KR100264741B1

KR100264741B1 - 글루탐산을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 글루탐산의 제조방법

Info

Publication number: KR100264741B1
Application number: KR1019980023149A
Authority: KR
Inventors: 심재익; 박성식; 황순연; 고중환
Original assignee: 손경식; 제일제당주식회사
Priority date: 1998-06-19
Filing date: 1998-06-19
Publication date: 2000-10-02
Also published as: KR20000002407A

Abstract

본 발명은 글루탐산을 생산하는 브레비박테리움 락토퍼멘텀(Brevibacterium lactofermentum) KFCC 10651을 친주로 자외선조사, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG) 등의 변이 유발제로 통상적인 방법에 따라 처리하여 친주의 성질을 변형시켜, 발효 배지중에 특정 인자에 의해 발생한 고삼투압하에서도 지속적으로 글루탐산을 생산할 수 있는 염화나트륨 내성을 갖고, 세포막이 변형되어 글루탐산의 세포외 분비능이 향상된 것으로 여겨지는 테트라케인과 페니실린에 대한 감수성이 높으며, 산소 공급이 적은 상태에서도 발효 후반까지 원활하게 글루탐산을 생산할 수 있는 소듐아자이드 내성을 갖는 변이주에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 브레비박테리움 락토퍼멘텀의 변이주를 폐당밀, 포도당, 전분 가수분해물 및 원당 등이 포함된 배지중에서 배양하여 배양물로부터 글루탐산을 채취하는, 미생물을 이용한 글루탐산의 제조방법에 관한 것이다.

Description

글루탐산을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 글루탐산의 제조방법

본 발명은 글루탐산을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 글루탐산의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 브레비박테리움 락토퍼멘텀(Brevibacterium lactofermentum) KFCC 10651의 변이주로서 염화나트륨 내성을 보유하여 삼투압 내성을 가짐과 동시에 소듐아자이드(sodium azide)에 내성이 강해 산소공급이 부족한 상태에서도 고농도의 글루탐산을 생산할 수 있으며, 또한 테트라케인(tetracaine) 및 계면활성제 그리고 페니실린계 항생제에 감수성이 높아 글루탐산 분비능이 증대되어 배지중에 비오틴이 과잉 존재하더라도 페니실린계 항생제나 계면활성제(양이온, 음이온, 비이온계 계면활성제)를 발효과정중 대수증식기 초기 내지 말기 사이에 첨가하거나 또는 첨가하지 않아도 글루탐산을 고농도, 고수율로 생산하는 미생물 및 이를 이용한 글루탐산의 제조방법에 관한 것이다.

고농도, 고수율의 발효공정에 있어서, 미생물은 배양액중 고농도의 특정 배지 성분이나 산물에 의해 발생된 삼투압에 의해 세포의 성장 및 활성이나 산물의 지속적인 생산이 저해된다. 글루탐산 발효에 있어서도 배양액중의 발효 초기의 고농도 당질과 발효 중기 및 후기에서 생산된 글루탐산에 의해 삼투압이 발생하여 발효미생물의 성장 및 활성이 저해되거나, 지속적인 글루탐산의 생산이 저하되는 현상이 초래된다. 이러한 발효과정중의 기질이나 산물에 의한 삼투압을 보정하기 위해 발효 미생물은 아미노산인 프로린이나 글루탐산을 삼투보호물질로 세포내에 과량 생산하게 된다,

종래 미생물을 이용하여 글루탐산을 생산하는 공업적 방법에서의 발효원료로는 포도당, 전분 가수분해물, 폐당밀 등을 사용하여 왔으나, 포도당 및 전분 가수분해물이 고가라서 비오틴이 과량으로 존재하는 저렴한 가격의 폐당밀을 사용하여 발효과정중 대수증식기 초기 내지 말기 사이에 페니실린계 항생제나 계면활성제를 첨가하여 글루탐산을 생산하여 왔다. 종래방법에서 페니실린계 항생물질 등을 첨가하는 것은, 이미 잘 알려진 바와 같이, 상기 물질이 세포벽 합성을 저해하기 때문에 세포벽의 구성물질인 펩티도글리칸 사슬(petidoglycan chain)의 가교결합 형성능이 불안전하게 되므로 세포내에서 생성된 글루탐산을 세포벽을 통해 용이하게 세포외로 분비시키기 때문이다.

일반적으로 글루탐산을 생산하는 브레비박테리움속이나, 코리네박테리움속에 속하는 미생물들은 성장을 위해 비오틴을 요구하나 비오틴이 발효배지중에 과잉으로 존재할 경우에는 비오틴이 세포막 합성을 촉진하기 때문에 글루탐산의 세포외 분비가 억제되어 글루탐산의 생산이 저하되므로 발효배지내 비오틴 양을 조절할 필요가 있다. 그러나, 글루탐산 발효에 주로 사용되는 폐당밀을 이용할 경우 비오틴이 다량 함유되어 있어 세포막의 합성이 잘 이루어지므로 글루탐산의 세포외 분비능을 증대시키기 위해 세포막이 변형된 미생물의 개발이 요구되었다.

따라서, 본 발명자들은 종래 미생물의 형질을 변형시켜 발효배지중에 특정 인자에 의해 발생한 삼투압하에서도 지속적으로 글루탐산을 생산할 수 있는 염화나트륨 내성을 갖는 미생물을 만든 다음, 세포막이 변형되어 글루탐산의 세포외 분비능이 향상된 것으로 여겨지는 테트라케인과 페니실린에 대한 감수성이 높은 변이주를 만들고, 다시 호흡억제제인 소듐아자이드 내성 변이주를 획득하므로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 미생물을 분리 및 획득하는 방법을 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

본 발명의 미생물CJ972020(KFCC 11040)은 브레비박테리움 락토퍼멘텀(Brevibacterium lactofermentum) KFCC10651을 친주로 하여 자외선 조사, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG) 등의 변이유발제로 통상적인 방법에 따라 처리한 후, 염화나트륨이 농도별로 첨가된 배지(주3)에서 생육할 수 있는 변이주를 획득한 후, 이를 다시 상기한 변이유발제로 처리하여 테트라케인 첨가배지(주4)와 페니실린 첨가배지(주5)에 도말하여, 테트라케인과 페니실린에 대하여 동시에 감수성이 있는 CJ804 균주를 구할 수 있으며, 이 CJ804균주를 모주로 하여 이를 다시 상기한 변이유발제로 처리하므로써 소듐아자이드에 내성을 갖는 변이주를 획득하여 이를 CJ972020이라 명명하여 한국종균협회에 기탁하게 되었다.

(주1) 영양배지 : 펩톤 1%, 육즙 1%, 염화나트륨 0.25%, 효모엑기스 1%, 한천 2%, pH7.2.

(주2) 최소배지 : 포도당 10g/l, 인산제1칼륨 1g/l, 인산제2칼륨 0.5g/l, 황산암모늄0.5g/l 요소 1g/l, 황산철 20mg/l, 황산마그네슘 0.5g/l, 황산망간 20mg/l, 티아민염산염 200g/l, 비오틴 200g/l, 당밀5g/l, pH7.0.

(주3) 염화나트륨 첨가배지 : (주2) 최소배지에 염화나트륨 1.7몰∼2.2몰을 첨가한 배지.

(주4) 테트라케인 첨가배지 : (주1) 영양배지에 테트라케인 0.1∼1.0mM을 첨가한 배지.

(주5) 페니실린 첨가배지 : (주1) 영양배지에 페니실린 0.01∼0.4 g/㎖를 첨가한 배지.

(주6) 소듐아자이드 첨가배지 : (주2) 최소배지에 소듐아자이드 1∼14g/㎖를 첨가한 배지

본 발명의 신규한 변이주 CJ972020(FKCC 11040)의 생화학적 특성은 표1, 표2, 표3 및 표 4에 기재된 바와 같으며, 이들 내용에 의하면, 본 발명의 미생물은 발효 배양중에 직접 글루탐산을 축적시키고, 세포막으로의 특정 대사산물의 분비기능이 증가된 테트라케인과 페니실린에 대한 감수성이 높고 배양 과정중 고농도의 탄소원이 배양액에 존재하거나 배양액중에 글루탐산이 다량 생성될 경우 균체 외부의 고농도 용질에 의해 발생된 삼투압에 의한 정상적인 생리활성 저해현상을 방지하기 위해 삼투압에 의한 영향을 배제할 수 있는 형질인 염화나트륨에 내성이 높고, 산소공급이 적은 상태에서도 글루탐산의 생산에 지장이 없는 소듐아자이드 내성이 높은 특수한 변이주라고 판단된다.

표 1

염화나트륨 농도에 의한 내성비교

균 주	염화나트륨(mol)
균 주	0	1.0	1.5	1.7	1.9	2.0
KFCC10651	＋＋＋	＋＋＋	＋＋＋	＋＋	＋	＋
CJ972020	＋＋＋	＋＋＋	＋＋＋	＋＋＋	＋＋＋	＋＋＋

주식회사 30℃에서 96시간 배양, ＋ ; 생육, － ; 생육치 못함.

표 2

테트라케인 농도에 의한 감수성 비교

균주	테트라케인(mM)
균주	0	0.1	0.2	0.3	0.4	0.7
KFCC10651	＋＋＋	＋＋＋	＋＋＋	＋＋＋	＋＋	＋
CJ972020	＋＋＋	＋＋＋	＋＋＋	＋	－	－

주식회사 30℃에서 72시간 배양, ＋ ; 생육, － ; 생육치 못함.

표 3

페니실린계 항생제에 대한 감수성 비교

균주	페니실린(unit/㎖)
균주	0	0.01	0.02	0.03	0.04	0.05
ATCC13869	＋＋＋	＋＋＋	＋＋＋	＋＋＋	＋＋＋	＋＋
KFCC10651	＋＋＋	＋＋	＋	－	－	－
CS807134	＋＋＋	＋	－	－	－	－

주식회사 30℃에서 72시간 배양, ＋ ; 생육, － ; 생육치 못함.

표 4

소듐아자이드 농도에 의한 내성비교

균주	소듐아자이드(g/ml)
균주	0	1	2	4	8	10
KFCC10651	＋＋＋	＋＋＋	＋＋＋	＋＋＋	±	－
CJ972020	＋＋＋	＋＋＋	＋＋＋	＋＋＋	＋＋＋	＋

주식회사 30℃에서 72시간 배양,＋ ; 생육, － ; 생육치 못함.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

실시예 1

사용균주 :

본 발명의 미생물 CJ972020(KFCC), KFCC10651.

종배지 :

폐당밀 0.5%, 포도당 1%, 펩톤 1%, 육즙 0.5%, 효모엑기스 1%, 염화나트륨 0.25%, pH7.2.

발효배지 :

폐당밀 1%, 포도당 2%, 인산제1칼륨 0.1%, 인산제2칼륨 0.05%, 황산암모늄 0.05%, 요소 0.9%, 황산철 0.002%, 황산마그네슘 0.05%, 황산망간 0.002%, 티아민 염산염 200g/l, 비오틴 10g/l, pH7.2.

발효방법 :

상기 종배지 3㎖를 지름 18㎜ 시험관에 분주하고, 상법에 따라 가압, 살균후 사용 균주를 접종하고 30℃에서 18시간 진탕 배양하여 종배양액으로 사용하였다. 발효배지 40㎖를 550㎖ 진탕용 삼각플라스크에 분주하고 120℃에서 10분간 가압 살균하여 종배양액 1㎖를 식균한 다음 48시간 배양하였다. 회전수는 분당 180회 온도 30℃ pH7.2로 조절하였다. 배양완료 후 배지내 글루탐산 축적량은 KFCC10651이 15.72g/l, CJ972020이 19.87g/l이었다.

본 실시예의 결과, 본 발명의 미생물은 발효배지중 비오틴의 농도가 과잉이라 할지라도 페니실린계 항생제 또는 계면활성제를 첨가하지 않아도 고농도의 글루탐산을 생산할 수 있음이 확인되었다.

실시예 2

사용균주 :

실시예 1과 동일.

1차 종배지 :

폐당밀 0.5%, 포도당 1%, 인산제1칼륨 0.1%, 인산제2칼륨 0.05%, 황산암모늄 0.05%, 요소 0.1%, 황산철 0.002%, 황산마그네슘 0.05%, 황산망간 0.002%, 티아민염산염 200g/l, 비오틴 10g/l, pH7.0.

2차 종배지 :

폐당밀(전화당으로 환산) 2.0%, 글루코오스 1%, 콘스팁리키 3%, 황산마그네슘 0.05%, 요소 0.2%, 인산제1칼륨 0.1%, 인산제2칼륨 0.05%, 황산철 0.002%, 황산망간 0.002%, 황산암모늄 0.3% 타아민염산염 200g/l, 비오틴 50g/l, 소포제 약간 pH7.0.

발효배지 :

폐당밀(전화당으로 환산) 8.0%, (NH₄)₂H₂PO₄0.15%, 황산철 0.002%, 황산마그네슘0.05%, 황산망간 0.002%, 콘스팁리키 3%, 황산암모늄 0.3%, 티아민염산염 200g/l, 소포제 약간, pH7.0.

1차 종배양 :

1차 종배지 40㎖를 500㎖ 진탕용 삼각 플라스크에 분주하고, 120℃에서 10분간 가압 살균하여 냉각 후 균주를 접종하여 회전수 분당 180회, 30℃에서 20시간 진탕 배양하였다.

2차 종배양 :

2차 종배지를 2.6리터 용량의 실험용 발효조에 1.2리터씩 분주하고 121℃에서 10분간 가압 살균한 후 냉각시켜 1차 종배양액의 배양 완료액을 5㎖ 접종한 후 공기를 매분당 0.5리터 공급하면서 900rpm, 30℃에서 18시간 진탕 배양하였다.

발효방법 :

상기 발효배지를 5리터 용량의 시험발효조에 1.8리터씩 분주하고, 121℃에서 10분간 가압 살균한 뒤 냉각하여 2차 종배양액을 약 150㎖씩 접종한 후 공기를 매분당 2.5리터씩 공급하면서 900rpm, 37℃에서 진탕 배양하였다.

상기 조건으로 배양하여 대수증식기 초기 내지 말기 사이에 페니실린을 0.3unit/㎖ 첨가하고 배양하며, 배양중 발효액의 pH는 28% 암모니아수로 pH7.7이 되도록 계속 조절하였다. 배양중 잔당의 농도가 1.5% 되면 살균된 폐당밀 또는 폐당밀과 원당을 일정한 비율로 혼합한 당을 수시로 공급하였다. 추가로 당밀 또는 혼합당과의 초기의 발효배지에 첨가된 당의 합계가 발효액량 대비 20%가 될 때까지 계속 배양하였다. 배양완료 후, 글루탐산의 농도가 KFCC10651은 142.7g/l, CJ972020은 152.1g/l이었다.

실시예 3

사용균주, 1차 및 2차 종배지, 발효배지, 1차 및 2차 종배양은 실시예2와 동일하게 행하였다.

발효방법 :

OD가 0.3(OD₅₆₂100) 정도가 될 때, 비이온계 계면활성제인 트윈 40을 발효액 대비 70g/㎖가 되도록 첨가하여 배양한 것을 제외하고는 실시예 2와 동일하게 진행하였다. 배양 완료 후, 글루탐산의 농도가 KFCC10651은 141.8g/l CJ972020은 151.6g/l이었다.

이상에서 설명된 바와 같이, 본 발명의 신규한 변이주 CJ972020은 염화나트륨 내성을 보유하여 고삼투압하에서도 지속적으로 글루탐산을 생산할 수 있으며, 테트라케인과 페니실린에 대한 감수성이 높아 글루탐산의 세포외 분비능이 증대되고, 소듐아자이드에 내성이 강해 산소공급이 적은 상태에서도 발효 후반까지 효과적인 수율로 지속적으로 글루탐산을 생산할 수 있다.

Claims

브레비박테리움 락토퍼멘텀(Brevibacterium lactofermentum)의 변이주로서 소듐아자이드 내성과 염화나트륨 내성을 가지며, 페니실린 및 테트라케인에 대하여 감수성이 있는 글루탐산 생산 미생물CJ972020인 KFCC 11040.
브레비박테리움 락토퍼멘텀의 변이주 CJ972020인 KFCC 11040을 폐당밀, 포도당, 전분 가수분해물 및 원당이 포함된 배지중에서 배양하여 배양물로부터 글루탐산을 채취하는 것을 특징으로 하는 미생물을 이용한 글루탐산의 제조방법.