启动子区域(自起始密码子上游约300bp)到终止子区域(自终止密码子下游约100bp)进行扩增的引物(SEQ ID NO:8和9)的两端插入BamHI限制位点(下划线)。相应序列显示在下表3中。
[表3]
SEQ ID NO: 序列(5′–3′)
8 TCC<u>GGATCC</u>TGACACACCATGACCATTATTC
9 TCC<u>GGATCC</u>CTTATGTACAAAGTGCACAGC
作为聚合酶，使用SolgTMPfu-X DNA聚合酶(SolGent co.,Ltd.)，并且PCR条件如下：在95℃下变性10分钟；30个循环的在95℃下变性30秒，在56℃下退火30秒，和在72℃下聚合4分钟；以及在72℃下聚合7分钟。结果是，获得ilvBNC基因编码区的4,010bp DNA片段。将pECCG117载体(韩国专利号10-0057684)和ilvBN DNA片段用限制酶BamHI处理，并利用DNA连接酶连接，然后克隆得到质粒，其被命名为pECCG117-ilvBNC WT。
实施例5：构建具有乙酰羟酸合酶(AHAS)活性的突变ilvBNC质粒
为比较生产大量L-异亮氨酸的突变ilvB的活性，设计用于扩增突变位点的5'-上游区的引物对(SEQ ID NO:8和10)和用于扩增突变位点的3'-下游区的引物对(SEQ ID NO:11和9)，以构建关于谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032hom(R407H)ilvA(F383A)源乙酰羟酸合酶(HAS)(SEQ ID NO:7)的编码ilvB基因的突变引入载体。将BamHI限制位点(下划线)插入SEQID NO:8和9的引物的各端。制备SEQ ID NO:10和11的引物，使得核苷酸取代突变(下划线)位于被设计以彼此交叉的位点。
[表4]
SEQ ID NO: 序列(5′–3′)
8 TCCGGATCCTGACACACCATGACCATTATTC
10 CTTC<u>gtt</u>GAAAGCGTCGGTACCCAG
11 CTTTC<u>aac</u>GAAGCCGATATCCGCGG
9 TCCGGATCCCTTATGTACAAAGTGCACAGC
利用谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032hom(R407H)ilvA(F383A)的染色体作为模板以及SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:9的引物进行PCR。作为聚合酶，使用SolgTMPfu-X DNA聚合酶(SolGent co.,Ltd.)，并且PCR条件如下：在95℃下变性10分钟；30个循环的在95℃下变性30秒，在56℃下退火30秒，和在72℃下聚合3分钟；以及在72℃下聚合5分钟。结果是，获得ilvBNC基因突变的5'-上游区的712bp DNA片段和ilvBNC基因突变的3'-下游区的3,310bp DNA片段。
利用扩增的两个DNA片段作为模板以及SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9的引物进行PCR。PCR条件如下：在95℃下变性10分钟；30个循环的在95℃下变性30秒，在56℃下退火30秒，和在72℃下聚合4分钟；以及在72℃下聚合7分钟。
结果是，扩增了4,010bp DNA片段，其包括编码乙酰羟酸合酶(AHAS)变体(SEQ IDNO:12)的突变ilvB基因(SEQ ID NO:2)，其中第136位的谷氨酰胺被天冬酰胺取代。
将pECCG117载体(韩国专利号10-0057684)和ilvBN DNA片段用限制酶BamHI处理，并利用DNA连接酶连接，然后克隆得到质粒，其被命名为pECCG117-ilvB(Q136N)NC。
实施例6：具有乙酰羟酸合酶(AHAS)活性的野生型和突变型ilvB的活性比较实验
通过电脉冲方法将实施例4和5中各自制备的pECCG117-ilvBNC WT和pECCG117-ilvB(Q136N)NC载体引入实施例3中制备的WTΔilvBNC菌株，然后各自铺平到含有25mg/L卡那霉素的选择培养基上，以获得转化体。
为比较如上制备的菌株的L-异亮氨酸生产力，将菌株通过下列方法培养，并分析培养基中L-异亮氨酸的浓度。
将一个铂环的各菌株接种到含有25mL下列培养基的250mL角挡烧瓶中，并在32℃下以200rpm在摇动培养箱中培养50小时。通过HPLC分析L-异亮氨酸的浓度，并且分析的浓度如表5所示。
<培养基组成(pH 7.0)>
葡萄糖100g、(NH4)2SO4 40g、大豆蛋白2.5g、玉米浆固体(Corn Steep Solids)5g、尿素3g、KH2PO4 1g、MgSO4·7H2O 0.5g、生物素100μg、硫胺素HCl 1,000μg、泛酸钙2,000μg、烟酰胺3,000μg、CaCO3 30g(基于1L蒸馏水)。
[表5]
Figure BDA0003645644140000161
参考上表5，与引入有对照ilvBNC WT质粒的菌株相比，引入有ilvB(Q136N)突变质粒的菌株显示L-异亮氨酸生产增加至少13倍。即，突变引入菌株具有增强的乙酰羟酸合酶(AHAS)活性，从而以高效率和高产率生产L-异亮氨酸。突变Q136N引入菌株被命名为CA10-3106。CA10-3106于2018年12月3日以登录号KCCM12415P被保藏在韩国微生物培养中心(Korean Culture Center of Microorganisms)，其乃布达佩斯条约规定的国际保藏机构。
KCCM11248P菌株是一种突变菌株(谷氨酸棒状杆菌KCJI-38、KCCM11248P；韩国专利号10-1335789)，其对谷氨酸棒状杆菌KFCC 11040(韩国专利公开号2000-0002407)中的L-苏氨酸衍生物α-氨基-β-羟基正缬氨酸和L-异亮氨酸衍生物4-硫代异亮氨酸和异亮氨酸-异羟肟酸显示共同抗性，并且该菌株被确认与谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032hom(R407H)ilvA(F383A)相比以高产率生产L-异亮氨酸。
为考察生产较大量L-异亮氨酸的菌株中的ilvB变体的效果，以与实施例3相同的方式制备KCCM11248PΔilvBNC菌株。进一步，通过电脉冲方法将分别在实施例4和5中制备的pECCG117-ilvBNC WT和pECCG117-ilvB(Q136N)NC载体引入谷氨酸棒状杆菌KCJI-38(KCCM11248P)——其乃具有增强的异亮氨酸生产能力的菌株，然后将其各自铺平到含有25mg/L卡那霉素的选择培养基上以得到转化体。
为比较如上制备的菌株的L-异亮氨酸生产力，以与实施例6相同的方式培养菌株。分析培养基中L-异亮氨酸的浓度，并且分析的浓度如表6所示。
[表6]
Figure BDA0003645644140000171
参考上表6，与引入有对照ilvBNC WT质粒的菌株相比，引入有ilvB(Q136N)突变质粒的菌株显示L-异亮氨酸生产增加约6倍。即，突变引入菌株具有增强的乙酰羟酸合酶(AHAS)活性，从而以高效率和高产率生产L-异亮氨酸。
实施例7：构建具有乙酰羟酸合酶(AHAS)活性的突变ilvBNC质粒
为考察实施例6中被确认为高L-异亮氨酸生产力相关的ilvB突变位点的第136位是增加生产力的重要位置，制备具有不同氨基酸取代的突变型，并确认其效果。另外制备17种突变体，每种突变体中ilvB的第136位氨基酸被另一氨基酸取代，并将实施例4中制备的质粒用作模板。各突变体中使用的对应突变体、取代氨基酸和引物显示在下表7中。
[表7]
Figure BDA0003645644140000172
Figure BDA0003645644140000181
具体地，利用表7中的引物进行PCR。作为聚合酶，使用SolgTMPfu-X DNA聚合酶(SolGent co.,Ltd.)，并且PCR条件如下：在95℃下变性10分钟；30个循环的在95℃下变性30秒，在56℃下退火30秒，和在72℃下聚合3分钟；以及在72℃下聚合5分钟。结果是，获得ilvB基因的5'-上游区的712bp DNA片段和ilvB基因的3'-下游区的3,310bp DNA片段。
利用扩增的两个DNA片段作为模板以及SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9的引物进行PCR。PCR条件如下：在95℃下变性10分钟；30个循环的在95℃下变性30秒，在56℃下退火30秒，和在72℃下聚合4分钟；以及在72℃下聚合7分钟。结果是，扩增了4,010bp DNA片段，各片段包括编码其中第136位谷氨酰胺被表7的各氨基酸取代的乙酰羟酸合酶(AHAS)变体的突变ilvB基因。将pECCG117载体(韩国专利号10-0057684)和通过PCR获得的各4,010bpilvBNC DNA片段用限制酶BamHI处理并利用DNA连接酶连接，然后克隆得到各质粒。结果是，制备了17种ilvB突变载体，各载体的第136位谷氨酰胺被表7的氨基酸取代，并被如表8中命名。
[表8]
Figure BDA0003645644140000191
实施例8：评价具有乙酰羟酸合酶(AHAS)活性的突变ilvB的L-异亮氨酸生产力
将实施例7中制备的17种突变质粒中的每一种通过电脉冲方法引入实施例3中制备的WTΔilvBNC菌株，然后各自铺平在含有25mg/L卡那霉素的选择培养基上以得到转化体。此后，以与实施例6相同的方式进行烧瓶测试。结果显示在下表9中。
[表9]
Figure BDA0003645644140000192
Figure BDA0003645644140000201
Figure BDA0003645644140000211
如表9所示，确认所有突变菌株——各在ilvB的第136位包括突变氨基酸——均野生型相比生产高水平的L-异亮氨酸。这些结果表明，ilvB的第136位氨基酸被另一氨基酸取代对于增加L-异亮氨酸生产力是重要的。
以上结果表明本公开的变体增加了L-异亮氨酸生产。
综上所述，本公开所属领域技术人员将能够理解，在不改变本公开的技术思路或基本特征的情况下，本公开可以以其它具体形式实施。关于这点，本文公开的示例性实施方式仅用于示例目的，而不应被解释为限制本公开的范围。相反，本公开旨在不仅涵盖示例性实施方式，而且涵盖由所附权利要求限定的本公开的精神和范围内可以包括的各种替代形式、修改、等效形式和其它实施方式。
国际保藏机构：韩国微生物培养中心
保藏号：KCCM12415P
保藏日期：20181203
Figure BDA0003645644140000231
<110> CJ第一制糖株式会社
<120> 新型乙酰羟酸合酶变体和包括其的微生物
<130> OPA20075-PCT
<150> KR 10-2019-0151672
<151> 2019-11-22
<160> 78
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 626
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 乙酰羟酸合酶, AHAS
<400> 1
Met Asn Val Ala Ala Ser Gln Gln Pro Thr Pro Ala Thr Val Ala Ser
1 5 10 15
Arg Gly Arg Ser Ala Ala Pro Glu Arg Met Thr Gly Ala Lys Ala Ile
20 25 30
Val Arg Ser Leu Glu Glu Leu Asn Ala Asp Ile Val Phe Gly Ile Pro
35 40 45
Gly Gly Ala Val Leu Pro Val Tyr Asp Pro Leu Tyr Ser Ser Thr Lys
50 55 60
Val Arg His Val Leu Val Arg His Glu Gln Gly Ala Gly His Ala Ala
65 70 75 80
Thr Gly Tyr Ala Gln Val Thr Gly Arg Val Gly Val Cys Ile Ala Thr
85 90 95
Ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu Val Thr Pro Ile Ala Asp Ala Asn
100 105 110
Leu Asp Ser Val Pro Met Val Ala Ile Thr Gly Gln Val Gly Ser Gly
115 120 125
Leu Leu Gly Thr Asp Ala Phe Gln Glu Ala Asp Ile Arg Gly Ile Thr
130 135 140
Met Pro Val Thr Lys His Asn Phe Met Val Thr Asn Pro Asn Asp Ile
145 150 155 160
Pro Gln Ala Leu Ala Glu Ala Phe His Leu Ala Ile Thr Gly Arg Pro
165 170 175
Gly Pro Val Leu Val Asp Ile Pro Lys Asp Val Gln Asn Ala Glu Leu
180 185 190
Asp Phe Val Trp Pro Pro Lys Ile Asp Leu Pro Gly Tyr Arg Pro Val
195 200 205
Ser Thr Pro His Ala Arg Gln Ile Glu Gln Ala Val Lys Leu Ile Gly
210 215 220
Glu Ala Lys Lys Pro Val Leu Tyr Val Gly Gly Gly Val Ile Lys Ala
225 230 235 240
Asp Ala His Glu Glu Leu Arg Ala Phe Ala Glu Tyr Thr Gly Ile Pro
245 250 255
Val Val Thr Thr Leu Met Ala Leu Gly Thr Phe Pro Glu Ser His Glu
260 265 270
Leu His Met Gly Met Pro Gly Met His Gly Thr Val Ser Ala Val Gly
275 280 285
Ala Leu Gln Arg Ser Asp Leu Leu Ile Ala Ile Gly Ser Arg Phe Asp
290 295 300
Asp Arg Val Thr Gly Asp Val Asp Thr Phe Ala Pro Asp Ala Lys Ile
305 310 315 320
Ile His Ala Asp Ile Asp Pro Ala Glu Ile Gly Lys Ile Lys Gln Val
325 330 335
Glu Val Pro Ile Val Gly Asp Ala Arg Glu Val Leu Ala Arg Leu Leu
340 345 350
Glu Thr Thr Lys Ala Ser Lys Ala Glu Thr Glu Asp Ile Ser Glu Trp
355 360 365
Val Asp Tyr Leu Lys Gly Leu Lys Ala Arg Phe Pro Arg Gly Tyr Asp
370 375 380
Glu Gln Pro Gly Asp Leu Leu Ala Pro Gln Phe Val Ile Glu Thr Leu
385 390 395 400
Ser Lys Glu Val Gly Pro Asp Ala Ile Tyr Cys Ala Gly Val Gly Gln
405 410 415
His Gln Met Trp Ala Ala Gln Phe Val Asp Phe Glu Lys Pro Arg Thr
420 425 430
Trp Leu Asn Ser Gly Gly Leu Gly Thr Met Gly Tyr Ala Val Pro Ala
435 440 445
Ala Leu Gly Ala Lys Ala Gly Ala Pro Asp Lys Glu Val Trp Ala Ile
450 455 460
Asp Gly Asp Gly Cys Phe Gln Met Thr Asn Gln Glu Leu Thr Thr Ala
465 470 475 480
Ala Val Glu Gly Phe Pro Ile Lys Ile Ala Leu Ile Asn Asn Gly Asn
485 490 495
Leu Gly Met Val Arg Gln Trp Gln Thr Leu Phe Tyr Glu Gly Arg Tyr
500 505 510
Ser Asn Thr Lys Leu Arg Asn Gln Gly Glu Tyr Met Pro Asp Phe Val
515 520 525
Thr Leu Ser Glu Gly Leu Gly Cys Val Ala Ile Arg Val Thr Lys Ala
530 535 540
Glu Glu Val Leu Pro Ala Ile Gln Lys Ala Arg Glu Ile Asn Asp Arg
545 550 555 560
Pro Val Val Ile Asp Phe Ile Val Gly Glu Asp Ala Gln Val Trp Pro
565 570 575
Met Val Ser Ala Gly Ser Ser Asn Ser Asp Ile Gln Tyr Ala Leu Gly
580 585 590
Leu Arg Pro Phe Phe Asp Gly Asp Glu Ser Ala Ala Glu Asp Pro Ala
595 600 605
Asp Ile His Glu Ala Val Ser Asp Ile Asp Ala Ala Val Glu Ser Thr
610 615 620
Glu Ala
625
<210> 2
<211> 1881
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ilvB变体n.t
<400> 2
gtgaatgtgg cagcttctca acagcccact cccgccacgg ttgcaagccg tggtcgatcc 60
gccgcccctg agcggatgac aggtgcaaag gcaattgttc gatcgctcga ggagcttaac 120
gccgacatcg tgttcggtat tcctggtggt gcggtgctac cggtgtatga cccgctctat 180
tcctccacaa aggtgcgcca cgtcttggtg cgccacgagc agggcgcagg ccacgcagca 240
accggctacg cgcaggttac tggacgcgtt ggcgtctgca ttgcaacctc tggcccagga 300
gcaaccaact tggttacccc aatcgctgat gcaaacttgg actccgttcc catggttgcc 360
atcaccggcc aggtcggaag tggcctgctg ggtaccgacg ctttcaacga agccgatatc 420
cgcggcatca ccatgccagt gaccaagcac aacttcatgg tcaccaaccc taacgacatt 480
ccacaggcat tggctgaggc attccacctc gcgattactg gtcgccctgg ccctgttctg 540
gtggatattc ctaaggatgt ccagaacgct gaattggatt tcgtctggcc accaaagatc 600
gacctgccag gctaccgccc agtttcaaca ccacatgctc gccagatcga gcaggcagtc 660
aagctgatcg gtgaggccaa gaagcccgtc ctttacgttg gtggtggcgt aatcaaggct 720
gacgcacacg aagagcttcg tgcgttcgct gagtacaccg gcatcccagt tgtcaccacc 780
ttgatggctt tgggtacttt cccagagtct cacgagctgc acatgggtat gccaggcatg 840
catggcactg tgtccgctgt tggtgcactg cagcgcagcg acctgctgat tgctatcggc 900
tcccgctttg atgaccgcgt caccggtgac gttgacacct tcgcgcctga cgccaagatc 960
attcacgccg acattgatcc tgccgaaatc ggcaagatca agcaggttga ggttccaatc 1020
gtgggcgatg cccgcgaagt tcttgctcgt ctgctggaaa ccaccaaggc aagcaaggca 1080
gagaccgagg acatctccga gtgggttgac tacctcaagg gcctcaaggc acgtttcccg 1140
cgtggctacg acgagcagcc aggcgatctg ctggcaccac agtttgtcat tgaaaccctg 1200
tccaaggaag ttggccccga cgcaatttac tgcgccggcg ttggccagca ccaaatgtgg 1260
gcagctcagt tcgttgactt tgaaaagcca cgcacctggc tcaactccgg tggactgggc 1320
accatgggct acgcagttcc tgcggccctt ggagcaaagg ctggcgcacc tgacaaggaa 1380
gtctgggcta tcgacggcga cggctgtttc cagatgacca accaggaact caccaccgcc 1440
gcagttgaag gtttccccat taagatcgca ctaatcaaca acggaaacct gggcatggtt 1500
cgccaatggc agaccctatt ctatgaagga cggtactcaa atactaaact tcgtaaccag 1560
ggcgagtaca tgcccgactt tgttaccctt tctgagggac ttggctgtgt tgccatccgc 1620
gtcaccaaag cggaggaagt actgccagcc atccaaaagg ctcgagagat caacgaccgc 1680
ccagtagtca tcgacttcat cgtcggtgaa gacgcacagg tatggccaat ggtgtctgct 1740
ggatcatcca actccgatat ccagtacgca ctcggattgc gcccattctt tgatggtgat 1800
gaatctgcag cagaagatcc tgccgacatt cacgaagccg tcagcgacat tgatgccgcc 1860
gttgaatcga ccgaggcata a 1881
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 3
attctagagg ccaagaagtc cgc 23
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 4
cttgttgctg ctacacacat cgagtttcc 29
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 5
tgtagcagca acaagatttt ggcaaaatg 29
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 6
attctagagc cgaacggcgc ccc 23
<210> 7
<211> 1881
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032 hom/ilvA变体
<400> 7
gtgaatgtgg cagcttctca acagcccact cccgccacgg ttgcaagccg tggtcgatcc 60
gccgcccctg agcggatgac aggtgcaaag gcaattgttc gatcgctcga ggagcttaac 120
gccgacatcg tgttcggtat tcctggtggt gcggtgctac cggtgtatga cccgctctat 180
tcctccacaa aggtgcgcca cgtcttggtg cgccacgagc agggcgcagg ccacgcagca 240
accggctacg cgcaggttac tggacgcgtt ggcgtctgca ttgcaacctc tggcccagga 300
gcaaccaact tggttacccc aatcgctgat gcaaacttgg actccgttcc catggttgcc 360
atcaccggcc aggtcggaag tggcctgctg ggtaccgacg ctttccagga agccgatatc 420
cgcggcatca ccatgccagt gaccaagcac aacttcatgg tcaccaaccc taacgacatt 480
ccacaggcat tggctgaggc attccacctc gcgattactg gtcgccctgg ccctgttctg 540
gtggatattc ctaaggatgt ccagaacgct gaattggatt tcgtctggcc accaaagatc 600
gacctgccag gctaccgccc agtttcaaca ccacatgctc gccagatcga gcaggcagtc 660
aagctgatcg gtgaggccaa gaagcccgtc ctttacgttg gtggtggcgt aatcaaggct 720
gacgcacacg aagagcttcg tgcgttcgct gagtacaccg gcatcccagt tgtcaccacc 780
ttgatggctt tgggtacttt cccagagtct cacgagctgc acatgggtat gccaggcatg 840
catggcactg tgtccgctgt tggtgcactg cagcgcagcg acctgctgat tgctatcggc 900
tcccgctttg atgaccgcgt caccggtgac gttgacacct tcgcgcctga cgccaagatc 960
attcacgccg acattgatcc tgccgaaatc ggcaagatca agcaggttga ggttccaatc 1020
gtgggcgatg cccgcgaagt tcttgctcgt ctgctggaaa ccaccaaggc aagcaaggca 1080
gagaccgagg acatctccga gtgggttgac tacctcaagg gcctcaaggc acgtttcccg 1140
cgtggctacg acgagcagcc aggcgatctg ctggcaccac agtttgtcat tgaaaccctg 1200
tccaaggaag ttggccccga cgcaatttac tgcgccggcg ttggccagca ccaaatgtgg 1260
gcagctcagt tcgttgactt tgaaaagcca cgcacctggc tcaactccgg tggactgggc 1320
accatgggct acgcagttcc tgcggccctt ggagcaaagg ctggcgcacc tgacaaggaa 1380
gtctgggcta tcgacggcga cggctgtttc cagatgacca accaggaact caccaccgcc 1440
gcagttgaag gtttccccat taagatcgca ctaatcaaca acggaaacct gggcatggtt 1500
cgccaatggc agaccctatt ctatgaagga cggtactcaa atactaaact tcgtaaccag 1560
ggcgagtaca tgcccgactt tgttaccctt tctgagggac ttggctgtgt tgccatccgc 1620
gtcaccaaag cggaggaagt actgccagcc atccaaaagg ctcgagagat caacgaccgc 1680
ccagtagtca tcgacttcat cgtcggtgaa gacgcacagg tatggccaat ggtgtctgct 1740
ggatcatcca actccgatat ccagtacgca ctcggattgc gcccattctt tgatggtgat 1800
gaatctgcag cagaagatcc tgccgacatt cacgaagccg tcagcgacat tgatgccgcc 1860
gttgaatcga ccgaggcata a 1881
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 8
tccggatcct gacacaccat gaccattatt c 31
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 9
tccggatccc ttatgtacaa agtgcacagc 30
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 10
cttcgttgaa agcgtcggta cccag 25
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 11
ctttcaacga agccgatatc cgcgg 25
<210> 12
<211> 626
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 乙酰羟酸合酶变体
<400> 12
Met Asn Val Ala Ala Ser Gln Gln Pro Thr Pro Ala Thr Val Ala Ser
1 5 10 15
Arg Gly Arg Ser Ala Ala Pro Glu Arg Met Thr Gly Ala Lys Ala Ile
20 25 30
Val Arg Ser Leu Glu Glu Leu Asn Ala Asp Ile Val Phe Gly Ile Pro
35 40 45
Gly Gly Ala Val Leu Pro Val Tyr Asp Pro Leu Tyr Ser Ser Thr Lys
50 55 60
Val Arg His Val Leu Val Arg His Glu Gln Gly Ala Gly His Ala Ala
65 70 75 80
Thr Gly Tyr Ala Gln Val Thr Gly Arg Val Gly Val Cys Ile Ala Thr
85 90 95
Ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu Val Thr Pro Ile Ala Asp Ala Asn
100 105 110
Leu Asp Ser Val Pro Met Val Ala Ile Thr Gly Gln Val Gly Ser Gly
115 120 125
Leu Leu Gly Thr Asp Ala Phe Asn Glu Ala Asp Ile Arg Gly Ile Thr
130 135 140
Met Pro Val Thr Lys His Asn Phe Met Val Thr Asn Pro Asn Asp Ile
145 150 155 160
Pro Gln Ala Leu Ala Glu Ala Phe His Leu Ala Ile Thr Gly Arg Pro
165 170 175
Gly Pro Val Leu Val Asp Ile Pro Lys Asp Val Gln Asn Ala Glu Leu
180 185 190
Asp Phe Val Trp Pro Pro Lys Ile Asp Leu Pro Gly Tyr Arg Pro Val
195 200 205
Ser Thr Pro His Ala Arg Gln Ile Glu Gln Ala Val Lys Leu Ile Gly
210 215 220
Glu Ala Lys Lys Pro Val Leu Tyr Val Gly Gly Gly Val Ile Lys Ala
225 230 235 240
Asp Ala His Glu Glu Leu Arg Ala Phe Ala Glu Tyr Thr Gly Ile Pro
245 250 255
Val Val Thr Thr Leu Met Ala Leu Gly Thr Phe Pro Glu Ser His Glu
260 265 270
Leu His Met Gly Met Pro Gly Met His Gly Thr Val Ser Ala Val Gly
275 280 285
Ala Leu Gln Arg Ser Asp Leu Leu Ile Ala Ile Gly Ser Arg Phe Asp
290 295 300
Asp Arg Val Thr Gly Asp Val Asp Thr Phe Ala Pro Asp Ala Lys Ile
305 310 315 320
Ile His Ala Asp Ile Asp Pro Ala Glu Ile Gly Lys Ile Lys Gln Val
325 330 335
Glu Val Pro Ile Val Gly Asp Ala Arg Glu Val Leu Ala Arg Leu Leu
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Val Asp Tyr Leu Lys Gly Leu Lys Ala Arg Phe Pro Arg Gly Tyr Asp
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385 390 395 400
Ser Lys Glu Val Gly Pro Asp Ala Ile Tyr Cys Ala Gly Val Gly Gln
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420 425 430
Trp Leu Asn Ser Gly Gly Leu Gly Thr Met Gly Tyr Ala Val Pro Ala
435 440 445
Ala Leu Gly Ala Lys Ala Gly Ala Pro Asp Lys Glu Val Trp Ala Ile
450 455 460
Asp Gly Asp Gly Cys Phe Gln Met Thr Asn Gln Glu Leu Thr Thr Ala
465 470 475 480
Ala Val Glu Gly Phe Pro Ile Lys Ile Ala Leu Ile Asn Asn Gly Asn
485 490 495
Leu Gly Met Val Arg Gln Trp Gln Thr Leu Phe Tyr Glu Gly Arg Tyr
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Pro Val Val Ile Asp Phe Ile Val Gly Glu Asp Ala Gln Val Trp Pro
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Met Val Ser Ala Gly Ser Ser Asn Ser Asp Ile Gln Tyr Ala Leu Gly
580 585 590
Leu Arg Pro Phe Phe Asp Gly Asp Glu Ser Ala Ala Glu Asp Pro Ala
595 600 605
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610 615 620
Glu Ala
625
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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cggcttcgaa gaaagcgtcg gtac 24
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<212> DNA
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cggcttcgca gaaagcgtcg gtac 24
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cgctttctgc gaagccgata tccgc 25
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cggcttctgg gaaagcgtcg gtac 24
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cggcttcgtg gaaagcgtcg gtac 24
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cgctttccac gaagccgata tccgc 25
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cggcttccag gaaagcgtcg gtac 24
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cgctttcctg gaagccgata tccgc 25
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<212> DNA
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cggcttcgat gaaagcgtcg gtac 24
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<220>
<223> 乙酰羟酸合酶变体
<400> 47
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<223> 乙酰羟酸合酶变体
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<220>
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Val Asp Tyr Leu Lys Gly Leu Lys Ala Arg Phe Pro Arg Gly Tyr Asp
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Asp Gly Asp Gly Cys Phe Gln Met Thr Asn Gln Glu Leu Thr Thr Ala
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545 550 555 560
Pro Val Val Ile Asp Phe Ile Val Gly Glu Asp Ala Gln Val Trp Pro
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Met Val Ser Ala Gly Ser Ser Asn Ser Asp Ile Gln Tyr Ala Leu Gly
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Leu Arg Pro Phe Phe Asp Gly Asp Glu Ser Ala Ala Glu Asp Pro Ala
595 600 605
Asp Ile His Glu Ala Val Ser Asp Ile Asp Ala Ala Val Glu Ser Thr
610 615 620
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625
<210> 63
<211> 626
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<220>
<223> 乙酰羟酸合酶变体
<400> 63
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Thr Gly Tyr Ala Gln Val Thr Gly Arg Val Gly Val Cys Ile Ala Thr
85 90 95
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225 230 235 240
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245 250 255
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275 280 285
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355 360 365
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370 375 380
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465 470 475 480
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625
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<220>
<223> 引物
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tcgagctcgg tacccgctca ctgaggacgc ttttgcac 38
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gaagagcgcg atgatgatgc acac 24
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<220>
<223> 引物
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tgatgatgca cacctgatcg tgg 23
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ggggatcctc tagaggacaa ggttttggaa gatgctcg 38
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tcgagctcgg tacccatgag tgaaacatac gtgtc 35
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<212> DNA
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<220>
<223> 引物
<400> 78
ttaggtcaag tattcgtact cag 23

Claims (10)

1.具有乙酰羟酸合酶(AHAS)活性的蛋白质变体，其中SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的第136位氨基酸谷氨酰胺被除谷氨酰胺以外的氨基酸取代。
2.根据权利要求1所述的具有乙酰羟酸合酶活性的蛋白质变体，其中所述第136位氨基酸被天冬酰胺、精氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、赖氨酸、缬氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸或色氨酸取代。
3.根据权利要求1所述的蛋白质变体，其中所述蛋白质变体包括SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ IDNO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ IDNO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62或SEQ ID NO:63的氨基酸序列。
4.多核苷酸，其编码根据权利要求1至3中任一项所述的蛋白质变体。
5.载体，其包括根据权利要求4所述的多核苷酸。
6.微生物，其包括根据权利要求1至3中任一项所述的蛋白质变体。
7.根据权利要求6所述的微生物，其中所述微生物生产L-异亮氨酸。
8.根据权利要求6所述的微生物，其中所述微生物属于棒状杆菌属(Corynebacteriumsp.)或埃希氏菌属(Escherichia sp.)。
9.生产L-异亮氨酸的方法，所述方法包括在培养基中培养根据权利要求6所述的微生物。
10.根据权利要求9所述的方法，进一步包括从培养的所述微生物或所述培养基收集L-异亮氨酸。
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