ES2739909T3

ES2739909T3 - Procedimiento para la producción de aminoácidos usando una bacteria que tiene expresión aumentada de los genes gltP y/o gltS

Info

Publication number: ES2739909T3
Application number: ES09829135T
Authority: ES
Inventors: Yuori Wakasa; Ryo Takeshita
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2008-11-27
Filing date: 2009-11-26
Publication date: 2020-02-04
Anticipated expiration: 2029-11-26
Also published as: EP2360263A1; RU2011126198A; CN102227504A; US8673597B2; EP2360263B1; BRPI0921655B1; US20110281311A1; BRPI0921655A2; EP2360263A4; CA2744852C; JP2012029565A; CA2744852A1; PL2360263T3; CN102227504B; RU2518677C2; WO2010061890A1

Abstract

Método para producir un L-aminoácido que comprende cultivar una bacteria perteneciente a la familia Enterobacteriaceae y tiene una capacidad de producción de L-aminoácido en un medio para producir y acumular el L-aminoácido en el medio, y recoger el L-aminoácido del medio, en el que: la bacteria se ha modificado para que esté aumentada la expresión del gen gltP y/o el gen gltS, y el Laminoácido se selecciona del grupo que consiste en L-lisina, L-treonina, L-asparagina, ácido L-aspártico, Lmetionina, L-alanina, L-isoleucina y L-homoserina.

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimiento para la producción de aminoácidos usando una bacteria que tiene expresión aumentada de los genes gltP y/o gltS

Campo técnico

La presente invención se refiere a un método para producir un L-aminoácido usando una bacteria que se ha modificado de manera que esté aumentada la expresión del gen gltP y/o el gen gltS. Los L-aminoácidos son útiles a nivel industrial como aditivos para piensos, ingredientes de alimentos saludables, infusiones de aminoácidos, etcétera.

Antecedentes de la técnica

Los métodos para producir una sustancia diana como un L-aminoácido mediante fermentación usando un microorganismo incluyen métodos de uso de un microorganismo de tipo natural (una cepa de tipo natural), métodos de uso de una cepa auxótrofa derivada de una cepa de tipo natural, métodos de uso de una cepa mutante de regulación metabólica derivada de una cepa de tipo natural como una cepa resistente a diversos fármacos, métodos de uso de una cepa que tenga propiedades tanto de cepa auxótrofa como de cepa mutante de regulación metabólica, etc.

En los últimos años, las técnicas de ADN recombinante se usan en la producción de sustancias diana mediante fermentación. Por ejemplo, la productividad de L-aminoácidos de un microorganismo se mejora potenciando la expresión de un gen que codifica para una enzima de biosíntesis de L-aminoácidos (documentos de patente 1 y 2), o potenciación la captación de una fuente de carbono en un sistema de biosíntesis de L-aminoácidos (documento de patente 3).

Mientras tanto, se describe un método para usar, en la producción de un aminoácido básico mediante fermentación, iones carbonato y iones bicarbonato como contraiones del aminoácido básico para sustituir una parte de los iones sulfato o iones cloruro. Estas referencias describen, como método para añadir iones carbonato e iones bicarbonato al medio, un método para controlar la presión interna del tanque de fermentación para que sea positiva durante la fermentación, o suministrar dióxido de carbono o un gas mixto que contenga dióxido de carbono al medio. (Documentos de patente 4 y 5).

La fermentación de aminoácidos convencional para aminoácidos de la familia del ácido L-aspártico, tales como L-lisina, tienen un problema de producción como subproducto de ácido L-glutámico y, en particular, tal producción fermentativa tal como se describió anteriormente en condiciones de alto pH presenta un problema de una producción como subproducto especialmente marcada de ácido L-glutámico. Dado que en muchos casos es necesario purificar los L-aminoácidos a alta pureza después de la producción fermentativa en el proceso de producción de L-aminoácidos, no se desea la presencia de subproductos, lo que puede provocar problemas de un proceso de purificación complicado y reducción de la pureza del producto.

Hasta la fecha, como proteínas involucradas en la captación de ácido glutámico que se han descubierto en enterobacterias tales como Escherichia coli, se conocen GltP, GltS (documentos no de patente 1 y 2), GadC (documento no de patente 3) y GltIJKL.

Se sabe que la productividad de L-lisina, L-treonina y L-triptófano de una cepa que se ha modificado para potenciar la actividad glutamato descarboxilasa se mejora potenciando la actividad como contratransportador (anti-porter) de glutamato/GABA (documento de patente 6). Sin embargo, no hay ningún informe de producción de L-aminoácido usando un microorganismo en el que el gen gltP o el gen gltS está amplificado.

Referencias de la técnica anterior

Documentos de patente

Documento de patente 1: Patente estadounidense n.° 5.168.056

Documento de patente 2: Patente estadounidense n.° 5.776.736

Documento de patente 3: Patente estadounidense n.° 5.906.925

Documento de patente 4: Solicitud de patente estadounidense publicada n.° 2002/0025564

Documento de patente 5: Publicación de patente internacional WO2006/038695

Documento de patente 6: Publicación de patente internacional WO2008/044453

Documentos no de patente

Documento no de patente 1: J. Bacteriol., abr. de 1992; 174 (7): 2391-3

Documento no de patente 2: J. Biol. Chem., dic. de 1990; 15; 265 (35): 21704-8

Documento no de patente 3: J. Bacteriol., dic. de 2006; 188 (23): 8118-27

Sumario de la invención

Objeto que debe lograrse mediante la invención

Un objeto de la presente invención es proporcionar un microorganismo perteneciente a la familia Enterobacteriaceae que puede reducir la producción de ácido L-glutámico como subproducto en la producción de un aminoácido seleccionado de L-lisina, L-treonina, L-asparagina, ácido L-aspártico, L-metionina, L-alanina, L-isoleucina y L-homoserina, y un método para producir un L-aminoácido tal como se describió anteriormente usando un microorganismo como el descrito anteriormente, que puede reducir el ácido L-glutámico como subproducto en la producción del aminoácido.

Medios para lograr el objeto

Los inventores realizaron diversas investigaciones para lograr el objeto mencionado anteriormente, como resultado, encontraron que el ácido L-glutámico producido como subproducto en la fermentación de L-aminoácidos podría reducirse mediante la modificación de una bacteria de manera que esté aumentada la expresión de gltP o y gltS, y así se logra la presente invención.

La presente invención proporciona así lo siguiente:

(1) Un método para producir un L-aminoácido que comprende cultivar una bacteria perteneciente a la familia Enterobacteriaceae y tiene una capacidad de producción de L-aminoácido en un medio para producir y acumular el L-aminoácido en el medio, y recoger el L-aminoácido del medio, en el que la bacteria se ha modificado para que esté aumentada la expresión del gen gltP y/o el gen gltS, y el L-aminoácido se selecciona del grupo que consiste en L-lisina, L-treonina, L-asparagina, ácido L-aspártico, L-metionina, L-alanina, L-isoleucina y L-homoserina.

(2) El método descrito anteriormente, en el que el gen gltP codifica para una proteína mostrada en los siguientes puntos (A) o (B):

(A) una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 12 y que tiene una actividad como transportador de L-glutamato,

(B) una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 12, que incluye sustituciones, deleciones, inserciones, adiciones o inversiones de uno a 20 residuos de aminoácido, y que tiene una actividad como transportador de L-glutamato.

(3) El método descrito anteriormente, en el que el gen gltP codifica para una proteína mostrada en los siguientes puntos (A1), (B1) o (C1):

(A1) una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2,

(B1) una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2, que incluye sustituciones, deleciones, inserciones, adiciones o inversiones de uno a 20 residuos de aminoácido, y que tiene una actividad como transportador de L-glutamato,

(C1) una proteína que muestra una identidad del 80% o más con la secuencia de aminoácidos total de la SEQ ID NO: 2 y que tiene una actividad como transportador de L-glutamato.

(4) El método descrito anteriormente, en el que el gen gltP es un ADN mostrado en los siguientes puntos (a) o (b): (a) un ADN que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 1,

(b) un ADN que es capaz de hibridar con una secuencia complementaria a la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 en condiciones rigurosas, y codifica para una proteína que tiene una actividad como transportador de L-glutamato.

(5) El método descrito anteriormente, en el que el gen gltS codifica para una proteína mostrada en los siguientes puntos (C) o (D):

(C) una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 13 y que tiene una actividad como transportador de L-glutamato,

(D) una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 13, que incluye sustituciones, deleciones, inserciones, adiciones o inversiones de uno a 20 residuos de aminoácido, y que tiene una actividad como transportador de L-glutamato.

(6) El método descrito anteriormente, en el que el gen gltS codifica para una proteína mostrada en los siguientes puntos (C1), (D1) o (E1)

(C1) una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 4,

(D1) una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 4 que incluye sustituciones, deleciones, inserciones, adiciones o inversiones de uno a 20 residuos de aminoácido, y que tiene una actividad como transportador de L-glutamato,

(E1) una proteína que muestra una identidad del 80% o más con la secuencia de aminoácidos total de la SEQ ID NO: 4 y que tiene una actividad como transportador de L-glutamato.

(7) El método descrito anteriormente, en el que el gen gltS es un ADN mostrado en los siguientes puntos (c) o (d): (c) un ADN que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 3,

(d) un ADN que es capaz de hibridar con una secuencia complementaria a la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 3 en condiciones rigurosas, y codifica para una proteína que tiene una actividad como transportador de L-glutamato.

(8) El método descrito anteriormente, en el que la expresión del gen se potencia aumentando el número de copias del gen, o modificando una secuencia de control de la expresión del gen.

(9) El método descrito anteriormente, en el que el L-aminoácido es L-lisina y la expresión del gen ybjE está aumentada en la bacteria.

(10) El método descrito anteriormente, en el que el gen ybjE codifica para una proteína mostrada en los siguientes puntos (E), (F) o (G):

(E) una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 6 o la secuencia de aminoácidos de los números de aminoácido 17 a 315 en la SEQ ID NO: 6,

(F) una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 6 o la secuencia de aminoácidos de los números de aminoácido 17 a 315 en la SEQ ID NO: 6, que incluye sustituciones, deleciones, inserciones, adiciones o inversiones de uno a 20 residuos de aminoácido, y que tiene una actividad de excreción de L-lisina,

(G) una proteína que muestra una identidad del 80% o más con la secuencia de aminoácidos total de la SEQ ID NO: 6 y que tiene una actividad de excreción de L-lisina.

(11) El método descrito anteriormente, en el que el gen ybjE es un ADN mostrado en los siguientes puntos (e) o (f): (e) un ADN que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 5 o la secuencia de nucleótidos de los números de nucleótido 49 a 948 en la SEQ ID NO: 5,

(f) un ADN que es capaz de hibridar con una secuencia complementaria a la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 5 o la secuencia de nucleótidos de los números de nucleótido 49 a 948 en la SEQ ID NO: 5, en condiciones rigurosas, y codifica para una proteína que tiene una actividad de excreción de L-lisina.

(12) El método descrito anteriormente, en el que el L-aminoácido es L-lisina, el pH del medio se controla para que sea de 6,0 a 9,0 durante el cultivo para la producción, y de 7,2 a 9,0 al final del cultivo, y se asegura un periodo de cultivo en el que están presentes en el medio 20 mM o más de iones bicarbonato y/o iones carbonato, de modo que los iones bicarbonato y/o iones carbonato sirven como contraiones del aminoácido básico.

(13) El método descrito anteriormente, en el que la bacteria es una bacteria Escherichia.

Realizaciones para llevar a cabo la invención

A continuación, la presente invención se explicará en detalle.

<1> Bacteria usada para la presente invención

La bacteria es una bacteria perteneciente a la familia Enterobacteriaceae, tiene una capacidad de producción de L-aminoácidos, y se ha modificado para que la expresión del gen gltP y/o el gen gltS esté aumentada. El L-aminoácido se selecciona del grupo que consiste en L-lisina, L-treonina, ácido L-aspártico, L-asparagina, L-metionina, L-alanina, L-isoleucina y L-homoserina. Si estos L-aminoácidos se producen mediante fermentación usando un microorganismo, el ácido L-glutámico se produce como subproducto en muchos casos. En cuanto a la producción como subproducto de ácido L-glutámico, es suficiente que la producción como subproducto se reduzca en comparación con la observada en una cepa no modificada por la modificación para aumentar la expresión del gen gltP y/o el gen gltS, pero de manera deseable se reduzca en el 40% o más, preferiblemente el 50% o más, más preferiblemente el 60% o más.

La capacidad de producción de L-aminoácido a la que se hace referencia en el presente documento significa una capacidad de la bacteria para producir un L-aminoácido en un medio o células y acumular el L-aminoácido hasta tal punto que el L-aminoácido pueda recogerse del medio o las células, cuando la bacteria se cultiva en el medio. La bacteria puede ser una bacteria que tenga la capacidad para producir uno de L-lisina, L-treonina, ácido L-aspártico, L-asparagina, L-metionina, L-alanina, L-isoleucina y L-homoserina, o puede ser una bacteria que tenga la capacidad para producir dos o tres clases de los mismos. La bacteria que tiene una capacidad de producción de L-aminoácido puede ser una bacteria que tiene inherentemente una capacidad de producción de L-aminoácido, o puede ser una bacteria tal como se describe a continuación que se ha modificado para que tenga una capacidad de producción de L-aminoácido usando un método de mutación o técnicas de recombinación de ADN.

El “aumento de la expresión de un gen” significa aumento de la transcripción y/o traducción del gen.

<1-1> Conferir la capacidad de producción de L-aminoácidos

Los métodos para conferir la capacidad para producir un L-aminoácido seleccionado de L-lisina, L-treonina, ácido L-aspártico, L-asparagina, L-metionina, L-isoleucina, L-alanina y L-homoserina a bacterias, y las bacterias a las que se confiere una capacidad para producir los L-aminoácidos descritos anteriormente, que pueden usarse para la presente invención, se ejemplificarán a continuación. Sin embargo, la bacteria no se limita a estos, siempre que se use una bacteria que tenga la capacidad para producir un L-aminoácido.

La bacteria usada para la presente invención no está particularmente limitada siempre que se elija una bacteria que pertenezca a la familia Enterobacteriaceae tales como los de los géneros Escherichia, Enterobacter, Pantoea, Klebsiella, Serratia, Erwinia, Salmonella y Morganella, y que tenga la capacidad de producción de L-aminoácidos mencionada antes. Específicamente, pueden usarse aquellas clasificadas en la familia Enterobacteriaceae de acuerdo con la taxonomía usada en la base de datos de NCBI (Centro Nacional para la Información Biotecnológica) (http://www.ncb¡.nlm.n¡h.gov/htb¡n-post/Taxonomv/wgetorg?mode=Tree&id=1236&lvl=3&keep=1&srch mode=1&unlock). Como cepa parental de la familia Enterobacteriaceae usada para la modificación, es deseable usar, especialmente, una bacteria del género Escherichia, Enterobacter o Pantoea.

Aunque las cepas parentales de bacteria Escherichia usadas para obtener las bacterias Escherichia usadas para la presente invención no están particularmente limitadas, específicamente, pueden usarse las descritas en la obra de Neidhardt et al. (Backmann B.J., 1996, Derivations and Genotypes of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12, págs. 2460-2488, tabla 1, en F.D. Neidhardt (ed.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology / segunda edición, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.). Entre esas, se prefiere Escherichia coli. Los ejemplos específicos de Escherichia coli incluyen Escherichia coli W3110 (ATCC 27325), Escherichia coli MG1655 (ATCC 47076) y otras derivadas de la cepa de tipo natural prototipo, la cepa K12.

Estas cepas están disponibles, por ejemplo, en la Colección Americana de Cultivos Tipo (apartado de correos 1549, Manassas, VA 20108, Estados Unidos de América). Es decir, se asignan números de registro a cada una de las cepas, y las cepas pueden ordenarse usando estos números de registro (remítase a http://www.atcc.org/). Los números de registro de las cepas se enumeran en el catálogo de la Colección Americana de Cultivos Tipo.

Los ejemplos de las bacterias Enterobacter incluyen Enterobacter agglomerans, Enterobacter aerogenes, etcétera, y los ejemplos de las bacterias Pantoea incluyen Pantoea ananatis. Algunas cepas de Enterobacter agglomerans se reclasificaron recientemente en Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis o Pantoea stewartii basándose en el análisis de secuencia de nucleótidos del ARNr 16S, etc. En la presente invención, puede usarse una bacteria perteneciente a cualquiera de los géneros Enterobacter o Pantoea siempre que sea una bacteria clasificada en la familia Enterobacteriaceae. Cuando se produce una cepa de Pantoea ananatis mediante técnicas de ingeniería genética, pueden usarse la cepa AJ13355 (FERM BP-6614), la cepa AJ13356 (FERM BP-6615), la cepa AJ13601 (FERM BP-7207) de Pantoea ananatis y sus derivados. Estas cepas se identificaron como Enterobacter agglomerans cuando se aislaron y se depositaron como Enterobacter agglomerans. Sin embargo, recientemente se reclasificaron como Pantoea ananatis basándose en la secuenciación de nucleótidos de ARNr 16S, etcétera tal como se describió anteriormente.

Se describen a continuación métodos para conferir la capacidad para producir un L-aminoácido seleccionado de L-lisina, L-treonina, ácido L-aspártico, L-asparagina, L-metionina, L-alanina, L-isoleucina y L-homoserina a bacterias pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae, y métodos para potenciar la capacidad para producir los L-aminoácidos mencionados anteriormente de bacterias pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae.

Para conferir la capacidad para producir un L-aminoácido, pueden usarse métodos empleados convencionalmente en la reproducción de bacterias corineformes o bacterias del género Escherichia (véase “Amino Acid Fermentation”, Gakkai Shuppan Center (Ltd ), 1a edición, publicado el 30 de mayo de 1986, págs. 77-100). Tales métodos incluyen la adquisición de las propiedades de un mutante auxótrofo, una cepa resistente a análogos de L-aminoácidos o un mutante de regulación metabólica, o la construcción de una cepa recombinante de manera que sobreexprese una enzima de biosíntesis de L-aminoácido. En este caso, en la reproducción de bacterias productoras de L-aminoácidos, pueden conferirse una o más de las propiedades descritas anteriormente, tales como auxotrofia, resistencia a análogos y mutación de regulación metabólica. La expresión de la (s) enzima (s) de biosíntesis de L-aminoácidos puede potenciarse solas o en combinaciones de dos o más. Además, los métodos de conferir propiedades tales como una auxotrofia, resistencia a análogos o mutación de regulación metabólica pueden combinarse con la potenciación de las enzimas de biosíntesis.

Una cepa mutante auxótrofa, una cepa resistente a análogos de L-aminoácidos o una cepa mutante de regulación metabólica con la capacidad para producir un L-aminoácido puede obtenerse sometiendo una cepa parental o de tipo natural a una mutagénesis convencional tal como exposición a rayos X o radiación UV, o tratamiento con un mutágeno tal como N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) y metanosulfonato de etilo (EMS), luego seleccionando aquellos que presentan autotrofia, resistencia a análogos o una mutación de regulación metabólica y que también tienen la capacidad para producir un L-aminoácido a partir de las cepas mutantes obtenidas.

Bacterias productoras de L-lisina

Las bacterias productoras de L-lisina y los métodos para construirlas se ejemplifican a continuación.

Los ejemplos de cepas que tienen capacidad de producción de L-lisina incluyen, por ejemplo, cepas resistentes a análogos de L-lisina y cepas mutantes de regulación metabólica. Los ejemplos de análogo de L-lisina incluyen, pero no se limitan a, oxalisina, hidroxamato de lisina, S-(2-aminoetil)-L-cisteína (AEC), y-metil-lisina, a-clorocaprolactama, etcétera. Las cepas mutantes que tienen resistencia a estos análogos de lisina pueden obtenerse sometiendo una bacteria perteneciente a la familia Enterobacteriaceae a un tratamiento de mutagénesis artificial convencional. Los ejemplos específicos de bacterias productoras de L-lisina incluyen Escherichia coli AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185, véase la patente japonesa abierta a consulta por el público n.° 56-18596 y la patente estadounidense n.° 4.346.170), Escherichia coli cepa VL611 (patente japonesa abierta a consulta por el público n.° 2000-189180), etcétera. Como Escherichia coli productora de L-lisina, también puede usarse la cepa WC196 (véase la publicación de patente internacional WO96/17930).

Además, también puede construirse una bacteria productora de L-lisina aumentando la actividad de una enzima del sistema de biosíntesis de L-lisina. El aumento de la actividad de una enzima de este tipo puede lograrse aumentando el número de copias del gen que codifica para la enzima en las células, o modificando una secuencia de control de la expresión del mismo. El aumento del número de copias de un gen que codifica para una enzima del sistema de biosíntesis de L-lisina y la modificación de una secuencia de control de la expresión del mismo pueden lograrse mediante el mismo método que el de los genes gltP y gltS descritos más adelante.

Los ejemplos de genes que codifican para enzimas de biosíntesis de L-lisina incluyen genes que codifican para enzimas de la ruta del diaminopimelato tal como el gen de la dihidrodipicolinato sintasa (dapA), gen de la aspartocinasa (lysC), gen de la dihidrodipicolinato reductasa (dapB), gen de la diaminopimelato descarboxilasa (lysA), gen de la diaminopimelato deshidrogenasa (ddh) (documento WO96/40934 para todos los genes anteriores), gen de la fosfoenolpiruvato carboxilasa (ppc) (patente japonesa abierta a consulta por el público n.° 60-87788), gen de la aspartato aminotransferasa (aspC) (publicación de patente japonesa (Kokoku) n.° 6-102028), y el gen de la aspartato semialdehído deshidrogenasa (asd) (documento WO00/61723), y los genes que codifican para enzimas de la ruta del ácido aminoadípico tales como el gen de la homoaconitato hidratasa (patente japonesa abierta a consulta por el público n.° 2000-157276). Además, la cepa principal puede mostrar un nivel aumentado de expresión del gen involucrado en la eficiencia energética (patente europea abierta a consulta por el público n.° 1170376), el gen que codifica para la nicotinamida nucleótido transhidrogenasa (pntAB) (patente estadounidense n.° 5.830.716), el gen ybjE que codifica para una proteína que tiene actividad de excreción de L-lisina (documento WO2005/073390), el gen que codifica para la glutamato deshidrogenasa (gdhA) (Gene 23: 199-209, 1983), o una combinación arbitraria de estos. Las abreviaturas de los genes se muestran entre paréntesis.

Entre los genes mencionados, se prefiere el gen ybjE. Los ejemplos del gen ybjE incluyen el gen ybjE de Escherichia coli y homólogos del mismo. Los ejemplos del gen ybjE de Escherichia coli incluyen un gen que codifica para la secuencia de aminoácidos de los números de aminoácido 17 a 315 en la SEQ ID NO: 6, específicamente un gen que tiene la secuencia de nucleótidos de los números de nucleótido 49 a 948 en la SEQ ID NO: 5. En la SEQ ID NO: 5, se estima que el codón de iniciación son los nucleótidos de los números de nucleótido 49 a 51. Aunque los nucleótidos de los números de nucleótido 1 a 3 en la SEQ ID NO: 5 constituyen el codón que codifica para Val, gtg, puede traducirse como Met como codón de iniciación, y la proteína codificada por el gen ybjE puede ser una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6 (1 a 315). En tal caso, es preferible usar un ADN que tenga la secuencia de nucleótidos de los números de nucleótido 1 a 948 en la SEQ ID NO: 5. Sin embargo, a partir de los ejemplos queda claro que, independientemente de qué residuo de aminoácido proporcione el codón de iniciación, puede obtenerse un microorganismo utilizable para el método de producción de la presente invención usando un ADN que contiene la secuencia de nucleótidos de los números de nucleótido 49 a 948 en la SEQ ID NO: 1.

Se sabe que la dihidrodipicolinato sintasa de tipo natural derivada de Escherichia coli está sujeta a inhibición por retroalimentación por L-lisina, y se sabe que la aspartocinasa de tipo natural derivada de Escherichia coli está sujeta a inhibición por retroalimentación y supresión por L-lisina. Por tanto, cuando se usan el gen dapA y el gen lysC, estos genes son preferiblemente genes que codifican para enzimas mutantes desensibilizadas frente a la inhibición por retroalimentación por L-lisina.

Los ejemplos de ADN que codifica para una dihidrodipicolinato sintetasa mutante desensibilizada frente a la inhibición por retroalimentación por L-lisina incluyen un ADN que codifica para una proteína de este tipo que tiene una secuencia de aminoácidos en la que el residuo de histidina en la posición 118 se reemplaza por un residuo de tirosina. Los ejemplos de ADN que codifica para una aspartocinasa mutante desensibilizada frente a la inhibición por retroalimentación por L-lisina incluyen un ADN que codifica para una AKIII que tiene una secuencia de aminoácidos en la que el residuo de treonina en la posición 352, el residuo de glicina en la posición 323 y el residuo de metionina en la posición la posición 318 se reemplazan por isoleucina, asparagina e isoleucina, respectivamente (para estos mutantes, véanse las patentes estadounidenses n.os 5.661.012 y 6.040.160). Tales ADN mutantes pueden obtenerse mediante mutagénesis específica del sitio usando PCR o similar.

Los plásmidos RSFD80, pCAB1 y pCABD2 de amplia gama de huéspedes se conocen como plásmidos que contienen un gen dapA mutante que codifica para una dihidrodipicolinato sintasa mutante y un gen lysC mutante que codifica para una aspartocinasa mutante (patente estadounidense n.° 6.040.160). Escherichia coli cepa JM109 transformada con el plásmido se denominó AJ12396 (patente estadounidense n.° 6.040.160), y la cepa se depositó ante el Instituto Nacional de Biociencias y Tecnología Humana, Agencia de Ciencia y Tecnología Industrial, Ministerio de Comercio Internacional e Industria (actualmente Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada, Depositario Internacional de Organismos de Patentes) el 28 de octubre de 1993 y se le asignó un número de registro de FERM P-13936, y el depósito se convirtió entonces en un depósito internacional conforme a las disposiciones del Tratado de Budapest el 1 de noviembre de 1994 y se le asignó un número de registro de FERM BP-4859. RSFD80 puede obtenerse a partir de la cepa AJ12396 mediante un método convencional.

Además, las bacterias productoras de L-aminoácidos pueden tener una actividad reducida de una enzima que cataliza una reacción que se ramifica a partir de una ruta de biosíntesis de L-aminoácidos y produce otro compuesto o puede ser deficiente en tal actividad, o puede tener una actividad reducida de una enzima que actúa negativamente sobre la síntesis o acumulación de L-aminoácidos, o puede ser deficiente en tal actividad. Los ejemplos de tales enzimas involucradas en la producción de L-lisina incluyen la homoserina deshidrogenasa, la lisina descarboxilasa (cadA, ldcC), la enzima málica, etcétera, y se divulgan cepas en las que las actividades de estas enzimas se reducen o delecionan en los documentos WO95/23864, WO96/17930, WO2005/010175, etcétera.

Se prefiere que las expresiones de ambos genes cadA e ldcC que codifican para la lisina descarboxilasa estén disminuidas para disminuir o delecionar la actividad de la lisina descarboxilasa. La expresión de ambos genes puede disminuirse, por ejemplo, mediante el método descrito en el documento WO2006/078039.

Con el fin de reducir o eliminar actividades de estas enzimas, puede introducirse una mutación en los genes de las enzimas en un genoma mediante un método de mutagénesis o una técnica de recombinación génica convencional para reducir o eliminar las actividades intracelulares de las enzimas. Tal introducción de una mutación puede lograrse, por ejemplo, usando recombinación genética para eliminar los genes que codifican para las enzimas en el genoma o para modificar una secuencia de control de la expresión, como un promotor o la secuencia Shine-Dalgarno (SD). También puede lograrse mediante la introducción de una mutación para la sustitución de aminoácidos (mutación de cambio de sentido), un codón de terminación (mutación sin sentido) o una mutación del marco de lectura para añadir o delecionar uno o dos nucleótidos en regiones que codifican para las enzimas en el genoma, o delecionar parcial o totalmente los genes (J. Biol. Chem., 272: 8611-8617, 1997). Las actividades enzimáticas también pueden disminuirse o eliminarse construyendo un gen que codifica para una enzima mutante, en el que la región codificante se deleciona total o parcialmente, y sustituyéndola por un gen normal en un genoma mediante recombinación homóloga o introduciendo un transposón o factor IS en el gen.

Por ejemplo, para introducir una mutación que disminuye o elimina las actividades de las enzimas mencionadas anteriormente mediante recombinación genética, se usan los siguientes métodos. Se prepara un gen mutante modificando una secuencia parcial de un gen objetivo para que no codifique para una enzima que pueda funcionar normalmente, y luego una bacteria perteneciente a la familia Enterobacteriaceae puede transformarse con un ADN que contiene el gen mutante para provocar la recombinación de un gen correspondiente en el genoma con el gen mutante para sustituir el gen mutante por el gen objetivo en el genoma. Los ejemplos de tal sustitución de genes usando recombinación homóloga incluyen métodos de uso de un ADN lineal como el método denominado integración dirigida por el rojo (Datsenko, K.A, y Wanner, B.L., 2000, Proc. Natl Acad Sci. USA, 97: 6640-6645.), y el método que utiliza la integración dirigida por el rojo en combinación con un sistema de escisión derivado del fago X (Cho, E.H., Gumport, R.I., Gardner, J.F., 2002, J. Bacteriol., 184: 5200-5203) (remítase al documento WO2005/010175), un método de uso de un plásmido que contiene un origen de replicación sensible a la temperatura (patente estadounidense n.° 6.303.383, patente japonesa abierta a consulta por el público n.° 05-007491). Además, tal mutagénesis específica del sitio basada en la sustitución de genes usando recombinación homóloga tal como se describió anteriormente también puede realizarse usando un plásmido que no es capaz de replicarse en un huésped.

Los ejemplos preferidos de bacterias productoras de L-lisina incluyen Escherichia coli WC196AcadAAldcC/pCABD2 (documento WO2006/078039). La cepa se construyó introduciendo el plásmido pCABD2 que contiene genes de biosíntesis de lisina (patente estadounidense n.° 6.040.160) en la cepa WC196 habiendo perturbado los genes cadA e IdcC, que codifican para la lisina descarboxilasa. La cepa WC196 se produjo a partir de la cepa W3110, que derivó de Escherichia coli K-12, reemplazando el gen lysC de tipo natural en el cromosoma de la cepa W3110 por un gen lysC mutante que codifica para una aspartocinasa III mutante en la que la treonina en la posición 352 se reemplazó por isoleucina, lo que da como resultado la desensibilización de la inhibición por retroalimentación de L-lisina (patente estadounidense n.° 5.661.012), y confiriendo resistencia a AEC a la cepa resultante (patente estadounidense n.° 5.827.698). La cepa WC196 se designó como Escherichia coli AJ13069, depositada ante el Instituto Nacional de Biociencias y Tecnología Humana, Agencia de Ciencia y Tecnología Industrial (actualmente la agencia administrativa independiente, Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada, Depositario Internacional de Organismos de Patentes, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305 8566, Japón) el 6 de diciembre de 1994, y se le asignó un número de registro de FERM P-14690. Luego, se convirtió en un depósito internacional conforme a las disposiciones del Tratado de Budapest el 29 de septiembre de 1995, y se le asignó un número de registro de FERM BP-5252 (patente estadounidense n.° 5.827.698). La propia cepa WC196AcadAAldcC también es una bacteria productora de L-lisina preferida. La WC196AcadAAldcC se designó como AJ110692 y se depositó ante el Instituto Nacional de Biociencias y Tecnología Humana, Agencia de Ciencia y Tecnología Industrial (actualmente la agencia administrativa independiente, Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada, Depositario Internacional de Organismos de Patentes (Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japón) el 7 de octubre de 2008 como depósito internacional y se le asignó un número de registro de PERM BP-11027.

El plásmido pCABD2 contiene un gen dapA mutante derivado de Escherichia coli y que codifica para una dihidrodipicolinato sintasa (DDPS) que tiene una mutación para la desensibilización frente a la inhibición por retroalimentación por L-lisina, un gen lysC mutante derivado de Escherichia coli y que codifica para la aspartocinasa III que tiene una mutación para la desensibilización frente a la inhibición por retroalimentación por L-lisina, el gen dapB derivado de Escherichia coli y que codifica para la dihidrodipicolinato reductasa, y el gen ddh derivado de Brevibacterium lactofermentum y que codifica para la diaminopimelato deshidrogenasa.

Bacterias productoras de L-treonina

Los ejemplos preferidos de bacterias productoras de L-treonina usadas para la presente invención incluyen bacterias pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae en las que se potencian una o más actividades de las enzimas del sistema de biosíntesis de L-treonina. Los ejemplos de genes que codifican para enzimas de biosíntesis de L-treonina incluyen el gen de la aspartocinasa III (lysC), el gen de la aspartato semialdehído deshidrogenasa (asd), el gen de la aspartocinasa I (thrA), el gen de la homoserina cinasa (thrB), y el gen de la treonina sintasa (thrC) codificados por el operón thr. Pueden introducirse dos o más tipos de estos genes. Los genes que codifican para las enzimas de biosíntesis de L-treonina pueden introducirse en una bacteria Enterobacteriaceae con una disminución de la descomposición de treonina. Los ejemplos de bacterias Escherichia con disminución de la descomposición de treonina incluyen, por ejemplo, la cepa TDH6 que es deficiente en la actividad de la treonina deshidrogenasa (patente japonesa abierta a consulta por el público n.° 2001-346578).

Las actividades enzimáticas de las enzimas de biosíntesis de L-treonina se inhiben por el producto final, L-treonina. Por tanto, para construir cepas productoras de L-treonina, es deseable que los genes para las enzimas de biosíntesis de L-treonina se modifiquen de modo que las enzimas se desensibilicen frente a la inhibición por retroalimentación por L-treonina en las cepas productoras de L-treonina. Los genes thrA, thrB y thrC mencionados anteriormente constituyen el operón de treonina, que forma una estructura atenuadora. La expresión del operón de treonina se inhibe por isoleucina y treonina en el medio de cultivo y también se suprime por atenuación. Por tanto, el operón de treonina puede modificarse eliminando la secuencia líder en la región de atenuación o el atenuador (remítase a Lynn, S.P., Burton, W.S., Donohue, T.J., Gould, R.M., Gumport, R.L, y Gardner, J.F., J. Mol. Biol. 194: 59-69 (1987); documento WO02/26993; documento WO2005/049808).

El promotor nativo del operón de treonina está presente en el sentido de 5' del operón de treonina, y puede reemplazarse por un promotor no nativo (remítase al documento WO98/04715), o un operón de treonina que se ha modificado para que la expresión del gen de biosíntesis de treonina esté controlada por el represor y pueda construirse el promotor del fago X (remítase a la patente europea n.° 0593792). Además, para modificar una bacteria Escherichia de modo que se desensibilice frente a la inhibición por retroalimentación por L-treonina, puede seleccionarse una cepa resistente al ácido a-amino-p-hidroxiisovalérico (AHV).

Es preferible que el número de copias del operón de treonina que se modifica para desensibilizarse frente a la inhibición por retroalimentación por L-treonina esté aumentado, o que la expresión del operón de treonina esté aumentada ligándolo a un promotor potente. El número de copias también puede aumentarse, además de la amplificación usando un plásmido, transfiriendo el operón de treonina a un genoma usando un transposón, un fago Mu o similar.

Como el gen de la aspartocinasa III (lysC), es deseable usar un gen modificado para que la enzima esté desensibilizada frente a la inhibición por retroalimentación por L-lisina. Un gen lysC de este tipo modificado para que la enzima se desensibilice frente a la inhibición por retroalimentación puede obtenerse mediante el método descrito en patente estadounidense n.° 5.932.453.

Aparte de aumentar la expresión de los genes de biosíntesis de L-treonina, también puede aumentarse preferiblemente la expresión de los genes involucrados en la ruta glucolítica, el ciclo de TCA o la cadena respiratoria, los genes que regulan la expresión de estos genes, o los genes involucrados en la captación de azúcar. Los ejemplos de tales genes efectivos para la producción de L-treonina incluyen los genes que codifican para la transhidrogenasa (pntAB, patente europea n.° 733712), fosfoenolpiruvato carboxilasa (pepC, documento WO95/06114), fosfoenolpiruvato sintasa (pps, patente europea n.° 877090), y un gen que codifica para la piruvato carboxilasa de bacteria corineforme o bacteria Bacillus (documento WO99/18228, patente europea abierta a consulta por el público n.° 1092776).

Las bacterias productoras de L-treonina también pueden obtenerse preferiblemente potenciando la expresión de un gen que confiere resistencia a L-treonina y/o un gen que confiere resistencia a L-homoserina, o confiriendo resistencia a L-treonina y/o resistencia a L-homoserina a la bacteria huésped. Los ejemplos de los genes que confieren la resistencia mencionada anteriormente incluyen el gen rhtA (Res. Microbiol. 154: 123-135 (2003)), el gen rhtB (patente europea abierta a consulta por el público n.° 0994190), el gen rhtC (patente europea abierta a consulta por el público n.° 1013765), el gen yFiK y el gen yeaS (patente europea abierta a consulta por el público n.° 1016710). Los métodos a modo de ejemplo para conferir resistencia a la L-treonina a una bacteria huésped incluyen los descritos en la patente europea abierta a consulta por el público n.° 0994190 o el documento WO90/04636.

E. coli VKPM B-3996 (patente estadounidense n.° 5.175.107) puede ejemplificarse como una bacteria productora de L-treonina. La cepa VKPM B-3996 se depositó el 7 de abril de 1987 ante la Colección Nacional Rusa de Microorganismos Industriales (VKPM), GNII Genetika (Rusia, 117545 Moscú 1, Dorozhny proezd, 1) con el número de registro VKPM B-3996. La cepa VKPM B-3996 contiene el plásmido pVIC40 (documento WO90/04636), que se obtuvo al insertar los genes de biosíntesis de treonina (operón de treonina, thrABC) en un vector de plásmido de amplia gama de huéspedes pAYC32 que contiene el marcador de resistencia a estreptomicina (Chistorerdov, A.Y., y Tsygankov, Y.D., Plasmid, 16, 161-167 (1986)). En pVIC40, la aspartocinasa I-homoserina deshidrogenasa I codificada por el gen thrA en el operón de treonina se desensibiliza frente a la inhibición por retroalimentación por L-treonina.

E. coli VKPM B-5318 (remítase a la patente europea n.° 0593792) también puede ejemplificarse como una bacteria productora de L-treonina preferida. La cepa VKPM B-5318 se depositó ante la Colección Nacional Rusa de Microorganismos Industriales (VKPM) GNII Genetika el 3 de mayo de 1990 con un número de registro de VKPM B-5318. La cepa VKPM B-5318 es protótrofa con respecto a la L-isoleucina, y alberga un ADN de plásmido recombinante construido de manera que el operón de treonina, es decir, los genes de biosíntesis de treonina, deficientes en la región del atenuador, que es una región de regulación de la transcripción contenida originariamente, está ubicado en el sentido de 3' del represor C1 sensible a la temperatura derivado del fago X, el promotor PR y el gen que codifica para el extremo N-terminal de la proteína Cro, y la expresión de los genes de biosíntesis de treonina está regulada por el represor y el promotor derivado del fago X.

Bacterias productoras de L-homoserina

Los ejemplos de bacterias productoras de L-homoserina pertenecientes al género Escherichia incluyen la cepa NZ10(thrB), que es un revertiente Leu+ derivado de la cepa conocida C600 (thrB, leuB, remítase a Appleyard R.K., Genetics, 39, 440-452, 1954). Una cepa transformante NZ10 transformada con el gen thrA que codifica para la aspartocinasa-homoserina deshidrogenasa I también puede usarse preferiblemente.

Si el número de copias del gen rhtB de una bacteria está aumentado, la bacteria se vuelve resistente a la L-homoserina, y se mejora su productividad para L-homoserina, L-treonina, L-alanina, L-valina y L-isoleucina (patente europea abierta a consulta por el público n.° 994190 A2). Además, si el número de copia del gen rthC de una bacteria está aumentado, la bacteria se vuelve resistente a L-homoserina y L-treonina, y su productividad para L-homoserina, L-treonina y L-leucina mejora (patente europea abierta a consulta por el público n.° 1013765 A1).

Además, también puede usarse Escherichia coli cepa 44 (depositada ante la Colección Nacional de Microorganismos Industriales de Rusia con un número de registro de VKPM B-2175).

Bacterias productoras de L-metionina

Ejemplos de bacterias productoras de L-metionina pertenecientes al género Escherichia incluir cepas tales como Escherichia coli AJ11539 (NRRL B-12399), AJ11540 (NRRL B-12400), AJ11541 (NRRL B-12401), AJ11542 (NRRL B-12402, GB 2075055), 218 (VKPM B-8125, patente europea n.° 1239041), Etcétera.

Bacterias productoras de ácido L-aspártico

Los ejemplos de bacterias productoras de ácido L-aspártico pertenecientes al género Escherichia incluyen la cepa de Escherichia coli en la que se potencia la actividad de aspartasa para generar ácido L-aspártico a partir del ácido fumárico (publicación de patente japonesa n.° 38-6588).

Bacterias productoras de L-alanina

La L-alanina se produce por la p-descarboxilación del ácido aspártico. Por tanto, los ejemplos de bacterias productoras de L-alanina pertenecientes al género Escherichia incluyen la cepa de Escherichia coli en la que se potencia la aspartato p-descarboxilasa (patente japonesa abierta a consulta por el público n.° 2-242690).

Bacterias productoras de L-isoleucina

Los ejemplos de cepas parentales que se usan para derivar bacterias productoras de L-isoleucina incluyen, pero no se limitan a, mutantes que son resistentes a la 6-dimetilaminopurina (patente japonesa abierta a consulta por el público n.° 5-304969), mutantes que son resistentes a análogos de isoleucina tales como hidroxamato de tiaisoleucina e isoleucina, y los mutantes que son resistentes adicionalmente a hidroxamato de DL-metionina y/o arginina (patente japonesa abierta a consulta por el público n.° 5-130882). Además, las cepas recombinantes transformadas con genes que codifican para proteínas involucradas en la biosíntesis de L-isoleucina tales como la treonina desaminasa y la acetohidroxato sintasa, también se usan como cepas parentales (patente japonesa abierta a consulta por el público n.° 2-458, documento FR 0356739 y la patente estadounidense n.° 5.998.178).

Bacterias productoras de L-asparagina

La L-asparagina se produce al transferir un grupo amino a ácido aspártico (Boehlein, S.K., Richards, N.G.J. y Schuster, S.M. (1994a), J. Biol. Chem., 269, 7450-7457). Por tanto, los ejemplos de bacterias productoras de L-asparagina pertenecientes al género Escherichia incluyen cepas productoras de ácido L-aspártico de Escherichia coli en las que se potencia la asparagina sintetasa.

La bacteria para su uso en la presente invención puede obtenerse modificando tal bacteria que tiene la capacidad para producir un L-aminoácido seleccionado de L-lisina, L-treonina, ácido L-aspártico, L-asparagina, L-metionina, L-alanina, L-isoleucina y L-homoserina tal como se describió anteriormente para que la expresión del gen gltP y/o el gen gltS esté aumentada. Alternativamente, la bacteria también puede obtenerse confiriendo una capacidad para producir tal L-aminoácido a una bacteria que se ha modificado de modo que la expresión del gen gltP y/o el gen gltS esté aumentada.

El estado de “modificándose para que la expresión del gen gltP y/o el gen gltS de la misma esté aumentada “corresponde a un estado en el que el número de las moléculas codificadas por el gen gltP y/o el gen gltS por célula aumenta o la actividad de la proteína GltP o la proteína GltS codificada por estos genes por molécula mejora en comparación con una cepa no modificada tal como una cepa de tipo natural o parental. La bacteria se modifica preferiblemente de modo que la actividad de la proteína GltP o la proteína GltS por célula aumenta hasta el 150% o más, más preferiblemente el 200% o más, todavía más preferiblemente el 300% o más, de la actividad de una cepa no modificada. Los ejemplos de cepas no modificadas que sirven como referencia para la comparación anterior, tales como una cepa de tipo natural de un microorganismo perteneciente a la familia Enterobacteriaceae incluyen, por ejemplo, Escherichia coli cepa MG1655 (ATCC 47076), cepa W3110 (ATCC 27325), Pantoea ananatis cepa AJ13335 (FERM BP-6614), etcétera. Las actividades de las proteínas GltP y GltS se refieren a actividades responsables de la captación de ácido L-glutámico en células bacterianas desde el exterior de las células, y se denominan “actividad como transportador de L-glutamato” en esta memoria descriptiva. La actividad como transportador de L-glutamato puede confirmarse comparando la velocidad de captación de L-glutamato en células del microorganismo para su uso en la presente invención con la velocidad de captación de L-glutamato de una cepa no modificada correspondiente. La velocidad de captación de L-glutamato puede medirse, por ejemplo, haciendo reaccionar células vivas con ácido L-glutámico marcado con RI durante un cierto periodo de tiempo, y detectando la radiactividad en las células (Wallace, B; Yang, YJ; Hong, JS; Lum, D, J. Bacteriol., jun. de 1990; 172 (6): 3214-3220).

El aumento de la expresión del gen gltP y/o el gen gltS en comparación con el de una cepa no modificada, tal como una cepa parental o de tipo natural, puede confirmarse comparando la cantidad de ARNm del gen con la de la cepa de tipo natural o no modificada. Los ejemplos del método para confirmar la cantidad de expresión incluyen la hibridación de tipo Northern y la PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR, Clonación molecular, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, EE.UU., 2001). La expresión puede estar aumentada a cualquier nivel siempre que el nivel esté aumentado en comparación con el de una cepa no modificada, y por ejemplo, esté aumentado de manera deseable no menos de 1,5 veces, más preferiblemente no menos de 2 veces, aún más preferiblemente no menos más de 3 veces, en comparación con el de, por ejemplo, una cepa no modificada. Además, la potenciación de las actividades de las proteínas codificadas por el gen gltP y/o el gen gltS también puede confirmarse basándose en el aumento en la cantidad de la proteína diana en comparación con la de una cepa no modificada, y puede detectarse mediante, por ejemplo, inmunotransferencia de tipo Western usando un anticuerpo (Clonación molecular, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, EE.UU., 2001).

Los genes gltP y gltS significan los genes gltP y gltS de un microorganismo perteneciente a la familia Enterobacteriaceae, u homólogos de los mismos. Como el gen gltP de Escherichia coli, puede ejemplificarse un gen que codifica para una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 (SEQ ID NO: 1) (b4077, número de registro de GenBank NP_418501. [gi: 16131903]). Como el gen gltS de Escherichia coli, puede ejemplificarse un gen que codifica para una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 (SEQ ID NO: 3) (b3653, número de registro de GenBank NP-418110 [gi: 16131524]).

Un homólogo del gen gltP o gltS significa un gen derivado de otro microorganismo, pero que muestra una alta similitud estructural con el gen gltP o el gen gltS de una bacteria Escherichia y que codifica para una proteína que tiene la actividad de reducir la cantidad de producción como subproducto de ácido L-glutámico en el momento de producir un L-aminoácido seleccionado de L-lisina, L-treonina, ácido L-aspártico, L-asparagina, L-metionina, L-alanina, L-isoleucina y L-homoserina y la actividad de captar ácido glutámico en las células, cuando el gen se introduce en un huésped. Los ejemplos de homólogos de los genes gltP o gltS incluyen, por ejemplo, aquellos genes registrados en GenBank, incluidos los de bacterias Shigella y Enterobacter Además, el gen gltP y/o el gen gltS puede ser un gen clonado a partir de una bacteria Streptomyces como Streptomyces coelicolor o una bacteria del ácido láctico del género Lactococcus, Lactobacillus o similar basándose en la homología con los genes ejemplificados anteriormente. Puede usarse cualquier gen que muestre alta homología con el gen gltP y/o el gen gltS de una bacteria Escherichia, aunque se le puede dar un nombre de gen diferente. Los homólogos del gen gltP y/o del gen gltS incluyen, por ejemplo, genes que pueden clonarse usando los oligonucleótidos sintéticos de las SEQ ID NO: 8 y 9, o las SEQ ID NO: 10 y 11.

Además, como homólogo del gen gltP y/o gltS, puede obtenerse un gen que muestra una alta homología de una base de datos conocida basándose en la información de secuencia mencionada anteriormente. La homología de las secuencias de aminoácidos y las secuencias de nucleótidos puede determinarse usando, por ejemplo, el algoritmo BLAST de Karlin y Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (1993)) o FASTA (Methods Enzymol., 183, 63 (1990)). Los programas llamados BLASTN y BLASTX se han desarrollado basándose en este algoritmo BLAST (remítase a www.ncbi.nlm.nih.gov).

En esta memoria descriptiva, el término “homología” también puede usarse para referirse a “identidad”.

Se describen a continuación homólogos que muestran una alta homología con el gen gltP o gltS de Escherichia coli con las homologías, los nombres de las bacterias y los números de registro en bases de datos de secuencias de genes.

Las secuencias de aminoácidos conservadas en los homólogos mencionados anteriormente se muestran en la SEQ ID NO: 12 (GltP) y la SEQ ID NO: 13 (GltS).

Además, el gen gltP y/o el gen gltS usados para la presente invención no se limitan a un gen de tipo natural, y pueden ser un gen mutante o modificado artificialmente que codifica para una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, 4, 12 ó 13, que incluye sustituciones y deleciones, inserciones, adiciones o similares de uno a 20 residuos de aminoácido en una o más posiciones siempre que la función de la proteína codificada, es decir, la actividad como transportador de L-glutamato, no se degrade.

Aunque el número que significa el término “uno o varios” usado en el presente documento puede diferir dependiendo de las posiciones en la estructura tridimensional de la proteína o los tipos de residuos de aminoácido, específicamente, significa de 1 a 20, preferiblemente de 1 a 10, más preferiblemente de 1 a 5. Las sustituciones, deleciones, inserciones o adiciones antes mencionadas de uno o más residuos de aminoácido corresponden a una mutación conservativa que mantiene la actividad como transportador de L-glutamato. La mutación conservativa es normalmente una sustitución conservativa. La sustitución conservativa es una sustitución en la que la sustitución tiene lugar mutuamente entre Phe, Trp y Tyr, si el sitio de sustitución es un aminoácido aromático; entre Leu, Ile y Val, si el sitio de sustitución es un aminoácido hidrófobo; entre Gln y Asn, si es un aminoácido polar; entre Lys, Arg y His, si es un aminoácido básico; entre Asp y Glu, si es un aminoácido ácido; y entre Ser y Thr, si es un aminoácido que tiene un grupo hidroxilo. Los ejemplos específicos de sustitución considerados como sustitución conservativa incluyen: sustitución de Ser o Thr por Ala; sustitución de Gln, His o Lys por Arg; sustitución de Glu, Gln, Lys, His o Asp por Asn; sustitución de Asn, Glu o Gln por Asp; sustitución de Ser o Ala por Cys; sustitución de Asn, Glu, Lys, His, Asp o Arg por Gln; sustitución de Gly, Asn, Gln, Lys o Asp por Glu; sustitución de Pro por Gly; sustitución de Asn, Lys, Gln, Arg o Tyr por His; sustitución de Leu, Met, Val o Phe por Ile; sustitución de Ile, Met, Val o Phe por Leu; sustitución de Asn, Glu, Gln, His o Arg por Lys; sustitución de Ile, Leu, Val o Phe por Met; sustitución de Trp, Tyr, Met, Ile o Leu por Phe; sustitución de Thr o Ala por Ser; sustitución de Ser o Ala por Thr; sustitución de Phe o Tyr por Trp; sustitución de His, Phe o Trp por Tyr; y sustitución de Met, Ile o Leu por Val. La mutación para tal sustitución, deleción, inserción, adición, inversión o similar de residuos de aminoácido tal como se describió anteriormente también incluye una mutación que se produce de manera natural basada en la diferencia individual, diferencia en la especie de microorganismos que tienen el gen gltP y/o el gen gltS (mutante o variante), etcétera. Un gen que tiene tal mutación puede obtenerse modificando la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 ó 3 o un homólogo de la misma mediante, por ejemplo, mutagénesis específica del sitio, de modo que la sustitución, deleción, inserción o adición de un residuo o residuos de aminoácido se incluyen en la proteína codificada en un sitio específico.

Además, como el gen gltP y/o el gen gltS, puede usarse un gen que codifica para una proteína que muestra una homología del 80% o más, preferiblemente el 90% o más, más preferiblemente el 95% o más, de manera particularmente preferible el 97% o más, con la secuencia de aminoácidos total de la SEQ ID NO: 2, 4, 12 ó 13 y que tiene la actividad como transportador de L-glutamato.

Además, pueden reemplazarse codones del gen gltP y/o el gen gltS por aquellos fácilmente usados por un huésped en el que se introduce el gen gltP y/o el gen gltS. Además, mientras se mantenga la actividad como transportador de L-glutamato, la proteína codificada por el gen gltP o el gen gltS puede ser una proteína en la que la secuencia del extremo N o C-terminal se elonga o deleciona. La longitud de la secuencia de aminoácidos que va a elongarse o delecionarse puede tener 50 o menos, preferiblemente 20 o menos, más preferiblemente 10 o menos, de manera particularmente preferible 5 o menos, en cuanto al número de residuos de aminoácido. Más específicamente, la proteína puede ser una proteína que tenga la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 con elongación o deleción de 5 a 50 residuos de aminoácido en el lado N-terminal o de 5 a 50 residuos de aminoácido en el lado C-terminal.

Además, también puede obtenerse un gen gltP y/o gen gltS modificado mediante el tratamiento de mutación conocido convencionalmente que se describe a continuación. Los ejemplos del tratamiento de mutación incluyen un método de tratamiento de uno o más del gen gltP y/o el gen gltS con hidroxilamina o similar in vitro y un método de tratamiento de un microorganismo, por ejemplo, bacterias Escherichia que contienen el gen con irradiación con rayos ultravioleta o un mutágeno usado en un tratamiento de mutación habitual tal como N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) o el metanosulfonato de etilo (EMS). Si tal gen modificado codifica para una proteína que tiene la actividad como transportador de L-glutamato puede confirmarse, por ejemplo, permitiendo la expresión del gen en una célula apropiada, y examinando si la proteína tiene la actividad como transportador de L-glutamato.

Además, el gen gltP y/o el gen gltS también pueden ser un ADN que puede hibridarse con una secuencia complementaria a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 ó 3, respectivamente, o una sonda que puede prepararse a partir de tales secuencias en condiciones rigurosas, y que codifica para una proteína que tiene la actividad como transportador de L-glutamato. Las “condiciones rigurosas” a las que se hace referencia en el presente documento significan condiciones en las cuales se forman híbridos específicos, pero no se forman híbridos inespecíficos. Aunque es difícil definir definitivamente la condición con números, los ejemplos incluyen, por ejemplo, las condiciones en las que hibridan entre sí los ADN que muestran una alta homología entre sí, por ejemplo, los ADN que muestran una homología de no menos del 80%, preferiblemente no menos del 90%. más preferiblemente no menos del 95%, de manera particularmente preferible no menos del 97%, y los ADN que tienen una homología menor que el nivel anterior no se hibridan entre sí, y una condición de lavado en la hibridación de tipo Southern habitual, es decir, una condición de lavado una vez, preferiblemente dos o tres veces, a concentraciones de sal y temperatura de 1 x SSC, SDS al 0,1% a 60°C, preferiblemente 0,1 x SSC, SDS al 0,1% a 60°C, más preferiblemente 0,1 x SSC, 0,1% SDS a 68°C.

Como sonda, también puede usarse una parte de la secuencia complementaria de la secuencia de la SEQ ID NO: 1. Una sonda de este tipo puede producirse mediante PCR usando oligonucleótidos preparados basándose en la secuencia complementaria de la SEQ ID NO: 1 como cebadores y un fragmento de ADN que contiene la secuencia de nucleótidos como molde. Por ejemplo, cuando se usa un fragmento de ADN que tiene una longitud de aproximadamente 300 pb como sonda, la condición de lavado después de la hibridación puede ejemplificarse mediante 2 x SSC, SDS al 0,1% a 50°C.

La modificación para potenciar la expresión de uno o más del gen gltP y/o el gen gltS puede lograrse aumentando el número de copias del gen en las células usando, por ejemplo, técnicas de recombinación génica. Por ejemplo, el número de copias del gen puede aumentarse ligando un fragmento de ADN que contiene el gen gltP y/o el gen gltS a un vector que funciona en una bacteria huésped, preferiblemente un vector multicopia, para preparar un ADN recombinante, e introduciéndolo en una bacteria para transformar la bacteria.

Cuando se usa el gen gltP de Escherichia coli como el gen gltP, puede obtenerse mediante PCR (reacción en cadena de la polimerasa, remítase a White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)) usando cebadores preparados basándose en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1, por ejemplo, los cebadores mostrados en las SEQ ID NO: 8 y 9, y un ADN genómico de Escherichia coli como molde. Los genes gltP derivados de otras bacterias pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae también puede obtenerse a partir de un ADN genómico de cada microorganismo o una biblioteca de ADN genómico mediante PCR usando, como cebadores, oligonucleótidos preparados basándose en el gen gltP conocido para la bacteria o una bacteria de otra especie, o información de secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por el gen gltP, o hibridación usando un oligonucleótido preparado basándose en tal información de secuencia tal como se describió anteriormente como una sonda. Puede prepararse un ADN genómico a partir de un microorganismo que sirve como donador de ADN mediante, por ejemplo, el método de Saito y Miura (Saito H. y Miura K., Biochem. Biophys Acta, 72, 619, 1963; Experiment Manual of Biotechnology, editado por The Society for Biotechnology, Japón, págs. 97-98, Baifukan Co., Ltd., 1992).

Entonces el gen gltP y/o el gen gltS amplificados mediante PCR se ligan a un vector de ADN que puede funcionar en células de una bacteria huésped para preparar un ADN recombinante. Los ejemplos del vector que puede funcionar en células de una bacteria huésped incluyen vectores replicables de manera autónoma en células de la bacteria huésped. Los ejemplos de vectores replicables de manera autónoma en células de Escherichia coli incluyen pUC19, pUC18, pHSG299, pHSG399, pHSG398, pACYC184, (los vectores de las series pHSG y pACYC están disponibles en Takara Bio Inc.), RSF1010, pBR322, pMW219 (pMw219 está disponible de Nippon Gene Co., Ltd.), pSTV29 (disponible de Takara Bio Inc.), etcétera.

Con el fin de introducir un ADN recombinante preparado tal como se describió anteriormente en una bacteria, puede emplearse cualquier método de transformación conocido descrito hasta ahora. Por ejemplo, hay un método de tratamiento de células receptoras con cloruro de calcio para aumentar la permeabilidad para el ADN, que se ha informado para Escherichia coli K-12 (Mandel, M. e Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)), y un método de uso de células competentes preparadas a partir de células en crecimiento e introducción de ADN en ellas, que se ha informado para Bacillus subtilis (Duncan, C.H., Wilson, G.A. y Young, F.E., Gene, 1, 153 (1977)). También es aplicable un método para convertir las células receptoras de ADN en protoplastos o esferoplastos, que captan fácilmente un ADN recombinante, e introducir un ADN recombinante en ellos, que se conoce para Bacillus subtilis, actinomicetos y levaduras (Chang, S. y Choen, S.N., Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979); Bibb, M.J., Ward, J.M. y Hopwood, O.A., Nature, 274, 398 (1978); Hinnen, A., Hicks, J.B. y Fink, G.R., Proc. Natl Acad Sci. USA, 75, 1929 (1978)).

El número de copias de uno o más del gen gltP y/o el gen gltS también puede aumentarse integrando múltiples copias de una o más de los genes gltP y/o gltS descritos anteriormente en un ADN genómico de una bacteria. Para integrar múltiples copias de uno o más de los genes gltP y/o gltS en un ADN genómico de una bacteria, se realiza recombinación homóloga seleccionando como diana una secuencia que está presente en múltiples copias en el ADN genómico. Como la secuencia presente en un ADN genómico en un número de múltiples copias, puede usarse un ADN repetitivo o una repetición invertida presente al final de un elemento transponible. El gen puede estar ligado a un lado del gen gltP y/o el gen gltS que está presente en el genoma en tándem, o el gen también puede introducirse en un gen innecesario en el genoma de modo que el gen esté presente en un número múltiple. Dicha transferencia génica puede lograrse usando un vector sensible a la temperatura o un vector de integración.

Alternativamente, tal como se divulga en la patente japonesa abierta a consulta por el público n.° 2-109985, también es posible incorporar el gen gltP y/o el gen gltS en un transposón, y permitir que se transfiera para introducir múltiples copias del gen en un ADN genómico. Se puede confirmar si el gen se ha transferido a un genoma mediante la hibridación de tipo Southern usando una parte del gen gltP y/o el gen gltS como sonda.

Adicionalmente, además del aumento del número de copias del gen descrito anteriormente, la expresión del gen gltP y/o el gen gltS también puede potenciarse de acuerdo con el método descrito en el documento WO00/18935 reemplazando una secuencia de control de la expresión, como un promotor del gen gltP y/o el gen gltS en un ADN genómico o un plásmido con un promotor más fuerte, modificando las secuencias de la región -35 y la región -10 para que las secuencias se conviertan en secuencias consenso, amplificando un regulador que aumenta la expresión del gen gltP y/o el gen gltS, o delecionando o atenuando un regulador que disminuye la expresión del gen gltP y/o el gen gltSe. Por ejemplo, el promotor lac, el promotor trp, el promotor trc, el promotor tac, el promotor araBA, el promotor PR del fago lambda y el promotor PL, el promotor tet, el promotor de T7, el promotor ^10, etcétera, se conocen como promotores fuertes. También puede usarse un promotor derivado del promotor del operón de treonina de E. coli o el promotor tac.

Una región promotora, RBS (secuencia de unión al ribosoma), o región SD del gen gltP y/o el gen gltS también puede modificarse para volverse más fuerte mediante la introducción de una sustitución de nucleótidos o similar. Se describen ejemplos del método para evaluar la fuerza de un promotor y promotores fuertes en el artículo de Goldstein et al. (Procaryotic promoters in biotechnology, Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)). Además, se sabe que la sustitución de varios nucleótidos en un espaciador entre el sitio de unión al ribosoma (RBS) y el codón de iniciación, especialmente una secuencia inmediatamente en el sentido de 5' del codón de iniciación, afecta en gran medida a la eficiencia de traducción del ARNm y, por tanto, esta secuencia puede modificarse. Pueden identificarse regiones de control de la expresión del gen gltP y/o el gen gltS tales como un promotor usando un vector de sonda promotora o un software de análisis de genes como GENETYX. Mediante tal sustitución o modificación del promotor tal como se describió anteriormente, la expresión del gen gltP y/o el gen gltS está potenciada. La sustitución de una secuencia de control de la expresión también puede lograrse, por ejemplo, mediante un método que usa un plásmido sensible a la temperatura o una integración dirigida por el rojo (documento WO2005/010175).

Las descripciones mencionadas anteriormente referentes a homólogos de genes y proteínas, y el aumento de la expresión génica también se aplican de manera similar a genes distintos de los genes gltP y gltS, por ejemplo, el gen usado para conferir una capacidad de producción de L-aminoácidos, el gen ybjE, y sus productos de expresión.

<2> Método para producir L-aminoácido

El método para producir un L-aminoácido según la presente invención se caracteriza por cultivar la bacteria en un medio para producir y acumular un L-aminoácido seleccionado de L-lisina, L-treonina, L-asparagina, ácido L-aspártico, L-metionina, L-alanina, L-isoleucina y L-homoserina en el medio, y recoger el L-aminoácido del medio o las células.

Como medio que va a usarse, pueden usarse medios usados convencionalmente para la producción de L-aminoácidos mediante fermentación usando bacterias. Es decir, pueden usarse medios habituales que contienen una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, iones inorgánicos y, opcionalmente, otros componentes orgánicos, según sea necesario. Como fuente de carbono, pueden usarse sacáridos tales como glucosa, sacarosa, lactosa, galactosa, fructosa e hidrolizados de almidones; alcoholes tales como glicerol y sorbitol; y ácidos orgánicos tales como ácido fumárico, ácido cítrico y ácido succínico. Es especialmente preferible usar glucosa, fructosa o sacarosa como fuente de carbono. Además, como para una cepa que no tiene capacidad de asimilación de sacarosa, si se introduce un gen de asimilación de sacarosa en dicha cepa, es posible usar la sacarosa como fuente de carbono (patente estadounidense n.° 5.175.107). Como fuente de nitrógeno, pueden usarse sales de amonio inorgánicas tales como sulfato de amonio, cloruro de amonio y fosfato de amonio, nitrógeno orgánico tal como hidrolizado de soja, gas amoniaco, amoniaco acuoso, etcétera. En cuanto a las fuentes de oligonutrientes orgánicos, es deseable que el medio contenga sustancias requeridas tales como vitamina B¹y L-homoserina, extracto de levadura, etcétera en cantidades apropiadas. Aparte de lo anterior, se añaden en pequeñas cantidades, según sea necesario, fosfato de potasio, sulfato de magnesio, iones de hierro, iones de manganeso, etcétera. Además, el medio usado para la presente invención puede ser un medio natural o un medio sintético, siempre que se use un medio que contenga una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno e iones inorgánicos, y que contenga otros componentes traza orgánicos, según se requiera.

Además, puede añadirse un L-aminoácido que mejora el crecimiento y la productividad. En el caso de la fermentación con L-lisina, es preferible añadir L-treonina, L-homoserina y/o L-isoleucina, y en el caso de la L-treonina, es preferible añadir L-isoleucina, L-lisina, L-homoserina, etc. La concentración de adición es de aproximadamente 0,01 a 10 g/l.

El cultivo se realiza preferiblemente durante de 1 a 7 días en condiciones aerobias. La temperatura de cultivo es preferiblemente de 24 a 37°C, y el pH durante el cultivo es preferiblemente de 5 a 9. Para el ajuste del pH, pueden usarse sustancias inorgánicas u orgánicas ácidas o alcalinas, gas amoniaco, etcétera. La recogida del L-aminoácido del medio de fermentación puede lograrse generalmente mediante una combinación de métodos conocidos tales como el método de resina de intercambio iónico y el método de precipitación. Cuando el L-aminoácido se acumula en las células, las células pueden romperse, por ejemplo, con ondas supersónicas o similares, y el L-aminoácido puede recogerse mediante el método de la resina de intercambio iónico o similar del sobrenadante obtenido mediante la retirada de las células de la suspensión con rotura celular mediante centrifugación.

Cuando se produce un aminoácido básico como la L-lisina, la producción puede realizarse mediante un método en el que la fermentación se realiza controlando el pH del medio durante el cultivo para que sea de 6,5 a 9,0 y el pH del medio al final del cultivo sea de 7,2 a 9,0 asegurando un periodo de cultivo en el que el medio contiene 20 mM o más de iones bicarbonato y/o iones carbonato, de modo que estos iones bicarbonato y/o iones carbonato sirvan como contraiones del aminoácido básico, y luego se recoge el aminoácido básico objetivo (patente japonesa abierta a consulta por el público n.° 2002-65287, solicitud de patente estadounidense publicada n.° 2002/0025564, patente europea abierta a consulta por el público n.° 1813677).

Cuando un microorganismo que tiene una capacidad de producción de aminoácidos básicos se cultiva en un medio en condiciones aerobias, pueden usarse iones carbonato, iones bicarbonato, o ambos, como contraiones principales del aminoácido básico. Para proporcionar iones carbonato y/o iones bicarbonato en una cantidad requerida para servir como contraiones del aminoácido básico, se sabe que el pH del medio puede controlarse para que sea de 6,5 a 9,0, preferiblemente de 6,5 a 8,0, durante el cultivo, y puede controlarse para que sea de 7,2 a 9,0 al final del cultivo, y la presión en el tanque de fermentación puede controlarse para que sea positiva durante la fermentación, o puede suministrarse dióxido de carbono o un gas mixto que contiene dióxido de carbono al medio (patente japonesa abierta a consulta por el público n.° 2002-65287, solicitud de patente estadounidense publicada n.° 2002/0025564, patente europea abierta a consulta por el público n.° 1813677).

En la presente invención, la presión en el tanque de fermentación puede controlarse para que sea positiva durante la fermentación, y al mismo tiempo, puede suministrarse gas dióxido de carbono o un gas mixto que contiene dióxido de carbono gaseoso al medio. Ambas operaciones anteriores se realizan preferiblemente de modo que haya un periodo de cultivo cuando preferiblemente 20 mM o más, más preferiblemente 30 mM o más, de manera particularmente preferible 40 mM o más, de iones bicarbonato y/o iones carbonato están presentes en el medio. La presión interna del tanque de fermentación, la cantidad de suministro de dióxido de carbono o el gas mixto que contiene dióxido de carbono, o el volumen limitado de suministro de gas pueden determinarse, por ejemplo, midiendo los iones bicarbonato o iones carbonato en el medio, o el pH o la concentración de amoniaco del medio. En la realización anterior, el pH del medio se controla para que sea de 6,0 a 9,0, preferiblemente de 6,5 a 8,0, durante el cultivo, y de 7,2 a 9,0 al final del cultivo. Según la realización anterior, el pH del medio puede reducirse en comparación con los métodos convencionales, asegurando la presencia de iones bicarbonato y/o iones carbonato en una cantidad requerida como contraiones. Cuando el pH se controla con amoniaco, se suministra amoniaco para aumentar el pH y puede servir como fuente de nitrógeno para el aminoácido básico. Los ejemplos de cationes distintos del aminoácido básico en el medio incluyen K, Na, Mg, Ca, etc. que se originan en componentes del medio. Estos están presentes preferiblemente en una cantidad del 50% o menos del total de cationes.

Además, la presión interna del tanque de fermentación durante la fermentación puede hacerse positiva, por ejemplo, haciendo que la presión del suministro de gas sea mayor que la presión de escape. Al hacer positiva la presión interna del tanque de fermentación, el dióxido de carbono generado por la fermentación se disuelve en el medio de cultivo para generar iones bicarbonato o iones carbonato, y estos pueden servir como contraiones del aminoácido básico. Específicamente, la presión interna del tanque de fermentación es de 0,03 a 0,2 MPa, preferiblemente de 0,05 a 0,15 MPa, más preferiblemente de 0,1 a 0,3 MPa, en términos de presión manométrica (diferencia de presión con respecto a la presión atmosférica). Además, al suministrar dióxido de carbono o un gas mixto que contiene dióxido de carbono al medio de cultivo, el dióxido de carbono puede disolverse en el medio. Además, cuando se suministra dióxido de carbono o un gas mixto que contiene dióxido de carbono al medio, la presión interna del tanque de fermentación se puede ajustar para que sea positiva.

La presión interna del tanque de fermentación se puede ajustar para que sea positiva, por ejemplo, haciendo que la presión del suministro de gas sea mayor que la presión de escape. Además, cuando se suministra dióxido de carbono al medio, por ejemplo, puede burbujearse en el medio dióxido de carbono puro o un gas mixto que contenga el 5% en volumen o más de dióxido de carbono.

Los métodos mencionados anteriormente para disolver iones bicarbonato y/o iones carbonato en el medio pueden usarse independientemente, o pueden usarse dos o más de ellos en combinación.

En los métodos convencionales, habitualmente se añade una cantidad suficiente de sulfato de amonio o cloruro de amonio al medio para servir como contraiones del aminoácido básico que va a producirse. También se añaden productos de descomposición de ácido sulfúrico o ácido clorhídrico de las proteínas, etc., al medio como componente nutriente y, por tanto, los iones sulfato y los iones cloruro generados a partir de estos están presentes en el medio. Por tanto, la concentración de los iones carbonato débilmente ácidos es extremadamente baja durante el cultivo, es decir, está en un orden de ppm. La realización anterior de la presente invención se caracteriza porque estos iones sulfato e iones cloruro se reducen, y el dióxido de carbono liberado por el microorganismo durante la fermentación se disuelve en el medio en el entorno de fermentación mencionado anteriormente y se usa como contraiones. Por tanto, en la realización anterior de la presente invención, no se requiere añadir iones sulfato o iones cloruro al medio en una cantidad mayor que la cantidad requerida para el crecimiento. Se prefiere que se añada una cantidad apropiada de sulfato de amonio o similar al medio en una etapa temprana del cultivo, y la adición se termina en la mitad del cultivo. Alternativamente, puede añadirse sulfato de amonio o similar mientras se mantiene el equilibrio con los iones carbonato o iones bicarbonato disueltos en el medio. Además, como fuente de nitrógeno del aminoácido básico, puede añadirse amoniaco al medio. El amoniaco puede suministrarse al medio de manera independiente o junto con otros gases.

Se prefieren más menores concentraciones de aniones distintos de los iones bicarbonato y/o los iones carbonato en el medio siempre que estén presentes en cantidades que se requieren para el crecimiento del microorganismo. Los ejemplos de dichos aniones incluyen iones cloruro, iones sulfato, iones fosfato, ácidos orgánicos ionizados, iones hidróxido, etc. La concentración molar total de estos otros iones habitualmente es de preferiblemente 900 mM o menor, más preferiblemente 700 mM o menor, todavía más preferiblemente 500 mM o menor, aún más preferiblemente 300 mM o menor, de manera particularmente preferible 200 mM o menor.

Reducir las cantidades necesarias de iones sulfato y/o iones cloruro es uno de los objetos de la realización anterior de la presente invención, y la cantidad total de iones sulfato o iones cloruro, o ambos contenidos en el medio, generalmente es de 700 mM o menor, preferiblemente 500 mM o menor, más preferiblemente 300 mM o menor, todavía más preferiblemente 200 mM o menor, de manera particularmente preferible 100 mM o menor.

Si el sulfato de amonio se añade a un medio como fuente de contraiones de un aminoácido básico, el dióxido de carbono en el medio de cultivo generalmente se elimina por los iones sulfato. Sin embargo, en la realización anterior de la presente invención, no es necesario añadir una cantidad en exceso de sulfato de amonio al medio y, por tanto, el dióxido de carbono puede disolverse fácilmente en el medio de fermentación.

Además, en la realización anterior de la presente invención, es preferible controlar la concentración de amoniaco total en el medio en una medida tal que “la producción del aminoácido básico no se inhiba”. Los ejemplos de las condiciones para alcanzar tal estado incluyen, por ejemplo, condiciones que proporcionan un rendimiento y/o una productividad correspondientes preferiblemente al 50% o más, más preferiblemente al 70% o más, de manera particularmente preferible al 90% o más, del rendimiento y/o la productividad obtenibles en la producción del aminoácido básico en condiciones óptimas. Específicamente, la concentración de amoniaco total en el medio es preferiblemente de 300 mM o menor, más preferiblemente de 250 mM o menor, de manera particularmente preferida de 200 mM o menor. El grado de disociación del amoniaco disminuye a medida que aumenta el pH. El amoniaco no disociativo es más tóxico para las bacterias en comparación con los iones amonio. Por tanto, el límite superior de la concentración de amoniaco total debe determinarse también dependiendo del pH del medio de cultivo. Es decir, a medida que aumenta el pH del medio de cultivo, disminuye la concentración de amoniaco total aceptable. Por tanto, la concentración de amoniaco total mencionada anteriormente “que no inhibe la producción de aminoácidos básicos” se determina preferiblemente para cada valor de pH específico. Sin embargo, el intervalo de concentración de amoniaco total que es aceptable al nivel de pH más alto durante el cultivo puede usarse como el límite superior de la concentración de amoniaco total durante todo el periodo de cultivo.

Por otro lado, la concentración de amoniaco total que funciona como fuente de nitrógeno requerida para el crecimiento del microorganismo y la producción de la sustancia básica no está particularmente limitada, y puede determinarse de manera apropiada, siempre que un nivel reducido de la fuente de nitrógeno que puede dar como resultado el agotamiento continuo del amoniaco durante el cultivo no reduzca la productividad de la sustancia objetivo por el microorganismo. Por ejemplo, la concentración de amoniaco puede medirse a lo largo del tiempo durante el cultivo, y si el amoniaco en el medio se agota, puede añadirse una pequeña cantidad de amoniaco al medio. Aunque la concentración de amoniaco total después de la adición de amoniaco no está particularmente limitada, la concentración de amoniaco total puede ser, por ejemplo, de preferiblemente 1 mM o mayor, más preferiblemente 10 mM o mayor, de manera particularmente preferible 20 mM o mayor.

El medio usado para el presente método puede ser cualquier medio siempre que sea un medio que contenga una fuente de carbono y una fuente de nitrógeno como fuentes de nutrientes. Para el método de la presente invención, puede usarse cualquiera de cultivo discontinuo, cultivo semicontinuo y cultivo continuo.

El cultivo semicontinuo mencionado anteriormente se refiere a un método de cultivo de alimentación de un medio de manera continua o intermitente en un recipiente en cultivo y no extraer el medio del recipiente antes de completarse el cultivo. El cultivo continuo se refiere a un método de alimentación continua o intermitente de un medio en un recipiente en cultivo y extracción del medio del recipiente en cultivo (normalmente, en una cantidad equivalente al medio alimentado). En la presente memoria descriptiva, el término “medio de partida” significa un medio usado para el cultivo discontinuo antes de que el medio de alimentación se alimente en el cultivo semicontinuo o el cultivo continuo, y la expresión “medio de alimentación” significa un medio que va a suministrarse a un fermentador cuando se realiza cultivo semicontinuo o continuo. El medio de alimentación puede contener la totalidad o una parte de los componentes necesarios para el crecimiento de un microorganismo. En la presente memoria descriptiva, el término “medio de fermentación” significa un medio contenido en un fermentador, y una sustancia objetiva se recoge de este medio de fermentación. Además, en la presente memoria descriptiva, el término “fermentador” significa un recipiente en el que se realiza la producción de aminoácidos, y su forma no está limitada. Puede usarse un tanque de fermentación o un fermentador de tanque. Además, el volumen del fermentador no está limitado siempre que la sustancia objetivo pueda producirse y recogerse.

Como la fuente de carbono contenida en el medio usado para la presente invención, pueden usarse sacáridos tales como glucosa, glicerol, fructosa, sacarosa, maltosa, manosa, galactosa, hidrolizado de almidón y melaza, y se prefieren particularmente la glucosa y la sacarosa. Además, también pueden usarse ácidos orgánicos tales como ácido acético y ácido cítrico, y alcoholes tales como etanol y metanol, independientemente o en combinación con otras fuentes de carbono. Además, como materia prima de la fuente de carbono, pueden usarse melaza de caña, melaza de remolacha, melaza de alta pureza (high test), melaza de cítricos y azúcar invertido, y también pueden usarse hidrolizados de materias primas naturales tales como celulosa, almidón, maíz, cereal y tapioca. Además, también puede usarse dióxido de carbono disuelto en el medio de cultivo como fuente de carbono. Estas fuentes de carbono pueden usarse en el medio de partida y en el medio de alimentación. El medio puede contener una o dos o más clases de estas fuentes de carbono. Además, la misma fuente de carbono puede usarse para el medio de partida y el medio de alimentación, o la fuente de carbono del medio de alimentación puede ser diferente de la del medio de partida. Por ejemplo, puede usarse glucosa como fuente de carbono del medio de partida, mientras que puede usarse sacarosa como fuente de carbono del medio de alimentación.

Como fuente de nitrógeno contenida en el medio, pueden usarse amoniaco, sales de amonio tales como sulfato de amonio, carbonato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, acetato de amonio y urea, nitratos, etcétera. El amoniaco gaseoso y el amoniaco acuoso usados para ajustar el pH también pueden usarse como fuente de nitrógeno. Además, también pueden utilizarse peptona, extracto de levadura, extracto de carne, extracto de malta, licor de fermentación de maíz, hidrolizado de soja, etcétera. El medio puede contener una o dos o más clases de estas fuentes de nitrógeno. Estas fuentes de nitrógeno pueden usarse tanto para el medio de partida como para el medio de alimentación. Además, puede usarse la misma fuente de nitrógeno tanto para el medio de partida como para el medio de alimentación, o la fuente de nitrógeno del medio de alimentación puede ser diferente de la del medio de partida.

Además, el medio contiene preferiblemente una fuente de fósforo además de la fuente de carbono y la fuente de nitrógeno. Como fuente de fósforo, pueden usarse dihidrogenofosfato de potasio, hidrogenofosfato de dipotasio, polímeros de ácido fosfórico tales como ácido pirofosfórico, etcétera.

Además, el medio puede contener un factor promotor del crecimiento (nutriente que muestra un efecto promotor del crecimiento) además de la fuente de carbono y la fuente de nitrógeno. Como factor promotor del crecimiento, pueden usarse metales traza, aminoácidos, vitaminas, ácidos grasos, ácidos nucleicos, así como peptona, casaminoácido, extracto de levadura, producto de degradación de proteína de soja, etcétera que contengan las sustancias anteriores. En particular, en el caso de los aminoácidos aromáticos y los aminoácidos de cadena ramificada, los sistemas de biosíntesis de los mismos son comunes y, por tanto, la biosíntesis de un aminoácido distinto del aminoácido objetivo del microorganismo puede atenuarse tal como se describe más adelante. En tal caso, es preferible añadir el aminoácido en el que se atenúa el sistema de biosíntesis al medio. Por ejemplo, cuando el aminoácido objetivo es L-lisina, tal aminoácido es L-metionina, L-treonina o L-isoleucina.

Los ejemplos de metales traza incluyen hierro, manganeso, magnesio, calcio, etcétera. Los ejemplos de las vitaminas incluyen la vitamina B¹, vitamina B², vitamina B^e, ácido nicotínico, amida del ácido nicotínico, vitamina B¹², piridoxina, ácido pantoténico, etcétera. Estos factores promotores del crecimiento pueden estar contenidos o bien en el medio de partida o bien en el medio de alimentación.

Además, cuando se usa una cepa mutante auxótrofa que requiere un aminoácido o similar para su crecimiento, es preferible complementar un nutriente requerido al medio usado en la presente invención. En particular, dado que las rutas de biosíntesis de L-aminoácidos se potencian a menudo y la capacidad de degradación de L-aminoácidos se atenúa a menudo en las bacterias productoras de L-aminoácidos utilizables para la presente invención tal como se describe más adelante, se añaden de manera deseable uno o más tipos de sustancias seleccionadas de L-lisina, L-homoserina, L-isoleucina y L-metionina. De manera similar, también es preferible añadir una sustancia requerida al medio para bacterias productoras de ácido nucleico.

El medio de partida y el medio de alimentación pueden tener la misma composición del medio o diferente. Además, cuando el medio de partida y el medio de alimentación contienen cristales simiente, las concentraciones de cristales simiente pueden ser iguales o diferentes. Además, cuando el medio de alimentación se alimenta en múltiples etapas, las composiciones de los medios de alimentación pueden ser iguales o diferentes.

El cultivo se realiza preferiblemente como un cultivo de aireación a una temperatura de fermentación de 20 a 45°C, de manera particularmente preferible a de 30 a 42°C.

La recogida del L-aminoácido del medio después del cultivo puede realizarse mediante una combinación de métodos de recogida conocidos, por ejemplo, el método de la resina de intercambio iónico, el método de precipitación y otros métodos conocidos. Cuando el L-aminoácido se deposita en el medio, puede recogerse mediante centrifugación o filtración. Además, cuando el L-aminoácido se deposita en el medio, el L-aminoácido que se disuelve en el medio puede cristalizarse, y luego depositarse el L-aminoácido y los cristales pueden aislarse juntos.

En la presente invención, el cultivo del microorganismo puede realizarse mediante el cultivo de simiente y el cultivo principal para asegurar una acumulación de L-aminoácido mayor a un cierto nivel. El cultivo de simiente puede realizarse como cultivo agitado usando un matraz o similar o cultivo discontinuo, y el cultivo principal puede realizarse como cultivo semicontinuo, cultivo discontinuo o cultivo continuo. Alternativamente, tanto el cultivo de simiente como el cultivo principal pueden realizarse como cultivo discontinuo. Además, el precultivo puede realizarse una o dos o más veces antes del cultivo de simiente y el cultivo principal, aumentando gradualmente la escala de cultivo durante estos cultivos.

En estos métodos de cultivo, cuando la concentración de L-aminoácido alcanza un nivel pretendido, puede extraerse una parte del L-aminoácido, y puede añadirse nuevamente un medio para repetir el cultivo. Como el medio que va a añadirse nuevamente, se prefiere un medio que contenga una fuente de carbono y un nutriente que tenga un efecto promotor del crecimiento (factor promotor del crecimiento). Como fuente de carbono del medio que va a añadirse, se prefieren la glucosa, la sacarosa y la fructosa. Como factor de promoción del crecimiento, se prefieren las fuentes de nitrógeno, ácido fosfórico, aminoácidos, etcétera. Como fuente de nitrógeno, pueden usarse amoniaco, sales de amonio tales como sulfato de amonio, carbonato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, acetato de amonio y urea, nitratos, etcétera. Además, como fuente de ácido fosfórico, pueden usarse dihidrogenofosfato de potasio e hidrogenofosfato de dipotasio. En cuanto a los aminoácidos, cuando se usa una cepa mutante auxótrofa, es preferible añadir de manera complementaria un nutriente requerido.

Cuando se realiza un cultivo semicontinuo o un cultivo continuo según la presente invención, el medio de alimentación puede alimentarse de manera intermitente de modo que se detenga temporalmente el suministro de sacárido o nutrientes. El suministro del medio de alimentación se detiene preferiblemente durante, como máximo, el 30% o menos, de manera deseable el 20% o menos, de manera particularmente deseable el 10% o menos, del tiempo de alimentación. Cuando el medio de alimentación se alimenta de manera intermitente, el medio de alimentación puede añadirse inicialmente a lo largo de un tiempo predeterminado, y la segunda y las siguientes adiciones pueden controlarse para que se inicien cuando un ordenador detecta la elevación del pH o la elevación de la concentración de oxígeno disuelto tras el agotamiento de la fuente de carbono en el medio de fermentación durante un periodo de adición detenida antes de un cierto periodo de adición del medio, y así la concentración de sustrato en el tanque de cultivo siempre se mantiene automáticamente a un nivel bajo (patente estadounidense n.° 5.912.113). La fuente de carbono del medio de alimentación es la misma que la descrita anteriormente. Además, el medio de alimentación puede consistir en un tipo de medio o una mezcla de dos o más tipos de medios. Cuando se usan dos o más tipos de medios de alimentación, los medios pueden mezclarse y alimentarse usando un recipiente de alimentación, o pueden alimentarse usando dos o más recipientes de alimentación.

Cuando se realiza un cultivo de alimentación semicontinua, el medio de alimentación se alimenta preferiblemente de modo que el sacárido se alimenta en una cantidad tal que la cantidad de fuente de carbono en el medio de alimentación o el medio de fermentación total no supere 30 g/l, y se controla preferiblemente para que sea de 20 g/l o menor, más preferiblemente 10 g/l o menor. En particular, la concentración de sacárido se controla preferiblemente de modo que se encuentre en el intervalo de concentración mencionado anteriormente al final de la proliferación logarítmica del microorganismo y posteriormente. La velocidad de alimentación de la fuente de carbono puede controlarse mediante el método descrito en patente estadounidense n.° 5.912.113. Además, el sacárido y el ácido fosfórico se alimentan preferiblemente a concentraciones tales que el sacárido y el ácido fosfórico sirven como factores limitantes del crecimiento de células bacterianas. El ácido fosfórico puede estar presente en el medio de alimentación en una cantidad de 2 o menos, preferiblemente 1,5 o menos, más preferiblemente 1 o menos, expresado en términos de la razón fósforo/carbono (P/C) (remítase a la patente estadounidense n.° 5.763.230).

Cuando se usa el método de cultivo continuo en la presente invención, el medio puede extraerse y alimentarse simultáneamente, o puede extraerse una parte del medio, y luego puede alimentarse el medio. Además, el método también puede ser un método de cultivo continuo que incluye la recirculación de células en las que se extrae el medio de cultivo que contiene un L-aminoácido y células bacterianas, y solo se devuelven las células al fermentador (remítase a la patente francesa n.° 2669935). Como método para alimentar de manera continua o intermitente una fuente de nutrientes, se usa el mismo método que se usa en el cultivo semicontinuo.

Cuando el medio de cultivo se extrae de manera intermitente, se extrae una parte del L-aminoácido cuando la concentración de L-aminoácido alcanza un nivel predeterminado, y se alimenta nuevo medio para continuar con el cultivo. Además, el cultivo se realiza preferiblemente de modo que el volumen final del medio después de añadir el medio sea igual al volumen del medio de cultivo antes de la extracción. El término “igual” significa que el volumen del medio después de añadir el medio corresponde a aproximadamente del 93 al 107% del volumen del medio antes de la extracción.

Cuando el medio de cultivo se extrae de manera continua, la extracción se inicia de manera deseable al mismo tiempo que o después de la alimentación del medio de nutrientes. Por ejemplo, en un plazo de 5 horas, de manera deseable 3 horas, de manera más deseable 1 hora, como máximo, después del inicio de la alimentación, puede iniciarse la extracción. Además, el volumen de extracción del medio de cultivo es preferiblemente igual al volumen del medio alimentado.

El método de cultivo continuo que incluye la recirculación de células bacterianas es un método de extracción de manera intermitente o continua del medio de fermentación cuando la concentración de L-aminoácido alcanza un nivel predeterminado, que extrae solo el L-aminoácido y que recircula los residuos de filtración que contienen células bacterianas o el sobrenadante de centrifugación en el recipiente de fermentación, y puede realizarse remitiéndose, por ejemplo, a la patente francesa n.° 2669935.

El caldo de fermentación que contiene un aminoácido básico obtenido por la presente invención comprende preferiblemente iones carbonato y/o iones bicarbonato de modo que la razón de normalidad representada por la siguiente ecuación se convierte en del 5 al 100%.

Razón de normalidad = (Normalidad de iones bicarbonato y/o iones carbonato) / (Normalidad de cationes en que consiste principalmente el aminoácido básico) x 100

Los iones carbonato y los iones bicarbonato en el medio se liberan como dióxido de carbono al calentarlos, y el contenido del aminoácido básico en el contenido sólido del caldo de fermentación aumenta de este modo. Además, puesto que los carbonatos pueden reemplazarse fácilmente por un ácido más fuerte que el ácido carbónico añadiendo dicho ácido al caldo de fermentación, pueden seleccionarse diversas formas de sal.

Ejemplos

Ejemplo 1: Construcción de plásmido para potenciación del gen gltP o el gen gltS

Toda la secuencia de nucleótidos genómica de Escherichia coli cepa K-12) ya se ha dilucidado (n.° de registro Genbank U00096, Science, 277, 1453-1474 (1997)). Para amplificar los genes objetivo, se usó un vector plasmídico pMW118 (Nippon Gene). Este plásmido tiene un sitio de clonación múltiple para la clonación de genes arbitrarios, y este es un plásmido que permite la clonación de un gen usando este sitio y la amplificación del gen.

Basándose en la secuencia de nucleótidos del gen gltP o gltS en la secuencia genómica de Escherichia coli y las regiones flanqueantes de la misma, se sintetizaron el oligonucleótido sintético mostrado en la SEQ ID NO: 8 como cebador 5' y el oligonucleótido sintético mostrado en la SEQ ID NO: 9 como cebador 3' para la amplificación de gltP, y se sintetizaron el oligonucleótido sintético mostrado en la SEQ ID NO: 10 como cebador 5' y el oligonucleótido sintético mostrado en la SEQ ID NO: 11 como cebador 3' para la amplificación de gltS, respectivamente. Mediante el uso de estos cebadores, se realizó PCR con el ADN genómico de Escherichia coli cepa K-12 MG1655 como molde para obtener fragmentos génicos que contienen los genes gltP y gltS, respectivamente. Se produjeron extremos romos de los productos de PCR purificados y se ligaron con el vector pMW118 digerido con SmaI para construir un plásmido pMW-gltP para la amplificación de gltP y un plásmido pMW-gltS para la amplificación de gltS.

Ejemplo 2: Potenciación del gen ybjE de la cepa WC196AcadAAldcC

Como cepa parental de la bacteria productora de L-lisina, se usó Escherichia coli cepa WC196AcadAAldcC descrita en la publicación de patente internacional WO2006/078039. Esta cepa corresponde a Escherichia coli cepa WC196 en la que se perturban los genes de la lisina descarboxilasa cadA y ldcC usando la integración dirigida por el rojo (Datsenko, K.A. y Wanner B.L., Proc. Natl Acad Sci. USA. 97: 6640-6645 (2000)) y el sistema de escisión derivado del fago X (J. Bacteriol., 184: 5200-5203 (2002)) en combinación. Esta cepa se depositó ante la agencia administrativa independiente, Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada, Depósito Internacional de Organismos de Patentes (Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japón) el 7 de octubre de 2008, y se le dio un número de registro de FERM BP-11027.

Se sabe que la capacidad de producción de L-lisina se mejora al potenciar la actividad de la proteína YbjE que tiene una actividad de excreción de L-lisina (la solicitud de patente estadounidense publicada n.° 2006/0019355). Por tanto, la expresión del gen ybjE en la cepa WC196AcadAAldcC se mejoró modificando el promotor del gen ybjE en el cromosoma de la cepa WC196AcadAAldcC en el promotor tac, y modificando el sitio de unión al ribosoma (RBS) del mismo en una secuencia derivada de una secuencia en el sentido de 5' del gen lac, respectivamente.

La modificación del promotor del gen ybjE y la secuencia de RBS de la cepa WC196AcadAAldcC se logró mediante el método mencionado anteriormente usando la integración dirigida por el rojo y un sistema de escisión derivado del fago X en combinación. Específicamente, la secuencia de 157 pb en el sentido de 5' desde el codón de iniciación (números de nucleótido 49 a 51) del gen ybjE (SEQ ID NO: 5) se reemplazó por la secuencia de la SEQ ID NO: 7. Puede seleccionarse una cepa en la que se haya producido la sustitución del gen deseado basándose en la resistencia a kanamicina como índice. Se confirmó mediante PCR que la sustitución génica pretendida se produjo en la cepa candidata. La cepa obtenida en la que se modificaron el promotor del gen ybjE y la secuencia de RBS se designó como cepa WC196LCY.

Ejemplo 3: Efecto de la amplificación de los genes gltP y gltS en la cepa productora de L-lisina de bacteria Escherichia

<3-1> Introducción del plásmido para la producción de lisina en la cepa WC196LCY

Se transformó la cepa WC196LCY con un plásmido para la producción de lisina, pCABD2 (patente europea n.° 0733710), que portaba los genes dapA, dapB y lysC de manera convencional para obtener la cepa WC196LCY/pCABD2. pCABD2 contiene un ADN que codifica para la dihidrodipicolinato sintasa (DDPS) de Escherichia coli que tiene una mutación para la desensibilización frente a la inhibición por retroalimentación por L-lisina, un ADN que codifica para la aspartocinasa III de Escherichia que tiene una mutación para la desensibilización frente a la inhibición por retroalimentación por L-lisina, un ADN que codifica para la dihidrodipicolinato reductasa de Escherichia coli, y un ADN que codifica para la diaminopimelato deshidrogenasa de Brevibacterium lactofermentum. Se transformó la cepa WC196LCY/pCABD2 con el plásmido pMW-gltP para la amplificación de gltP y el plásmido pMW-gltS para la amplificación de gltS, que se produjeron en el ejemplo 1, respectivamente, para obtener cepas resistentes a ampicilina. Después de que se confirmó la introducción del plásmido predeterminado en cada transformante, la cepa a la que se introdujo el plásmido pMW-gltP para la amplificación de gltP se designó como cepa WC196LCY/pCABD2/pMW-gltP, y la cepa a la que se introdujo el plásmido pMW-gltS para la amplificación de gltS se designó como cepa WC196LCY/pCABD2/pMW-gltS. Además, se preparó una cepa transformada con pMW118 como control y se designó como cepa WC196LCY/pCABD2/pMW118.

Se cultivó cada una de las cepas producidas anteriormente a 37°C en el medio LB que contenía 25 mg/l de estreptomicina y 100 mg/l de ampicilina hasta que la DO⁶⁰⁰del cultivo se volvió de aproximadamente 0,6, luego se añadió al cultivo un volumen igual de una disolución de glicerol al 40%, y se agitó la mezcla, se dividió en volúmenes apropiados y se almacenó a -80°C como disoluciones madre de glicerol.

<3-2> Cultivo de producción de lisina.

Se descongelaron las disoluciones madre de glicerol anteriores y se aplicaron uniformemente en un volumen de 500 |il cada una a una placa L que contenía 25 mg/l de estreptomicina y 100 mg/l de ampicilina, y se realizó el cultivo a 37°C durante 24 horas. Se inocularon las células en una cantidad de aproximadamente 1/8 de las células obtenidas en una placa en 20 ml del medio de fermentación que se describe a continuación, que contenía 25 mg/l de estreptomicina y 100 mg/l de ampicilina, que estaba contenido en un matraz Sakaguchi de 500 ml de volumen, y se cultiva a 37°C durante 22 horas en un aparato de cultivo de agitación de manera recíproca. Después del cultivo, se midieron las cantidades de L-lisina y ácido L-glutámico acumuladas en el medio con el aparato Biotec Analyzer AS210 (SAKURA SEIKI). La composición del medio usado para el cultivo se muestra a continuación.

Medio de producción de L-lisina.

Glucosa 40 g/l

(NH⁴)²SO⁴24 g/l

KH²PO⁴1,0 g/l

MgSO⁴^7H²O 1,0 g/l

FeSO⁴^7H²O 0,01 g/l

MnSO⁴^7H²O 0,08 g/l

Extracto de levadura 2,0 g/l

L-isoleucina 0,1 g/l

NaCl 1,0 g/l

CaCO³50 g/l

(Farmacopea japonesa)

Se ajustó el medio a pH 7,0 con KOH y se trató en autoclave a 115°C durante 10 minutos, excepto que se mezclaron la glucosa y MgSOW ^O y se trataron en autoclave por separado de los demás componentes. Se añadió CaCO³después de la esterilización con aire caliente.

Los rendimientos de L-lisina y las concentraciones de ácido L-glutámico observados después de 22 horas de cultivo se muestran en la Tabla 3 con valores relativos basados en los valores observados para WC196LCY/pCABD2/pMW118 como control, que se toman como 100.

Tabla 3: Efecto de la amplificación de gltP o gltS en la bacteria productora de L-lisina, WC196LCY/pCABD2

Concentración de

Cepa ^{Rendimiento de L-lisina}

_{(valor relativo)}ácido L-glutámico

(valor relativo) WC196LCY/pCABD2/pMW118 100 100 WC196LCY/pCABD2/pMW-gltP 99 47

WC196LCY/pCABD2/pMW-gltS____________100___________________ 55________ En la cepa amplificada con el gen gltP WC196LCY/pCABD2/pMW-gltP y la cepa amplificada con el gen gltS WC196LCY/pCABD2/pMW-gltS, la cantidad de producción como subproducto de ácido L-glutámico disminuyó en comparación con la de WC196LC/pCABD2/pMW118 como control sin reducción del rendimiento de L-lisina.

Ejemplo 4: Efecto de la amplificación del gen gltP o gltS en la cepa productora de L-treonina de bacteria Escherichia Como cepa productora de L-treonina, se usó Escherichia coli cepa VKPM B-3996 (remítase a la patente estadounidense n.° 5.175.107).

Se transformó la cepa B-3996 con cada uno de los plásmidos pMW-gltP para la amplificación de gltP y el plásmido pMW-gltS para la amplificación de gltS, que se produjeron en el ejemplo 1, para obtener cepas resistentes a ampicilina. Después de que se confirmó la introducción del plásmido predeterminado en cada transformante, la cepa a la que se introdujo el plásmido pMW-gltP para la amplificación de gltP se designó como cepa B-3996/pMW-gltP, y la cepa a la que se introdujo el plásmido pMW-gltS para la amplificación de gltS se designó como cepa B-3996/pMW-gltS. Además, se preparó una cepa transformada con pMW118 como control y se designó como cepa B-3996/pMW118.

Se cultivó cada una de las cepas producidas anteriormente a 37°C en el medio LB que contenía 100 mg/l de ampicilina y 20 mg/l de sulfato de estreptomicina hasta que la DO⁶⁰⁰del cultivo se volvió de aproximadamente 0,6, luego se añadió al cultivo un volumen igual de una disolución de glicerol al 40%, y se agitó la mezcla, luego se dividió en volúmenes apropiados y se almacenó a -80°C como disoluciones madre de glicerol.

Se descongelaron las disoluciones madre de glicerol anteriores y se aplicaron uniformemente en un volumen de 150 |il cada una a una placa L que contenía 100 mg/l de ampicilina y 20 mg/l de sulfato de estreptomicina, y se realizó el cultivo a 37°C durante 24 horas. Se inocularon las células en una cantidad de aproximadamente 1/10 de las células obtenidas en una placa en 50 ml del medio LB que contenía 100 mg/l de ampicilina y 20 mg/l de sulfato de estreptomicina en un matraz con deflectores, y se cultivaron a 40°C.°C durante 4 horas a 144 rpm como cultivo de simiente.

Después de completarse el cultivo de simiente, en 300 ml del medio de cultivo principal descrito a continuación en un fermentador de tanque de 1 l de volumen, se inoculó el medio de cultivo de simiente en un volumen de 30 ml correspondiente al 10% del volumen del medio de cultivo principal y se realizó el cultivo a 40°C y pH 7,0.

Composición del medio de cultivo principal.

Glucosa 100 g/l

Extracto de levadura 1,8 g/l

KH²PO⁴1,0 g/l

NaCl 0,6 g/l

MgSO⁴^7H²O 0,36 g/l

FeSO⁴^7H²O 18 mg/l

MnSO⁴^4H²O 18 mg/l

Sulfato de estreptomicina 20 mg/l

Ampicilina 100 mg/l

Se mezclaron la glucosa y MgSO4^7H2O y se esterilizaron por separado de los demás componentes.

Durante el cultivo, se ajustó el medio de cultivo a pH 7,0 añadiendo gas amoniaco.

Después de realizarse el cultivo durante 15,5 horas, se midió la concentración de L-treonina acumulada en el medio mediante HPLC. Además, se midió la cantidad de ácido L-glutámico con el aparato Biotec Analyzer AS210 (SAKURA SEIKI). Los rendimientos de L-treonina y las concentraciones de ácido L-glutámico se muestran en la tabla 4 con valores relativos basados en los valores observados para B-3996/pMW118 como control, que se toman como 100.

Tabla 4: Efecto de la amplificación de gltP o gltS en la bacteria productora de L-treonina B-3996

Cepa ^{Rendimiento de L-treonina}Concentración de ácido L-glutámico

_{(valor relativo)}(valor relativo)

B-3996/pMW118 100,0 100,0

B-3996/pMW-gltP 103,0 13,4

B-3996/pMW-gltS 99,4 13,4

En la cepa amplificada con el gen gltP B-3996/pMW-gltP y la cepa amplificada con el gen gltS B-3996/pMW-gltS, la cantidad de producción como subproducto de ácido L-glutámico disminuyó en comparación con la de B 3996/pMW118 como control sin reducción del rendimiento de L-treonina.

Ejemplo 5: Comparación del efecto de amplificación del gen gltP o gltS y efecto de amplificación del gen gadC en la cepa productora de L-treonina de bacteria Escherichia

Como un hallazgo previo referente al método para producir un L-aminoácido con la amplificación de una proteína que tiene la actividad como transportador de L-glutamato, se sabe que al amplificar simultáneamente gadC que codifica para una proteína que tiene actividad como contratransportador de L-glutamato/GABA, y gadB que codifica para una proteína que tiene la actividad de glutamato descarboxilasa, se mejoran las productividades de L-lisina, L-treonina y L-triptófano (documento WO2008/044453). Por tanto, el efecto de reducción de la cantidad de producción como subproducto de ácido glutámico de la amplificación de gltP o gltS se comparó con el efecto de la amplificación de gadC.

Para construir un plásmido para amplificar gadC, se usó el plásmido pMWPthr descrito en el documento WO2008/044453. Este plásmido corresponde al vector pMW118 (Nippon Gene) que tiene la región promotora del operón de treonina (thrABC) en el genoma de Escherichia coli entre el sitio HindIII y el sitio Xbal, y es un plásmido que permite la amplificación de un gen insertando el gen en el sentido de 3' del promotor.

Basándose en la secuencia de nucleótidos del gen gadC en la secuencia genómica de Escherichia coli y las regiones flanqueantes de la misma, se prepararon el oligonucleótido sintético mostrado en la SEQ ID NO: 14 como cebador 5' y el oligonucleótido sintético mostrado en la SEQ ID NO: 15 como cebador 3', y se usaron con el ADN genómico de Escherichia coli cepa K-12 W3110 como molde para realizar la PCR y obtener así un fragmento génico que contiene el gen gadC. El producto de PCR purificado se digirió con SacI y SmaI, y se ligó con el vector pMWPthr digerido con SacI y SmaI para construir un plásmido pMW-gadC para la amplificación de gadC.

De la misma manera que en el ejemplo 4, se transformó la cepa B-3996 con pMW-gadC, y el transformante obtenido se denominó cepa B-3996/pMW-gadC. Esta cepa se cultivó junto con B-3996/pMW118, B-3996/pMW-gltP y B-3996/pMW-gltS de la misma manera que en el ejemplo 4. Se muestran las concentraciones de ácido L-glutámico acumulado en el medio en la tabla 5 en términos de valores relativos basados en el valor observado con B3996/pMW118 como control, que se toma como 100.

Tabla 5: Comparación del efecto de la amplificación del gen gltP o gltS y efecto de la amplificación de gadC en la cepa de bacteria productora de L-treonina B-3996

Cepa Concentración de ácido L-glutámico (valor relativo)

B-3996/pMW118 100,0

B-3996/pMW-gltP 13,4

B-3996/pMW-gltS 13,4

B-3996/pMW-gadC 109,3

En la cepa amplificada por el gen gltP B-3996/pMW-gltP y la cepa amplificada por el gen gltS B-3996/pMW-gltS, la cantidad de producción como subproducto de ácido L-glutámico se redujo notablemente. Por otro lado, en la cepa amplificada por el gen gadC B-3996/pMW-gadC, la concentración de ácido L-glutámico no disminuyó, sino que aumentó a la inversa, y así quedó claro que la amplificación de gadC no tuvo el efecto de reducir la concentración de ácido L-glutámico en el medio de fermentación.

Explicación del listado de secuencias

SED ID NO.: 1: secuencia del gen gltP

SEQ ID NO: 2: secuencia de aminoácidos de GltP

SEQ ID NO: 3: secuencia del gen gltS

SEQ ID NO: 4: secuencia de aminoácidos de GltS

SEQ ID NO: 5: secuencia del gen ybjE

SEQ ID NO: 6: secuencia de aminoácidos de YbjE

SEQ ID NO: 7: secuencia en sentido 5' de ybjE para la sustitución

SEQ ID NO: 8: Cebador para la amplificación de gltP (lado 5')

SEQ ID NO: 9: Cebador para la amplificación de gltP (lado 3')

Claims

REIVINDICACIONES

1. Método para producir un L-aminoácido que comprende cultivar una bacteria perteneciente a la familia Enterobacteriaceae y tiene una capacidad de producción de L-aminoácido en un medio para producir y acumular el L-aminoácido en el medio, y recoger el L-aminoácido del medio, en el que:

la bacteria se ha modificado para que esté aumentada la expresión del gen gltP y/o el gen gltS, y el L-aminoácido se selecciona del grupo que consiste en L-lisina, L-treonina, L-asparagina, ácido L-aspártico, L-metionina, L-alanina, L-isoleucina y L-homoserina.

2. Método según la reivindicación 1, en el que el gen gltP codifica para una proteína mostrada en los siguientes puntos (A) o (B):

(B) una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 12, que incluye sustituciones, deleciones, inserciones, adiciones o inversiones de 1 a 20 residuos de aminoácido, y que tiene una actividad como transportador de L-glutamato.

3. Método según la reivindicación 2, en el que el gen gltP codifica para una proteína mostrada en los siguientes puntos (A1), (B1) o (C1):

(B1) una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2, que incluye sustituciones, deleciones, inserciones, adiciones o inversiones de 1 a 20 residuos de aminoácido, y que tiene una actividad como transportador de L-glutamato,

(C1) una proteína que muestra una identidad del 80% o más con la secuencia de aminoácidos total de la

SEQ ID NO: 2 y que tiene una actividad como transportador de L-glutamato.

4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el gen gltP es un ADN mostrado en

los siguientes puntos (a) o (b):

(a) un ADN que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 1,

5. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el gen gltS codifica para una proteína mostrada en los siguientes puntos (C) o (D):

(D) una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 13, que incl sustituciones, deleciones, inserciones, adiciones o inversiones de 1 a 20 residuos de aminoácido, y que tiene una actividad como transportador de L-glutamato.

6. Método según la reivindicación 5, en el que el gen gltS codifica para una proteína mostrada en los siguientes puntos (C1), (D1) o (E1):

(D1) una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 4, que incluye sustituciones, deleciones, inserciones, adiciones o inversiones de 1 a 20 residuos de aminoácido, y que tiene una actividad como transportador de L-glutamato,

(E1) una proteína que muestra una identidad del 80% o más con la secuencia de aminoácidos total de la

SEQ ID NO: 4 y que tiene una actividad como transportador de L-glutamato.

7. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el gen gltS es un ADN mostrado en

los siguientes puntos (c) o (d):

(c) un ADN que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 3,

8. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la expresión del gen se potencia aumentando el número de copias del gen, o modificando una secuencia de control de la expresión del gen.

9. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el L-aminoácido es L-lisina, y la expresión del gen ybjE está aumentada en la bacteria.

10. Método según la reivindicación 9, en el que el gen ybjE codifica para una proteína mostrada en los siguientes puntos (E), (F) o (G):

(F) una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 6 o la secuencia de aminoácidos de los números de aminoácido 17 a 315 en la SEQ ID NO: 6 que incluye sustituciones, deleciones, inserciones, adiciones o inversiones de 1 a 20 residuos de aminoácido, y que tiene una actividad de excreción de L-lisina,

11. Método según la reivindicación 9 ó 10, en el que el gen ybjE es un ADN mostrado en los siguientes puntos (e) o (f):

(e) un ADN que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 5 o la secuencia de nucleótidos de los números de nucleótido 49 a 948 en la SEQ ID NO: 5,

12. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el L-aminoácido es L-lisina, el pH del medio se controla para que sea de 6,0 a 9,0 durante el cultivo para la producción, y de 7,2 a 9,0 al final del cultivo, y se asegura un periodo de cultivo en el que 20 mM o más de iones bicarbonato y/o carbonato están presentes en el medio, de modo que los iones bicarbonato y/o los iones carbonato sirven como contraiones del aminoácido básico.

13. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que la bacteria es una bacteria Escherichia.