JPWO2015060314A1 - Ｌ−アミノ酸の製造法 - Google Patents

Abstract

Ｌ−アミノ酸の製造法を提供する。ａｃｐＰ−ｆａｂＦオペロンが弱化されるように改変されたＬ−アミノ酸生産能を有する腸内細菌科に属する細菌を培地で培養し、該培地または菌体よりＬ−アミノ酸を採取することにより、Ｌ−アミノ酸を製造する。

Description

本発明は、細菌を用いたＬ−アミノ酸の製造法に関する。Ｌ−アミノ酸は、動物飼料用の添加物、調味料や飲食品の成分、又はアミノ酸輸液等として、産業上有用である。

Ｌ−アミノ酸は、例えば、Ｌ−アミノ酸生産能を有する各種微生物を用いた発酵法により工業生産されている。発酵法によるＬ−アミノ酸の製造法としては、例えば、野生型微生物（野生株）を用いる方法、野生株から誘導された栄養要求株を用いる方法、野生株から種々の薬剤耐性変異株として誘導された代謝調節変異株を用いる方法、栄養要求株と代謝調節変異株の両方の性質を持った株を用いる方法が挙げられる。

また、近年は、組換えＤＮＡ技術によりＬ−アミノ酸生産能を向上させた微生物がＬ−アミノ酸の製造に利用されている。微生物のＬ−アミノ酸生産能を向上させる方法としては、例えば、Ｌ−アミノ酸生合成系酵素をコードする遺伝子の発現を増強すること（特許文献１、特許文献２）やＬ−アミノ酸生合成系への炭素源の流入を増強すること（特許文献３）が挙げられる。

acpP遺伝子は、アシルキャリアタンパク質（acyl carrier protein；ＡＣＰ）をコードする遺伝子である（非特許文献１）。ＡＣＰは、不活性なapo-ACPとして翻訳され、その後、ＡＣＰシンターゼ（ACP synthease）によりapo-ACPの３６位（エシェリヒア・コリの場合）のセリン残基に４’−ホスホパンテテイン（4'-phosphopanteheine）が補因子として付加され、活性なholo-ACPとなる。ＡＣＰは、細菌等の脂肪酸生合成において重要な役割を担うタンパク質である。具体的には、ＡＣＰ（holo-ACP）は、脂肪酸生合成の際に、４’−ホスホパンテテイン基を介して脂肪酸鎖と結合し、脂肪酸鎖を担持する。

fabF遺伝子は、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ（beta-ketoacyl-ACP synthase II）をコードする遺伝子である（非特許文献１）。β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩは、脂肪酸生合成酵素の１つであり、脂肪酸鎖の伸長に関与する。具体的には、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩは、アシル−ＡＣＰ（炭素数ｎ）とマロニル−ＡＣＰから、３−オキソアシル−ＡＣＰ（炭素数ｎ＋２）を生成する反応を触媒する（EC 2.3.1.41）。

エシェリヒア・コリにおいて、acpP遺伝子およびfabF遺伝子を含む脂肪酸生合成に関与する遺伝子群は、yceD-rpmF-plsX-fabHDG-acpP-fabF遺伝子クラスターとして存在する。同クラスターの遺伝子群は、いくつかの遺伝子ペアとして共転写される（非特許文献１）。例えば、acpP遺伝子およびfabF遺伝子はacpP-fabFオペロンとして共転写される。なお、fabF遺伝子は、自前のプロモーターから個別にも転写される。また、acpP遺伝子は、yceD-rpmF-plsX-fabHDG-acpP-fabF遺伝子クラスター中の、fabD遺伝子およびfabG遺伝子から共転写され得る。

しかしながら、acpP遺伝子およびfabF遺伝子とＬ−アミノ酸生産との関係は知られていなかった。

米国特許第5,168,056号明細書 米国特許第5,776,736号明細書 米国特許第5,906,925号明細書

Zhang Y, Cronan JE Jr., J Bacteriol. 1996 Jun; 178(12): 3614-20.

本発明は、細菌のＬ−アミノ酸生産能を向上させる新規な技術を開発し、効率的なＬ−アミノ酸の製造法を提供することを課題とする。

本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、acpPおよびfabF遺伝子の発現が低下するように細菌を改変することによって、細菌のＬ−アミノ酸生産能を向上させることができることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は以下の通り例示できる。
［１］
Ｌ−アミノ酸生産能を有する腸内細菌科に属する細菌を培地で培養してＬ−アミノ酸を該培地中または該細菌の菌体内に生成蓄積すること、および該培地または菌体よりＬ−アミノ酸を採取すること、を含むＬ−アミノ酸の製造法であって、
前記細菌が、ａｃｐＰ−ｆａｂＦオペロンが弱化されるように改変されていることを特徴とする、方法。
［２］
前記ａｃｐＰ−ｆａｂＦオペロンの弱化が、ａｃｐＰ−ｆａｂＦオペロンの遺伝子にコードされるタンパク質の活性の低下である、前記方法。
［３］
ａｃｐＰ−ｆａｂＦオペロンの遺伝子の発現が弱化されることにより、前記オペロンが弱化された、前記方法。
［４］
前記ａｃｐＰ−ｆａｂＦオペロンの遺伝子の発現調節配列が改変されることにより、前記遺伝子の発現が弱化された、前記方法。
［５］
前記ａｃｐＰ−ｆａｂＦオペロンの遺伝子が、ａｃｐＰ遺伝子および／またはｆａｂＦ遺伝子である、前記方法。
［６］
前記ａｃｐＰ−ｆａｂＦオペロンの遺伝子が、ａｃｐＰ遺伝子およびｆａｂＦ遺伝子である、前記方法。
［７］
ａｃｐＰ遺伝子の翻訳開始点の上流−３４位のシトシンが他の塩基に置換されることにより、前記ａｃｐＰ−ｆａｂＦオペロンの遺伝子の発現が弱化された、前記方法。
［８］
ａｃｐＰ遺伝子の翻訳開始点の上流−３４位のシトシンがアデニンに置換されることにより、前記ａｃｐＰ−ｆａｂＦオペロンの遺伝子の発現が弱化された、前記方法。
［９］
前記細菌が、エシェリヒア属、パントエア属、またはエンテロバクター属に属する細菌である、前記方法。
［１０］
前記細菌が、エシェリヒア・コリである、前記方法。
［１１］
前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−リジンである、前記方法。
［１２］
Ｌ−リジン生産能を有するエシェリヒア・コリを培地で培養してＬ−リジンを該培地中または該エシェリヒア・コリの菌体内に生成蓄積すること、および該培地または菌体よりＬ−リジンを採取すること、を含むＬ−リジンの製造法であって、
前記エシェリヒア・コリにおいて、ａｃｐＰ−ｆａｂＦオペロンの遺伝子の発現調節配列が改変されることにより、前記遺伝子の発現が弱化されていることを特徴とする、方法。
［１３］
Ｌ−リジン生産能を有するエシェリヒア・コリを培地で培養してＬ−リジンを該培地中または該エシェリヒア・コリの菌体内に生成蓄積すること、および該培地または菌体よりＬ−リジンを採取すること、を含むＬ−リジンの製造法であって、
前記エシェリヒア・コリにおいてａｃｐＰ遺伝子の翻訳開始点の上流−３４位のシトシンが他の塩基に置換されていることを特徴とする、方法。
［１４］
Ｌ−リジン生産能を有するエシェリヒア・コリを培地で培養してＬ−リジンを該培地中または該エシェリヒア・コリの菌体内に生成蓄積すること、および該培地または菌体よりＬ−リジンを採取すること、を含むＬ−リジンの製造法であって、
前記エシェリヒア・コリにおいてａｃｐＰ遺伝子の翻訳開始点の上流−３４位のシトシンがアデニンに置換されていることを特徴とする、方法。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明の方法は、Ｌ−アミノ酸生産能を有する腸内細菌科に属する細菌を培地で培養してＬ−アミノ酸を該培地中または該細菌の菌体内に生成蓄積すること、および該培地または菌体よりＬ−アミノ酸を採取すること、を含むＬ−アミノ酸の製造法であって、前記細菌が、acpP-fabFオペロンが弱化されるように改変されていることを特徴とする、方法である。同方法に用いられる細菌を、「本発明の細菌」ともいう。

＜１＞本発明の細菌
本発明の細菌は、Ｌ−アミノ酸生産能を有する腸内細菌科に属する細菌であって、且つ、acpP-fabFオペロンが弱化されるように改変された細菌である。

＜１−１＞Ｌ−アミノ酸生産能を有する細菌
本発明において、「Ｌ−アミノ酸生産能を有する細菌」とは、培地で培養したときに、目的とするＬ−アミノ酸を生成し、回収できる程度に培地中または菌体内に蓄積する能力を有する細菌をいう。Ｌ−アミノ酸生産能を有する細菌は、非改変株よりも多い量の目的とするＬ−アミノ酸を培地に蓄積することができる細菌であってよい。非改変株としては、野生株や親株が挙げられる。また、Ｌ−アミノ酸生産能を有する細菌は、好ましくは０．５ｇ／Ｌ以上、より好ましくは１．０ｇ／Ｌ以上の量の目的とするＬ−アミノ酸を培地に蓄積することができる細菌であってもよい。

Ｌ−アミノ酸としては、Ｌ−リジン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−シトルリン等の塩基性アミノ酸、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、グリシン等の脂肪族アミノ酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−セリン等のヒドロキシモノアミノカルボン酸であるアミノ酸、Ｌ−プロリン等の環式アミノ酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン等の芳香族アミノ酸、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−メチオニン等の含硫アミノ酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸等の酸性アミノ酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン等の側鎖にアミド基を持つアミノ酸が挙げられる。本発明の細菌は、１種のＬ−アミノ酸の生産能のみを有していてもよく、２種またはそれ以上のＬ−アミノ酸の生産能を有していてもよい。

本発明において、「アミノ酸」という用語は、特記しない限り、Ｌ−アミノ酸を意味してよい。また、生産されるＬ−アミノ酸は、フリー体、その塩、またはそれらの混合物であってよい。すなわち、本発明において、「Ｌ−アミノ酸」という用語は、特記しない限り、フリー体のＬ−アミノ酸、その塩、またはそれらの混合物を意味してよい。塩の例については後述する。

腸内細菌科に属する細菌としては、エシェリヒア（Escherichia）属、エンテロバクター（Enterobacter）属、パントエア（Pantoea）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、セラチア（Serratia）属、エルビニア（Erwinia）属、フォトラブダス（Photorhabdus）属、プロビデンシア（Providencia）属、サルモネラ（Salmonella）属、モルガネラ（Morganella）等の属に属する細菌が挙げられる。具体的には、NCBI（National Center for Biotechnology Information）のデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=91347）で用いられている分類法により腸内細菌科に分類されている細菌を用いることができる。

エシェリヒア属細菌としては、特に制限されないが、微生物学の専門家に知られている分類によりエシェリヒア属に分類されている細菌が挙げられる。エシェリヒア属細菌としては、例えば、Neidhardtらの著書（Backmann, B. J. 1996. Derivations and Genotypes of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12, p. 2460-2488. Table 1. In F. D. Neidhardt (ed.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.）に記載されたものが挙げられる。エシェリヒア属細菌としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）が挙げられる。エシェリヒア・コリとして、具体的には、例えば、プロトタイプの野生株K-12由来のエシェリヒア・コリW3110（ATCC 27325）やエシェリヒア・コリMG1655（ATCC 47076）が挙げられる。

エンテロバクター属細菌としては、特に制限されないが、微生物学の専門家に知られている分類によりエンテロバクター属に分類されている細菌が挙げられる。エンテロバクター属細菌としては、例えば、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）やエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）が挙げられる。エンテロバクター・アグロメランスとして、具体的には、例えば、エンテロバクター・アグロメランスATCC12287株が挙げられる。エンテロバクター・アエロゲネスとして、具体的には、例えば、エンテロバクター・アエロゲネスATCC13048株、NBRC12010株（Biotechonol Bioeng. 2007 Mar 27; 98(2) 340-348）、AJ110637株（FERM BP-10955）が挙げられる。また、エンテロバクター属細菌としては、例えば、欧州特許出願公開EP0952221号明細書に記載されたものが挙げられる。なお、Enterobacter agglomeransには、Pantoea agglomeransと分類されているものも存在する。

パントエア属細菌としては、特に制限されないが、微生物学の専門家に知られている分類によりパントエア属に分類されている細菌が挙げられる。パントエア属細菌としては、例えば、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）、パントエア・スチューアルティ（Pantoea stewartii）、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）、パントエア・シトレア（Pantoea citrea）が挙げられる。パントエア・アナナティスとして、具体的には、例えば、パントエア・アナナティスLMG20103株、AJ13355株（FERM BP-6614）、AJ13356株（FERM BP-6615）、AJ13601株（FERM BP-7207）、SC17株（FERM BP-11091）、及びSC17(0)株（VKPM B-9246）が挙げられる。なお、エンテロバクター・アグロメランスのある種のものは、最近、16S rRNAの塩基配列分析等に基づき、パントエア・アグロメランス、パントエア・アナナティス、パントエア・ステワルティイ等に再分類された（Int. J. Syst. Bacteriol., 43, 162-173 (1993)）。本発明において、パントエア属細菌には、このようにパントエア属に再分類された細菌も含まれる。

エルビニア属細菌としては、エルビニア・アミロボーラ（Erwinia amylovora）、エルビニア・カロトボーラ（Erwinia carotovora）が挙げられる。クレブシエラ属細菌としては、クレブシエラ・プランティコーラ（Klebsiella planticola）が挙げられる。

これらの菌株は、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）より分譲を受けることが出来る。すなわち各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る（http://www.atcc.org/参照）。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。

本発明の細菌は、本来的にＬ−アミノ酸生産能を有するものであってもよく、Ｌ−アミノ酸生産能を有するように改変されたものであってもよい。Ｌ−アミノ酸生産能を有する細菌は、例えば、上記のような細菌にＬ−アミノ酸生産能を付与することにより、または、上記のような細菌のＬ−アミノ酸生産能を増強することにより、取得できる。

Ｌ−アミノ酸生産能の付与または増強は、従来、コリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌等のアミノ酸生産菌の育種に採用されてきた方法により行うことができる（アミノ酸発酵、（株）学会出版センター、1986年5月30日初版発行、第７７〜１００頁参照）。そのような方法としては、例えば、栄養要求性変異株の取得、Ｌ−アミノ酸のアナログ耐性株の取得、代謝制御変異株の取得、Ｌ−アミノ酸の生合成系酵素の活性が増強された組換え株の創製が挙げられる。Ｌ−アミノ酸生産菌の育種において、付与される栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独であってもよく、２種又は３種以上であってもよい。また、Ｌ−アミノ酸生産菌の育種において、活性が増強されるＬ−アミノ酸生合成系酵素も、単独であってもよく、２種又は３種以上であってもよい。さらに、栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、生合成系酵素の活性の増強が組み合わされてもよい。

Ｌ−アミノ酸生産能を有する栄養要求性変異株、アナログ耐性株、又は代謝制御変異株は、親株又は野生株を通常の変異処理に供し、得られた変異株の中から、栄養要求性、アナログ耐性、又は代謝制御変異を示し、且つＬ−アミノ酸生産能を有するものを選択することによって取得できる。通常の変異処理としては、Ｘ線や紫外線の照射、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、メチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の変異剤による処理が挙げられる。

また、Ｌ−アミノ酸生産能の付与又は増強は、目的のＬ−アミノ酸の生合成に関与する酵素の活性を増強することによっても行うことができる。酵素活性の増強は、例えば、同酵素をコードする遺伝子の発現が増強するように細菌を改変することにより行うことができる。遺伝子の発現を増強する方法は、WO00/18935号パンフレット、欧州特許出願公開1010755号明細書等に記載されている。酵素活性を増強する詳細な手法については後述する。

また、Ｌ−アミノ酸生産能の付与又は増強は、目的のＬ−アミノ酸の生合成経路から分岐して目的のＬ−アミノ酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性を低下させることによっても行うことができる。なお、ここでいう「目的のＬ−アミノ酸の生合成経路から分岐して目的のＬ−アミノ酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素」には、目的のアミノ酸の分解に関与する酵素も含まれる。酵素活性を低下させる手法については後述する。

以下、Ｌ−アミノ酸生産菌、およびＬ−アミノ酸生産能を付与または増強する方法について具体的に例示する。なお、以下に例示するようなＬ−アミノ酸生産菌が有する性質およびＬ−アミノ酸生産能を付与または増強するための改変は、いずれも、単独で用いてもよく、適宜組み合わせて用いてもよい。

＜Ｌ−グルタミン酸生産菌＞
Ｌ−グルタミン酸生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ−グルタミン酸生合成系酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（gdhA）、グルタミンシンテターゼ（glnA）、グルタミン酸シンテターゼ（gltBD）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（icdA）、アコニテートヒドラターゼ（acnA, acnB）、クエン酸シンターゼ（gltA）、メチルクエン酸シンターゼ（prpC）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ppc）、ピルビン酸カルボキシラーゼ（pyc）、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（aceEF, lpdA）、ピルベートキナーゼ（pykA, pykF）、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ（ppsA）、エノラーゼ（eno）、ホスホグリセロムターゼ（pgmA, pgmI）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（pgk）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（gapA）、トリオースリン酸イソメラーゼ（tpiA）、フルクトースビスリン酸アルドラーゼ（fbp）、ホスホフルクトキナーゼ（pfkA, pfkB）、グルコースリン酸イソメラーゼ（pgi）、６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼ（edd）、２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸アルドラーゼ（eda）、トランスヒドロゲナーゼが挙げられる。なお、カッコ内は、その酵素をコードする遺伝子の略記号である（以下の記載においても同様）。これらの酵素の中では、例えば、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、クエン酸シンターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、及びメチルクエン酸シンターゼから選択される１またはそれ以上の酵素の活性を増強するのが好ましい。

クエン酸シンターゼ遺伝子、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子、および／またはグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が増大するように改変された腸内細菌科に属する株としては、EP1078989A、EP955368A、及びEP952221Aに開示されたものが挙げられる。また、エントナー・ドゥドロフ経路の遺伝子（edd, eda）の発現が増大するように改変された腸内細菌科に属する株としては、EP1352966Bに開示されたものが挙げられる。

また、Ｌ−グルタミン酸生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が低下するように細菌を改変する方法も挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、イソクエン酸リアーゼ（aceA）、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ（sucA）、ホスホトランスアセチラーゼ（pta）、酢酸キナーゼ（ack）、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ilvG）、アセト乳酸シンターゼ（ilvI）、ギ酸アセチルトランスフェラーゼ（pfl）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ldh）、アルコールデヒドロゲナーゼ（adh）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（gadAB）、コハク酸デヒドロゲナーゼ（sdhABCD）、１−ピロリン−５−カルボキシレートデヒドロゲナーゼ（putA）が挙げられる。これらの酵素の中では、例えば、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を低下又は欠損させることが好ましい。

α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下または欠損したエシェリヒア属細菌、及びそれらの取得方法は、米国特許第5,378,616号及び第5,573,945号に記載されている。また、パントエア属細菌、エンテロバクター属細菌、クレブシエラ属細菌、エルビニア属細菌等の腸内細菌においてα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を低下または欠損させる方法は、米国特許6,197,559号公報、米国特許6,682,912号公報、米国特許6,331,419号公報、米国特許8,129,151号公報、およびWO2008/075483に開示されている。α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下または欠損したエシェリヒア属細菌として、具体的には、例えば、下記の株が挙げられる。
E. coli W3110sucA::Kmr
E. coli AJ12624 (FERM BP-3853)
E. coli AJ12628 (FERM BP-3854)
E. coli AJ12949 (FERM BP-4881)

E. coli W3110sucA::Kmr は、E. coli W3110のα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼをコードするsucA遺伝子を破壊することにより得られた株である。この株は、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を完全に欠損している。

また、Ｌ−グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株としては、Pantoea ananatis AJ13355株（FERM BP-6614）、Pantoea ananatis SC17株（FERM BP-11091）、Pantoea ananatis SC17(0)株（VKPM B-9246）等のパントエア属細菌も挙げられる。AJ13355株は、静岡県磐田市の土壌から、低pHでＬ−グルタミン酸及び炭素源を含む培地で増殖できる株として分離された株である。SC17株は、AJ13355株から、粘液質低生産変異株として選択された株である（米国特許第6,596,517号）。SC17株は、2009年2月4日に、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（現、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター、郵便番号：292-0818、住所：日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に寄託され、受託番号FERM BP-11091が付与されている。AJ13355株は、1998年2月19日に、工業技術院生命工学工業技術研究所（現、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター、郵便番号：292-0818、住所：日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に、受託番号FERM P-16644として寄託され、1999年1月11日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6614が付与されている。

また、Ｌ−グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株としては、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下または欠損したパントエア属細菌も挙げられる。そのような株としては、AJ13355株のα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼのE1サブユニット遺伝子（sucA）欠損株であるAJ13356株（米国特許第6,331,419号）、及びSC17株のsucA遺伝子欠損株であるSC17sucA株（米国特許第6,596,517号）が挙げられる。AJ13356株は、1998年2月19日に、工業技術院生命工学工業技術研究所（現、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター、郵便番号：292-0818、住所：日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に受託番号FERM P-16645として寄託され、1999年1月11日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6616が付与されている。また、SC17sucA株は、ブライベートナンバーAJ417が付与され、2004年2月26日に独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（現、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター、郵便番号：292-0818、住所：日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に受託番号FERM BP-8646として寄託されている。

尚、AJ13355株は、分離された当時はEnterobacter agglomeransと同定されたが、近年、16S rRNAの塩基配列解析などにより、Pantoea ananatisに再分類されている。よって、AJ13355株及びAJ13356株は、上記寄託機関にEnterobacter agglomeransとして寄託されているが、本明細書ではPantoea ananatisとして記載する。

また、Ｌ−グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株としては、Pantoea ananatis SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株、Pantoea ananatis AJ13601株、Pantoea ananatis NP106株、及びPantoea ananatis NA1株等のパントエア属細菌も挙げられる。SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株は、SC17sucA株に、エシェリヒア・コリ由来のクエン酸シンターゼ遺伝子（gltA）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（ppc）、およびグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（gdhA）を含むプラスミドRSFCPG、並びに、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のクエン酸シンターゼ遺伝子（gltA）を含むプラスミドpSTVCBを導入して得られた株である。AJ13601株は、このSC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株から低pH下で高濃度のＬ−グルタミン酸に耐性を示す株として選択された株である。また、NP106株は、AJ13601株からプラスミドRSFCPG+pSTVCBを脱落させた株である。AJ13601株は、1999年8月18日に、工業技術院生命工学工業技術研究所（現、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター、郵便番号：292-0818、住所：日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に受託番号FERM P-17516として寄託され、2000年7月6日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-7207が付与されている。

また、Ｌ−グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株としては、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ（sucA）活性およびコハク酸デヒドロゲナーゼ（sdh）活性の両方が低下または欠損した株も挙げられる（特開2010-041920号）。そのような株として、具体的には、例えば、Pantoea ananatis NA1のsucAsdhA二重欠損株が挙げられる（特開2010-041920号）。

また、Ｌ−グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株としては、栄養要求性変異株も挙げられる。栄養要求性変異株として、具体的には、例えば、E. coli VL334thrC⁺ (VKPM B-8961) (EP 1172433) が挙げられる。E. coli VL334 (VKPM B-1641) は、thrC遺伝子及びilvA遺伝子に変異を有するＬ−イソロイシン及びＬ−スレオニン要求性株である (米国特許第4,278,765号)。E. coli VL334thrC⁺は、thrC遺伝子の野生型アレルをVL334に導入することにより得られた、Ｌ−イソロイシン要求性のＬ−グルタミン酸生産菌である。thrC遺伝子の野生型アレルは、野生型E. coli K-12株 (VKPM B-7) の細胞で増殖したバクテリオファージP1を用いる一般的形質導入法により導入された。

また、Ｌ−グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株としては、アスパラギン酸アナログに耐性を有する株も挙げられる。これらの株は、例えば、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を欠損していてもよい。アスパラギン酸アナログに耐性を有し、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を欠損した株として、具体的には、例えば、E. coli AJ13199 (FERM BP-5807) (米国特許第5,908,768号)、さらにＬ−グルタミン酸分解能が低下したE. coli FFRM P-12379 (米国特許第5,393,671号)、E. coli AJ13138 (FERM BP-5565) (米国特許第6,110,714号) が挙げられる。

また、Ｌ−グルタミン酸生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｄ−キシルロース−５−リン酸−ホスホケトラーゼ及び／又はフルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼの活性が増大するように細菌を改変する方法も挙げられる（特表2008-509661）。Ｄ−キシルロース−５−リン酸−ホスホケトラーゼ活性及びフルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼ活性はいずれか一方を増強してもよいし、両方を増強してもよい。なお、本明細書ではＤ−キシルロース−５−リン酸−ホスホケトラーゼとフルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼをまとめてホスホケトラーゼと呼ぶことがある。

Ｄ−キシルロース−５−リン酸−ホスホケトラーゼ活性とは、リン酸を消費して、キシルロース−５−リン酸をグリセルアルデヒド−３−リン酸とアセチルリン酸に変換し、一分子のH₂Oを放出する活性を意味する。この活性は、Goldberg, M.らの文献 (Methods Enzymol., 9,515-520 (1966)) またはL.Meileの文献 (J.Bacteriol. (2001) 183; 2929-2936) に記載の方法によって測定することができる。

また、フルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼ活性とは、リン酸を消費して、フルクトース６−リン酸をエリスロース−４−リン酸とアセチルリン酸に変換し、一分子のH₂Oを放出する活性を意味する。この活性は、Racker, Eの文献 (Methods Enzymol., 5, 276-280 (1962)) またはL.Meileの文献 (J.Bacteriol. (2001) 183; 2929-2936) に記載の方法によって測定することができる。

また、Ｌ−グルタミン酸生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ−グルタミン酸排出遺伝子であるyhfK遺伝子（WO2005/085419）やybjL遺伝子（WO2008/133161）の発現を増強することも挙げられる。

＜Ｌ−グルタミン生産菌＞
Ｌ−グルタミン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ−グルタミン生合成系酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（gdhA）やグルタミンシンセターゼ（glnA）が挙げられる。なお、グルタミンシンセターゼの活性は、グルタミンアデニニルトランスフェラーゼ遺伝子（glnE）の破壊やPII制御タンパク質遺伝子（glnB）の破壊によって増強してもよい（EP1229121）。

また、Ｌ−グルタミン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ−グルタミンの生合成経路から分岐してＬ−グルタミン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が低下するように細菌を改変する方法も挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、グルタミナーゼが挙げられる。

Ｌ−グルタミン生産菌又はそれを誘導するための親株として、具体的には、例えば、グルタミンシンセターゼの397位のチロシン残基が他のアミノ酸残基に置換された変異型グルタミンシンセターゼを有するエシェリヒア属に属する株が挙げられる（米国特許出願公開第2003-0148474号明細書）。

＜Ｌ−プロリン生産菌＞
Ｌ−プロリン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ−プロリン生合成系酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。そのような酵素としては、グルタミン酸−５−キナーゼ（proB）、γ‐グルタミル−リン酸レダクターゼ、ピロリン−５−カルボキシレートレダクターゼ（putA）が挙げられる。酵素活性の増強には、例えば、Ｌ−プロリンによるフィードバック阻害が解除されたグルタミン酸−５−キナーゼをコードするproB遺伝子(ドイツ特許第3127361号)が好適に利用できる。

また、Ｌ−プロリン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ−プロリン分解に関与する酵素の活性が低下するように細菌を改変する方法が挙げられる。そのような酵素としては、プロリンデヒドロゲナーゼやオルニチンアミノトランスフェラーゼが挙げられる。

Ｌ−プロリン生産菌又はそれを誘導するための親株として、具体的には、例えば、E. coli NRRL B-12403及びNRRL B-12404 (英国特許第2075056号)、E. coli VKPM B-8012 (ロシア特許出願2000124295)、ドイツ特許第3127361号に記載のE. coliプラスミド変異体、Bloom F.R. et al (The 15th Miami winter symposium, 1983, p.34)に記載のE. coliプラスミド変異体、３，４−デヒドロキシプロリンおよびアザチジン−２−カルボキシレートに耐性のE. coli 702株（VKPMB-8011）、702株のilvA遺伝子欠損株であるE. coli 702ilvA株(VKPM B-8012) (EP 1172433) が挙げられる。

＜Ｌ−スレオニン生産菌＞
Ｌ−スレオニン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ−スレオニン生合成系酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、アスパルトキナーゼIII（lysC）、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（asd）、アスパルトキナーゼI（thrA）、ホモセリンキナーゼ（homoserine kinase）（thrB）、スレオニンシンターゼ（threonine synthase）（thrC）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（アスパラギン酸トランスアミナーゼ）（aspC）が挙げられる。これらの酵素の中では、アスパルトキナーゼIII、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アスパルトキナーゼI、ホモセリンキナーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、及びスレオニンシンターゼから選択される１またはそれ以上の酵素の活性を増強するのが好ましい。Ｌ−スレオニン生合成系遺伝子は、スレオニン分解が抑制された株に導入してもよい。スレオニン分解が抑制された株としては、例えば、スレオニンデヒドロゲナーゼ活性が欠損したE. coli TDH6株（特開2001-346578号）が挙げられる。

Ｌ−スレオニン生合成系酵素の活性は、最終産物のＬ−スレオニンによって阻害される。従って、Ｌ−スレオニン生産菌を構築するためには、Ｌ−スレオニンによるフィードバック阻害を受けないようにＬ−スレオニン生合成系遺伝子を改変するのが好ましい。上記thrA、thrB、thrC遺伝子は、スレオニンオペロンを構成しており、スレオニンオペロンは、アテニュエーター構造を形成している。スレオニンオペロンの発現は、培養液中のイソロイシン、スレオニンに阻害を受け、アテニュエーションにより抑制される。スレオニンオペロンの発現の増強は、アテニュエーション領域のリーダー配列あるいはアテニュエーターを除去することにより達成できる（Lynn, S. P., Burton, W. S., Donohue, T. J., Gould, R. M., Gumport, R. I., and Gardner, J. F. J. Mol. Biol. 194:59-69 (1987); WO02/26993; WO2005/049808; WO2003/097839参照）。

スレオニンオペロンの上流には固有のプロモーターが存在するが、同プロモーターを非天然のプロモーターに置換してもよい（WO98/04715号パンフレット参照）。また、スレオニン生合成関与遺伝子がラムダファ−ジのリプレッサーおよびプロモーターの制御下で発現するようにスレオニンオペロンを構築してもよい（欧州特許第0593792号明細書参照）。また、Ｌ−スレオニンによるフィードバック阻害を受けないように改変された細菌は、Ｌ−スレオニンアナログであるα-amino-β-hydroxyvaleric acid（AHV）に耐性な菌株を選抜することによっても取得できる。

このようにＬ−スレオニンによるフィードバック阻害を受けないように改変されたスレオニンオペロンは、コピー数の上昇により、あるいは強力なプロモーターに連結されることにより、宿主内での発現量が向上しているのが好ましい。コピー数の上昇は、スレオニンオペロンを含むプラスミドを宿主に導入することにより達成できる。また、コピー数の上昇は、トランスポゾン、Muファ−ジ等を利用して、宿主のゲノム上にスレオニンオペロンを転移させることによっても達成できる。

また、Ｌ−スレオニン生産能を付与または増強する方法としては、宿主にＬ−スレオニン耐性を付与する方法やＬ−ホモセリン耐性を付与する方法も挙げられる。耐性の付与は、例えば、Ｌ−スレオニンに耐性を付与する遺伝子、Ｌ−ホモセリンに耐性を付与する遺伝子の発現を強化することにより達成できる。耐性を付与する遺伝子としては、rhtA遺伝子(Res. Microbiol. 154:123−135 (2003))、rhtB遺伝子（欧州特許出願公開第0994190号明細書）、rhtC遺伝子（欧州特許出願公開第1013765号明細書）、yfiK遺伝子、yeaS遺伝子（欧州特許出願公開第1016710号明細書）が挙げられる。また、宿主にＬ−スレオニン耐性を付与する方法は、欧州特許出願公開第0994190号明細書や国際公開第90/04636号パンフレットに記載の方法を参照出来る。

Ｌ−スレオニン生産菌又はそれを誘導するための親株として、具体的には、例えば、E. coli TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996) (米国特許第5,175,107号、米国特許第5,705,371号)、E. coli 472T23/pYN7 (ATCC 98081) (米国特許第5,631,157号)、E. coli NRRＬ−21593 (米国特許第5,939,307号)、E. coli FERM BP-3756 (米国特許第5,474,918号)、E. coli FERM BP-3519及びFERM BP-3520 (米国特許第5,376,538号)、E. coli MG442 (Gusyatiner et al., Genetika (in Russian), 14, 947-956 (1978))、E. coli VL643及びVL2055 (EP 1149911 A)、ならびにE. coli VKPM B-5318 (EP 0593792 B) が挙げられる。

VKPM B-3996株は、TDH-6株に、プラスミドpVIC40を導入した株である。TDH-6株は、スクロース資化性であり、thrC遺伝子を欠損し、ilvA遺伝子にリーキー（leaky）変異を有する。また、VKPM B-3996株は、rhtA遺伝子に、高濃度のスレオニンまたはホモセリンに対する耐性を付与する変異を有する。プラスミドpVIC40は、RSF1010由来ベクターに、スレオニンによるフィードバック阻害に耐性のアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする変異型thrA遺伝子と野生型thrBC遺伝子を含むthrA^*BCオペロンが挿入されたプラスミドである（米国特許第5,705,371号）。この変異型thrA遺伝子は、スレオニンによるフィードバック阻害が実質的に解除されたアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする。B-3996株は、1987年11月19日、オールユニオン・サイエンティフィック・センター・オブ・アンチビオティクス（Nagatinskaya Street 3-A, 117105 Moscow, Russia）に、受託番号RIA 1867で寄託されている。この株は、また、1987年4月7日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ (VKPM) (FGUP GosNII Genetika, 1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia) に、受託番号VKPM B-3996で寄託されている。

VKPM B-5318株は、イソロイシン非要求性であり、プラスミドpVIC40中のスレオニンオペロンの制御領域を温度感受性ラムダファージC1リプレッサー及びPRプロモーターにより置換したプラスミドpPRT614を保持する。VKPM B-5318は、1990年5月3日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ (VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia) に、受託番号VKPM B-5318で国際寄託されている。

E. coliのアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードするthrA遺伝子は明らかにされている(ヌクレオチド番号337〜2799, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrA遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrL遺伝子とthrB遺伝子との間に位置する。Escherichia coliのホモセリンキナーゼをコードするthrB遺伝子は明らかにされている(ヌクレオチド番号2801〜3733, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrB遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrA遺伝子とthrC遺伝子との間に位置する。E. coliのスレオニンシンターゼをコードするthrC遺伝子は明らかにされている(ヌクレオチド番号3734〜5020, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrC遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrB遺伝子とyaaXオープンリーディングフレームとの間に位置する。また、スレオニンによるフィードバック阻害に耐性のアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする変異型thrA遺伝子と野生型thrBC遺伝子を含むthrA*BCオペロンは、スレオニン生産株E. coli VKPM B-3996に存在する周知のプラスミドpVIC40（米国特許第5,705,371号）から取得できる。

E. coliのrhtA遺伝子は、グルタミン輸送系の要素をコードするglnHPQ オペロンに近いE. coli染色体の18分に存在する。rhtA遺伝子は、ORF1 (ybiF遺伝子, ヌクレオチド番号764〜1651, GenBank accession number AAA218541, gi:440181)と同一であり、pexB遺伝子とompX遺伝子との間に位置する。ORF1によりコードされるタンパク質を発現するユニットは、rhtA遺伝子と呼ばれている(rht: resistant to homoserine and threonine（ホモセリン及びスレオニンに耐性）)。また、高濃度のスレオニン又はホモセリンへの耐性を付与するrhtA23変異が、ATG開始コドンに対して-1位のG→A置換であることが判明している(ABSTRACTS of the 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No. 457, EP 1013765 A)。

E. coliのasd遺伝子は既に明らかにされており(ヌクレオチド番号3572511〜3571408, GenBank accession NC_000913.1, gi:16131307)、その遺伝子の塩基配列に基づいて作製されたプライマーを用いるPCRにより取得できる(White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)参照)。他の微生物のasd遺伝子も同様に得ることができる。

また、E. coliのaspC遺伝子も既に明らかにされており(ヌクレオチド番号983742〜984932, GenBank accession NC_000913.1, gi:16128895)、その遺伝子の塩基配列に基づいて作製されたプライマーを用いるPCRにより得ることができる。他の微生物のaspC遺伝子も同様に得ることができる。

＜Ｌ−リジン生産菌＞
Ｌ−リジン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ−リジン生合成系酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ（dihydrodipicolinate synthase）（dapA）、アスパルトキナーゼIII（aspartokinase III）（lysC）、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ（dihydrodipicolinate reductase）（dapB）、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ（diaminopimelate decarboxylase）（lysA）、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（diaminopimelate dehydrogenase）（ddh）（米国特許第6,040,160号）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（phosphoenolpyruvate carboxylase）（ppc）、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（aspartate semialdehyde dehydrogenase）（asd）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（aspartate aminotransferase）（アスパラギン酸トランスアミナーゼ（aspartate transaminase））（aspC）、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ（diaminopimelate epimerase）（dapF）、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ（tetrahydrodipicolinate succinylase）（dapD）、スクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼ（succinyl-diaminopimelate deacylase）（dapE）、及びアスパルターゼ（aspartase）（aspA）（EP 1253195 A）が挙げられる。これらの酵素の中では、例えば、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ、及びスクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼから選択される１またはそれ以上の酵素の活性を増強するのが好ましい。また、Ｌ−リジン生産菌又はそれを誘導するための親株では、エネルギー効率に関与する遺伝子（cyo）（EP 1170376 A）、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ（nicotinamide nucleotide transhydrogenase）をコードする遺伝子（pntAB）（米国特許第5,830,716号）、ybjE遺伝子（WO2005/073390）、またはこれらの組み合わせの発現レベルが増大していてもよい。アスパルトキナーゼIII（lysC）はＬ−リジンによるフィードバック阻害を受けるので、同酵素の活性を増強するには、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除されたアスパルトキナーゼIIIをコードする変異型lysC遺伝子を利用してもよい（米国特許5,932,453号明細書）。また、ジヒドロジピコリン酸合成酵素（dapA）Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けるので、同酵素の活性を増強するには、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除されたジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする変異型dapA遺伝子を利用してもよい。

また、Ｌ−リジン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ−リジンの生合成経路から分岐してＬ−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が低下するように細菌を改変する方法も挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、ホモセリンデヒドロゲナーゼ（homoserine dehydrogenase）、リジンデカルボキシラーゼ（lysine decarboxylase）（米国特許第5,827,698号）、及びリンゴ酸酵素（malic enzyme）（WO2005/010175）が挙げられる。

また、Ｌ−リジン生産菌又はそれを誘導するための親株としては、Ｌ−リジンアナログに耐性を有する変異株が挙げられる。Ｌ−リジンアナログは腸内細菌科の細菌やコリネ型細菌等の細菌の生育を阻害するが、この阻害は、Ｌ−リジンが培地に共存するときには完全にまたは部分的に解除される。Ｌ−リジンアナログとしては、特に制限されないが、オキサリジン、リジンヒドロキサメート、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン（AEC）、γ−メチルリジン、α−クロロカプロラクタムが挙げられる。これらのリジンアナログに対して耐性を有する変異株は、細菌を通常の人工変異処理に付すことによって得ることができる。

Ｌ−リジン生産菌又はそれを誘導するための親株として、具体的には、例えば、E. coli AJ11442（FERM BP-1543, NRRL B-12185; 米国特許第4,346,170号参照）及びE. coli VL611が挙げられる。これらの株では、アスパルトキナーゼのＬ−リジンによるフィードバック阻害が解除されている。Ｌ−リジン生産菌又はそれを誘導するための親株として、具体的には、例えば、E. coli AJIK01株（NITE BP-01520）も挙げられる。AJIK01株は、E. coli AJ111046と命名され、2013年1月29日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（郵便番号：292-0818、住所：日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に寄託され、2014年5月15日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号NITE BP-01520が付与されている。

Ｌ−リジン生産菌又はそれを誘導するための親株として、具体的には、E. coli WC196株も挙げられる。WC196株は、E. coli K-12に由来するW3110株にAEC耐性を付与することにより育種された（米国特許第5,827,698号）。WC196株は、E. coli AJ13069と命名され、1994年12月6日に、工業技術院生命工学工業技術研究所（現、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター、郵便番号：292-0818、住所：日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に受託番号FERM P-14690として寄託され、1995年9月29日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-5252が付与されている（米国特許第5,827,698号）。

好ましいＬ−リジン生産菌として、E. coli WC196ΔcadAΔldcやE. coli WC196ΔcadAΔldc/pCABD2が挙げられる（WO2010/061890）。WC196ΔcadAΔldcは、WC196株より、リジンデカルボキシラーゼをコードするcadA及びldcC遺伝子を破壊することにより構築した株である。WC196ΔcadAΔldc/pCABD2は、WC196ΔcadAΔldcに、リジン生合成系遺伝子を含むプラスミドpCABD2（米国特許第6,040,160号）を導入することにより構築した株である。WC196ΔcadAΔldcは、AJ110692と命名され、2008年10月7日、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（現、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター、郵便番号：292-0818、住所：日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に受託番号FERM BP-11027として国際寄託された。pCABD2は、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除された変異を有するエシェリヒア・コリ由来のジヒドロジピコリン酸合成酵素（DDPS）をコードする変異型dapA遺伝子と、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除された変異を有するエシェリヒア・コリ由来のアスパルトキナーゼIIIをコードする変異型lysC遺伝子と、エシェリヒア・コリ由来のジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードするdapB遺伝子と、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードするddh遺伝子を含んでいる。

＜Ｌ−アルギニン生産菌＞
Ｌ−アルギニン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ−アルギニン生合成系酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ（argA）、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ（argC）、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ（argJ）、Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ（argB）、アセチルオルニチントランスアミナーゼ（argD）、アセチルオルニチンデアセチラーゼ（argE）オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（argF）、アルギニノコハク酸シンターゼ（argG）、アルギニノコハク酸リアーゼ（argH）、カルバモイルリン酸シンターゼ（carAB）が挙げられる。Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ（argA）遺伝子としては、例えば、野生型の１５位〜１９位に相当するアミノ酸残基が置換され、Ｌ−アルギニンによるフィードバック阻害が解除された変異型Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼをコードする遺伝子を用いると好適である（欧州出願公開1170361号明細書）。

Ｌ−アルギニン生産菌又はそれを誘導するための親株として、具体的には、例えば、E. coli 237株 (VKPM B-7925) (米国特許出願公開2002/058315 A1)、変異型Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼをコードするargA遺伝子が導入されたその誘導株 (ロシア特許出願第2001112869号, EP1170361A1)、237株由来の酢酸資化能が向上した株であるE. coli 382株 (VKPM B-7926) (EP1170358A1)、及び382株にE. coli K-12株由来の野生型ilvA遺伝子が導入された株であるE. coli 382ilvA+株が挙げられる。E. coli 237株は、2000年4月10日にルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ (VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia) にVKPM B-7925の受託番号で寄託され、2001年5月18日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管された。E. coli 382株は、2000年4月10日にルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ (VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia) にVKPM B-7926の受託番号で寄託されている。

また、Ｌ−アルギニン生産菌又はそれを誘導するための親株としては、アミノ酸アナログ等への耐性を有する株も挙げられる。そのような株としては、例えば、α−メチルメチオニン、ｐ−フルオロフェニルアラニン、Ｄ−アルギニン、アルギニンヒドロキサム酸、Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン、α−メチルセリン、β−２−チエニルアラニン、またはスルファグアニジンに耐性を有するエシェリヒア・コリ変異株（特開昭56-106598号公報参照）が挙げられる。

＜Ｌ−シトルリン生産菌およびＬ−オルニチン生産菌＞
Ｌ−シトルリンおよびＬ−オルニチンは、Ｌ−アルギニンと生合成経路が共通している。よって、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ（argA）、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ（argC）、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ（argJ）、N-アセチルグルタミン酸キナーゼ（argB）、アセチルオルニチントランスアミナーゼ（argD）、および／またはアセチルオルニチンデアセチラーゼ（argE）の酵素活性を上昇させることによって、Ｌ−シトルリンおよび／またはＬ−オルニチンの生産能を付与または増強することができる（国際公開2006-35831号パンフレット）。

＜Ｌ−ヒスチジン生産菌＞
Ｌ−ヒスチジン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ−ヒスチジン生合成系酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、ＡＴＰホスホリボシルトランスフェラーゼ（hisG）、ホスホリボシル−ＡＭＰサイクロヒドロラーゼ（hisI）、ホスホリボシル−ＡＴＰピロホスホヒドロラーゼ（hisI）、ホスホリボシルフォルミミノ−５−アミノイミダゾールカルボキサミドリボタイドイソメラーゼ（hisA）、アミドトランスフェラーゼ（hisH）、ヒスチジノールフォスフェイトアミノトランスフェラーゼ（hisC）、ヒスチジノールフォスファターゼ（hisB）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（hisD）が挙げられる。

これらの内、hisG及びhisBHAFIにコードされるＬ−ヒスチジン生合成系酵素は、Ｌ−ヒスチジンにより阻害されることが知られている。従って、Ｌ−ヒスチジン生産能は、例えば、ＡＴＰホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（hisG）にフィードバック阻害への耐性を付与する変異を導入することにより、付与または増強させることができる(ロシア特許第2003677号及び第2119536号)。

Ｌ−ヒスチジン生産菌又はそれを誘導するための親株として、具体的には、例えば、E. coli 24株 (VKPM B-5945, RU2003677)、E. coli NRRL B-12116〜B12121 (米国特許第4,388,405号)、E. coli H-9342 (FERM BP-6675)及びH-9343 (FERM BP-6676) (米国特許第6,344,347号)、E. coli H-9341 (FERM BP-6674) (EP1085087)、E. coli AI80/pFM201 (米国特許第6,258,554号)、Ｌ−ヒスチジン生合成系酵素をコードするDNAを保持するベクターを導入したE. coli FERM P-5038及び5048 (特開昭56-005099号)、アミノ酸輸送の遺伝子を導入したE. coli株 (EP1016710A)、スルファグアニジン、ＤＬ−１，２，４−トリアゾール−３−アラニン、及びストレプトマイシンに対する耐性を付与したE. coli 80株 (VKPM B-7270, ロシア特許第2119536号) などのエシェリヒア属に属する株が挙げられる。

＜Ｌ−システイン生産菌＞
Ｌ−システイン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ−システイン生合成系酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、セリンアセチルトランスフェラーゼ（cysE）や３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（serA）が挙げられる。セリンアセチルトランスフェラーゼ活性は、例えば、システインによるフィードバック阻害に耐性の変異型セリンアセチルトランスフェラーゼをコードする変異型cysE遺伝子を細菌に導入することにより増強できる。変異型セリンアセチルトランスフェラーゼは、例えば、特開平11-155571や米国特許公開第20050112731に開示されている。また、３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性は、例えば、セリンによるフィードバック阻害に耐性の変異型３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼをコードする変異型serA遺伝子を細菌に導入することにより増強できる。変異型３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼは、例えば、米国特許第6,180,373号に開示されている。

また、Ｌ−システイン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ−システインの生合成経路から分岐してＬ−システイン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が低下するように細菌を改変する方法も挙げられる。そのような酵素としては、例えば、Ｌ−システインの分解に関与する酵素が挙げられる。Ｌ−システインの分解に関与する酵素としては、特に制限されないが、シスタチオニン−β−リアーゼ（metC）（特開平11-155571号、Chandra et. al., Biochemistry, 21 (1982) 3064-3069））、トリプトファナーゼ（tnaA）（特開2003-169668、Austin Newton et. al., J. Biol. Chem. 240 (1965) 1211-1218）、Ｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼＢ（cysM）（特開2005-245311）、malY遺伝子産物（特開2005-245311）、Pantoea ananatisのd0191遺伝子産物（特開2009-232844）が挙げられる。

また、Ｌ−システイン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ−システイン排出系を増強することや硫酸塩／チオ硫酸塩輸送系を増強することも挙げられる。Ｌ−システイン排出系のタンパク質としては、ydeD遺伝子にコードされるタンパク質（特開2002-233384）、yfiK遺伝子にコードされるタンパク質（特開2004-49237）、emrAB、emrKY、yojIH、acrEF、bcr、およびcusAの各遺伝子にコードされる各タンパク質（特開2005-287333）、yeaS遺伝子にコードされるタンパク質（特開2010-187552）が挙げられる。硫酸塩／チオ硫酸塩輸送系のタンパク質としては、cysPTWAM遺伝子クラスターにコードされるタンパク質が挙げられる。

Ｌ−システイン生産菌又はそれを誘導するための親株として、具体的には、例えば、フィードバック阻害耐性の変異型セリンアセチルトランスフェラーゼをコードする種々のcysEアレルで形質転換されたE. coli JM15 (米国特許第6,218,168号、ロシア特許出願第2003121601号)、細胞に毒性の物質を排出するのに適したタンパク質をコードする過剰発現遺伝子を有するE. coli W3110 (米国特許第5,972,663号)、システインデスルフヒドラーゼ活性が低下したE. coli株 (JP11155571A2)、cysB遺伝子によりコードされる正のシステインレギュロンの転写制御因子の活性が上昇したE. coli W3110 (WO01/27307A1)が挙げられる。

＜Ｌ−メチオニン生産菌＞
Ｌ−メチオニン生産菌又はそれを誘導するための親株としては、Ｌ−スレオニン要求株や、ノルロイシンに耐性を有する変異株が挙げられる(特開2000-139471)。また、Ｌ−メチオニン生産菌又はそれを誘導するための親株としては、Ｌ−メチオニンによるフィードバック阻害に対して耐性をもつ変異型ホモセリントランスサクシニラーゼを保持する株も挙げられる（特開2000-139471、US20090029424）。なお、Ｌ−メチオニンはＬ−システインを中間体として生合成されるため、Ｌ−システインの生産能の向上によりＬ−メチオニンの生産能も向上させることができる（特開2000-139471、US20080311632）。

Ｌ−メチオニン生産菌又はそれを誘導するための親株として、具体的には、例えば、E. coli AJ11539 (NRRL B-12399)、E. coli AJ11540 (NRRL B-12400)、E. coli AJ11541 (NRRL B-12401)、E. coli AJ11542 (NRRL B-12402) (英国特許第2075055号)、Ｌ−メチオニンのアナログであるノルロイシン耐性を有するE. coli 218株 (VKPM B-8125)(ロシア特許第2209248号)や73株 (VKPM B-8126) (ロシア特許第2215782号)、E. coli AJ13425 (FERM P-16808)（特開2000-139471）が挙げられる。AJ13425株は、メチオニンリプレッサーを欠損し、細胞内のＳ−アデノシルメチオニンシンセターゼ活性が弱化し、細胞内のホモセリントランスサクシニラーゼ活性、シスタチオニンγ−シンターゼ活性、及びアスパルトキナーゼ−ホモセリンデヒドロゲナーゼII活性が増強された、E. coli W3110由来のＬ−スレオニン要求株である。

＜Ｌ−ロイシン生産菌＞
Ｌ−ロイシン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ−ロイシン生合成系酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、leuABCDオペロンの遺伝子にコードされる酵素が挙げられる。また、酵素活性の増強には、例えば、Ｌ−ロイシンによるフィードバック阻害が解除されたイソプロピルマレートシンターゼをコードする変異leuA遺伝子(米国特許第6,403,342号)が好適に利用できる。

Ｌ−ロイシン生産菌又はそれを誘導するための親株として、具体的には、例えば、ロイシン耐性のE. coli株 (例えば、57株 (VKPM B-7386, 米国特許第6,124,121号))、β−２−チエニルアラニン、３−ヒドロキシロイシン、４−アザロイシン、５，５，５−トリフルオロロイシンなどのロイシンアナログ耐性のE. coli株(特公昭62-34397号及び特開平8-70879号)、WO96/06926に記載された遺伝子工学的方法で得られたE. coli株、E. coli H-9068 (特開平8-70879号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられる。

＜Ｌ−イソロイシン生産菌＞
Ｌ−イソロイシン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ−イソロイシン生合成系酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、スレオニンデアミナーゼやアセトヒドロキシ酸シンターゼが挙げられる（特開平2-458号, FR 0356739, 及び米国特許第5,998,178号）。

Ｌ−イソロイシン生産菌又はそれを誘導するための親株として、具体的には、例えば、６−ジメチルアミノプリンに耐性を有する変異株(特開平5-304969号)、チアイソロイシン、イソロイシンヒドロキサメートなどのイソロイシンアナログに耐性を有する変異株、イソロイシンアナログに加えてＤＬ−エチオニン及び／またはアルギニンヒドロキサメートに耐性を有する変異株(特開平5-130882号) 等のエシェリヒア属細菌が挙げられる。

＜Ｌ−バリン生産菌＞
Ｌ−バリン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ−バリン生合成系酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、ilvGMEDAオペロンやilvBNCオペロンの遺伝子にコードされる酵素が挙げられる。ilvBNはアセトヒドロキシ酸シンターゼを、ilvCはイソメロリダクターゼ（国際公開00/50624号）を、それぞれコードする。なお、ilvGMEDAオペロンおよびilvBNCオペロンは、Ｌ−バリン、Ｌ−イソロイシン、および／またはＬ−ロイシンによる発現抑制（アテニュエーション）を受ける。よって、酵素活性の増強のためには、アテニュエーションに必要な領域を除去または改変し、生成するＬ−バリンによる発現抑制を解除するのが好ましい。また、ilvA遺伝子がコードするスレオニンデアミナーゼは、Ｌ−イソロイシン生合成系の律速段階であるＬ−スレオニンから２−ケト酪酸への脱アミノ化反応を触媒する酵素である。よって、Ｌ−バリン生産のためには、ilvA遺伝子が破壊等され、スレオニンデアミナーゼ活性が減少しているのが好ましい。

また、Ｌ−バリン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ−バリンの生合成経路から分岐してＬ−バリン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が低下するように細菌を改変する方法も挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、Ｌ−ロイシン合成に関与するスレオニンデヒドラターゼやＤ−パントテン酸合成に関与する酵素が挙げられる（国際公開00/50624号）。

Ｌ−バリン生産菌又はそれを誘導するための親株として、具体的には、例えば、ilvGMEDAオペロンを過剰発現するように改変されたE. coli株(米国特許第5,998,178号) が挙げられる。

また、Ｌ−バリン生産菌又はそれを誘導するための親株としては、アミノアシルt-RNAシンテターゼに変異を有する株(米国特許第5,658,766号)も挙げられる。そのような株としては、例えば、イソロイシンtRNAシンテターゼをコードするileS遺伝子に変異を有するE. coli VL1970が挙げられる。E. coli VL1970は、1988年6月24日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia)に、受託番号VKPM B-4411で寄託されている。また、Ｌ−バリン生産菌又はそれを誘導するための親株としては、生育にリポ酸を要求する、および／または、H⁺-ATPaseを欠失している変異株(WO96/06926)も挙げられる。

＜Ｌ−トリプトファン生産菌、Ｌ−フェニルアラニン生産菌、Ｌ−チロシン生産菌＞
Ｌ−トリプトファン生産能、Ｌ−フェニルアラニン生産能、および／またはＬ−チロシン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、および／またはＬ−チロシンの生合成系酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。

これらの芳香族アミノ酸に共通する生合成系酵素としては、特に制限されないが、３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロン酸−７−リン酸シンターゼ（aroG）、３−デヒドロキネートシンターゼ（aroB）、シキミ酸デヒドロゲナーゼ（aroE）、シキミ酸キナーゼ（aroL）、５−エノール酸ピルビルシキミ酸３−リン酸シンターゼ（aroA）、コリスミ酸シンターゼ（aroC）が挙げられる（欧州特許763127号）。これらの酵素をコードする遺伝子の発現はチロシンリプレッサー（tyrR）によって制御されており、tyrR遺伝子を欠損させることによって、これらの酵素の活性を増強してもよい（欧州特許763127号）。

Ｌ−トリプトファン生合成系酵素としては、特に制限されないが、アントラニル酸シンターゼ（trpE）、トリプトファンシンターゼ（trpAB）、及びホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（serA）が挙げられる。例えば、トリプトファンオペロンを含むＤＮＡを導入することにより、Ｌ−トリプトファン生産能を付与又は増強できる。トリプトファンシンターゼは、それぞれtrpA及びtrpB遺伝子によりコードされるα及びβサブユニットからなる。アントラニル酸シンターゼはＬ−トリプトファンによるフィードバック阻害を受けるので、同酵素の活性を増強するには、フィードバック阻害を解除する変異を導入した同酵素をコードする遺伝子を利用してもよい。ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼはＬ−セリンによるフィードバック阻害を受けるので、同酵素の活性を増強するには、フィードバック阻害を解除する変異を導入した同酵素をコードする遺伝子を利用してもよい。さらに、マレートシンターゼ（aceB）、イソクエン酸リアーゼ（aceA）、およびイソクエン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ／フォスファターゼ（aceK）からなるオペロン（aceオペロン）の発現を増大させることによりＬ−トリプトファン生産能を付与または増強してもよい(WO2005/103275)。

Ｌ−フェニルアラニン生合成系酵素としては、特に制限されないが、コリスミ酸ムターゼ及びプレフェン酸デヒドラターゼが挙げられる。コリスミ酸ムターゼ及びプレフェン酸デヒドラターゼは、２機能酵素としてpheA遺伝子によってコードされている。コリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドラターゼはＬ−フェニルアラニンによるフィードバック阻害を受けるので、同酵素の活性を増強するには、フィードバック阻害を解除する変異を導入した同酵素をコードする遺伝子を利用してもよい。

Ｌ−チロシン生合成系酵素としては、特に制限されないが、コリスミ酸ムターゼ及びプレフェン酸デヒドロゲナーゼが挙げられる。コリスミ酸ムターゼ及びプレフェン酸デヒドロゲナーゼは、２機能酵素としてtyrA遺伝子によってコードされている。コリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼはＬ−チロシンによるフィードバック阻害を受けるので、同酵素の活性を増強するには、フィードバック阻害を解除する変異を導入した同酵素をコードする遺伝子を利用してもよい。

Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、および／またはＬ−チロシンの生産菌は、目的の芳香族アミノ酸以外の芳香族アミノ酸の生合成が低下するように改変されていてもよい。また、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、および／またはＬ−チロシンの生産菌は、副生物の取り込み系が増強されるように改変されていてもよい。副生物としては、目的の芳香族アミノ酸以外の芳香族アミノ酸が挙げられる。副生物の取り込み系をコードする遺伝子としては、例えば、Ｌ−トリプトファンの取り込み系をコードする遺伝子であるtnaBやmtr、Ｌ−フェニルアラニンの取り込み系をコードする遺伝子であるpheP、Ｌ−チロシンの取り込み系をコードする遺伝子であるtyrPが挙げられる（EP1484410）。

Ｌ−トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株として、具体的には、例えば、部分的に不活化されたトリプトファニル-tRNAシンテターゼをコードする変異型trpS遺伝子を保持するE. coli JP4735/pMU3028 (DSM10122)及びJP6015/pMU91 (DSM10123) (米国特許第5,756,345号)、トリプトファンによるフィードバック阻害を受けないアントラニル酸シンターゼをコードするtrpEアレルを有するE. coli SV164、セリンによるフィードバック阻害を受けないホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼをコードするserAアレル及びトリプトファンによるフィードバック阻害を受けないアントラニル酸シンターゼをコードするtrpEアレルを有するE. coli SV164 (pGH5) (米国特許第6,180,373号)、トリプトファンによるフィードバック阻害を受けないアントラニル酸シンターゼをコードするtrpEアレルを含むトリプトファンオペロンが導入された株 (特開昭57-71397号, 特開昭62-244382号, 米国特許第4,371,614号)、トリプトファナーゼが欠損したE. coli AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263)及びAGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264) (米国特許第4,371,614号)、ホスホエノールピルビン酸生産能が増大したE. coli AGX17/pGX50,pACKG4-pps (WO9708333, 米国特許第6,319,696号)、yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属する株 (米国特許出願公開2003/0148473 A1及び2003/0157667 A1) が挙げられる。

Ｌ−フェニルアラニン生産菌又はそれを誘導するための親株として、具体的には、例えば、コリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼ及びチロシンリプレッサーを欠損したE. coli AJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (VKPM B-8197)(WO03/044191)、フィードバック阻害が解除されたコリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドラターゼをコードする変異型pheA34遺伝子を保持するE. coli HW1089 (ATCC 55371) (米国特許第 5,354,672号)、E. coli MWEC101-b (KR8903681)、E. coli NRRL B-12141、NRRL B-12145、NRRL B-12146、NRRL B-12147 (米国特許第4,407,952号)が挙げられる。また、Ｌ−フェニルアラニン生産菌又はそれを誘導するための親株として、具体的には、例えば、フィードバック阻害が解除されたコリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子を保持するE. coli K-12 ＜W3110 (tyrA)/pPHAB＞ (FERM BP-3566)、E. coli K-12 ＜W3110 (tyrA)/pPHAD＞ (FERM BP-12659)、E. coli K-12 ＜W3110 (tyrA)/pPHATerm＞ (FERM BP-12662)、E. coli K-12 AJ 12604 ＜W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB＞ (FERM BP-3579)も挙げられる(EP 488424 B1)。また、Ｌ−フェニルアラニン生産菌又はそれを誘導するための親株として、具体的には、例えば、yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属する株も挙げられる(US2003/0148473、US2003/0157667、WO03/044192)。

また、Ｌ−アミノ酸生産能を付与または増強する方法としては、例えば、細菌の細胞からＬ−アミノ酸を排出する活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。Ｌ−アミノ酸を排出する活性は、例えば、Ｌ−アミノ酸を排出するタンパク質をコードする遺伝子の発現を上昇させることにより、増大させることができる。各種アミノ酸を排出するタンパク質をコードする遺伝子としては、例えば、b2682遺伝子（ygaZ）、b2683遺伝子（ygaH）、b1242遺伝子（ychE）、b3434遺伝子（yhgN）が挙げられる（特開2002-300874号公報）。

また、Ｌ−アミノ酸生産能を付与または増強する方法としては、例えば、糖代謝に関与するタンパク質やエネルギー代謝に関与するタンパク質の活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。

糖代謝に関与するタンパク質としては、糖の取り込みに関与するタンパク質や解糖系酵素が挙げられる。糖代謝に関与するタンパク質をコードする遺伝子としては、グルコース６−リン酸イソメラーゼ遺伝子（pgi；国際公開第01/02542号パンフレット）、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ遺伝子（pps；欧州出願公開877090号明細書）、ホスホエノ−ルピルビン酸カルボキシラ−ゼ遺伝子（ppc；国際公開95/06114号パンフレット)、ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（pyc；国際公開99/18228号パンフレット、欧州出願公開1092776号明細書）、ホスホグルコムターゼ遺伝子（pgm；国際公開03/04598号パンフレット）、フルクトース二リン酸アルドラーゼ遺伝子（pfkB, fbp；国際公開03/04664号パンフレット）、ピルビン酸キナーゼ遺伝子（pykF；国際公開03/008609号パンフレット）、トランスアルドラーゼ遺伝子（talB；国際公開03/008611号パンフレット）、フマラーゼ遺伝子（fum；国際公開01/02545号パンフレット）、non-PTSスクロース取り込み遺伝子遺伝子（csc；欧州出願公開149911号パンフレット）、スクロース資化性遺伝子（scrABオペロン；国際公開第90/04636号パンフレット）が挙げられる。

エネルギー代謝に関与するタンパク質をコードする遺伝子としては、トランスヒドロゲナーゼ遺伝子（pntAB；米国特許 5,830,716号明細書）、チトクロムbo型オキシダーゼ（cytochromoe bo type oxidase）遺伝子(cyoB；欧州特許出願公開1070376号明細書)が挙げられる。

なお、上記のＬ−アミノ酸生産菌の育種に使用される遺伝子は、元の機能が維持されたタンパク質をコードする限り、上記例示した遺伝子や公知の塩基配列を有する遺伝子に限られず、そのバリアントであってもよい。例えば、Ｌ−アミノ酸生産菌の育種に使用される遺伝子は、公知のタンパク質のアミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。遺伝子やタンパク質のバリアントについては、後述するacpP遺伝子およびfabF遺伝子ならびにそれらがコードするタンパク質のバリアントに関する記載を準用できる。

＜１−２＞acpP-fabFオペロンの弱化
本発明の細菌は、acpP-fabFオペロンが弱化されるように改変されている。acpP-fabFオペロンは脂肪酸生合成に関与する（非特許文献１）ため、acpP-fabFオペロンが弱化された細菌を用いてＬ−アミノ酸生産培養を行った場合、非改変株を用いてＬ−アミノ酸生産培養を行った場合と比較して、脂肪酸生合成経路への炭素の流入が減る結果、余剰の炭素や還元力がＬ−アミノ酸生産に用いられ、Ｌ−アミノ酸生産が向上すると推定される。本発明の細菌は、Ｌ−アミノ酸生産能を有する細菌を、acpP-fabFオペロンが弱化されるように改変することにより取得できる。また、本発明の細菌は、acpP-fabFオペロンが弱化されるように細菌を改変した後に、Ｌ−アミノ酸生産能を付与または増強することによっても得ることができる。また、本発明の細菌は、acpP-fabFオペロンが弱化されるように改変されたことによりＬ−アミノ酸生産能を獲得したものであってもよい。本発明の細菌を構築するための改変は、任意の順番で行うことができる。

「acpP-fabFオペロンが弱化される」とは、acpP-fabFオペロンの遺伝子にコードされるタンパク質の活性が低下すること、および／または、acpP-fabFオペロンの遺伝子の発現が低下することを意味する。「遺伝子の発現が低下する」とは、遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）が低下すること、および／または、遺伝子の翻訳量（タンパク質の量）が低下することを意味する。「acpP-fabFオペロンの遺伝子」とは、acpP遺伝子および／またはfabF遺伝子をいう。すなわち、「acpP-fabFオペロンの遺伝子にコードされるタンパク質」とは、acpP遺伝子にコードされるタンパク質および／またはfabF遺伝子にコードされるタンパク質（すなわち、AcpPタンパク質および／またはFabFタンパク質）をいう。タンパク質の活性は、後述するように、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子の発現を弱化することや、同タンパク質をコードする遺伝子を破壊することにより、達成できる。すなわち、「acpP-fabFオペロンが弱化される」とは、例えば、acpP-fabFオペロンの遺伝子の発現が弱化されることであってよい。本発明においては、例えば、acpP遺伝子およびfabF遺伝子のいずれかの発現が弱化されてもよく、両方の発現が弱化されてもよい。すなわち、acpP-fabFオペロン全体の発現が弱化されてもよい。

acpP遺伝子は、アシルキャリアタンパク質（acyl carrier protein；ＡＣＰ）をコードする遺伝子である。「ＡＣＰ」とは、脂肪酸生合成の際に、４’−ホスホパンテテイン基を介して脂肪酸鎖と結合し、脂肪酸鎖を担持する機能を有するタンパク質をいう。また、当該機能を、「ＡＣＰ活性」ともいう。なお、ＡＣＰは、不活性なapo-ACPとして翻訳され、その後、ＡＣＰシンターゼ（ACP synthease）によりapo-ACPの３６位（エシェリヒア・コリの場合）のセリン残基に４’−ホスホパンテテイン（4'-phosphopanteheine）が補因子として付加され、活性なholo-ACPとなる。

fabF遺伝子は、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ（beta-ketoacyl-ACP synthase II）をコードする遺伝子である。「β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ」とは、アシル−ＡＣＰ（炭素数ｎ）とマロニル−ＡＣＰから、３−オキソアシル−ＡＣＰ（炭素数ｎ＋２）を生成する反応を触媒する酵素をいう（EC 2.3.1.41）。また、同反応を触媒する活性を、「β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ活性」ともいう。

Escherichia coli K-12 MG1655株のacpP遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、1150838〜1151074位の配列に相当する。MG1655株のacpP遺伝子は、ECK1080、JW1080と同義である。また、MG1655株のAcpPタンパク質は、GenBank accession NP_415612 (version NP_415612.1 GI:16129057, locus_tag="b1094")として登録されている。

Escherichia coli K-12 MG1655株のfabF遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、1151162〜1152403位の配列に相当する。MG1655株のfabF遺伝子は、ECK1081、JW1081と同義である。また、MG1655株のFabFタンパク質は、GenBank accession NP_415613 (version NP_415613.1 GI:16129058, locus_tag="b1095")として登録されている。

MG1655株のacpP-fabFオペロンの塩基配列（上流210 bpを含む）を、配列番号７に示す。配列番号７において、acpP遺伝子の塩基配列は211〜447位に、fabF遺伝子の塩基配列は535〜1776位に、それぞれ相当する。また、MG1655株のAcpPタンパク質およびFabFタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号８および９に示す。

Pantoea ananatis AJ13355株のacpP遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_017531 (VERSION NC_017531.1 GI:386014600)として登録されているゲノム配列中、986154〜986528位の配列に相当する。また、AJ13355株のAcpPタンパク質は、GenBank accession YP_005933706 (version YP_005933706.1 GI:386015425)として登録されている。

Pantoea ananatis AJ13355株のfabF遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_017531 (VERSION NC_017531.1 GI:386014600)として登録されているゲノム配列中、986650〜987855位の配列に相当する。また、AJ13355株のFabFタンパク質は、GenBank accession YP_005933707 (version YP_005933707.1 GI:386015426)として登録されている。

AJ13355株のacpP-fabFオペロンの塩基配列（上流210 bpを含む）を、配列番号１０に示す。配列番号１０において、acpP遺伝子の塩基配列は211〜585位に、fabF遺伝子の塩基配列は707〜1912位に、それぞれ相当する。また、AJ13355株のAcpPタンパク質およびFabFタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１１および１２に示す。

AcpPタンパク質またはFabFタンパク質は、元の機能が維持されている限り、上記AcpPタンパク質またはFabFタンパク質のバリアントであってもよい。同様に、acpP遺伝子またはfabF遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記acpP遺伝子またはfabF遺伝子のバリアントであってもよい。なお、そのような元の機能が維持されたバリアントを「保存的バリアント」という場合がある。「AcpPタンパク質」または「FabFタンパク質」という用語は、それぞれ、上記AcpPタンパク質またはFabFタンパク質に加えて、それらの保存的バリアントを包含するものとする。同様に、「acpP遺伝子」または「fabF遺伝子」という用語は、それぞれ、上記acpP遺伝子またはfabF遺伝子に加えて、それらの保存的バリアントを包含するものとする。保存的バリアントとしては、例えば、上記AcpPタンパク質またはFabFタンパク質や上記acpP遺伝子またはfabF遺伝子の、ホモログや人為的な改変体が挙げられる。

「元の機能が維持されている」とは、タンパク質または遺伝子のバリアントが、元のタンパク質または遺伝子の機能（活性や性質）に対応する機能（活性や性質）を有することをいう。すなわち、例えば、AcpPタンパク質についての「元の機能が維持されている」とは、タンパク質がＡＣＰ活性を有することをいい、FabFタンパク質についての「元の機能が維持されている」とは、タンパク質がβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ活性を有することをいう。また、例えば、acpP遺伝子についての「元の機能が維持されている」とは、遺伝子がＡＣＰ活性を有するタンパク質をコードすることをいい、fabF遺伝子についての「元の機能が維持されている」とは、遺伝子がβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ活性を有するタンパク質をコードすることをいう。

上記AcpPタンパク質またはFabFタンパク質のホモログをコードする遺伝子は、例えば、上記acpP遺伝子またはfabF遺伝子の塩基配列を問い合わせ配列として用いたBLAST検索やFASTA検索によって公開データベースから容易に取得することができる。また、上記AcpPタンパク質またはFabFタンパク質のホモログをコードする遺伝子は、例えば、細菌等の生物の染色体を鋳型にして、これら公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲにより取得することができる。

acpP遺伝子またはfabF遺伝子は、上記AcpPタンパク質またはFabFタンパク質の保存的バリアントをコードする遺伝子であってよい。例えば、acpP遺伝子またはfabF遺伝子は、元の機能が維持されたタンパク質をコードする限りにおいて、上記アミノ酸配列（例えば、配列番号８、９、１１、または１２のアミノ酸配列）において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。この場合、対応する活性（ＡＣＰ活性やβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ活性）は、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加される前のタンパク質に対して、通常70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上が維持され得る。なお上記「１又は数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、具体的には、１〜５０個、１〜４０個、１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個を意味する。

上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加は、タンパク質の機能が正常に維持される保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、遺伝子が由来する生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。

さらに、上記のような保存的変異を有する遺伝子は、上記アミノ酸配列全体に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有し、かつ、元の機能が維持されたタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。尚、本明細書において、「相同性」（homology）は、「同一性」（identity）を意味する。

また、acpP遺伝子またはfabF遺伝子は、公知の遺伝子配列から調製され得るプローブ、例えば上記塩基配列（例えば、配列番号７の211〜447位、配列番号７の535〜1776位、配列番号１０の211〜585位、または配列番号１０の707〜1912位の塩基配列）の全体または一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、元の機能が維持されたタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。また、acpP-fabFオペロンは、公知の遺伝子配列から調製され得るプローブ、例えば上記塩基配列（例えば、配列番号７の全体、配列番号７の211〜1776位、配列番号１０の全体、または配列番号１０の211〜1912位の塩基配列）の全体または一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、元の機能が維持されたタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1% SDS、好ましくは60℃、0.1×SSC、0.1% SDS、より好ましくは、68℃、0.1×SSC、0.1% SDSに相当する塩濃度および温度で、１回、好ましくは２〜３回洗浄する条件を挙げることができる。

上述の通り、上記ハイブリダイゼーションに用いるプローブは、遺伝子の相補配列の一部であってもよい。そのようなプローブは、公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、これらの塩基配列を含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作製することができる。例えば、プローブとしては、300 bp程度の長さのDNA断片を用いることができる。プローブとして300 bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件としては、50℃、2×SSC、0.1% SDSが挙げられる。

また、acpP遺伝子またはfabF遺伝子は、元の機能が維持されたタンパク質をコードする限り、任意のコドンがそれと等価のコドンに置換されたものであってもよい。例えば、acpP遺伝子またはfabF遺伝子は、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変されたものであってもよい。

なお、上記の遺伝子やタンパク質の保存的バリアントに関する記載は、Ｌ−アミノ酸生合成系酵素等の任意のタンパク質、およびそれらをコードする遺伝子にも準用できる。

＜１−３＞タンパク質の活性を低下させる手法
以下に、AcpPタンパク質やFabFタンパク質等のタンパク質の活性を低下させる手法について説明する。

「タンパク質の活性が低下する」とは、同タンパク質の細胞当たりの活性が野性株や親株等の非改変株と比較して減少していることを意味し、活性が完全に消失している場合を含む。「タンパク質の活性が低下する」とは、具体的には、非改変株と比較して、同タンパク質の細胞当たりの分子数が低下していること、および／または、同タンパク質の分子当たりの機能が低下していることをいう。すなわち、「タンパク質の活性が低下する」という場合の「活性」とは、タンパク質の触媒活性に限られず、タンパク質をコードする遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）または翻訳量（タンパク質の量）を意味してもよい。なお、「タンパク質の細胞当たりの分子数が低下している」ことには、同タンパク質が全く存在していない場合が含まれる。また、「タンパク質の分子当たりの機能が低下している」ことには、同タンパク質の分子当たりの機能が完全に消失している場合が含まれる。タンパク質の活性は、非改変株と比較して低下していれば特に制限されないが、例えば、非改変株と比較して、９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５５％以下、５０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。

タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子の発現を低下させることにより達成される。「遺伝子の発現が低下する」ことには、同遺伝子が全く発現していない場合が含まれる。なお、「遺伝子の発現が低下する」ことを、「遺伝子の発現が弱化される」ともいう。遺伝子の発現は、例えば、非改変株と比較して、９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５５％以下、５０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。

なお、例えばE. coliにおいて、acpP遺伝子は必須（essential）であることが知られている。よって、AcpPタンパク質の活性を低下させる場合は、必要により、本発明の細菌を培地で培養した際に、本発明の細菌が増殖でき、目的のＬ−アミノ酸が生産される程度に、AcpPタンパク質の活性を残存させる。すなわち、AcpPタンパク質の活性は、非改変株と比較して、０％には低下しない（完全には消失しない）ものとする。例えば、AcpPタンパク質の活性は、非改変株と比較して、１％以上、５％以上、１０％以上、１５％以上、１７％以上、２０％以上、３０％以上、または５０％以上残存してよい。AcpPタンパク質の活性は、具体的には、例えば、非改変株と比較して、１％〜９０％、５％〜８０％、１０％〜７０％、１５％〜６０％、または１７％〜５５％に低下してもよい。また、acpP遺伝子の発現量は、非改変株と比較して、０％には低下しないものとする。例えば、acpP遺伝子の発現量は、非改変株と比較して、１％以上、５％以上、１０％以上、２０％以上、１５％以上、１７％以上、３０％以上、または５０％以上残存してよい。acpP遺伝子の発現量は、具体的には、例えば、非改変株と比較して、１％〜９０％、５％〜８０％、１０％〜７０％、１５％〜６０％、または１７％〜５５％に低下してもよい。このようなAcpPタンパク質の活性を低下させる場合の記載は、FabFタンパク質の活性を低下させる場合に準用してもよい。

遺伝子の発現の低下は、例えば、転写効率の低下によるものであってもよく、翻訳効率の低下によるものであってもよく、それらの組み合わせによるものであってもよい。遺伝子の発現の低下は、例えば、遺伝子のプロモーター、シャインダルガノ（ＳＤ）配列（リボソーム結合部位（ＲＢＳ）ともいう）、ＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域等の発現調節配列を改変することにより達成できる。AcpPタンパク質は細胞内で豊富なタンパク質として知られており、よって、acpP遺伝子の野生型プロモーターの活性は強いことが示唆される（非特許文献１）。従って、例えば、acpP遺伝子の野生型プロモーターをより活性の弱いプロモーターに置換することにより、acpP遺伝子の発現を低下させることができる。acpP遺伝子の野生型プロモーターより活性の弱いプロモーターとしては、例えば、lacプロモーターや、ロシア特許出願公開第2006/134574号公報に記載のP_tac84プロモーターが挙げられる。発現調節配列を改変する場合には、発現調節配列は、好ましくは１塩基以上、より好ましくは２塩基以上、特に好ましくは３塩基以上が改変される。また、発現調節配列の一部または全部を欠失させてもよい。また、遺伝子の発現の低下は、例えば、発現制御に関わる因子を操作することによっても達成できる。発現制御に関わる因子としては、転写や翻訳制御に関わる低分子（誘導物質、阻害物質など）、タンパク質（転写因子など）、核酸（siRNAなど）等が挙げられる。また、遺伝子の発現の低下は、例えば、遺伝子のコード領域に遺伝子の発現が低下するような変異を導入することによっても達成できる。例えば、遺伝子のコード領域のコドンを、宿主においてより低頻度で利用される同義コドンに置き換えることによって、遺伝子の発現を低下させることができる。また、例えば、後述するような遺伝子の破壊により、遺伝子の発現自体が低下し得る。

acpP遺伝子およびfabF遺伝子はacpP-fabFオペロンとして共転写される。なお、fabF遺伝子は、自前のプロモーターから個別にも転写される。また、acpP遺伝子は、yceD-rpmF-plsX-fabHDG-acpP-fabF遺伝子クラスター中の、fabD遺伝子およびfabG遺伝子から共転写され得る。よって、例えば、acpP-fabFオペロンの共転写を制御するプロモーターを改変することにより、acpP遺伝子およびfabF遺伝子の発現をまとめて低下させてもよい。また、例えば、fabF遺伝子の自前のプロモーターを改変することにより、fabF遺伝子の発現を単独で低下させてもよい。また、例えば、fabD遺伝子および／またはfabG遺伝子のプロモーターを改変することにより、それらの遺伝子とともにacpP遺伝子の発現を低下させてもよい。また、例えば、acpP遺伝子および／またはfabF遺伝子のコード領域に、遺伝子の発現が低下するような変異を導入することにより、acpP遺伝子および／またはfabF遺伝子の発現を低下させてもよい。

また、acpP遺伝子および／またはfabF遺伝子の発現が低下する変異として、具体的には、例えば、acpP遺伝子の翻訳開始点の上流−３４位のシトシン（Ｃ）が他の塩基に置換される変異が挙げられる。他の塩基は、アデニン（Ａ）であるのが好ましい。

ここでいう「acpP遺伝子の翻訳開始点の上流−３４位」とは、配列番号７に示す塩基配列における、acpP遺伝子の開始コドン（ＡＴＧ）のＡから数えて、上流に３４番目に相当する位置を意味する。なお、開始コドン（ＡＴＧ）のＡが＋１位、その上流側の隣が−１位である。言い換えると、「acpP遺伝子の翻訳開始点の上流−３４位」とは、配列番号７に示す塩基配列の１７７位（すなわち、GenBank accession NC_000913として登録されているEscherichia coli K-12 MG1655株のゲノム配列の1150804位）に相当する位置を意味する。なお、「acpP遺伝子の翻訳開始点の上流−３４位」は、配列番号７を基準とした相対的な位置を示すものであって、塩基の欠失、挿入、付加などによってその絶対的な位置は前後することがある。すなわち、「acpP遺伝子の翻訳開始点の上流−３４位」は、配列番号７において、１７７位の塩基と開始コドンのＡの間で１塩基が欠失している場合は、acpP遺伝子の開始コドンのＡから数えて、上流に３３番目の位置を意味する。また、「acpP遺伝子の翻訳開始点の上流−３４位」は、配列番号７において、１７７位の塩基と開始コドンのＡの間で１塩基が挿入されている場合は、acpP遺伝子の開始コドンのＡから数えて、上流に３５番目の位置を意味する。

任意の細菌のacpP-fabFオペロンにおいて、いずれの塩基が「acpP遺伝子の翻訳開始点の上流−３４位」の塩基であるかは、例えば、当該細菌のacpP遺伝子の上流配列と、配列番号７におけるacpP遺伝子の上流配列とで、アライメントを行うことにより決定できる。アライメントは、例えば、公知の遺伝子解析ソフトウェアを利用して行うことができる。具体的なソフトウェアとしては、日立ソリューションズ製のDNASISや、ゼネティックス製のGENETYXなどが挙げられる（Elizabeth C. Tyler et al., Computers and Biomedical Research, 24(1), 72-96, 1991；Barton GJ et al., Journal of molecular biology, 198(2), 327-37. 1987）。

また、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子を破壊することにより達成できる。遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域の一部又は全部を欠損させることにより達成できる。さらには、染色体上の遺伝子の前後の配列を含めて、遺伝子全体を欠失させてもよい。タンパク質の活性の低下が達成できる限り、欠失させる領域は、Ｎ末端領域、内部領域、Ｃ末端領域等のいずれの領域であってもよい。通常、欠失させる領域は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、欠失させる領域の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。

また、遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、終止コドンを導入すること（ナンセンス変異）、あるいは１〜２塩基を付加または欠失するフレームシフト変異を導入すること等によっても達成できる（Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617(1997), Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95 5511-5515(1998), Journal of Biological Chemistry 26 116, 20833-20839(1991)）。

また、遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域に他の配列を挿入することによっても達成できる。挿入部位は遺伝子のいずれの領域であってもよいが、挿入する配列は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、挿入部位の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。他の配列としては、コードされるタンパク質の活性を低下又は消失させるものであれば特に制限されないが、例えば、抗生物質耐性遺伝子等のマーカー遺伝子や目的物質の生産に有用な遺伝子が挙げられる。

染色体上の遺伝子を上記のように改変することは、例えば、遺伝子の部分配列を欠失し、正常に機能するタンパク質を産生しないように改変した欠失型遺伝子を作製し、該欠失型遺伝子を含む組換えＤＮＡで宿主を形質転換して、欠失型遺伝子と染色体上の野生型遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、染色体上の野生型遺伝子を欠失型遺伝子に置換することによって達成できる。その際、組換えＤＮＡには、宿主の栄養要求性等の形質にしたがって、マーカー遺伝子を含ませておくと操作がしやすい。欠失型遺伝子によってコードされるタンパク質は、生成したとしても、野生型タンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が低下又は消失する。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子破壊は既に確立しており、「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）とを組み合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法や、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で機能する複製起点を持たないスイサイドベクターを用いる方法などがある（米国特許第6303383号、特開平05-007491号）。

また、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、突然変異処理により行ってもよい。突然変異処理としては、Ｘ線の照射、紫外線の照射、ならびにＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、およびメチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の変異剤による処理が挙げられる。

なお、タンパク質が複数のサブユニットからなる複合体として機能する場合、結果としてタンパク質の活性が低下する限り、それら複数のサブユニットの全てを改変してもよく、一部のみを改変してもよい。すなわち、例えば、それらのサブユニットをコードする複数の遺伝子の全てを破壊等してもよく、一部のみを破壊等してもよい。また、タンパク質に複数のアイソザイムが存在する場合、結果としてタンパク質の活性が低下する限り、複数のアイソザイムの全ての活性を低下させてもよく、一部のみの活性を低下させてもよい。すなわち、例えば、それらのアイソザイムをコードする複数の遺伝子の全てを破壊等してもよく、一部のみを破壊等してもよい。

タンパク質の活性が低下したことは、同タンパク質の活性を測定することで確認できる。

タンパク質の活性が低下したことは、同タンパク質をコードする遺伝子の発現が低下したことを確認することによっても、確認できる。遺伝子の発現が低下したことは、同遺伝子の転写量が低下したことを確認することや、同遺伝子から発現するタンパク質の量が低下したことを確認することにより確認できる。

遺伝子の転写量が低下したことの確認は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を非改変株と比較することによって行うことが出来る。mRNAの量を評価する方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT−PCR等が挙げられる（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。mRNAの量は、非改変株と比較して、例えば、９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５５％以下、５０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。ただし、acpP遺伝子から転写されるmRNAの量は、非改変株と比較して、０％には低下しないものとする。例えば、acpP遺伝子の発現が低下する場合、同遺伝子から転写されるmRNAの量は、非改変株と比較して、１％以上、５％以上、１０％以上、１５％以上、１７％以上、２０％以上、または３０％以上、または５０％以上残存してもよい。acpP遺伝子の発現が低下する場合、同遺伝子から転写されるmRNAの量は、具体的には、例えば、非改変株と比較して、１％〜９０％、５％〜８０％、１０％〜７０％、１５％〜６０％、または１７％〜５５％に低下してよい。

タンパク質の量が低下したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことが出来る（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。タンパク質の量は、非改変株と比較して、例えば、９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５５％以下、５０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。ただし、AcpPタンパク質の量は、非改変株と比較して、０％には低下しないものとする。例えば、acpP遺伝子の発現が低下する場合、AcpPタンパク質の量は、非改変株と比較して、１％以上、５％以上、１０％以上、１５％以上、１７％以上、２０％以上、または３０％以上、または５０％以上残存してもよい。acpP遺伝子の発現が低下する場合、AcpPタンパク質の量は、具体的には、例えば、非改変株と比較して、１％〜９０％、５％〜８０％、１０％〜７０％、１５％〜６０％、または１７％〜５５％に低下してよい。

遺伝子が破壊されたことは、破壊に用いた手段に応じて、同遺伝子の一部または全部の塩基配列、制限酵素地図、または全長等を決定することで確認できる。

上記したタンパク質の活性を低下させる手法は、acpP-fabFオペロンの弱化に加えて、任意のタンパク質、例えば目的のＬ−アミノ酸の生合成経路から分岐して目的のＬ−アミノ酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素、の活性低下や、任意の遺伝子、例えばそれら任意のタンパク質をコードする遺伝子、の発現低下に利用できる。

＜１−４＞タンパク質の活性を増大させる手法
以下に、タンパク質の活性を増大させる手法について説明する。

「タンパク質の活性が増大する」とは、同タンパク質の細胞当たりの活性が野生株や親株等の非改変株に対して増大していることを意味する。なお、「タンパク質の活性が増大する」ことを、「タンパク質の活性が増強される」ともいう。「タンパク質の活性が増大する」とは、具体的には、非改変株と比較して、同タンパク質の細胞当たりの分子数が増加していること、および／または、同タンパク質の分子当たりの機能が増大していることをいう。すなわち、「タンパク質の活性が増大する」という場合の「活性」とは、タンパク質の触媒活性に限られず、タンパク質をコードする遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）または翻訳量（タンパク質の量）を意味してもよい。また、「タンパク質の活性が増大する」とは、もともと標的のタンパク質の活性を有する菌株において同タンパク質の活性を増大させることだけでなく、もともと標的のタンパク質の活性が存在しない菌株に同タンパク質の活性を付与することを含む。また、結果としてタンパク質の活性が増大する限り、宿主が本来有する標的のタンパク質の活性を低下または消失させた上で、好適な標的のタンパク質の活性を付与してもよい。

タンパク質の活性は、非改変株と比較して増大していれば特に制限されないが、例えば、非改変株と比較して、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。また、非改変株が標的のタンパク質の活性を有していない場合は、同タンパク質をコードする遺伝子を導入することにより同タンパク質が生成されていればよいが、例えば、同タンパク質はその酵素活性が測定できる程度に生産されていてよい。

タンパク質の活性が増大するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子の発現を上昇させることによって達成される。なお、「遺伝子の発現が上昇する」ことを、「遺伝子の発現が増強される」ともいう。遺伝子の発現は、例えば、非改変株と比較して、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。また、「遺伝子の発現が上昇する」とは、もともと標的の遺伝子が発現している菌株において同遺伝子の発現量を上昇させることだけでなく、もともと標的の遺伝子が発現していない菌株において、同遺伝子を発現させることを含む。すなわち、「遺伝子の発現が上昇する」とは、例えば、標的の遺伝子を保持しない菌株に同遺伝子を導入し、同遺伝子を発現させることを含む。

遺伝子の発現の上昇は、例えば、遺伝子のコピー数を増加させることにより達成できる。

遺伝子のコピー数の増加は、宿主の染色体へ同遺伝子を導入することにより達成できる。染色体への遺伝子の導入は、例えば、相同組み換えを利用して行うことができる（MillerI, J. H. Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory）。遺伝子は、１コピーのみ導入されてもよく、２コピーまたはそれ以上導入されてもよい。例えば、染色体上に多数のコピーが存在する配列を標的として相同組み換えを行うことで、染色体へ遺伝子の多数のコピーを導入することができる。染色体上に多数のコピーが存在する配列としては、反復DNA配列（repetitive DNA）、トランスポゾンの両端に存在するインバーテッド・リピートが挙げられる。また、目的物質の生産に不要な遺伝子等の染色体上の適当な配列を標的として相同組み換えを行ってもよい。相同組み換えは、例えば、Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で機能する複製起点を持たないスイサイドベクターを用いる方法、またはファージを用いたtransduction法により行うことができる。また、遺伝子は、トランスポゾンやMini-Muを用いて染色体上にランダムに導入することもできる（特開平2-109985号公報、US5,882,888、EP805867B1）。

染色体上に標的遺伝子が導入されたことの確認は、同遺伝子の全部又は一部と相補的な配列を持つプローブを用いたサザンハイブリダイゼーション、又は同遺伝子の配列に基づいて作成したプライマーを用いたPCR等によって確認できる。

また、遺伝子のコピー数の増加は、同遺伝子を含むベクターを宿主に導入することによっても達成できる。例えば、標的遺伝子を含むＤＮＡ断片を、宿主で機能するベクターと連結して同遺伝子の発現ベクターを構築し、当該発現ベクターで宿主を形質転換することにより、同遺伝子のコピー数を増加させることができる。標的遺伝子を含むＤＮＡ断片は、例えば、標的遺伝子を有する微生物のゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲにより取得できる。ベクターとしては、宿主の細胞内において自律複製可能なベクターを用いることができる。ベクターは、マルチコピーベクターであるのが好ましい。また、形質転換体を選択するために、ベクターは抗生物質耐性遺伝子などのマーカーを有することが好ましい。また、ベクターは、挿入された遺伝子を発現するためのプロモーターやターミネーターを備えていてもよい。ベクターは、例えば、細菌プラスミド由来のベクター、酵母プラスミド由来のベクター、バクテリオファージ由来のベクター、コスミド、またはファージミド等であってよい。エシェリヒア・コリ等の腸内細菌科の細菌において自律複製可能なベクターとして、具体的には、例えば、pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、pBR322、pSTV29（いずれもタカラバイオ社より入手可）、pACYC184、pMW219（ニッポンジーン社）、pTrc99A（ファルマシア社）、pPROK系ベクター（クロンテック社）、pKK233‐2（クロンテック社製）、pET系ベクター（ノバジェン社）、pQE系ベクター（キアゲン社）、広宿主域ベクターRSF1010が挙げられる。

遺伝子を導入する場合、遺伝子は、発現可能に本発明の細菌に保持されていればよい。具体的には、遺伝子は、本発明の細菌で機能するプロモーター配列による制御を受けて発現するように導入されていればよい。プロモーターは、宿主由来のプロモーターであってもよく、異種由来のプロモーターであってもよい。プロモーターは、導入する遺伝子の固有のプロモーターであってもよく、他の遺伝子のプロモーターであってもよい。プロモーターとしては、例えば、後述するような、より強力なプロモーターを利用してもよい。また、例えば、遺伝子の下流には、転写終結用のターミネーターを配置することができる。ターミネーターは、本発明の細菌において機能するものであれば特に制限されない。ターミネーターは、宿主由来のターミネーターであってもよく、異種由来のターミネーターであってもよい。ターミネーターは、導入する遺伝子の固有のターミネーターであってもよく、他の遺伝子のターミネーターであってもよい。ターミネーターとして、具体的には、例えば、T7ターミネーター、T4ターミネーター、fdファージターミネーター、tetターミネーター、およびtrpAターミネーターが挙げられる。各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネーターに関しては、例えば「微生物学基礎講座８ 遺伝子工学、共立出版、1987年」に詳細に記載されており、それらを利用することが可能である。

また、２またはそれ以上の遺伝子を導入する場合、各遺伝子が、発現可能に本発明の細菌に保持されていればよい。例えば、各遺伝子は、全てが単一の発現ベクター上に保持されていてもよく、全てが染色体上に保持されていてもよい。また、各遺伝子は、複数の発現ベクター上に別々に保持されていてもよく、単一または複数の発現ベクター上と染色体上とに別々に保持されていてもよい。また、２またはそれ以上の遺伝子でオペロンを構成して導入してもよい。「２またはそれ以上の遺伝子を導入する場合」としては、例えば、２またはそれ以上の酵素をそれぞれコードする遺伝子を導入する場合、単一の酵素を構成する２またはそれ以上のサブユニットをそれぞれコードする遺伝子を導入する場合、およびそれらの組み合わせが挙げられる。

導入される遺伝子は、宿主で機能するタンパク質をコードするものであれば特に制限されない。導入される遺伝子は、宿主由来の遺伝子であってもよく、異種由来の遺伝子であってもよい。導入される遺伝子は、例えば、同遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーを用い、同遺伝子を有する生物のゲノムDNAや同遺伝子を搭載するプラスミド等を鋳型として、PCRにより取得することができる。また、導入される遺伝子は、例えば、同遺伝子の塩基配列に基づいて全合成してもよい（Gene, 60(1), 115-127 (1987)）。

なお、タンパク質が複数のサブユニットからなる複合体として機能する場合、結果としてタンパク質の活性が増大する限り、それら複数のサブユニットの全てを改変してもよく、一部のみを改変してもよい。すなわち、例えば、遺伝子の発現を上昇させることによりタンパク質の活性を増大させる場合、それらのサブユニットをコードする複数の遺伝子の全ての発現を増強してもよく、一部の発現のみを増強してもよい。通常は、それらのサブユニットをコードする複数の遺伝子の全ての発現を増強するのが好ましい。また、複合体を構成する各サブユニットは、複合体が目的のタンパク質の機能を有する限り、１種の生物由来であってもよく、２種またはそれ以上の異なる生物由来であってもよい。すなわち、例えば、複数のサブユニットをコードする、同一の生物由来の遺伝子を宿主に導入してもよく、それぞれ異なる生物由来の遺伝子を宿主に導入してもよい。

また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の転写効率を向上させることにより達成できる。遺伝子の転写効率の向上は、例えば、染色体上の遺伝子のプロモーターをより強力なプロモーターに置換することにより達成できる。「より強力なプロモーター」とは、遺伝子の転写が、もともと存在している野生型のプロモーターよりも向上するプロモーターを意味する。より強力なプロモーターとしては、例えば、公知の高発現プロモーターであるT7プロモーター、trpプロモーター、lacプロモーター、thrプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーター、tetプロモーター、araBADプロモーター、rpoHプロモーター、PRプロモーター、およびPLプロモーターが挙げられる。また、より強力なプロモーターとしては、各種レポーター遺伝子を用いることにより、在来のプロモーターの高活性型のものを取得してもよい。例えば、プロモーター領域内の-35、-10領域をコンセンサス配列に近づけることにより、プロモーターの活性を高めることができる（国際公開第00/18935号）。高活性型プロモーターとしては、各種tac様プロモーター（Katashkina JI et al. Russian Federation Patent application 2006134574）やpnlp8プロモーター（WO2010/027045）が挙げられる。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)）等に記載されている。

また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の翻訳効率を向上させることにより達成できる。遺伝子の翻訳効率の向上は、例えば、染色体上の遺伝子のシャインダルガノ（ＳＤ）配列（リボソーム結合部位（ＲＢＳ）ともいう）をより強力なＳＤ配列に置換することにより達成できる。「より強力なＳＤ配列」とは、ｍＲＮＡの翻訳が、もともと存在している野生型のＳＤ配列よりも向上するＳＤ配列を意味する。より強力なＳＤ配列としては、例えば、ファージＴ７由来の遺伝子１０のＲＢＳが挙げられる(Olins P. O. et al, Gene, 1988, 73, 227-235)。さらに、ＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域、特に開始コドンのすぐ上流の配列(5'-UTR)における数個のヌクレオチドの置換、あるいは挿入、あるいは欠失がｍＲＮＡの安定性および翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することによっても遺伝子の翻訳効率を向上させることができる。

本発明においては、プロモーター、ＳＤ配列、およびＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域等の遺伝子の発現に影響する部位を総称して「発現調節領域」ともいう。発現調節領域は、プロモーター検索ベクターやＧＥＮＥＴＹＸ等の遺伝子解析ソフトを用いて決定することができる。これら発現調節領域の改変は、例えば、温度感受性ベクターを用いた方法や、Ｒｅｄドリブンインテグレーション法（WO2005/010175）により行うことができる。

遺伝子の翻訳効率の向上は、例えば、コドンの改変によっても達成できる。エシェリヒア・コリ等において、ｍＲＮＡ分子の集団内に見出される６１種のアミノ酸コドン間には明らかなコドンの偏りが存在し、あるｔＲＮＡの存在量は、対応するコドンの使用頻度と直接比例するようである（Kane, J.F., Curr. Opin. Biotechnol., 6(5), 494-500 (1995)）。すなわち、過剰のレアコドンを含むｍＲＮＡが大量に存在すると翻訳の問題が生じうる。近年の研究によれば、特に、ＡＧＧ／ＡＧＡ、ＣＵＡ、ＡＵＡ、ＣＧＡ、又はＣＣＣコドンのクラスターが、合成されたタンパク質の量および質の両方を低下させ得ることが示唆されている。このような問題は、特に異種遺伝子の発現の際に生じうる。よって、遺伝子の異種発現を行う場合等には、遺伝子中に存在するレアコドンを、より高頻度で利用される同義コドンに置き換えることにより、遺伝子の翻訳効率を向上させることができる。コドンの置換は、例えば、ＤＮＡの目的の部位に目的の変異を導入する部位特異的変異法により行うことができる。部位特異的変異法としては、PCRを用いる方法（Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989)；Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382 (1987)）や、ファージを用いる方法（Kramer,W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987)；Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)）が挙げられる。また、コドンが置換された遺伝子断片を全合成してもよい。種々の生物におけるコドンの使用頻度は、「コドン使用データベース」（http://www.kazusa.or.jp/codon; Nakamura, Y. et al, Nucl. Acids Res., 28, 292 (2000)）に開示されている。

また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の発現を上昇させるようなレギュレーターを増幅すること、または、遺伝子の発現を低下させるようなレギュレーターを欠失または弱化させることによっても達成できる。

上記のような遺伝子の発現を上昇させる手法は、単独で用いてもよく、任意の組み合わせで用いてもよい。

また、タンパク質の活性が増大するような改変は、例えば、タンパク質の比活性を増強することによっても達成できる。比活性の増強には、フィードバック阻害の低減および解除も含まれる。比活性が増強されたタンパク質は、例えば、種々の生物を探索し取得することができる。また、在来のタンパク質に変異を導入することで高活性型のものを取得してもよい。導入される変異は、例えば、タンパク質の１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されるものであってよい。変異の導入は、例えば、上述したような部位特異的変異法により行うことができる。また、変異の導入は、例えば、突然変異処理により行ってもよい。突然変異処理としては、Ｘ線の照射、紫外線の照射、ならびにＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、およびメチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の変異剤による処理が挙げられる。また、in vitroでDNAを直接ヒドロキシルアミンで処理し、ランダム変異を誘発してもよい。比活性の増強は、単独で用いてもよく、上記のような遺伝子の発現を増強させる手法と任意に組み合わせて用いてもよい。

形質転換の方法は特に限定されず、従来知られた方法を用いることができる。例えば、エシェリヒア・コリ K-12について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してDNAの透過性を増す方法（Mandel, M. and Higa, A.,J. Mol. Biol. 1970, 53, 159-162）や、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してDNAを導入する方法（Duncan, C. H., Wilson, G. A. and Young, F. E.., 1997. Gene 1: 153-167）を用いることができる。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類、及び酵母について知られているような、DNA受容菌の細胞を、組換えDNAを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えDNAをDNA受容菌に導入する方法（Chang, S.and Choen, S.N., 1979.Mol. Gen. Genet. 168: 111-115; Bibb, M. J., Ward, J. M. and Hopwood, O. A. 1978.Nature 274: 398-400; Hinnen, A., Hicks, J. B. and Fink, G. R. 1978. Proc. Natl.Acad. Sci. USA 75: 1929-1933）も応用できる。あるいは、コリネ型細菌について報告されているような、電気パルス法（特開平2-207791）を利用することもできる。

タンパク質の活性が増大したことは、同タンパク質の活性を測定することで確認できる。

タンパク質の活性が増大したことは、同タンパク質をコードする遺伝子の発現が上昇したことを確認することによっても、確認できる。遺伝子の発現が上昇したことは、同遺伝子の転写量が上昇したことを確認することや、同遺伝子から発現するタンパク質の量が上昇したことを確認することにより確認できる。

遺伝子の転写量が上昇したことの確認は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を野生株または親株等の非改変株と比較することによって行うことができる。mRNAの量を評価する方法としてはノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCR等が挙げられる(Sambrook, J., et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual/Third Edition, Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001）。mRNAの量は、非改変株と比較して、例えば、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。

タンパク質の量が上昇したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことができる（Molecular cloning(Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001)）。タンパク質の量は、非改変株と比較して、例えば、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。

上記したタンパク質の活性を増大させる手法は、任意のタンパク質、例えばＬ−アミノ酸生合成系酵素、の活性増強や、任意の遺伝子、例えばそれら任意のタンパク質をコードする遺伝子、の発現増強に利用できる。

＜２＞本発明のＬ−アミノ酸の製造法
本発明の方法は、本発明の細菌を培地で培養してＬ−アミノ酸を該培地中又は該細菌の菌体内に生成蓄積すること、および該培地又は菌体よりＬ−アミノ酸を採取することを含む、Ｌ−アミノ酸の製造法である。本発明においては、１種のＬ−アミノ酸が製造されてもよく、２種またはそれ以上のＬ−アミノ酸が製造されてもよい。

使用する培地は、本発明の細菌が増殖でき、Ｌ−アミノ酸が生産される限り、特に制限されない。培地としては、例えば、細菌等の微生物の培養に用いられる通常の培地を用いることができる。培地は、炭素源、窒素源、リン酸源、硫黄源、その他の各種有機成分や無機成分から選択される成分を必要に応じて含有してよい。培地成分の種類や濃度は、使用する細菌の種類や製造するＬ−アミノ酸の種類等の諸条件に応じて適宜設定してよい。

炭素源は、本発明の細菌が資化してＬ−アミノ酸を生成し得るものであれば、特に限定されない。炭素源として、具体的には、例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、ラクトース、ガラクトース、キシロース、アラビノース、廃糖蜜、澱粉加水分解物、バイオマスの加水分解物等の糖類、酢酸、フマル酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸等の有機酸類、グリセロール、粗グリセロール、エタノール等のアルコール類、脂肪酸類が挙げられる。炭素源としては、１種の炭素源を用いてもよく、２種またはそれ以上の炭素源を組み合わせて用いてもよい。

培地中での炭素源の濃度は、本発明の細菌が増殖でき、Ｌ−アミノ酸が生産される限り、特に制限されない。培地中での炭素源の濃度は、Ｌ−アミノ酸の生産が阻害されない範囲で可能な限り高くするのが好ましい。培地中での炭素源の初発濃度は、例えば、通常5〜30 %(W/V)、好ましくは10〜20 %(W/V)であってよい。また、発酵の進行に伴う炭素源の消費に応じて、炭素源を追加で添加してもよい。

窒素源として、具体的には、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆タンパク質分解物等の有機窒素源、アンモニア、ウレアが挙げられる。pH調整に用いられるアンモニアガスやアンモニア水を窒素源として利用してもよい。窒素源としては、１種の窒素源を用いてもよく、２種またはそれ以上の窒素源を組み合わせて用いてもよい。

リン酸源として、具体的には、例えば、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウム等のリン酸塩、ピロリン酸等のリン酸ポリマーが挙げられる。リン酸源としては、１種のリン酸源を用いてもよく、２種またはそれ以上のリン酸源を組み合わせて用いてもよい。

硫黄源として、具体的には、例えば、硫酸塩、チオ硫酸塩、亜硫酸塩等の無機硫黄化合物、システイン、シスチン、グルタチオン等の含硫アミノ酸が挙げられる。硫黄源としては、１種の硫黄源を用いてもよく、２種またはそれ以上の硫黄源を組み合わせて用いてもよい。

その他の各種有機成分や無機成分として、具体的には、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の無機塩類；鉄、マンガン、マグネシウム、カルシウム等の微量金属類；ビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンB6、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、ビタミンB12等のビタミン類；アミノ酸類；核酸類；これらを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆タンパク質分解物等の有機成分が挙げられる。その他の各種有機成分や無機成分としては、１種の成分を用いてもよく、２種またはそれ以上の成分を組み合わせて用いてもよい。

また、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には、培地に要求される栄養素を補添することが好ましい。例えば、Ｌ−リジン生産菌は、Ｌ−リジン生合成経路が強化され、Ｌ−リジン分解能が弱化されている場合が多い。よって、そのようなＬ−リジン生産菌を培養する場合には、例えば、Ｌ−スレオニン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニンから選ばれる１またはそれ以上のアミノ酸を培地に補添するのが好ましい。

また、培養時の発泡を抑えるために、培地には市販の消泡剤を適量添加しておくことが好ましい。

培養条件は、本発明の細菌が増殖でき、Ｌ−アミノ酸が生産される限り、特に制限されない。培養は、例えば、細菌等の微生物の培養に用いられる通常の条件で行うことができる。培養条件は、使用する細菌の種類や製造するＬ−アミノ酸の種類等の諸条件に応じて適宜設定してよい。

培養は、液体培地を用いて行うことができる。培養の際には、本発明の細菌を寒天培地等の固体培地で培養したものを直接液体培地に接種してもよく、本発明の細菌を液体培地で種培養したものを本培養用の液体培地に接種してもよい。すなわち、培養は、種培養と本培養とに分けて行われてもよい。培養開始時に培地に含有される本発明の細菌の量は特に制限されない。例えば、ＯＤ６６０＝４〜８の種培養液を、培養開始時に、本培養用の培地に対して０．１質量％〜３０質量％、好ましくは１質量％〜１０質量％、添加してよい。

培養は、回分培養（batch culture）、流加培養（Fed-batch culture）、連続培養（continuous culture）、またはそれらの組み合わせにより実施することができる。なお、培養が種培養と本培養とに分けて行われる場合、種培養と本培養の培養条件は、同一であってもよく、そうでなくてもよい。例えば、種培養と本培養を、共に回分培養で行ってもよい。また、例えば、種培養を回分培養で行い、本培養を流加培養または連続培養で行ってもよい。

培養は、例えば、好気的に行うことができる。例えば、培養は、通気培養または振盪培養で行うことができる。酸素濃度は、例えば、飽和酸素濃度の5〜50％、好ましくは10％程度に制御されてよい。培地のpHは、例えば、pH 3〜10、好ましくはpH 4.0〜9.5であってよい。培養中、必要に応じて培地のpHを調整することができる。培地のpHは、アンモニアガス、アンモニア水、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、炭酸マグネシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム等の各種アルカリ性または酸性物質を用いて調整することができる。培養温度は、例えば、20〜45℃、好ましくは25℃〜37℃であってよい。培養期間は、例えば、1時間以上、4時間以上、10時間以上、または15時間以上であってよく、168時間以下、120時間以下、90時間、または72時間以下であってよい。培養期間は、具体的には、例えば、10時間〜120時間であってよい。培養は、例えば、培地中の炭素源が消費されるまで、あるいは本発明の細菌の活性がなくなるまで、継続してもよい。このような条件下で本発明の細菌を培養することにより、菌体内および／または培地中にＬ−アミノ酸が蓄積する。

また、Ｌ−グルタミン酸を製造する場合、Ｌ−グルタミン酸が析出する条件に調整された液体培地を用いて、培地中にＬ−グルタミン酸を析出させながら培養を行うことも出来る。Ｌ−グルタミン酸が析出する条件としては、例えば、ｐＨ５．０〜３．０、好ましくはｐＨ４．９〜３．５、さらに好ましくはｐＨ４．９〜４．０、特に好ましくはｐＨ４．７付近の条件が挙げられる（欧州特許出願公開第1078989号明細書）。尚、培養は、その全期間において上記ｐＨで行われてもよく、一部の期間のみ上記ｐＨで行われてもよい。「一部の期間」とは、例えば、培養の全期間の５０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、または９９％以上の期間であってよい。

また、Ｌ−リジン等の塩基性アミノ酸を製造する場合、重炭酸イオン及び／又は炭酸イオンを塩基性アミノ酸の主なカウンタイオンとして利用して塩基性アミノ酸を発酵生産する方法を利用してもよい（特開2002-65287、US2002-0025564A、EP1813677A）。これらの方法によれば、塩基性アミノ酸のカウンタイオンとして従来利用されていた硫酸イオン及び／又は塩化物イオンの使用量を削減しつつ、塩基性アミノ酸を製造することができる。

Ｌ−アミノ酸が生成したことは、化合物の検出または同定に用いられる公知の手法により確認することができる。そのような手法としては、例えば、ＨＰＬＣ、ＬＣ／ＭＳ、ＧＣ／ＭＳ、ＮＭＲが挙げられる。これらの手法は適宜組み合わせて用いることができる。

生成したＬ−アミノ酸の回収は、化合物の分離精製に用いられる公知の手法により行うことができる。そのような手法としては、例えば、イオン交換樹脂法、膜処理法、沈殿法、および晶析法が挙げられる。これらの手法は適宜組み合わせて用いることができる。なお、菌体内にＬ−アミノ酸が蓄積する場合には、例えば、菌体を超音波などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清から、イオン交換樹脂法などによってＬ−アミノ酸を回収することができる。回収されるＬ−アミノ酸は、フリー体、その塩、またはそれらの混合物であってよい。塩としては、例えば、硫酸塩、塩酸塩、炭酸塩、アンモニウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩が挙げられる。例えば、Ｌ−リジンは、フリー体のＬ−リジン、Ｌ−リジン硫酸塩、Ｌ−リジン塩酸塩、Ｌ−リジン炭酸塩、またはそれらの混合物であってもよい。また、例えば、Ｌ−グルタミン酸は、フリー体のＬ−グルタミン酸、Ｌ―グルタミン酸ナトリウム（ＭＳＧ）、Ｌ−グルタミン酸アンモニウム塩、またはそれらの混合物であってもよい。

また、Ｌ−アミノ酸が培地中に析出する場合は、遠心分離又は濾過等により回収することができる。また、培地中に析出したＬ−アミノ酸は、培地中に溶解しているＬ−アミノ酸を晶析した後に、併せて単離してもよい。

尚、回収されるＬ−アミノ酸は、Ｌ−アミノ酸以外に、例えば、細菌菌体、培地成分、水分、及び細菌の代謝副産物等の成分を含んでいてもよい。回収されたＬ−アミノ酸の純度は、例えば、30％（w/w）以上、50％（w/w）以上、70％（w/w）以上、80％（w/w）以上、85％以上、90％（w/w）以上、または95％（w/w）以上であってよい (JP1214636B, USP5,431,933, USP4,956,471, USP4,777,051, USP4,946,654, USP5,840,358, USP6,238,714, US2005/0025878)。

本発明の方法の一態様は、Ｌ−リジン生産能を有するエシェリヒア・コリを培地で培養してＬ−リジンを該培地中または該細菌の菌体内に生成蓄積すること、および該培地または菌体よりＬ−リジンを採取すること、を含むＬ−リジンの製造法であって、前記エシェリヒア・コリにおいて、ａｃｐＰ−ｆａｂＦオペロンの遺伝子の発現調節配列が改変されることにより、前記遺伝子の発現が弱化されていることを特徴とする方法であってよい。また、本発明の方法の一態様は、Ｌ−リジン生産能を有するエシェリヒア・コリを培地で培養してＬ−リジンを該培地中または該細菌の菌体内に生成蓄積すること、および該培地または菌体よりＬ−リジンを採取すること、を含むＬ−リジンの製造法であって、前記エシェリヒア・コリにおいてａｃｐＰ遺伝子の翻訳開始点の上流−３４位のシトシンが他の塩基に置換されていることを特徴とする方法であってもよい。また、本発明の方法の一態様は、Ｌ−リジン生産能を有するエシェリヒア・コリを培地で培養してＬ−リジンを該培地中または該細菌の菌体内に生成蓄積すること、および該培地または菌体よりＬ−リジンを採取すること、を含むＬ−リジンの製造法であって、前記エシェリヒア・コリにおいてａｃｐＰ遺伝子の翻訳開始点の上流−３４位のシトシンがアデニンに置換されていることを特徴とする方法であってもよい。本発明の方法のこれらの態様については、上述した本発明の細菌や本発明の方法に関する記載を準用できる。

以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。

実施例１：acpPおよびfabF遺伝子の発現が低下したＬ−リジン生産菌の構築（１）
Ｌ−リジン生産菌として、E. coli WC196ΔcadAΔldc株（FERM BP-11027；WO2010/061890）（以下、WC196LC株ともいう）を用いた。同株のacpPおよびfabF遺伝子からなるacpP-fabFオペロンの上流に、DatsenkoとWannerによって最初に開発された「Red-driven integration」と呼ばれる方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97, No. 12, p6640-6645）を用いて点変異を導入した。この方法によれば、標的とする遺伝子に対応する配列を合成オリゴヌクレオチドの５'側にデザインし、抗生物質耐性遺伝子に対応する配列を３'側にデザインした合成オリゴヌクレオチドを用いて得られたPCR産物を用いて、一段階で変異導入株を構築することが出来る。手順を以下に示す。

Escherichia coli MG1655株（ATCC 47076）の染色体DNAを鋳型として、配列番号１及び２に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーに用いて、PCRを行った。配列番号１のプライマーは、プラスミドpMW118(λattL-Km^r-λattR) （WO2006/093322）のBglIIサイト周辺に対応する配列をプライマーの５’末端に、acpP遺伝子の上流配列の一部に対応する配列をプライマーの３’末端に有する。配列番号２のプライマーは、プラスミドpMW118(λattL-Km^r-λattR) （WO2006/093322）のBglIIサイト周辺に対応する配列をプライマーの５’末端に、fabF遺伝子の下流配列の一部に対応する配列をプライマーの３’末端に有する。得られたDNA断片を、制限酵素BglIIで処理したベクターpMW118(λattL-Km^r-λattR) とIn-Fusion HD Cloning Kit (TAKARA BIO)を用いて連結した。In-Fusion反応液を用いてE. coli JM109を形質転換した。50 mg/Lのカナマイシンを含むL-寒天培地上で形質転換体を選択した。形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的の断片が挿入されていることを確認した。このプラスミドをpMW118(λattL-Km^r-λattR)-acpP-fabFと命名した。

pMW118(λattL-Km^r-λattR)-acpP-fabFを鋳型とし、配列番号３及び４に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent Technologies)を用いて点変異を導入したプラスミドを構築した。この変異はacpP遺伝子の翻訳開始点の34塩基上流のシトシンをアデニンに置換したものである。このプラスミドをpMW118(λattL-Km^r-λattR)-acpP^*-fabFと命名した。

pMW118(λattL-Km^r-λattR)-acpP^*-fabFを鋳型とし、配列番号５及び６に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーに用いて、PCRを行った。得られたDNA断片を用いて、米国特許出願公開第2006/0160191号公報及びWO2005/010175に記載のλ-red法を用いて、E. coli WC196LC株から、WC196LCacpP^*株を構築した。WC196LCacpP^*株は、acpP遺伝子の翻訳開始点の34塩基上流のシトシンがアデニンに置換されている。λ-red法におけるカナマイシン耐性組換え体の取得は、37℃でカナマイシン50 mg/Lを含むL-寒天培地上で平板培養し、カナマイシン耐性組換え体を選択することにより行った。

プラスミドpCABD2（米国特許第6,040,160号明細書）を用いてWC196LCacpP^*株を形質転換し、20 mg/Lのストレプトマイシンを含むL-寒天培地上で形質転換体を選択して、WC196LCacpP^*/pCABD2株を得た。pCABD2は、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除された変異を有するエシェリヒア・コリ由来のジヒドロジピコリン酸合成酵素（DDPS）をコードする変異型dapA遺伝子と、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除された変異を有するエシェリヒア・コリ由来のアスパルトキナーゼIIIをコードする変異型lysC遺伝子と、エシェリヒア・コリ由来のジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードするdapB遺伝子と、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードするddh遺伝子を含む。

実施例２：Ｌ−リジン生産培養（１）
作成したWC196LCacpP^*/pCABD2株を用いて、Ｌ−リジン生産培養を行った。同株を、20 mg/Lのストレプトマイシンを含むL-寒天培地にてOD600が約0.6となるまで37℃にて培養した後、培養液と等量の40%グリセロール溶液を加えて攪拌した。その後、適当量ずつ分注、-80℃に保存し、グリセロールストックとした。

WC196LCacpP^*/pCABD2株のグリセロールストックを、20 mg/Lのストレプトマイシンを含むL-寒天培地に均一に塗布し、37℃にて24時間培養した。WC196LC株にpCABD2が導入された対照株であるWC196LC/pCABD2株も、20 mg/Lのストレプトマイシンを含むL-寒天培地上で同様に培養した。生育した菌体を3.0 mLの表１に示すＬ−リジン生産培地（MS-Glc培地）に懸濁し、得られた懸濁液をOD600が15になるように同培地にて希釈した。得られた希釈懸濁液1.0 mLを、20 mg/Lのストレプトマイシンを含む19 mLのＬ−リジン生産培地を張り込んだ500 mL容坂口フラスコに植菌し、往復振とう培養装置を用いて37℃で培養を行った。培養開始後48時間目に、残存するグルコースの量と生成したＬ−リジンの量を定量した。

培養48時間目における残存グルコース濃度とＬ−リジン蓄積濃度を表２に示す。対照株であるWC196LC/pCABD2株と比較して、acpPおよびfabF遺伝子の発現が低下したWC196LCacpP^*/pCABD2株では、Ｌ−リジン収率が大きく向上した。

実施例３：RT-PCRによるacpP遺伝子の発現量の確認（１）
実施例１で作成したWC196LCacpP^*/pCABD2株およびWC196LC/pCABD2株をそれぞれ実施例２に記載の条件で培養し、培養液を培養１７時間目にサンプリングした。RNAprotect Bacteria Reagent (Qiagen) とRNeasy Mini Kit (Qiagen) を用いて培養液からRNAを抽出した。得られたRNAを鋳型とし、PrimeScript RT reagent Kit (Takara Bio) を用いて逆転写PCRを行った。得られたcDNAを鋳型とし、配列番号１３と１４に示す合成オリゴヌクレオチド及び配列番号１５と１６に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーに用い、Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) を用いて定量PCRを行った。配列番号１３と１４に示すオリゴヌクレオチドはacpP遺伝子の塩基配列に対応する。配列番号１５と１６に示すオリゴヌクレオチドはrrsA (16s rRNA)のORF内部の配列に対応する。rrsA (16s rRNA)を内部標準として、acpP遺伝子のmRNA量を算出した。

培養17時間目におけるacpP遺伝子のmRNA量を表３に示す。データは、pCABD2/WC196LC株のacpP遺伝子のmRNA量を1とした相対値として示した。対照株であるpCABD2/WC196LC株と比較して、pCABD2/WC196LC acpP^*株では、acpP遺伝子のmRNA量が大きく低下した。

実施例４：acpPおよびfabF遺伝子の発現が低下したＬ−リジン生産菌の構築（２）
Ｌ−リジン生産菌として、WC196LC株を用いる。同株のacpPおよびfabF遺伝子からなるacpP-fabFオペロンの上流の領域を、「Red-driven integration」法により、P_tac84プロモーター（ロシア特許出願公開第2006/134574号公報）又はlacプロモーターに置換する。置換される領域は、acpP-fabFオペロンの転写開始点の上流-200〜-1の一部または全体であってよい。例えば、acpP-fabFオペロンの転写開始点の上流-100〜-1、上流-50〜-1、上流-30〜-1、又は上流-30〜-10の領域を置換する。

以下、WC196LC株のacpP-fabFオペロンの上流の領域をP_tac84プロモーターに置換した株をWC196LC P_tac84acpP株、lacプロモーターに置換した株をWC196LC P_lac acpP株と呼ぶ。

プラスミドpCABD2を用いてWC196LC P_tac84acpP株とWC196LC P_lac acpP株を形質転換し、20 mg/Lのストレプトマイシンを含むL-寒天培地上で形質転換体を選択して、WC196LC P_tac84acpP /pCABD2株とWC196LC P_lac acpP /pCABD2株を得る。

実施例５：Ｌ−リジン生産培養（２）
実施例４で作成したWC196LC P_tac84acpP /pCABD2株とWC196LC P_lac acpP /pCABD2株、および対照株としてWC196LC /pCABD2株を用いて、実施例２に記載の方法に従いＬ−リジン生産培養を行う。

実施例６：RT-PCRによるacpP遺伝子の発現量の確認（２）
実施例４で作成したWC196LC P_tac84acpP /pCABD2株とWC196LC P_lac acpP /pCABD2株、およびWC196LC/pCABD2株をそれぞれ実施例２に記載の条件で培養し、実施例３に記載の方法を用いてacpP遺伝子のmRNA量を算出する。

実施例７：acpPおよびfabF遺伝子の発現が低下したＬ−スレオニン生産菌の構築
Ｌ−スレオニン生産菌として、E. coli TDH-6株（特開2001-346578号）を用いる。TDH-6株は、E. coli TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996) からプラスミドpVIC40を除去することにより得られる（特開2001-346578号）。実施例１に記載した方法を用いて、TDH-6株のacpP遺伝子の翻訳開始点の34塩基上流のシトシンをアデニンに置換する。又は、実施例４に記載した方法を用いて、TDH-6株のacpP-fabFオペロンの上流の領域をP_tac84プロモーター又はlacプロモーターに置換する。置換される領域は、acpP-fabFオペロンの転写開始点の上流-200〜-1の一部または全体であってよい。例えば、acpP-fabFオペロンの転写開始点の上流-100〜-1、上流-50〜-1、上流-30〜-1、又は上流-30〜-10の領域を置換する。

以下、TDH-6株のacpP遺伝子の翻訳開始点の34塩基上流のシトシンをアデニンに置換した株をTDH-6acpP^*株、TDH-6株のacpP-fabFオペロンの上流の領域をP_tac84プロモーターに置換した株をTDH-6 P_tac84acpP株、lacプロモーターに置換した株をTDH-6 P_lac acpP株と呼ぶ。

プラスミドpVIC40（米国特許第5,705,371号）を用いてTDH-6acpP^*株、TDH-6 P_tac84acpP株、TDH-6 P_lac acpP株を形質転換し、TDH-6acpP^*/pVIC40株、TDH-6 P_tac84acpP/pVIC40株、TDH-6 P_lac acpP/pVIC40株を得る。

実施例８：Ｌ−スレオニン生産培養
実施例７で作成したTDH-6acpP^*/pVIC40株、TDH-6 P_tac84acpP/pVIC40株、TDH-6 P_lac acpP/pVIC40株、および対照株としてTDH-6/pVIC40株を用いて、米国特許第7,915,018号に記載の方法に従いＬ−スレオニン生産培養を行う。

実施例９：RT-PCRによるacpP遺伝子の発現量の確認（３）
実施例７で作成したTDH-6acpP^*/pVIC40株、TDH-6 P_tac84acpP/pVIC40株、TDH-6 P_lac acpP/pVIC40株、および対照株としてTDH-6/pVIC40株を用いて、米国特許第7,915,018号に記載の方法に従ってＬ−スレオニン生産培養を行い、その培養液を用い実施例３に記載の方法に従ってacpP遺伝子のmRNA量を算出する。

本発明によれば、細菌のＬ−アミノ酸生産能を向上させることができ、Ｌ−アミノ酸を効率よく製造することができる。

＜配列表の説明＞
配列番号１〜６：プライマー
配列番号７：E. coli MG1655のacpP-fabFオペロンおよびその上流配列の塩基配列
配列番号８：E. coli MG1655のAcpPタンパク質のアミノ酸配列
配列番号９：E. coli MG1655のFabFタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１０：Pantoea ananatis AJ13355のacpP-fabFオペロンおよびその上流配列の塩基配列
配列番号１１：Pantoea ananatis AJ13355のAcpPタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１２：Pantoea ananatis AJ13355のFabFタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１３〜１６：プライマー

Claims (14)

1. Ｌ−アミノ酸生産能を有する腸内細菌科に属する細菌を培地で培養してＬ−アミノ酸を該培地中または該細菌の菌体内に生成蓄積すること、および該培地または菌体よりＬ−アミノ酸を採取すること、を含むＬ−アミノ酸の製造法であって、
   前記細菌が、ａｃｐＰ−ｆａｂＦオペロンが弱化されるように改変されていることを特徴とする、方法。
2. 前記ａｃｐＰ−ｆａｂＦオペロンの弱化が、ａｃｐＰ−ｆａｂＦオペロンの遺伝子にコードされるタンパク質の活性の低下である、請求項１に記載の方法。
3. ａｃｐＰ−ｆａｂＦオペロンの遺伝子の発現が弱化されることにより、前記オペロンが弱化された、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記ａｃｐＰ−ｆａｂＦオペロンの遺伝子の発現調節配列が改変されることにより、前記遺伝子の発現が弱化された、請求項３に記載の方法。
5. 前記ａｃｐＰ−ｆａｂＦオペロンの遺伝子が、ａｃｐＰ遺伝子および／またはｆａｂＦ遺伝子である、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記ａｃｐＰ−ｆａｂＦオペロンの遺伝子が、ａｃｐＰ遺伝子およびｆａｂＦ遺伝子である、請求項５に記載の方法。
7. ａｃｐＰ遺伝子の翻訳開始点の上流−３４位のシトシンが他の塩基に置換されることにより、前記ａｃｐＰ−ｆａｂＦオペロンの遺伝子の発現が弱化された、請求項３〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. ａｃｐＰ遺伝子の翻訳開始点の上流−３４位のシトシンがアデニンに置換されることにより、前記ａｃｐＰ−ｆａｂＦオペロンの遺伝子の発現が弱化された、請求項７に記載の方法。
9. 前記細菌が、エシェリヒア属、パントエア属、またはエンテロバクター属に属する細菌である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記細菌が、エシェリヒア・コリである、請求項９に記載の方法。
11. 前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−リジンである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
12. Ｌ−リジン生産能を有するエシェリヒア・コリを培地で培養してＬ−リジンを該培地中または該エシェリヒア・コリの菌体内に生成蓄積すること、および該培地または菌体よりＬ−リジンを採取すること、を含むＬ−リジンの製造法であって、
    前記エシェリヒア・コリにおいて、ａｃｐＰ−ｆａｂＦオペロンの遺伝子の発現調節配列が改変されることにより、前記遺伝子の発現が弱化されていることを特徴とする、方法。
13. Ｌ−リジン生産能を有するエシェリヒア・コリを培地で培養してＬ−リジンを該培地中または該エシェリヒア・コリの菌体内に生成蓄積すること、および該培地または菌体よりＬ−リジンを採取すること、を含むＬ−リジンの製造法であって、
    前記エシェリヒア・コリにおいてａｃｐＰ遺伝子の翻訳開始点の上流−３４位のシトシンが他の塩基に置換されていることを特徴とする、方法。
14. Ｌ−リジン生産能を有するエシェリヒア・コリを培地で培養してＬ−リジンを該培地中または該エシェリヒア・コリの菌体内に生成蓄積すること、および該培地または菌体よりＬ−リジンを採取すること、を含むＬ−リジンの製造法であって、
    前記エシェリヒア・コリにおいてａｃｐＰ遺伝子の翻訳開始点の上流−３４位のシトシンがアデニンに置換されていることを特徴とする、方法。