CN104736707A - 生产l-氨基酸的方法 - Google Patents
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Abstract
提供了一种用于生产L-氨基酸的方法。通过在培养基中培养属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)并具有L-氨基酸生产能力的细菌，该细菌已经进行了修饰，使得acpP-fabF操纵子减弱，并从细菌的培养基或细胞收集L-氨基酸，来生产L-氨基酸。
Description
技术领域
本发明涉及一种使用细菌生产L-氨基酸的方法。L-氨基酸在工业上用作动物饲料的添加剂、调味料、食品和饮料、氨基酸灌输的成分，等等。
背景技术
在工业上通过例如使用具有L-氨基酸生产能力的各种微生物的发酵来生产L-氨基酸。通过发酵生产L-氨基酸的方法的实例包括，例如，使用野生型微生物(野生型菌株)的方法，使用源自野生型菌株的营养缺陷型菌株的方法，使用源自野生型菌株的作为对各种药物中的任一种的抗性突变菌株的代谢调控突变菌株的方法和使用同时具有营养缺陷型菌株和代谢调控突变菌株特征的菌株的方法。
此外，在近些年来，将L-氨基酸生产能力通过重组DNA技术提高的微生物用于L-氨基酸生产。用于提高微生物的L-氨基酸生产能力的方法的实例包括，例如，增强编码L-氨基酸生物合成酶的基因的表达(专利文献1和2)和提高碳源流入L-氨基酸生物合成系统中(专利文献3)。
acpP基因是编码酰基载体蛋白(ACP)的基因(非专利文献1)。ACP翻译为无活性的apo-ACP，然后4’-磷酸泛酰巯基乙胺作为辅因子通过ACP合成酶添加至apo-ACP的位置36的丝氨酸残基(在大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)的情况中)，并且由此将apo-ACP制成活性的holo-ACP。ACP是在细菌的脂肪酸生物合成等中起着重要作用的蛋白质。特别地，在脂肪酸生物合成中，ACP(holo-ACP)通过4’-磷酸泛酰巯基乙胺基团结合脂肪酸链，由此携带脂肪酸链。
fabF基因是编码β-酮酰基-ACP合成酶II的基因(非专利文献1)。β-酮酰基-ACP合成酶II是脂肪酸生物合成酶之一，并且参与脂肪酸链的延伸。特别地，β-酮酰基-ACP合成酶II催化从酰基ACP(碳数＝n)和丙二酰-ACP产生3-氧酰基-ACP(碳数＝n+2)的反应(EC 2.3.1.41)。
在大肠埃希氏菌中，参与脂肪酸生物合成的基因，包括acpP基因和fabF基因，作为yceD-rpmF-plsX-fabHDG-acpP-fabF基因簇存在。这一基因簇的基因共同转录为几个基因对(非专利文献1)。例如，acpP基因和fabF基因共同转录为acpP-fabF操纵子。此外，fabF基因还使用其自身的启动子独立地转录。此外，acpP基因还可以从yceD-rpmF-plsX-fabHDG-acpP-fabF基因簇中的fabD基因和fabG基因共同转录。
然而，acpP和fabF基因与L-氨基酸生产之间的关联还是未知的。
现有技术参考文献
专利文献
专利文献1：美国专利No.5,168,056
专利文献2：美国专利No.5,776,736
专利文献3：美国专利No.5,906,925
非专利文献
非专利文献1：Zhang Y，Cronan JE Jr.，J Bacteriol.，1996年6月；178(12)：3614-20
发明概述
本发明待实现的目的
本发明的目的是研发用于提高细菌的L-氨基酸生产能力的新技术，并且由此提供用于有效生产L-氨基酸的方法。
实现目的的方法
本发明的发明人进行了各种研究，以实现上述目的。结果，发明人发现了可以通过修饰细菌，使得降低acpP和fabF基因的表达，从而提高细菌的L-氨基酸生产能力，并完成了本发明。
即，例如，本发明可以具体化，如下。
[1]
一种生产L-氨基酸的方法，包括：
在培养基中培养属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)并具有L-氨基酸生产能力的细菌，以在细菌的培养基或细胞中产生并累积L-氨基酸；和
从培养基或细胞收集L-氨基酸；
其中细菌已经进行了修饰，使得acpP-fabF操纵子减弱。
[2]
如上所述的方法，其中所述acpP-fabF操纵子的减弱是指由acpP-fabF操纵子的基因编码的蛋白质的活性降低。
[3]
如上所述的方法，其中通过减弱acpP-fabF操纵子的基因的表达来减弱acpP-fabF操纵子。
[4]
如上所述的方法，其中通过修饰基因的表达控制序列来减弱acpP-fabF操纵子的基因的表达。
[5]
如上所述的方法，其中acpP-fabF操纵子的基因由acpP基因和/或fabF基因组成。
[6]
如上所述的方法，其中acpP-fabF操纵子的基因由acpP基因和fabF基因组成。
[7]
如上所述的方法，其中通过用另一个碱基替代acpP基因的比翻译起始位点靠上游的位置-34的胞嘧啶来减弱acpP-fabF操纵子的基因的表达。
[8]
如上所述的方法，其中通过用腺嘌呤替代acpP基因的比翻译起始位点靠上游的位置-34的胞嘧啶来减弱acpP-fabF操纵子的基因的表达。
[9]
如上所述的方法，其中细菌是属于埃希氏菌属(Escherichia)、泛菌属(Pantoea)或肠杆菌属(Enterobacter)的细菌。
[10]
如上所述的方法，其中细菌是大肠埃希氏菌。
[11]
如上所述的方法，其中L-氨基酸是L-赖氨酸。
[12]
一种生产L-赖氨酸的方法，包括：
在培养基中培养具有L-赖氨酸生产能力的大肠埃希氏菌，以在大肠埃希氏菌的培养基或细胞中产生并累积L-赖氨酸；和
从培养基或细胞收集L-赖氨酸；
其中已经通过修饰基因的表达控制序列，减弱了大肠埃希氏菌中的acpP-fabF操纵子的基因的表达。
[13]
一种生产L-赖氨酸的方法，包括：
在培养基中培养具有L-赖氨酸生产能力的大肠埃希氏菌，以在大肠埃希氏菌的培养基或细胞中产生并累积L-赖氨酸；和
从培养基或细胞收集L-赖氨酸；
其中该大肠埃希氏菌中的acpP基因的比翻译起始位点靠上游的位置-34的胞嘧啶已用其他碱基替代。
[14]
一种生产L-赖氨酸的方法，包括：
在培养基中培养具有L-赖氨酸生产能力的大肠埃希氏菌，以在大肠埃希氏菌的培养基或细胞中产生并累积L-赖氨酸；和
从培养基或细胞收集L-赖氨酸；
其中该大肠埃希氏菌中的acpP基因的比翻译起始位点靠上游的位置-34的胞嘧啶已用腺嘌呤替代。
发明实施方式
下文，将详细解释本发明。
本发明的方法是一种生产L-氨基酸的方法，包括在培养基中培养属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)并具有L-氨基酸生产能力的细菌，以在细菌的培养基或细胞中产生并累积L-氨基酸，并从培养基或细胞收集L-氨基酸，其中细菌已经进行了修饰，使得acpP-fabF操纵子减弱。用于这种方法中的细菌也称为“本发明的细菌”。
<1>本发明的细菌
本发明的细菌是属于肠杆菌科并具有L-氨基酸生产能力的细菌，其已经进行了修饰，使得acpP-fabF操纵子减弱。
<1-1>具有L-氨基酸生产能力的细菌
在本发明中，“具有L-氨基酸生产能力的细菌”是指在培养基中培养细菌时，具有以可以收集L-氨基酸的程度在细菌的培养基或细胞中产生并累积目标L-氨基酸的能力的细菌。具有L-氨基酸生产能力的细菌可以是以大于未修饰菌株可获得的含量在培养基中累积目标L-氨基酸的细菌。未修饰菌株的实例包括野生型菌株和亲本菌株。具有L-氨基酸生产能力的细菌可以是以优选0.5g/L或更高，更优选1.0g/L或更高的含量在培养基中累积目标L-氨基酸的细菌。
L-氨基酸的实例包括碱性氨基酸，如L-赖氨酸、L-鸟氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸和L-瓜氨酸；脂肪族氨基酸，如L-异亮氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸和甘氨酸；其是羟基-单氨基羧酸的氨基酸，如L-苏氨酸和L-丝氨酸；环状氨基酸，如L-脯氨酸；芳香族氨基酸，如L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸；含硫氨基酸，如L-半胱氨酸、L-胱氨酸和L-甲硫氨酸；酸性氨基酸，如L-谷氨酸和L-天冬氨酸；以及在侧链中具有酰胺基团的氨基酸，如L-谷氨酰胺和L-天冬酰胺。本发明的细菌可以具有生产单种L-氨基酸，或两种或多种L-氨基酸的能力。
在本发明中，术语“氨基酸”可以是指L-氨基酸，除非另外指出。此外，待生产的L-氨基酸可以是游离化合物，其盐，或其混合物。即，在本发明中，术语“L-氨基酸”可以是指游离形式的L-氨基酸，其盐，或其混合物，除非另外指出。之后将描述盐的实例。
术语肠杆菌科的细菌的实例包括属于埃希氏菌属(Escherichia)、肠杆菌属(Enterobacter)、泛菌属(Pantoea)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、沙雷氏菌属(Serratia)、欧文氏菌属(Erwinia)、Photorhabdus、普罗威登斯菌属(Providencia)、沙门氏菌属(Salmonella)、摩根氏菌属(Morganella)等的细菌。特别地，可以使用根据NCBI(国际生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information))数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi？id＝91347)中使用的分类系统归入肠杆菌科的细菌。
埃希氏菌属细菌没有特别限制，并且其实例包括根据微生物学领域中的技术人员已知的分类系统归入埃希氏菌属的那些。埃希氏菌属细菌的实例包括，例如，Neidhardt等的工作中描述的那些(Backmann B.J.，1996，Derivationsand Genotypes of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12(大肠埃希氏菌K-12的一些突变衍生株的衍生和基因型)，pp.2460-2488，表1，见F.D.Neidhardt(编辑)，Escherichia coli and Salmonella Cellular and MolecularBiology(大肠埃希氏菌和沙门氏菌细胞和分子生物学)，第2版，AmericanSociety for Microbiology Press，Washington,D.C.)。埃希氏菌属细菌的实例包括，例如，大肠埃希氏菌。大肠埃希氏菌的特定实例包括，例如，源自原型野生型菌株K-12菌株的大肠埃希氏菌W3110(ATCC 27325)和大肠埃希氏菌MG1655(ATCC 47076)。
肠杆菌属细菌没有特别限制，并且其实例包括根据微生物学领域的技术人员已知的分类归入肠杆菌属的那些。肠杆菌细菌的实例包括，例如，成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)和产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)。成团肠杆菌的特定实例包括，例如，成团肠杆菌ATCC 12287菌株。产气肠杆菌的特定实例包括，例如，产气肠杆菌ATCC 13048菌株、NBRC 12010菌株(Biotechnol Bioeng.，2007年3月27日；98(2):340-348)和AJ110637菌株(FERM ABP-10955)。肠杆菌属细菌的实例还包括，例如，欧洲专利申请公开(EP-A)No.0952221中描述的菌株。此外，成团肠杆菌还包括一些归为成团泛菌(Pantoea agglomerans)的菌株。
泛菌属细菌没有特别限制，并且其实例包括根据微生物学领域的技术人员已知的分类归入泛菌属的那些。泛菌属细菌的实例包括，例如，菠萝泛菌(Pantoea ananatis)、斯氏泛菌(Pantoea stewartii),成团泛菌(Pantoeaagglomerans)和柠檬泛菌(Pantoea citrea)。菠萝泛菌的特定实例包括，例如，菠萝泛菌LMG20130菌株、AJ13355菌株(FERM BP-6614)、AJ13356菌株(FERM BP-6615)、AJ13601菌株(FERM BP-7207)、SC17菌株(FERMBP-11091)和SC17(0)菌株(VKPM B-9246)。基于16S RNA的核苷酸序列分析等，成团肠杆菌的一些菌株最近重新归入成团泛菌。(Int.J.Syst.Bacteriol.，43，162-173(1993))。在本发明中，泛菌属细菌包括如上所述的重新归入泛菌属的那些。
埃文氏属细菌的实例包括解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)和胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)。克雷伯氏菌属细菌的实例包括植生克雷伯氏菌(Klebsiella planticola)。
这些菌株例如可以从美国典型微生物保藏中心(American Type CultureCollection)获得(地址：12301Parklawn Drive，Rcokville，Maryland 20852，P.O.Box 1549，Manassas VA 20108，United States of America)。即，给各自的菌株给出了注册号，并且可以通过使用这些注册号订购菌株(参见http://www.atcc.org)。菌株的注册号列在美国典型微生物保藏中心的目录中。
本发明的细菌可以是内在地具有L-氨基酸生产能力的细菌，或可以是修饰的使得其具有L-氨基酸生产能力的细菌。可以通过将L-氨基酸生产能力给予如上所述的细菌，或通过增强如上所述细菌的L-氨基酸生产能力，来获得具有L-氨基酸生产能力的细菌。
为了给予或增强L-氨基酸生产能力，可以使用棒状杆菌细菌、埃希氏菌属细菌等的氨基酸生产菌株育种中常用的方法(参见“Amino AcidFermentation(氨基酸发酵)”，Gakkai Shuppan Center(Ltd.)，第1版，1986年5月30日出版，pp.77-100)。这样的方法的实例包括，例如，获取营养缺陷型菌株、获取L-氨基酸类似物-抗性菌株、获取代谢调控突变菌株和构建其中L-氨基酸生物合成酶活性增强的重组菌株。在L-氨基酸生产细菌的育种中，可以单独给予上述特性之一，如营养缺陷型、类似物抗性和代谢调控突变，或可以组合给予两个或三个或更多个这样的特性。此外，在L-氨基酸生产细菌的育种中，可以单独增强L-氨基酸生物合成酶中的一种的活性，或可以组合增强这些酶中的两种或三种或多种的活性。此外，给予如营养缺陷型、类似物抗性和代谢调控这样的特性可以结合增强生物合成酶的活性。
可以通过将亲本菌株或野生型菌株接受通常的诱变处理，并且随后从所获得的突变菌株中选择呈现出营养缺陷型、类似物抗性或代谢调控突变并且具有L-氨基酸生产能力的菌株，从而获得具有L-氨基酸生产能力的营养缺陷型突变菌株、L-氨基酸类似物抗性菌株或代谢调控突变菌株。通常的诱变处理实例包括x-射线或紫外线照射和使用突变剂的处理，所述突变剂如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、乙基甲烷磺酸酯(EMS)和甲基甲烷磺酸酯(MMS)。
还可以通过增强目标L-氨基酸的生物合成中涉及的酶的活性来给予或增强L-氨基酸生产能力。例如，可以通过修饰细菌，使得编码酶的基因的表达增强，从而来增强酶活性。用于增强基因表达的方法描述于WO00/18935、EP 1010755A等中。之后将描述用于增强酶活性的详细程序。
此外，还可以通过降低催化产生目标L-氨基酸以外的化合物的目标L-氨基酸生物合成路径的分支反应的酶的活性来给予或增强L-氨基酸生产能力。本文中涉及的“催化产生目标L-氨基酸以外的化合物的目标L-氨基酸生物合成路径的分支反应的酶”包括涉及目标氨基酸分解的酶。之后将描述用于降低酶活性的方法。
以下，将具体举例说明L-氨基酸生产细菌和给予或增强L-氨基酸生产能力的方法。所有L-氨基酸生产细菌的特性和用于给予或增强L-氨基酸生产能力的修饰可以独立使用或以任意合适的组合使用。
<L-谷氨酸生产细菌>
用于给予或增强L-谷氨酸生产能力的方法的实例包括，例如，修饰细菌使得细菌具有一种或多种选自L-谷氨酸生物合成酶的酶的提高活性的方法。这样的酶的实例包括，但不特别限于，谷氨酸脱氢酶(gdhA)、谷氨酰胺合成酶(glnA)、谷氨酸合成酶(gltBD)、异柠檬酸脱氢酶(icdA)、乌头酸水合酶(acnA、acnB)、柠檬酸合成酶(gltA)、甲基柠檬酸合成酶(prpC)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)、丙酮酸羧化酶(pyc)、丙酮酸脱氢酶(aceEF、lpdA)、丙酮酸激酶(pykA、pykK)、磷酸烯醇丙酮酸合成酶(ppsA)、烯醇酶(eno)、磷酸甘油酸变位酶(pgmA、pgmI)、磷酸甘油酸激酶(pgk)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapA)、磷酸丙糖异构酶(tpiA)、二磷酸果糖醛缩酶(fbp)、磷酸果糖激酶(pfkA、pfkB)、磷酸葡糖异构酶(pgi)、6-磷酸葡糖脱氢酶(edd)、2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖醛缩酶(eda)和转氢酶。在酶的名称后面的括号中显示的是编码该酶的基因(应当同样适用于下文中的相同情况)。在这些酶中，优选增强一种或多种选自例如谷氨酸脱氢酶、柠檬酸合成酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和甲基柠檬酸合成酶的酶的活性。
属于肠杆菌科并且修饰使得柠檬酸合成酶基因、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因和/或谷氨酸脱氢酶基因的表达提高的菌株的实例包括EP 1078989A、EP955368A和EP952221A中公开的那些。此外，属于肠杆菌科并且修饰使得Entner-Doudoroff路径(edd、eda)的基因的表达提高的菌株的实例包括EP1352966B中公开的那些。
用于给予或增强L-谷氨酸生产能力的方法的实例还包括，例如，修饰细菌使得细菌具有一种或多种酶降低的活性，所述酶选自催化产生L-谷氨酸以外的化合物的L-谷氨酸生物合成路径的分支反应的酶。这样的酶的实例包括，但不特别限于，异柠檬酸裂解酶(aceA)、α-酮戊二酸脱氢酶(sucA)、磷酸转乙酰酶(pta)、乙酸激酶(ack)、乙酰醇酸合成酶(ilvG)、乙酰乳酸合成酶(ilvI)、甲酸转乙酰酶(pfl)、乳酸脱氢酶(ldh)、醇脱氢酶(adh)、谷氨酸脱羧酶(gadAB)、琥珀酸脱氢酶(sdhABCD)和1-pyroline-5-羧酸脱氢酶(putA)。在这些酶中，优选降低或删除例如α-酮戊二酸脱氢酶活性。
具有降低的α-酮戊二酸脱氢酶活性或缺乏α-酮戊二酸脱氢酶活性的埃希氏菌属细菌及其获得方法描述于美国专利No.5,378,616和5,573,945。此外，用于降低或删除肠杆菌科细菌(如，泛菌属细菌、肠杆菌属细菌、克雷伯氏菌属细菌和埃文氏菌属细菌)的α-酮戊二酸脱氢酶活性的方法公开于美国专利No.6,197,559、6,682,912、6,331,419、8,129,151和WO2008/075483中。具有降低的α-酮戊二酸脱氢酶活性或缺乏α-酮戊二酸脱氢酶活性的埃希氏菌属细菌的特定实例包括以下菌株。
大肠埃希氏菌W3110sucA::Kmr
大肠埃希氏菌AJ12624(FERM BP-3853)
大肠埃希氏菌AJ12628(FERM BP-3854)
大肠埃希氏菌AJ12949(FERM BP-4881)
大肠埃希氏菌W3110sucA::Kmr是通过破坏编码大肠埃希氏菌W3110的α-酮戊二酸脱氢酶的sucA基因获得的菌株。该菌株完全缺乏α-酮戊二酸脱氢酶活性。
L-谷氨酸生产细菌和用于衍生它们的亲本菌株的实例还包括泛菌属细菌，如菠萝泛菌AJ13355菌株(FERM BP-6614)、菠萝泛菌SC17菌株(FERMBP-11091)和菠萝泛菌SC17(0)菌株(VKPM B-9246)。AJ13355菌株是从Iwata-shi，Shizuoka-ken，日本的土壤中分离的菌株，作为可以在含有L-谷氨酸和碳源的低pH培养基中增殖的菌株。SC17菌株是作为低粘液-生产突变菌株从AJ13355菌株选择的菌株(美国专利No.6,596,517)。SC17菌株于2009年2月4日保藏在独立的管理机构，National Institute of AdvancedIndustrial Science and Technology，International Patent Organism Depositary(目前为独立的管理机构，National Institute of Technology and Evaluation，International Patent Organism Depositary，#120，2-5-8Kazusakamatari，Kisarazu-shi，Chiba-ken，292-0818，日本)，并且指定了FERM BP-11091的保藏号。AJ13355菌株于1998年2月19日保藏在National Institute ofBioscience and Human Technology，Agency of Industrial Science and Technology(目前为独立的管理机构，National Institute of Technology and Evaluation，International Patent Organism Depositary，#120，2-5-8Kazusakamatari，Kisarazu-shi，Chiba-ken，292-0818，日本)，并且指定了FERM P-16644的保藏号。然后，于1999年1月11日依据布达佩斯条约的规定，将该保藏转为国际保藏，并且指定了FERM BP-6614的保藏号。
此外，L-谷氨酸生产细菌和用于衍生它们的亲本菌株的实例还包括具有降低的α-酮戊二酸脱氢酶活性或缺乏α-酮戊二酸脱氢酶活性的泛菌属细菌。这样的菌株的实例包括AJ13356菌株(美国专利No.6,331,419)，其是AJ13355菌株的α-酮戊二酸脱氢酶E1亚基(sucA)基因-缺陷菌株，和SC17sucA菌株(美国专利No.6,596,517)，其是SC17菌株的sucA基因-缺陷菌株。AJ13356菌株于1998年2月19日保藏在National Institute of Bioscience and HumanTechnology，Agency of Industrial Science and Technology(目前为独立的管理机构，National Institute of Technology and Evaluation，International PatentOrganism Depositary，#120，2-5-8Kazusakamatari，Kisarazu-shi，Chiba-ken，292-0818，日本)，并且指定了FERM P-16645的保藏号。然后，于1999年1月11日依据布达佩斯条约的规定，将该保藏转为国际保藏，并且指定了FERM BP-6616的保藏号。给SC17sucA菌株指定了AJ417的私有编号，并且依据FERM BP-8646的保藏号，于2004年2月26日保藏于独立的管理机构，National Institute of Advanced Industrial Science and Technology，InternationalPatent Organism Depositary(目前为独立的管理机构，National Institute ofTechnology and Evaluation，International Patent Organism Depositary，#120，2-5-8Kazusakamatari，Kisarazu-shi，Chiba-ken，292-0818，日本)，
分离时，将AJ13355菌株鉴定为成团肠杆菌，但最近基于16S rRNA的核苷酸序列等重新分类为菠萝泛菌。因此，尽管AJ13355和AJ13356菌株作为成团肠杆菌保藏在上述保藏单位，但在本说明书中将它们称为菠萝泛菌。
此外，L-谷氨酸生产细菌和用于衍生它们的亲本菌株的实例还包括泛菌属细菌，如菠萝泛菌SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB菌株、菠萝泛菌AJ13601菌株、菠萝泛菌NP106菌株和菠萝泛菌NA1菌株。通过将含有源自大肠埃希氏菌的柠檬酸合成酶基因(gltA)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(ppc)和谷氨酸脱氢酶基因(gdhA)的质粒RSFCPG以及含有源自乳酸发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)的柠檬酸合成酶基因(gltA)的质粒pSTVCB引入SC17sucA菌株中来获得SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB菌株。AJ13601菌株是作为在低pH下对高浓度的L-谷氨酸抗性的菌株从SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB菌株选择的菌株。通过熟化RSFCPG和pSTYCB质粒，从AJ13601菌株获得NP106菌株。AJ13601菌株于1999年8月18日保藏在National Institute of Bioscience and Human Technology，Agency ofIndustrial Science and Technology(目前为独立的管理机构，National Institute ofTechnology and Evaluation，International Patent Organism Depositary，#120，2-5-8Kazusakamatari，Kisarazu-shi，Chiba-ken，292-0818，日本)，并且指定了FERM P-17516的保藏号。然后，于2000年7月6日依据布达佩斯条约的规定，将该保藏转为国际保藏，并且指定了FERM BP-7207的保藏号。
L-谷氨酸生产细菌和用于衍生它们的亲本菌株的实例还包括其中α-酮戊二酸脱氢酶(sucA)活性和琥珀酸脱氢酶(sdh)活性都降低或删除的菌株(日本专利公开(Kokai)No.2010-041920)。这样的菌株的特定实例包括，例如，菠萝泛菌NA1菌株的sucAsdhA双缺陷菌株(日本专利公开(Kokai)No.2010-041920)。
L-谷氨酸生产细菌和用于衍生它们的亲本菌株的实例还包括营养缺陷型菌株。营养缺陷型突变菌株的特定实例包括，例如，大肠埃希氏菌VL334thrC+(VKPM B-8961，EP 1172433)。大肠埃希氏菌VL334(VKPM B-1641)是在thrC和ilvA基因中具有突变的L-苏氨酸营养缺陷型菌株(美国专利No.4,278,765)。大肠埃希氏菌VL334thrC+是通过将thrC基因的野生型等位基因引入VL334菌株中获得的L-异亮氨酸-营养缺陷型L-谷氨酸生产细菌。通过使用在野生型大肠埃希氏菌K-12菌株(VKPM B-7)细胞上生长的噬菌体P1的一般转导方法引入了thrC基因的野生型等位基因。
L-谷氨酸生产细菌和用于衍生它们的亲本菌株的实例还包括具有天冬氨酸类似物抗性的菌株。这样的菌株也可以缺乏α-酮戊二酸脱氢酶活性。具有天冬氨酸类似物抗性并缺乏α-酮戊二酸脱氢酶活性的菌株的特定实例包括，例如，大肠埃希氏菌AJ13199(FERM BP-5807，美国专利No.5,908,768)、大肠埃希氏菌FERM P-12379，其另外具有降低的L-谷氨酸分级活性(美国专利No.5,393,671)和大肠埃希氏菌AJ13138(FERM BP-5565，美国专利No.6,110,714)。
用于给予或增强L-谷氨酸生产能力的方法的实例还包括修饰细菌使得D-木酮糖-5-磷酸-磷酸酮醇酶活性和/或和/或果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶活性(日本专利公开(Kohyo)No.2008-509661)。可以增强D-木酮糖-5-磷酸磷酸酮醇酶活性和果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶活性中的任一种，或可以增强两种。在本说明书中，D-木酮糖-5-磷酸磷酸酮醇酶和果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶可以总称为磷酸酮醇酶。
D-木酮糖-5-磷酸磷酸酮醇酶活性表示用于将木酮糖-5-磷酸盐转化成甘油醛-3-磷酸盐和乙酰磷酸盐的活性，伴随消耗磷酸，以释放一分子的H2O。可以通过Goldberg，M.等所述的方法(Methods Enzymol.，9，515-520，1996)或L.Meile描述的方法(J.Bacteriol.，183:2929-2936，2001)来测量这种活性。
果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶活性表示用于将果糖-6-磷酸盐转化成赤藓糖-4-磷酸盐和乙酰磷酸盐的活性，伴随着消耗磷酸，以释放一分子的H2O。可以通过Racker，E.描述的方法(Methods Enzymol.，5，276-280，1962)或L.Meile描述的方法(J.Bacteriol.，183:2929-2936，2001)来测量这种活性。
用于给予或增强L-谷氨酰胺-生产能力的方法的实例还包括，例如，增强yhfK基因(WO2005/085419)或ybjL基因(WO2008133161)的表达的方法，其是L-谷氨酸分泌基因。
<L-谷氨酰胺生产细菌>
用于给予或增强L-谷氨酰胺生产能力的方法的实例包括，例如，修饰细菌使得细菌具有一种或多种选自L-谷氨酰胺生物合成酶的酶的提高活性的方法。这样的酶的实例包括，但不特别限于，谷氨酸脱氢酶(gdhA)和谷氨酰胺合成酶(glnA)。谷氨酰胺合成酶活性还可以通过破坏谷氨酰胺乙酰基转移酶基因(glnE)或破坏PII控制蛋白基因(glnB)(EP 1229121)来增强谷氨酰胺合成酶活性。
用于给予或增强L-谷氨酰胺生产能力的方法的实例包括，例如，修饰细菌使得细菌具有一种或多种酶降低的活性，所述酶选自催化产生L-谷氨酰胺以外的化合物的L-谷氨酰胺生物合成路径的分支反应的酶。这样的酶的实例包括，但不特别限于，谷氨酰胺酶。
L-谷氨酸生产细菌和用于衍生它们的亲本菌株的特定实例包括属于埃希氏菌属并具有突变谷氨酰胺合成酶的菌株，在所述合成酶中，位置397的酪氨酸残基被另一个氨基酸残基取代(美国专利公开申请No.2003/0148474)。
<L-脯氨酸生产细菌>
用于给予或增强L-脯氨酸生产能力的方法的实例包括，例如，修饰细菌使得细菌具有一种或多种选自L-脯氨酸生物合成酶的酶的提高活性的方法。这样的酶的实例包括谷氨酸-5-激酶(proB)、γ-谷氨酰磷酸还原酶和脯氨酸-5-羧酸还原酶(putA)。为了增强这样的酶的活性，例如，可以优选使用编码对L-脯氨酸反馈抑制脱敏的谷氨酸激酶的proB基因(德国专利No.3127361)。
用于给予或增强L-谷氨酰胺生产能力的方法的实例还包括，例如，修饰细菌使得细菌具有涉及L-脯氨酸分解的酶的降低活性的方法。这样的酶的实例包括脯氨酸脱氢酶和鸟氨酸转氨酶。
L-脯氨酸生产细菌和用于衍生它们的亲本菌株的特定实例包括，例如，大肠埃希氏菌NRRL B-12403和NRRL B-12404(英国专利No.2075056)、大肠埃希氏菌VKPM B-8012(俄国专利申请No.2000124295)、德国专利No.312761中描述的大肠埃希氏菌质粒突变菌株、Bloom F.R.等描述的大肠埃希氏菌质粒突变菌株(The 15th Miami winter symposium，1983，p.34)、为3,4-脱氢脯氨酸和吖丁啶-2-羧酸酯抗性菌株的大肠埃希氏菌702菌株(VKPMB-8011)和为702菌株的ilvA基因缺陷菌株的大肠埃希氏菌702ilvA菌株(VKPMB-8012)。
<L-苏氨酸生产细菌>
用于给予或增强L-苏氨酸生产能力的方法的实例包括，例如，修饰细菌使得细菌具有一种或多种选自L-苏氨酸生物合成酶的酶的提高活性的方法。这样的酶的实例包括，但不特别限于，天冬氨酸激酶III(lysC)、天冬氨酸半醛脱氢酶(asd)、天冬氨酸激酶I(thrA)、同型丝氨酸激酶(thrB)、苏氨酸合成酶(thrC)和天冬氨酸氨基转移酶(天冬氨酸转氨酶)(aspC)。在这些酶中，优选增强一种或多种选自天冬氨酸激酶III、天冬氨酸半醛脱氢酶、天冬氨酸激酶I、同型丝氨酸激酶、天冬氨酸氨基转移酶和苏氨酸合成酶的酶的活性。可以将编码L-苏氨酸生物合成酶的任一种基因引入具有降低的分解苏氨酸能力的细菌中。其中苏氨酸分解受到抑制的菌株的实例包括，例如，大肠埃希氏菌TDH6菌株，其缺乏苏氨酸脱氢酶活性(日本专利公开(Kokai)No.2001-346578)。
L-苏氨酸生物合成酶的活性受到终产物L-苏氨酸的抑制。因此，为了构建L-苏氨酸生产菌株，优选修饰L-苏氨酸生物合成酶的基因，使得所述酶对L-苏氨酸反馈抑制脱敏。上述thrA、thrB和thrC基因组成苏氨酸操纵子，其形成减弱子结构。苏氨酸操纵子的表达受到培养基中异亮氨酸和苏氨酸的抑制，并且还受到减弱的抑制。因此，可以通过除去减弱区域的前导序列或减弱子来增强苏氨酸操纵子的表达(参见，Lynn，S.P.，Burton，W.S.，Donohue，T.J.，Gould，R.M.，Gumport，R.L和Gardner，J.F.，J.Mol.Biol.194:59-69(1987)；WO02/26993；WO2005/049808和WO2003/097839)。
苏氨酸操纵子的天然启动子存在于苏氨酸操纵子的上游，并且可以用非天然启动子替代(参见WO98/04715)。此外，可以构建苏氨酸操纵子，使得在λ-噬菌体的抑制子和启动子的控制下表达苏氨酸生物合成基因(欧洲专利No.0593792)。此外，还可以通过选择对α-氨基-β-羟基异戊酸(AHV)(其是L-苏氨酸类似物)抗性的菌株来获得修饰的使得对L-苏氨酸的反馈抑制脱敏的细菌。
优选通过提高其拷贝数或通过将其连接有效的启动子，在宿主中提高如上所述的修饰的使得对L-苏氨酸的反馈抑制脱敏的苏氨酸操纵子的表达量。通过将含有苏氨酸操纵子的质粒引入宿主中来提高拷贝数。还可以通过使用转位子、Mu-噬菌体等，将苏氨酸操纵子转移至宿主的基因组中来提高拷贝数。
用于给予或增强L-苏氨酸生产能力的方法的实例还包括，例如，给予宿主L-苏氨酸抗性的方法和给予宿主L-同型丝氨酸抗性的方法。例如，可以通过增强给予L-苏氨酸抗性的基因或给予L-同型丝氨酸抗性的基因的表达来给予这样的抗性。给予上述抗性的基因的实例包括rhtA基因(Res.Microbiol.154:123-135(2003))、rhtB基因(欧洲专利公开No.0994190)、rhtC基因(欧洲专利公开No.1013765)、yfiK基因和yeaS基因(欧洲专利公开No.1016710)。至于用于给予宿主L-苏氨酸抗性的方法，可以参考欧洲专利公开No.0994190和WO90/04636中描述的那些。
L-苏氨酸生产细菌和用于衍生它们的亲本菌株的特定实例包括，例如，大肠埃希氏菌TDH-6/pVIC40(VKPM B-3996，美国专利Nos.5,175,107和5,705,371)、大肠埃希氏菌472T23/pYN7(ATCC 98081，美国专利No.5,631,157)、大肠埃希氏菌NRRL-21593(美国专利No.5,939,307)、大肠埃希氏菌FERM BP-3756(美国专利No.5,474,918)、大肠埃希氏菌FERMBP-3519和FERM BP-3520(美国专利No.5,376,538)、大肠埃希氏菌MG442(Gusyatiner等，Genetika(俄国)，14，947-956(1978))、大肠埃希氏菌VL643和VL2055(EP 1149911A)和大肠埃希氏菌VKPM B-5318(EP 0593792B)。
VKPM B-3996菌株是通过将质粒pVIC40引入TDH-6菌株中获得的菌株。TDH-6菌株具有蔗糖-同化活性并且缺乏thrC基因，其ilvA基因具有渗漏突变。这种VKPM B-3996菌株在rhtA基因中也具有突变，其给予对高浓度的苏氨酸或同型丝氨酸的抗性。质粒pVIC40是通过将thrA*BC操纵子插入RSF1010-衍生的载体中获得的质粒，其中所述操纵子含有编码对反馈苏氨酸抑制抗性的天冬氨酸激酶-同型丝氨酸脱氢酶I的突变thrA基因和野生型thrBC基因(美国专利No.5,705,371)。这种突变的thrA基因编码实质性地对苏氨酸反馈抑制脱敏的天冬氨酸激酶-同型丝氨酸脱氢酶I。B-3996菌株依据保藏号RIA 1867于1987年11月19日保藏在All-Union Scientific Center ofAntibiotics(Nagatinskaya Street 3-A，117105Moscow，俄罗斯)。这种菌株还依据保藏号VKPM B-3996于1987年4月7日保藏在Russian NationalCollection of Industrial Microorganisms(VKPM，1Dorozhny proezd.，1Moscow117545，俄罗斯)。
VKPM B-5318菌株关于异亮氨酸是原养型的，并且带有质粒pPRT614，其对应于质粒pVIC40，其苏氨酸操纵子的调控区域被温度敏感性λ-噬菌体C1抑制子和PR启动子替代。VKPM B-5318菌株依据保藏号VKPM B-5318于1990年5月3日保藏在Russian National Collection of IndustrialMicroorganisms(VKPM，1Dorozhny proezd.，1Moscow 117545，俄罗斯)。
大肠埃希氏菌的编码天冬氨酸激酶-同型丝氨酸脱氢酶I的thrA基因已经阐明(核苷酸编号337至2799，GenBank登录号NC_000913.2，gi:49175990)。thrA基因位于大肠埃希氏菌K-12的染色体上的thrL和thrB基因之间。编码大肠埃希氏菌的同型丝氨酸激酶的thrB基因已经阐明(核苷酸编号2801至3733，GenBank登录号NC_000913.2，gi:49175990)。thrB基因位于大肠埃希氏菌K-12染色体上的thrA和thrC基因之间。编码大肠埃希氏菌的苏氨酸合成酶的thrC基因已经阐明(核苷酸编号3734至5020，GenBank登录号NC_000913.2，gi:49175990)。thrC基因位于大肠埃希氏菌K-12染色体上的thrB基因和yaaX开放阅读框之间。可以从公知的质粒pVIC40(其存在于苏氨酸生产菌株大肠埃希氏菌VKPM B-3996中)(美国专利No.5,705,371)，获得thrA*BC操纵子，其含有编码对苏氨酸抑制反馈抗性的天冬氨酸激酶-同型丝氨酸脱氢酶I的突变thrA基因和野生型thrBC基因。
大肠埃希氏菌的rhtA基因位于大肠埃希氏菌染色体上接近于glnHPQ操纵子的18min处，其编码谷氨酰胺转运系统的成分。rhtA基因与ORF1(ybiF基因，核苷酸编号764至1651，Genbank登录号AAA218541，gi:440181)相同，并且位于pexB和ompX基因之间。表达由ORF1编码的蛋白质的单元已经指定为0基因(rht：同型丝氨酸和苏氨酸抗性)。还已经揭示了给予高浓度苏氨酸或同型丝氨酸抗性的rhtA23突变是相对于ATG起始密码子的位置-1的A-G替换(ABSTRACTS of the 17th International Congress ofBiochemistry and Molecular Biology in conjugation with Annual Meeting of theAmerican Society for Biochemistry and Molecular Biology,San Francisco,California August 24-29,1997,abstract No.457；EP 1013765A)。
大肠埃希氏菌的asd基因已经阐明(核苷酸编号3572511至3571408，GenBank登录号NC_000913.1，gi:16131307)，并且可以利用基于基因的核苷酸序列制备的引物，通过PCR获得(参见White，T.J.等，Trends Genet,5:185-189，1989)。其他微生物的asd基因也可以以相似的方式获得。
大肠埃希氏菌的aspC基因也已经阐明(核苷酸编号983742至984932，GenBank登录号NC_000913.1，gi:16128895)，并且可以利用基于基因的核苷酸序列制备的引物，通过PCR获得。其他微生物的aspC基因也可以以相似的方式获得。
<L-赖氨酸生产细菌>
用于给予或增强L-赖氨酸生产能力的方法的实例包括，例如，修饰细菌使得细菌具有一种或多种选自L-赖氨酸生物合成酶的酶的提高活性的方法。这样的酶的实例包括，但不特别限于，二氢吡啶二羧酸合成酶(dapA)、天冬氨酸激酶(lysC)、二氢吡啶二羧酸还原酶(dapB)、二氨基庚二酸脱羧酶(lysA)、二氨基庚二酸脱氢酶(ddh)(美国专利No.6,040,160)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)、天冬氨酸半醛脱氢酶(asd)、天冬氨酸氨基转移酶(天冬氨酸转氨酶)(aspC)、二氨基庚二酸表异构酶(dapF)、四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶(dapD)、琥珀酰二氨基庚二酸脱酰酶(dapE)和天冬氨酸酶(aspA)(EP1253195A)。在这些酶中，优选增强一种或多种选自例如二氢吡啶二羧酸还原酶、二氨基庚二酸脱羧酶、二氨基庚二酸脱氢酶、磷酸烯醇丙酮羧化酶、天冬氨酸氨基转移酶、二氨基庚二酸表异构酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶和琥珀酰二氨基庚二酸脱酰酶的酶的活性。此外，L-赖氨酸生产细菌和用于衍生它们的亲本菌株可以表达提高水平的涉及能量效率的基因(cyo)(EP 1170376A)、编码烟酰胺核苷酸转氢酶的基因(pntAB)(美国专利No.5,830,716)、ybjE基因(WO2005/073390)，或这些的组合。由于天冬氨酸激酶III(lysC)接受L-赖氨酸的反馈抑制，因此编码对L-赖氨酸的反馈抑制脱敏的天冬氨酸激酶III的突变lysC基因(美国专利No.5,932,453)可以用于增强这种酶的活性。此外，由于二氢吡啶二羧酸合成酶(dapA)接受L-赖氨酸的反馈抑制，因此编码对L-赖氨酸的反馈抑制脱敏的二氢吡啶二羧酸合成酶的突变dapA基因可以用于增强这种酶的活性。
用于给予或增强L-赖氨酸生产能力的方法的实例还包括，例如，修饰细菌使得细菌具有一种或多种酶的降低活性的方法，所述酶选自催化产生L-赖氨酸以外的化合物的L-赖氨酸生物合成路径的分支反应的酶。这样的酶的实例包括，但不特别限于，同型丝氨酸脱氢酶、赖氨酸脱羧酶(美国专利No.5,827,698)和苹果酸酶(WO2005/010175)。
L-赖氨酸生产细菌和用于衍生它们的亲本菌株的实例还包括对L-赖氨酸类似物具有抗性的突变菌株。L-赖氨酸类似物抑制细菌的生长，如肠杆菌科的细菌和棒状细菌，但L-赖氨酸存在于培养基中时，这种抑制完全或部分释放。这些L-赖氨酸类似物的实例包括，但没有特别限于，氧杂赖氨酸(oxalysine)、赖氨酸-异羟肟酸盐(hydroxamate)、S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(AEC)、γ-甲基赖氨酸和α-氯己内酰胺。可以通过将细菌接受常规的人工诱变处理，获得对这些赖氨酸类似物具有抗性的突变菌株。
L-赖氨酸生产细菌和用于衍生它们的亲本菌株的特定实例包括大肠埃希氏菌AJ11442(FERM BP-1543、NRRL B-12185，参见美国专利No.4,346,170)和大肠埃希氏菌VL611。在这些菌株中，天冬氨酸激酶对L-赖氨酸的反馈抑制脱敏。L-赖氨酸生产细菌和用于衍生它们的亲本菌株的特定实例还包括大肠埃希氏菌AJIK01(NITE BP-01520)。AJIK01菌株指定为大肠埃希氏菌AJ111046，并且于2013年1月29日保藏在独立的管理机构，National Instituteof Technology and Evaluation，International Patent Organism Depositary(#120，2-5-8Kazusakamatari，Kisarazu-shi，Chiba-ken，292-0818，日本)，并于2014年5月15日依据布达佩斯条约的规定，转为国际保藏，并且指定保藏号为NITE BP-01520。
L-赖氨酸生产细菌和用于衍生它们的亲本菌株的特定实例还包括大肠埃希氏菌WC196菌株。通过基于W3110菌株AEC抗性来培育WC196菌株，W3110菌株源自大肠埃希氏菌K-12(美国专利No.5,827,698)。WC196菌株指定为大肠埃希氏菌AJ13069并且于1994年12月6日保藏在National Instituteof Bioscience and Human-Technology，Agency of Industrial Science andTechnology(目前为独立的管理机构，National Institute of Technology andEvaluation，International Patent Organism Depositary，#120,2-5-8Kazusakamatari，Kisarazu-shi，Chiba-ken，292-0818，日本)，并且分配保藏号为FERM P-14690。然后，于1995年9月29日依据布达佩斯条约的规定转为国际保藏，并且分配了保藏号FERM BP-5252(美国专利No.5,827,698)。
L-赖氨酸生产细菌的优选实例包括大肠埃希氏菌WC196ΔcadAΔldc和大肠埃希氏菌WC196ΔcadAΔldc/pCABD2(WO2006/078039)。大肠埃希氏菌WC196ΔcadAΔldc是通过破坏编码赖氨酸脱羧酶的cadA和ldcC基因从WC196菌株构建的菌株。WC196ΔcadAΔldc/pCABD2菌株是通过将含有赖氨酸生物合成酶基因的质粒pCABD2(美国专利No.6,040,160)引入WC196ΔcadAΔldc菌株构建的菌株。WC196ΔcadAΔldc菌株，指定为AJ110692，于2008年10月7日保藏在独立的管理机构，National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology，International Patent OrganismDepositary(目前为独立的管理机构，National Institute of Technology andEvaluation，International Patent Organism Depositary，#120，2-5-8Kazusakamatari，Kisarazu-shi，Chiba-ken，292-0818，日本)，作为国际保藏，并且分配了保藏号FERM BP-11027。质粒pCABD2含有源自大肠埃希氏菌并编码具有对L-赖氨酸反馈抑制脱敏的突变的二氢吡啶二羧酸合成酶(DDPS)的突变dapA基因、源自大肠埃希氏菌并编码具有对L-赖氨酸反馈抑制脱敏的突变的天冬氨酸激酶III的突变lysC基因、源自大肠埃希氏菌并编码二氢吡啶二羧酸还原酶的dapB基因和源自乳发酵短杆菌并编码二氨基庚二酸脱氢酶的ddh基因。
<L-精氨酸生产细菌>
用于给予或增强L-精氨酸生产能力的方法的实例包括，例如，修饰细菌使得细菌具有一种或多种选自L-精氨酸生物合成酶的酶的提高活性的方法。这样的酶的实例包括，但不特别限于，N-乙酰谷氨酸合成酶(argA)、N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶(argC)、鸟氨酸乙酰转移酶(argJ)、N-乙酰谷氨酸激酶(argB)、乙酰鸟氨酸转氨酶(argD)、乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶(argE)、鸟氨酸氨基甲酰转移酶(argF)、精氨酸琥珀酸合成酶(argE)、精氨酸琥珀酸裂解酶(argH)和氨基甲酰磷酸合成酶(carAB)。作为N-乙酰谷氨酸合成酶基因(argA)，例如，可以优选使用编码对L-精氨酸反馈抑制脱敏的突变N-乙酰谷氨酸合成酶的基因，该突变酶是通过取代对应于野生型酶的位置15至19的氨基酸残基获得的(欧洲专利公开No.1170361)。
L-精氨酸生产细菌和用于衍生它们的亲本菌株的特定实例包括，例如，大肠埃希氏菌237菌株(VKPM B-7925)(美国专利公开申请No.2002/058315A1)、其引入了编码突变N-乙酰谷氨酸合成酶的argA基因的衍生菌株(俄罗斯专利申请No.2001112869，EP 1170361A1)、源自237菌株并具有提高的乙酸同化能力的大肠埃希氏菌382菌株(VKPM B-7926，EP1170358A1)和大肠埃希氏菌382ilvA+菌株，其是通过将来自大肠埃希氏菌K-12菌株的野生型ilvA基因引入382菌株获得的菌株。大肠埃希氏菌菌株237依据保藏号VKPM B-7925于2000年4月10日保藏在Russian NationalCollection of Industrial Microorganisms(VKPM，1Dorozhny proezd.，1Moscow117545，俄罗斯)，并且于2001年3月18日依据布达佩斯条约的规定转为国际保藏。大肠埃希氏菌382菌株依据保藏号VKPM B-7926于2000年4月10日保藏在Russian National Collection of Industrial Microorganisms(VKPM，1Dorozhny proezd.，1Moscow 117545，俄罗斯)。
L-精氨酸生产细菌和用于衍生它们的亲本菌株的实例还包括具有氨基酸类似物抗性的菌株等等。这样的菌株的实例包括具有α-甲基甲硫氨酸、p-氟代苯基丙氨酸、D-精氨酸、精氨酸异羟肟酸盐、S-(2-氨基乙基)-半胱氨酸、α-甲基丝氨酸、β-2-噻吩丙氨酸或磺胺胍的大肠埃希氏菌突变菌株(参见日本专利公开(Kokai)No.56-106598)。
<L-瓜氨酸生产细菌和L-鸟氨酸生产细菌>
L-瓜氨酸和L-鸟氨酸的生物合成路径与L-精氨酸的共用。因此，可以通过提高N-乙酰谷氨酸合成酶(argA)、N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶(argC)、鸟氨酸乙酰转移酶(argJ)、N-乙酰谷氨酸激酶(argB)、乙酰鸟氨酸转氨酶(argD)和.或乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶(argE)的活性来给予或增强生产L-瓜氨酸和/或L-鸟氨酸的能力(WO2006/35831)。
<L-组氨酸生产细菌>
用于给予或增强L-组氨酸生产能力的方法的实例包括，例如，修饰细菌使得细菌具有一种或多种选自L-组氨酸生物合成酶的酶的提高活性的方法。这样的酶的实例包括，但不特别限于，ATP磷酸核糖基转移酶(hisG)、磷酸核糖基AMP环式水解酶(hisI)、磷酸核糖基-ATP焦磷酸水解酶(hisI)、磷酸核糖基亚胺甲基-5-酰胺转移酶(hisH)、组胺醇磷酸氨基转移酶(hisC)、组胺醇磷酸酶(hisB)和组胺醇脱氢酶(hisD)。
在这些酶中，已知由hisG和hisBHAFI编码的L-组氨酸生物合成酶受到L-组氨酸的抑制。因此，可以通过，例如，将给予反馈抑制抗性的突变引入编码ATP磷酸核糖基转移酶(hisG)的基因中，来给予或增强生产L-组氨酸的能力(俄罗斯专利No.2003677和2119536)。
L-组氨酸生产细菌和用于衍生它们的亲本菌株的特定实例包括，例如，属于埃希氏菌属的菌株，如大肠埃希氏菌24菌株(VKPM B-5945，RU2003677)、大肠埃希氏菌NRRL B-12116至B-12121(美国专利No.4,388,405)、大肠埃希氏菌H-9342(FERM BP-6675)和H-9343(FERM BP-6676，美国专利No.6,344,347)、大肠埃希氏菌H-9341(FERM BP-6674，EP 1085087)、大肠埃希氏菌AI80/pFM201(美国专利No.6,258,554)、大肠埃希氏菌FERMP-5038和FERM P-5048，其已经引入了携带编码L-组氨酸生物合成酶的DNA的载体(日本专利公开(Kokai)No.56-005099)、引入了用于氨基酸转运的基因的大肠埃希氏菌菌株(EP 1016710A)和大肠埃希氏菌80菌株，已经给予其磺胺胍、DL-1,2,4-三唑-3-丙氨酸和链霉素抗性(VKPM B-7270，俄罗斯专利No.2119536)。
<L-半胱氨酸生产细菌>
用于给予或增强L-半胱氨酸生产能力的方法的实例包括，例如，修饰细菌使得细菌具有一种或多种选自L-半胱氨酸生物合成酶的酶的提高活性的方法。这样的酶的实例包括，但不特别限于，丝氨酸乙酰转移酶(cysE)和3-磷酸甘油酸脱氢酶(serA)。例如，可以通过将编码对半胱氨酸反馈抑制抗性的突变丝氨酸乙酰转移酶的突变cysE基因引入细菌中，来增强丝氨酸乙酰转移酶活性。这样的突变丝氨酸乙酰转移酶公开于例如日本专利公开(Kokai)No.11-155571和美国专利公开申请No.20050112731中。此外，例如，可以通过将编码丝氨酸反馈抑制抗性的突变3-磷酸甘油酸脱氢酶的突变serA基因引入细菌中，来增强3-磷酸甘油酸脱氢酶活性。这样的突变3-磷酸甘油酸脱氢酶公开于例如美国专利No.6,180,373中。
此外，用于给予或增强L-半胱氨酸生产能力的方法的实例还包括，例如，修饰细菌使得细菌具有一种或多种酶的降低活性的方法，所述细菌选自催化产生L-半胱氨酸以外的化合物的L-半胱氨酸胺生物合成路径的分支反应的酶。这样的酶的实例包括，例如，涉及L-半胱氨酸分解的酶。涉及L-半胱氨酸分解的酶的实例包括，但不特别限于，胱硫醚-β-裂解酶(metC，日本专利公开(Kokai)No.11-155571；Chandra等，Biochemistry，21(1982)3064-3069)、色氨酸酶(tnaA，日本专利公开(Kokai)No.2003-169668；Austin Newton等，J.Biol.Chem.，240(1965)1211-1218)、O-乙酰丝氨酸硫化氢解酶B(cysM，日本专利公开(Kokai)No.2005-245311)、malY基因产物(日本专利公开(Kokai)No.2005-245311)和菠萝泛菌的d0191基因产物(日本专利公开(Kokai)No.2009-232844)。
此外，用于给予或增强L-半胱氨酸生产能力的方法的实例还包括，例如，增强L-半胱氨酸分泌系统的方法和增强硫酸盐/硫代硫酸盐转运系统的方法。L-半胱氨酸分泌系统的蛋白质的实例包括由ydeD基因编码的蛋白质(日本专利公开(Kokai)No.2002-233384)、yfiK基因编码的蛋白质(日本专利公开(Kokai)No.2004-49237)、由emrAB、emrKY、yojIH、acrEF、bcr和cusA基因编码的蛋白质(日本专利公开(Kokai)No.2005-287333)和由yeaS基因编码的蛋白质(日本专利公开(Kokai)No.2010-187552)。硫酸盐/硫代硫酸盐转运系统的蛋白质的实例包括由cysPTWAM基因簇编码的蛋白质。
L-半胱氨酸生产细菌和用于衍生它们的亲本菌株的特定实例包括，例如，用不同的编码反馈抗性丝氨酸乙酰转移酶的cysE等位基因转化的大肠埃希氏菌JM15(美国专利No.6,218,168，俄罗斯专利申请2003121601)、具有超表达的编码适于细胞毒性物质分泌的蛋白质的基因的大肠埃希氏菌W3110(美国专利No.5,972,663)、具有降低的半胱氨酸脱巯基酶活性的大肠埃希氏菌菌株(JP11155571A2)和具有提高的cysB基因编码的半胱氨酸调节子的阳性转录调控子的活性的大肠埃希氏菌W3110(WO0127307A1)。
<L-甲硫氨酸生产细菌>
L-甲硫氨酸生产细菌和用于衍生它们的亲本菌株的实例包括L-苏氨酸营养缺陷型菌株和正亮氨酸抗性突变菌株(日本专利公开(Kokai)No.2000-139471)。L-甲硫氨酸生产细菌和用于衍生它们的亲本菌株的实例还包括含有L-甲硫氨酸反馈抑制抗性的突变同型丝氨酸转琥珀酰基酶的菌株(日本专利公开(Kokai)No.2000-139471，美国专利公开申请No.20090029424)。由于L-甲硫氨酸是经由L-半胱氨酸作为中间体生物合成的，因此也可以通过提高L-半胱氨酸生产能力来提高L-甲硫氨酸生产能力(日本专利公开(Kokai)No.2000-139471，美国专利公开申请No.20080311632)。
L-甲硫氨酸生产细菌和用于衍生它们的亲本菌株的特定实例包括，例如，大肠埃希氏菌AJ11539(NRRL B-12399)、大肠埃希氏菌AJ11540(NRRLB-12400)、大肠埃希氏菌AJ11541(NRRL B-12401)、大肠埃希氏菌AJ11542(NRRL B-12402，英国专利No.2075055)、大肠埃希氏菌218菌株(VKPMB-8125，俄罗斯专利No.2209248)和73菌株(VKPM B-8126，俄罗斯专利No.2215782)，其是正亮氨酸抗性的，其是L-甲硫氨酸的类似物，以及大肠埃希氏菌AJ13425(FERMP-16808，日本专利公开(Kokai)No.2000-139471)。AJ13425菌株是源自大肠埃希氏菌W3110的L-苏氨酸营养缺陷型菌株，其中删除了甲硫氨酸抑制子，减弱了胞内S-腺苷甲硫氨酸合成酶活性，以及增强了胞内同型丝氨酸转琥珀酰基酶活性、胱硫醚γ-合成酶活性和天冬氨酸激酶-同型丝氨酸脱氢酶II活性。
<L-亮氨酸生产细菌>
用于给予或增强L-亮氨酸生产能力的方法的实例包括，例如，修饰细菌使得细菌具有一种或多种选自L-亮氨酸生物合成酶的酶的提高活性的方法。这样的酶的实例包括，但不特别限于，由leuABCD操纵子的基因编码的酶。此外，为了增强这样的酶的活性，可以优选使用，例如，编码对L-亮氨酸反馈抑制脱敏的异丙基马来酸合成酶的突变leuA基因(美国专利No.6,403,342)。
L-亮氨酸生产细菌和用于衍生它们的亲本菌株的特定实例包括，例如，属于埃希氏菌属的菌株，如亮氨酸抗性的大肠埃希氏菌菌株(例如，57菌株(VKPM B-7386，美国专利No.6,124,121))，亮氨酸类似物抗性的大肠埃希氏菌菌株，所述亮氨酸类似物如β-2-噻吩丙氨酸、3-羟基亮氨酸、4-氮杂亮氨酸和5,5,5-三氟亮氨酸(日本专利公布(kokolu)No.62-34397和日本专利公开(Kokai)No.8-70879)，通过WO96/06926中所述的基因工程技术获得的大肠埃希氏菌菌株和大肠埃希氏菌H-9068(日本专利公开(Kokai)No.8-70879)。
<L-异亮氨酸生产细菌>
用于给予或增强L-异亮氨酸生产能力的方法的实例包括，例如，修饰细菌使得细菌具有一种或多种选自L-异亮氨酸生物合成酶的酶的提高活性的方法。这样的酶的实例包括，但不特别限于，苏氨酸脱氨酶和乙酰醇酸合成酶(日本专利公开(Kokai)No.2-458，FR 0356739，美国专利No.5,998,178)。
L-异亮氨酸生产细菌和用于衍生它们的亲本菌株的特定实例包括，例如，埃希氏菌属细菌，如具有6-二甲基氨基嘌呤抗性的突变菌株(日本专利公开(Kokai)No.5-304969)、具有异亮氨酸类似物(如，硫代异亮氨酸和异亮氨酸异羟肟酸盐)抗性的突变菌株和具有这样的异亮氨酸类似物抗性并且进一步具有DL-乙基硫氨酸和/或精氨酸异羟肟酸盐抗性的突变菌株(日本专利公开(Kokai)No.5-130882)。
<L-缬氨酸生产细菌>
用于给予或增强L-缬氨酸生产能力的方法的实例包括，例如，修饰细菌使得细菌具有一种或多种选自L-缬氨酸生物合成酶的酶的提高活性的方法。这样的酶的实例包括，但不特别限于，由ilvGMEDA操纵子的基因编码的酶和由ilvBNC操纵子编码的酶。ilvBN基因编码乙酰醇酸合成酶，而ilvC基因编码isomeroreductase(WO00/50624)。ilvGMEDA操纵子和ilvBNC操纵子的表达受到L-缬氨酸、L-异亮氨酸和/或L-亮氨酸的抑制(减弱)。因此，为了增强这样的酶的活性，优选通过除去或修饰减弱需要的区域来释放由产生的L-缬氨酸引起的表达抑制。此外，由ilvA基因编码的苏氨酸脱氨酶是催化L-苏氨酸形成2-酮丁酸的脱氨基反应的酶，这是L-苏氨酸生物合成系统的速率限制步骤。因此，对于L-缬氨酸生产，例如，优选破坏ilvA基因并且由此降低苏氨酸脱氨酶活性。
用于给予或增强L-缬氨酸生产能力的方法的实例还包括，例如，修饰细菌使得细菌具有一种或多种酶的降低活性的方法，所述酶选自催化产生L-缬氨酸以外的化合物的L-缬氨酸生物合成路径的分支反应的酶。这样的酶的实例包括，但不特别限于，涉及L-亮氨酸合成的苏氨酸脱水酶和涉及D-泛酸合成的酶(WO00/50624)。
L-缬氨酸生产细菌和用于衍生它们的亲本菌株的特定实例包括，例如，修饰使得超表达ilvGMEDA操纵子的大肠埃希氏菌菌株(美国专利No.5,998,178)。
L-缬氨酸生产细菌和用于衍生它们的亲本菌株的实例还包括在氨基-酰基t-RNA合成酶中具有突变的突变菌株(美国专利No.5,658,766)。这样的菌株的实例包括，例如，大肠埃希氏菌VL1970，其在编码异亮氨酸t-RNA合成酶的ileS基因中具有突变。大肠埃希氏菌VL1970依据保藏号VKPM B-4411于1988年6月24日保藏在Russian National Collection of IndustrialMicroorganisms(VKPM，1Dorozhny Proezd，1Moscow 117545，俄罗斯)。L-缬氨酸生产细菌和用于衍生它们的亲本菌株的实例还包括需要硫辛酸用于生长和/或缺乏H+-ATPase的突变菌株(WO96/06926)。
<L-色氨酸生产细菌、L-苯丙氨酸生产细菌和L-酪氨酸生产细菌>
用于给予或增强L-色氨酸生产能力、L-苯丙氨酸生产能力和/或L-酪氨酸生产能力的方法的实例包括，例如，修饰细菌使得细菌具有一种或多种选自L-色氨酸、L-苯丙氨酸和/或L-酪氨酸生物合成酶的酶的提高活性的方法。
这些芳香族氨基酸的生物合成系统共有的酶的实例包括，但不特别限于，3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合成酶(aroG)、3-脱氢奎尼酸合成酶(aroB)、莽草酸脱氢酶(aroE)、莽草酸激酶(aroL)、5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(aroA)和分支酸合成酶(aroC)(欧洲专利No.763127)。通过酪氨酸抑制子(tyrR)控制编码这些酶的基因的表达，并且可以通过删除tyrR基因来增强这些酶的活性(欧洲专利No.763127)。
L-色氨酸生物合成酶的实例包括，但不特别限于，邻氨基苯甲酸合成酶(trpE)、色氨酸合成酶(trpAB)和磷酸甘油酸脱氢酶(serA)。例如，通过引入含有色氨酸操纵子的DNA，可以给予或增强L-色氨酸生产能力。色氨酸合成酶由分别由trpA和trpB基因编码的α和β亚基组成。由于邻氨基苯甲酸合成酶接受L-色氨酸的反馈抑制，因此编码引入了用于反馈抑制脱敏的突变的这种酶的基因可以用于增强这种酶的活性。由于磷酸甘油酸脱氢酶接受L-丝氨酸的反馈抑制，因此编码引入了用于反馈抑制脱敏的突变的这种酶的基因可以用于增强这种酶的活性。此外，通过提高由马来酸合成酶基因(aceB)、异柠檬酸裂解酶基因(aceA)和异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸酶基因(aceK)组成的操纵子(ace操纵子)的表达，可以给予或增强L-色氨酸生产能力(WO2005/103275)。
L-苯丙氨酸生物合成酶的实例包括，但不特别限于，分支酸变位酶和预苯酸脱水酶。分支酸变位酶和预苯酸脱水酶由作为双功能酶的pheA基因编码。由于分支酸变位酶和预苯酸脱水酶接受L-苯丙氨酸的反馈抑制，因此编码引入了用于反馈抑制脱敏的突变的这些酶的基因可以用于增强这些酶的活性。
L-酪氨酸生物合成酶的实例包括，但不特别限于，分支酸变位酶和预苯酸脱氢酶。分支酸变位酶和预苯酸脱氢酶由作为双功能酶的tryA基因编码。由于分支酸变位酶和预苯酸脱氢酶接受L-酪氨酸的反馈抑制，因此编码引入了用于反馈抑制脱敏的突变的这些酶的基因可以用于增强这些酶的活性。
可以修饰L-色氨酸、L-苯丙氨酸和/或L-酪氨酸生产细菌，使得降低除了目标芳香族氨基酸以外的芳香族氨基酸的生物合成。此外，可以修饰L-色氨酸、L-苯丙氨酸和/或L-酪氨酸生产细菌，使得增强副产物吸收系统。副产物的实例包括除了目标芳香族氨基酸以外的芳香族氨基酸。编码这样的副产物吸收系统的基因的实例包括，例如，tnaB和mtr，其是编码L-色氨酸吸收系统的基因，pheP，其是编码L-苯丙氨酸吸收系统的基因，和tryP，其是编码L-酪氨酸吸收系统的基因(EP 1484410)。
L-色氨酸生产细菌和用于衍生它们的亲本菌株的特定实例包括，例如，大肠埃希氏菌JP4735/pMU3028(DSM10122)和JP6015/pMU91(DSM10123)，其具有编码部分失活的色氨酰-tRNA合成酶的突变trpS基因(美国专利No.5,756,345)，大肠埃希氏菌SV164，其具有编码对色氨酸反馈抑制脱敏的邻氨基苯甲酸合成酶的trpE等位基因，大肠埃希氏菌SV164(pGH5)，其具有编码对丝氨酸反馈抑制脱敏的磷酸甘油酸脱氢酶的serA等位基因和编码对色氨酸反馈抑制脱敏的邻氨基苯甲酸合成酶的trpE等位基因(美国专利No.6,180,373)，引入了含有编码对色氨酸抑制反馈脱敏的邻氨基苯甲酸合成酶的trpE等位基因的色氨酸操纵子的菌株(日本专利公开(Kokai)No.57-71397HE62-244382，美国专利No.4,371,614)，大肠埃希氏菌AGX17(pGX44)(NRRLB-12263)和AGX6(pGX50)aroP(NRRL B-12264)，其缺乏色氨酸酶(美国专利No.4,371,614)，大肠埃希氏菌AGX17/pGX50，pACKG4-pps，其具有提高的磷酸烯醇丙酮酸-生产能力(WO97/08333，美国专利No.6.319,696)和属于埃希氏菌属的具有提高的由yedA或yddG基因编码的蛋白质的活性的菌株(美国专利公开申请2003/0148473A1和2003/0157667A1)。
L-苯丙氨酸生产细菌和用于衍生它们的亲本菌株的特定实例包括，例如，大肠埃希氏菌AJ12739(tyrA::Tn10，tyrR)(VKPM B-8179)，其缺乏分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶和酪氨酸抑制子(WO03/044191)，大肠埃希氏菌HW1089(ATCC 55371)，其含有编码对反馈抑制脱敏的分支酸变位酶-预苯酸脱水酶的突变pheA34基因(美国专利No.5,354,672)，大肠埃希氏菌MWEC101-b(KR8903681)，大肠埃希氏菌NRRL B-12141、NRRL B-12145、NRRL B-12146和NRRL B-12147(美国专利No.4,407,952)。L-苯丙氨酸生产细菌和用于衍生它们的亲本菌株的特定实例还包括，例如，大肠埃希氏菌K-12<W3110(tyrA)/pPHAB>(FERM BP-3566)、大肠埃希氏菌K-12<W3110(tyrA)/pPHAD>(FERM BP-12659)、大肠埃希氏菌K-12<W3110(tyrA)/pPHATerm>(FERM BP-12662)和大肠埃希氏菌K-12AJ12604<W3110(tyrA)/pBR-arpG4，pACMAB>(FERM BP-3579)，其含有编码对反馈抑制脱敏的分支酸变位酶-预苯酸脱水酶的基因(EP 488424B1)。L-苯丙氨酸生产细菌和用于衍生它们的亲本菌株的特定实例进一步包括，例如，属于埃希氏菌属的具有提高的由yedA基因或yddG基因编码的蛋白质的活性的菌株(美国专利公开申请No.2003/0148473和2003/0157667，WO03/044192)。
此外，用于给予或增强L-氨基酸生产能力的方法的实例包括，例如，修饰细菌使得细菌具有提高的从细菌细胞分泌L-氨基酸的活性的方法。例如，可以通过提高编码负责L-氨基酸分泌的蛋白质的基因的表达来提高这种分泌L-氨基酸的活性。编码负责各种氨基酸分泌的蛋白质的基因的实例包括，例如，b2682基因(ygaZ)、b2683基因(ygaH)、b1242基因(ychE)和b3434基因(yhgN)(日本专利公开(Kokai)No.2002-300874)。
此外，用于给予或增强L-氨基酸生产能力的方法的实例还包括，例如，修饰细菌使得细菌具有一种或多种蛋白质的提高活性的方法，所述蛋白质选择涉及糖代谢的蛋白质和涉及能量代谢的蛋白质。
涉及糖代谢的蛋白质的实例包括涉及糖吸收和糖解系统酶的蛋白质。编码涉及糖代谢的蛋白质的基因的实例包括葡萄糖-6-磷酸异构酶基因(pgi，WO01/02542)、磷酸烯醇丙酮酸合成酶基因(pps，欧洲专利公开No.877090)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(ppc，WO95/06114)、丙酮酸羧化酶基因(pyc，WO99/18228，欧洲专利公开No.1092776)、葡糖磷酸变位酶基因(pgm，WO03/04598)、果糖二磷酸醛缩酶基因(pykF，WO03/008609)、转醛醇酶基因(talB，WO03/008611)、富马酸酶基因(fum，WO01/02545)、非-PTS蔗糖吸收基因(csc，欧洲专利公开No.149911)和蔗糖同化基因(scrAB操纵子，WO90/04636)。
编码涉及能量代谢的蛋白质的基因的实例包括转氢酶基因(pntAB，美国专利No.5,830,716)和细胞色素bo-型氧化酶基因(cyoB，欧洲专利公开No.1070376)。
用于上述L-氨基酸生产细菌育种的基因不限于以上具体举例的基因和具有已知核苷酸序列的基因，并且可以是其变体，只要保持其最初的功能。例如，用于L-氨基酸生产细菌育种的基因可以是编码具有已知蛋白质的氨基酸序列但在一个或几个位置包括一个或几个氨基酸残基的置换、删除、插入或添加的蛋白质的基因。对于基因和蛋白质的变体，加以必要的变更，适用于acpP和fabF基因的变体以及之后提及的由此编码的蛋白质的描述。
<1-2>acpP-fabF操纵子的减弱
本发明的细菌已经进行了修饰，使得减弱了acpP-fabF操纵子。所述acpP-fabF操纵子参与脂肪酸的生物合成(非专利文献1)。因此，如与当L-氨基酸生产培养物通过使用未修饰的菌株进行时相比较，推测当L-氨基酸生产培养物通过使用其中acpP-fabF操纵子已被减弱的细菌进行时，碳源流入脂肪酸生物合成途径减少，且结果是，剩余的碳源和剩余的还原能量可用于L-氨基酸的生产，由此改善L-氨基酸的生产。可以通过修饰具有L-氨基酸生产能力的细菌使得acpP-fabF操纵子减弱，来获得本发明的细菌。此外，还可以通过修饰细菌使得acpP-fabF操纵子减弱，然后给予L-氨基酸生产能力或增强细菌的L-氨基酸生产能力，来获得本发明的细菌。本发明的细菌也可以是通过修饰使得acpP-fabF操纵子减弱而获得了L-氨基酸生产能力的细菌。可以以任意顺序进行用于构建本发明细菌的修饰。
表述“acpP-fabF操纵子减弱”意思是降低了由acpP-fabF操纵子的基因编码的蛋白质的活性，和/或降低了acpP-fabF操纵子的基因的表达。表述“降低基因的表达”意思是降低该基因的转录量(mRNA的量)，和/或降低该基因的翻译量(蛋白质的量)。“acpP-fabF操纵子的基因”意思是acpP基因和/或fabF基因。即，“由acpP-fabF操纵子的基因编码的蛋白质”是指由fabF基因编码的蛋白质和/或由acpP基因编码的蛋白质，即，AcpP蛋白质和/或FabF蛋白质。如之后所述的，可以通过，例如，减弱编码所述蛋白质的基因的表达，或破坏编码所述蛋白质的基因，来降低蛋白质的活性。即，表述“acpP-fabF操纵子减弱”还可以表示，例如，减弱了acpP-fabF操纵子的基因的表达。在本发明中，例如，可以减弱acpP基因和fabF基因中的任一种或两种的表达。即，还可以减弱完整的acpP-fabF操纵子的表达。
acpP基因是编码酰基载体蛋白(ACP)的基因。“ACP”是具有通过4’-磷酸泛酰巯基乙胺基团结合脂肪酸链功能的蛋白质，并且由此在脂肪酸生物合成时携带脂肪酸链。这种功能也称为“ACP活性”。ACP翻译为无活性apo-ACP，然后4’-磷酸泛酰巯基乙胺作为辅因子通过ACP合成酶添加至apo-ACP的位置36的丝氨酸残基(在大肠埃希氏菌的情况中)，并且由此将apo-ACP制成活性holo-ACP。
fabF基因是编码β-酮酰基-ACP合成酶II的基因。“β-酮酰基-ACP合成酶II”是指催化从酰基-ACP(碳数＝n)和丙二酰-ACP(EC 2.3.1.41)产生3-氧酰基-ACP(碳数＝n+2)反应的酶。催化这种反应的活性也称为“β-酮酰基-ACP合成酶II活性”。
大肠埃希氏菌K-12MG1655菌株的acpP基因对应于按照GenBank登录号NC_000913(VERSION NC_000913.2GI:49175990)在NCBI数据库登记的基因组序列中的位置1150838至1151074的序列。MG1655菌株的acpP基因与ECK1080和JW1080同义。此外，MG1655菌株的AcpP蛋白质登记为GenBank登录号NP_415612(版本NP_415612.1GI:16129057，基因座_标记“b1094”)。
大肠埃希氏菌K-12MG1655菌株的fabF基因对应于按照GenBank登录号NC_000913(VERSION NC_000913.2GI:49175990)在NCBI数据库登记的基因组序列中的位置1151162至1152403的序列。MG1655的fabF基因与ECK1081和JW1081同义。此外，MG1655菌株的FabF蛋白质登记为GenBank登录号NP_415613(版本NP_415613.1GI:16129058，基因座_标记“b1095”)。
MG1655菌株的acpP-fabF操纵子的核苷酸序列(包括其上游210bp)显示为SEQ ID NO:7。在SEQ ID NO:7中，acpP基因的核苷酸序列对应于位置211至447，而fabF基因的核苷酸序列对应于位置535至1776。此外，MG1665菌株的AcpP蛋白质和FabF蛋白质的氨基酸序列分别显示为SEQ IDNO:8和9。
菠萝泛菌AJ13355菌株的acpP基因对应于按照GenBank登录号NC_017531(VERSION NC_017531.1GI:386014600)在NCBI数据库登记的基因组序列中的位置986154至986528的序列。此外，AJ13355的AcpP蛋白质登记为GenBank登录号YP_005933706(版本YP_005933706.1GI:386015425)。
菠萝泛菌AJ13355菌株的fabF基因对应于按照GenBank登录号NC_017531(VERSION NC_017531.1GI:386014600)在NCBI数据库登记的基因组序列中的位置986650至987855的序列。此外，AJ13355的FabF蛋白质登记为GenBank登录号YP_005933707(版本YP_0059337067.1GI:386015426)。
AJ13355菌株的acpP-fabF操纵子的核苷酸序列(包括其上游210bp)显示为SEQ ID NO:10。在SEQ ID NO:10中，acpP基因的核苷酸序列对应于位置211至585，而fabF基因的核苷酸序列对应于位置707至1912。此外，AJ13355菌株的AcpP蛋白质和FabF蛋白质的氨基酸序列分别显示为SEQ IDNO:11和12。
AcpP蛋白质或FabF蛋白质可以是上述AcpP蛋白质或FabF蛋白质的变体，只要保持每种蛋白质的初始功能。相似地，acpP基因或fabF基因可以是上述acpP基因或fabF基因的变体，只要保持每种基因的初始功能。这样保持了初始功能的变体也可以称为“保守性变体”。术语“AcpP蛋白质”或“FabF蛋白质”不限于上述AcpP蛋白质或FabF蛋白质，而且还包括其保守性变体。相似地，术语“acpP基因”或“fabF基因”不限于上述acpP基因或fabF基因，而且还包括其保守性变体。这样的保守性变体的实例包括，例如，上述AcpP蛋白质或FabF蛋白质，或上述acpP基因或fabF基因的同源物和人工修饰的变体。
“保持了初始功能”的表述意思是蛋白质或基因的变体具有对应于初始蛋白质或初始基因的功能(即，活性或特性)的功能(即，活性或特性)。即，例如，针对AcpP蛋白质使用的“保持了蛋白质的初始功能”的表述意思是蛋白质具有ACP活性，而针对FabF蛋白质使用的“保持了蛋白质的初始功能”的表述意思是蛋白质具有β-酮酰基-ACP合成酶II活性。此外，例如，针对acpP基因使用的“保持了基因的初始功能”的表示意思是基因编码具有ACP活性的蛋白质，而针对fabF基因使用的“保持了基因的初始功能”的表示意思是基因编码具有β-酮酰基-ACP合成酶II活性的蛋白质。
可以通过，例如，使用上述acpP基因或fabF基因的任一种核苷酸序列作为询问序列进行BLAST搜寻或FASTA搜寻，从公众数据库容易地获得编码上述AcpP蛋白质或FabF蛋白质的同源物的基因。此外，可以通过，例如，使用生物体(如，细菌)的染色体作为模板和基于其已知基因序列制备的寡核苷酸作为引物，通过PCR获得编码上述AcpP蛋白质或FabF蛋白质的同源物的基因。
acpP基因或fabF基因可以是编码上述AcpP蛋白质或FabF蛋白质的保守性变体的基因。例如，acpP基因或fabF基因可以是，例如，编码具有上述任一个在一个或几个位置包括一个或几个氨基酸的置换、删除、插入或添加的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:8、9、10、11或12的氨基酸序列)的蛋白质的基因，只要其编码具有初始功能的蛋白质。在这样的情况中，相对于不包括一个或几个氨基酸残基的添加、删除、插入或添加的蛋白质，通常可以保持70％或更高，优选80％或更高，更优选90％或更高的相应蛋白质活性(即，ACP活性或β-酮酰基-ACP合成酶II活性)。尽管“一个或几个”的数量可以根据蛋白质三维结构中氨基酸残基的位置或氨基酸残基的类型而不同，但特别地，其是1至50，1至40，或1至30，优选1至20，更优选1至10，再更优选1至5，特别优选1至3。
上述一个或几个氨基酸残基的置换、删除、插入或添加是保持了蛋白质正常功能的保守性突变。保守性突变的典型实例是保守性置换。保守性置换是如果置换位点是芳香族氨基酸，其中置换在Phe、Trp和Tyr之间相互进行的突变；如果是疏水性氨基酸，在Leu、Ile和Val之间置换；如果是极性氨基酸，在Gln和Asn之间置换；如果是碱性氨基酸，在Lys、Arg和His之间置换；以及如果是具有羟基基团的氨基酸，在Ser和Thr之间置换。认为是保守性置换的置换实例包括，特别是，Ser或Thr置换Ala，Gln、His或Lys置换Arg，Glu、Gln、Lys、His或Asp置换Asn，Asn、Glu或Gln置换Asp，Ser或Ala置换Cys，Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg置换Gln，Gly、Asn、Gln、Lys或Asp置换Glu，Pro置换Gly，Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr置换His，Leu、Met、Val或Phe置换Ile，Ile、Met、Val或Phe置换Leu，Asn、Glu、Gln、His或Arg置换Lys，Ile、Leu、Val或Phe置换Met，Trp、Tyr、Met、Ile或Leu置换Phe，Thr或Ala置换Ser，Ser或Ala置换Thr，Phe或Tyr置换Trp，His、Phe或Trp置换Tyr，以及Met、Ile或Leu置换Val。此外，如上所述的这样的氨基酸残基置换、删除、插入、添加、倒置等包括由于个体差异或产生基因的生物体物种的差异天然产生的突变(突变体或变体)。
此外，具有如上所述的这样的保守性突变的基因可以是编码显示出与上述任一个氨基酸序列的总氨基酸序列80％或更高，优选90％或更高，更优选95％或更高，再更优选97％或更高，特别优选99％或更高同源性并且具有初始功能的蛋白质的基因。在本说明书中，“同源性”表示“同一性”。
此外，acpP基因或fabF基因可以是在严格条件下，能够与从已知基因序列制备的探针杂交并且编码具有初始功能的蛋白质的DNA，所述已知序列如与上述任一个核苷酸序列的全部或部分(例如，SEQ ID NO:7的位置211至447的核苷酸序列，SEQ ID NO:7的位置535至1776，SEQ ID NO:10的位置211至585或SEQ ID NO:10的位置707至1912)互补的序列。此外，acpP-fabF操纵子可以是在严格条件下，能够与从已知基因序列制备的探针杂交并且编码具有初始功能的蛋白质的DNA，所述已知序列如与上述任一个核苷酸序列的全部或部分(例如，SEQ ID NO:7的总核苷酸序列，SEQ ID NO:7的位置211至1776的核苷酸序列，SEQ ID NO:10的总核苷酸序列，或SEQID NO:10的位置211至1912的核苷酸序列)互补的序列。“严格条件”是指在该条件下形成所谓的特异性杂种并且未形成非特异性杂种的条件。严格条件的实例包括在该条件下高度同源的DNA彼此杂交的那些条件，所述DNA例如为不低于80％同源性，优选不低于90％同源性，更优选不低于95％同源性，再更优选不低于97％同源性，特别优选不低于99％同源性的彼此杂交的DNA，并且在该条件下同源性低于以上的DNA彼此不杂交，或是指典型的Southern杂交的洗涤条件，即，在对应于1×SSC，0.1％SDS，60℃的盐浓度和温度下洗涤一次，优选2或3次的条件，优选0.1×SSC，0.1％SDS，60℃，更优选0.1×SSC，0.1％SDS，68℃。
如上所述，用于上述杂交的探针可以是与上述基因互补的序列的一部分。可以使用基于已知基因序列制备的寡核苷酸作为引物和含有任一个核苷酸序列的DNA片段作为模板，通过PCR，来制备这样的探针。作为探针，例如，可以使用具有约300bp长度的DNA片段。将具有约300bp长度的DNA片段用作探针时，杂交的洗涤条件可以是，例如，50℃，2×SSC和0.1％SDS。
此外，在acpP基因或fabF基因中，可以用等价密码子替代任何密码子，只要基因编码具有初始功能的蛋白质。例如，可以修饰acpP基因或fabF基因，使得根据在待使用的宿主中观察到的密码子频率，其具有最佳密码子。
加以必要的变更，以上关于基因和蛋白质变体的描述也适用于任意蛋白质，如L-氨基酸生物合成酶和编码其的基因。
<1-3>用于降低蛋白质活性的方法
下文，将解释用于降低蛋白质(如，AcpP蛋白质和FabF蛋白质)活性的方法。
表述“降低蛋白质的活性”意思是与未修饰菌株(如，野生型或亲本菌株)相比降低了每个细胞的蛋白质的活性，并且包括活性已经完全消失的状况。特别地，表述“降低蛋白质的活性”表示与未修饰菌株的那些相比，降低了每个细胞的蛋白质分子的数量和/或降低了每个蛋白质分子的功能。即，表述“降低蛋白质的活性”中的术语“活性”不限于蛋白质的催化活性，而是可以表示编码蛋白质的基因的转录量(mRNA的含量)或蛋白质的翻译量(蛋白质的含量)。“降低每个细胞的蛋白质分子的数量”的状况包括根本不存在蛋白质的状况。“降低每个蛋白质分子的功能”的状况包括每个蛋白质分子的功能完全消失的状况。尽管蛋白质活性降低的程度没有特别限制，只要与未修饰菌株相比降低了活性，但可以降至，例如，未修饰菌株的90％或更低，80％或更低，70％或更低，60％或更低，55％或更低，50％或更低，30％或更低，20％或更低，10％或更低，5％或更低，或0％。
例如，可以通过降低编码所述蛋白质的基因的表达来获得降低蛋白质活性的修饰。“降低基因的表达”的状况包括基因根本不表达的状况。“降低基因的表达”的状况也称为“减弱基因的表达”。基因的表达可以降至未修饰菌株的90％或更低，80％或更低，70％或更低，60％或更低，55％或更低，50％或更低，30％或更低，20％或更低，10％或更低，5％或更低，或0％。
此外，已知，例如，在大肠埃希氏菌中，acpP基因是不可缺少的(必需的)。因此，降低AcpP蛋白质的活性时，将AcpP蛋白质的活性保留至如下的程度，将培养基中培养本发明的细菌时，本发明的细菌可以增殖，并且产生目标L-氨基酸。即AcpP蛋白质的活性不应降低至未修饰菌株的0％。例如，与未修饰菌株的相比，可以保留1％或更高，5％或更高，10％或更高，15％或更高，17％或更高，20％或更高，30％或更高，或50％或更高的AcpP蛋白质的活性。特别地，AcpP蛋白质的活性也可以降至，例如，未修饰菌株的1％至90％，5％至80％，10％至70％，15％至60％，或17％至55％。此外，acpP基因的表达量不应降低至未修饰菌株的0％。例如，与未修饰菌株的相比，可以保留1％或更高，5％或更高，10％或更高，15％或更高，17％或更高，20％或更高，30％或更高，或50％或更高的acpP基因的表达量。特别地，acpP基因的表达量也可以降至，例如，未修饰菌株的1％至90％，5％至80％，10％至70％，15％至60％，或17％至55％。加以必要的变更，这样关于其中降低AcpP蛋白质的活性的情况的描述也适用于其中降低FabF蛋白质的活性的情况。
基因表达的降低可能是由于，例如，转录效率的降低、翻译效率的降低或其组合引起的。可以通过修饰基因的表达控制序列来降低基因的表达，所述基因的表达控制序列如启动子、Shine-Dalgarno(SD)序列(也称为核糖体-结合位点(RBS))以及RBS和起始密码子之间的间隔区。已知AcpP蛋白质为细胞中的富裕蛋白，且因此暗示野生型acpP基因启动子表现出高活性(非专利文献1)。因此，可例如通过用表现出较弱活性的启动子替换所述野生型acpP基因启动子而降低acpP基因的表达。表现出比野生型acpP基因启动子较弱活性的启动子的实例包括，例如lac启动子和俄罗斯专利公开No.2006/134574中的Ptac84启动子。修饰表达控制序列时，优选修饰表达控制序列的一个或多个核苷酸，更优选两个或更多个核苷酸，特别优选三个或更多个核苷酸。此外，可以删除部分或全部的表达控制序列。还可以通过，例如，操纵负责表达控制的因子，来降低基因的表达。负责表达控制的因子的实例包括负责转录或翻译控制的低分子(诱导子、抑制子等)、负责转录或翻译控制的蛋白质(转录因子等)、负责转录或翻译控制的核酸(siRNA等)，等等。此外，还可以通过，例如，将降低基因表达的突变引入基因的编码区中，来降低基因的表达。例如，可以通过用宿主中频率使用较低的同义密码子替代基因编码区域中的密码子来降低基因的表达。此外，例如，可以通过破坏基因来降低基因表达自身，如之后所述的。
acpP基因和fabF基因作为acpP-fabF操纵子共同转录。也可以使用自身启动子单独地转录fabF基因。此外，acpP基因也可以从yceD-rpmF-plsX-fabHDG-acpP-fabF基因簇中的fabD基因和fabG基因共同转录。因此，例如，通过修饰控制acpP-fabF操纵子共同转录的启动子，可以降低acpP基因和fabF基因的总表达。或者，例如，通过修饰fabF基因自身的启动子，可以独立地降低fabF基因的表达。此外，例如，通过修饰fabD基因和/或fabG基因的启动子，可以与fabD基因和/或fabG基因的表达一起降低acpP基因的表达。此外，例如，通过将减低基因表达的突变引入acpP基因和/或fabF基因的编码区中，可以降低acpP基因和/或fabF基因的表达。
此外，降低acpP基因和/或fabF基因表达的突变的特定实例包括，例如，用另一个碱基替代acpP基因的翻译起始位点上游-34位置的胞嘧啶(C)的突变。其他碱基优选是腺嘌呤(A)。
“acpP基因的翻译起始位点上游-34位置”是指从SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列中的acpP基因的起始密码子(ATG)的A计数的上游侧的第34个位置。起始密码子(ATG)的A的位置对应于位置+1，上游侧该位置旁边的位置是位置-1。换句话说，“acpP基因的翻译起始位点上游-34位置”表示对应于SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列的位置177(即，按照GenBank登录号NC_000913登记的大肠埃希氏菌K-12MG1655菌株的基因组序列的位置1150804)。“acpP基因的翻译起始位点上游-34位置”表示基于SEQ ID NO:7序列的相对位置，并且由于一个或多个核苷酸的删除、插入、添加等，绝对位置可以向前或向后移动。即，在SEQ ID NO:7序列中的位置177的核苷酸和起始密码子A之间删除一个核苷酸时，“acpP基因的翻译起始位点上游-34位置”表示从acpP基因的起始密码子的A计数，在上游侧的第33个位置。在SEQ ID NO:7序列的位置177的核苷酸和起始密码子A之间插入一个核苷酸时，“acpP基因的翻译起始位点上游-34位置”表示从acpP基因的起始密码子的A计数，在上游侧的第35个位置。
可以通过，例如，将细菌的acpP基因的上游序列与SEQ ID NO:7所示的acpP基因的上游序列进行比对，来确定任意细菌的acpP-fabF操纵子中哪个核苷酸对应于“acpP基因的翻译起始位点上游-34位置”的核苷酸。例如，可以使用已知的基因分析软件来进行这样的比对。这样的软件的特定实例包括由Hitachi Solutions生产的DNASIS，由Genetyx生产的GENETYX等等(Elizabeth C.Tyler等，Computers and Biomedical Research，24(1)72-96，1991，Barton GJ等，Journal of Molecular Biology，198(2)，327-37，1987)。
还可以通过，例如，破坏编码蛋白质的基因，来获得用于降低蛋白质活性的修饰。可以通过，例如，删除染色体上部分或全部的基因编码区来获得基因的破坏。此外，可以删除染色体上的整个基因，包括基因的上游和下游序列。待删除的区域可以是任何区域，如N-端区域、内部区域或C-端区域，只要可以降低蛋白质的活性。较长区域的删除通常可以更确定地灭活基因。此外，优选待删除区域的上游和下游序列的阅读框不同。
还可以通过，例如，将针对氨基酸置换的突变(错义突变)、终止密码子(无义突变)、添加或删除一个或两个核苷酸残基的移码突变等引入染色体上的基因编码区中，来获得基因的破坏(Journal of Biological Chemistry，272:8611-8617(1997)；Proceedings of the National Academy of Sciences，USA，955511-5515(1998)；Journal of Biological Chemistry，26116，20833-20839(1991))。
还可以通过，例如，将另一个序列插入染色体上的基因编码区中，来获得基因的破坏。插入的位点可以在基因的任何区域中，并且较长区域的插入通常更确定地灭活基因。优选，插入位点上游和下游序列的阅读框是不同的。其他序列没有特别限制，只要选择降低或消除所编码蛋白质的活性的序列，并且其实例包括，例如，标记基因，如抗生素抗性基因，和用于目标物质生产的基因。
可以通过，例如，制备缺陷型基因，其中删除基因的部分序列，使得其不能产生可以正常起作用的蛋白质，并且用含有缺陷型基因的重组DNA转化宿主，以引起缺陷型基因和染色体上的野生型基因之间的同源重组，并且由此缺陷型基因取代染色体上的野生型基因，从而获得以上所述的染色体上的基因的修饰。在这种程序中，如果将根据宿主的特征(如，营养缺陷型)选定的标记基因包含在重组DNA中，操作将变得容易。由缺陷型基因编码的蛋白质具有不同于野生型蛋白质的构象，即使产生了，并且由此其功能降低或消除。已经确定了这种基于利用同源重组的基因置换的基因破坏，并且存在使用线性DNA的方法，如称为“Red驱动整合”(Datsenko,K.A和Wanner,B.L.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97:6640-6645(2000))的方法，和利用Red驱动整合并结合使用源自λ噬菌体的切除系统的方法(Cho，E.H.，Gumport,R.I.，Gardner,J.F.，J.Bacteriol.，184:5200-5203(2002))(参见WO2005/010175)，使用具有温度敏感性复制起点的质粒的方法，使用能够接合转移的质粒的方法，利用不具有在宿主中起作用的复制起点的自杀载体的方法(美国专利No.6,303,383，日本专利公开(Kokai)No.05-007491)，等。
还可以通过，例如，诱变处理，来获得用于降低蛋白质活性的修饰。诱变处理的实例包括X-射线的照射、紫外线照射和使用突变剂的处理，所述突变剂如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、乙基甲烷磺酸盐(EMS)和甲基甲烷磺酸盐(MMS)。
当蛋白质作为由多个亚基组成的复合物起作用时，可以修饰多个亚基的一部分或全部，只要最终降低了蛋白质的活性。即，例如，可以破坏编码各自亚基的多个基因的一部分或全部等。此外，存在蛋白质的多种同工酶时，可以降低多种同工酶的一部分或全部的活性，只要最终降低了蛋白质的活性。即，例如，可以破坏编码各自同工酶的多个基因的一部分或全部等。
可以通过测量蛋白质的活性来证实蛋白质活性的降低。
还可以通过证实编码所述蛋白质的基因的表达降低来证实蛋白质活性的降低。可以通过证实基因转录量的降低或从基因表达的蛋白质量的降低来证实基因表达的降低。
可以通过将从所述基因转录的mRNA量与未修饰菌株中观察到的相比较，来证实基因转录量的降低。用于评价mRNA量的方法的实例包括Northern杂交、RT-PCR等等(Molecular Cloning(分子克隆)，Cold spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor(USA)，2001)。mRNA量可以降至，例如，未修饰菌株中观察到的90％或更低，80％或更低，70％或更低，60％或更低，55％或更低，50％或更低，30％或更低，20％或更低，10％或更低，5％或更低，或0％。然而，从apcP基因转录的mRNA的量不应降低至未修饰菌株的0％。例如，降低acpP基因的表达时，与未修饰菌株中观察到的相比，还可以保留1％或更高，5％或更高，10％或更高，15％或更高，17％或更高，20％或更高，30％或更高，或50％或更高含量的从所述基因转录的mRNA。特别地，acpP基因的表达降低时，从acpP基因转录的mRNA的量可以降至，例如，未修饰菌株的1％至90％，5％至80％，10％至70％，15％至60％，或17％至55％。
可以使用抗体通过Western印迹来证实蛋白质含量的降低(MolecularCloning(分子克隆)，Cold spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor(USA)，2001)。蛋白质含量可以降至，例如，未修饰菌株中观察到的90％或更低，80％或更低，70％或更低，60％或更低，55％或更低，50％或更低，30％或更低，20％或更低，10％或更低，5％或更低，或0％。然而，ApcP蛋白质的量不应降低至未修饰菌株的0％。例如，降低acpP基因的表达时，与未修饰菌株中观察到的相比，还可以保留1％或更高，5％或更高，10％或更高，15％或更高，17％或更高，20％或更高，30％或更高，或50％或更高含量的AcpP蛋白质。特别地，acpP基因的表达降低时，AcpP蛋白质的量可以降至，例如，未修饰菌株的1％至90％，5％至80％，10％至70％，15％至60％，或17％至55％。
根据用于破坏的方式，可以通过测定一部分或全部基因的核苷酸序列、基因的限制性酶图谱、全长等来证实基因的破坏。
除了acpP-fabF操纵子的减弱以外，上述用于降低蛋白质活性的方法适用于任意蛋白质的活性的降低，如催化产生目标L-氨基酸以外的化合物的目标L-氨基酸物合成路径的分支反应的酶，和任意基因的表达的降低，如编码那些任意蛋白质的基因。
<1-4>用于提高蛋白质活性的方法
下文，将解释用于提高蛋白质活性的方法。
表述“提高蛋白质的活性”意思是与未修饰菌株(如，野生型菌株和亲本菌株)相比，提高了每个细胞的蛋白质的活性。表述“提高蛋白质的活性”也表述为“增强蛋白质的活性”。特别地，表述“提高蛋白质的活性”意思是与未修饰菌株的那些相比，提高了每个细胞的蛋白质分子的数量，和/或提高了每个蛋白质分子的功能。即，表述“提高蛋白质的活性”中的术语“活性”不限于蛋白质的催化活性，而且还表示编码所述蛋白质的基因的转录量(mRNA的含量)，或基因的翻译量(蛋白质的含量)。此外，“提高蛋白质的活性”的状况不仅包括在本身具有目标蛋白质活性的菌株中提高目标蛋白质的活性的状况，而且还包括给予本身不具有目标蛋白质活性的菌株目标蛋白质活性的状况。此外，只要最终提高了蛋白质活性，可以降低或消除宿主中本身含有的目标蛋白质的活性，并且随后可以给予其合适类型的蛋白质。
尽管蛋白质活性的提高程度没有特别限制，只要与未修饰菌株相比提高了蛋白质的活性，但与未修饰菌株的相比，蛋白质活性可以提高，例如，1.5倍或更高，2倍或更高，或3倍或更高。此外，当未修饰菌株不具有目标蛋白质活性时，通过引入编码所述蛋白质的基因来产生所述蛋白质就足够了，并且例如，可以测量产生至酶活性程度的蛋白质。
例如，通过提高编码所述蛋白质的基因的表达，来获得提高蛋白质活性的修饰。“提高基因的表达”的状况也称为“增强基因的表达”。与未修饰菌株中观察到的相比，基因的表达可以提高1.5倍或更高，2倍或更高，或3倍或更高。此外，“提高基因的表达”的表述不仅包括在本身表达目标基因的菌株中提高了目标基因的表达量的状况，而且还包括将基因引入本身不表达目标基因的菌株中并且在其中表达的状况。即，短语“提高基因的表达”还表示，例如，将目标基因引入不具有该基因的菌株中，并且在其中表达。
可以通过，例如，提高基因的拷贝数，来提高基因的表达。
可以通过将基因引入宿主的染色体中来提高基因的拷贝数。可以通过，例如，使用同源重组，将基因引入染色体中(Miller，J.H.，Experiments inMolecular Genetics(分子遗传学实验)，1972，Cold Spring Harbor Laboratory)。可以只引入一个，或两个或多个基因拷贝。例如，使用存在于染色体上的多个拷贝中的序列作为目标，通过进行同源重组，可以将多个基因拷贝引入染色体中。这样存在于染色体上的多个拷贝中的序列的实例包括位于转座子两端的重复DNA和反向重复。或者，可以通过使用染色体上的合适序列，如用于目标物质生产必需的基因，作为目标，进行同源重组。可以通过，例如，使用线性DNA的方法，如Red-驱动整合(Datsenko，K.A.和Wanner，B.L.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97:6640-6645(2000))，使用具有温度敏感性复制起点的质粒的方法，使用能够接合转移的质粒的方法，使用不具有在宿主中起作用的复制起点的自杀载体的方法或使用噬菌体的转导方法。此外，还可以通过使用转座子或Mini-Mu，将基因随机引入染色体中(日本专利公开(Kokai)No.2-109985，美国专利No.5,882,888，EP 805867B1)。
可以使用具有与完整基因或其部分互补的序列的探针，通过Southern杂交，使用基于基因序列制备的引物的PCR等，来证实目标基因引入染色体中。
此外，还可以通过将含有所述基因的载体引入宿主中来提高基因的拷贝数。例如，可以通过将含有目标基因的DNA片段连接在宿主中起作用的载体，以构件基因的表达载体，并且用该表达载体转化宿主，从而提高目标基因的拷贝数。可以通过，例如，使用具有目标基因作为模板的微生物的基因组DNA的PCR，来获得包括目标基因的DNA片段。作为载体，可以使用在宿主细胞中可自主复制的载体。载体优选是多拷贝载体。此外，载体优选具有标记物，如用于转化体选择的抗生素抗性基因。此外，载体可以具有用于表达引入的基因的启动子和/或终止子。载体可以是，例如，源自细菌质粒的载体，源自酵母质粒的载体，源自噬菌体的载体，粘粒，嗜菌粒等等。在属于肠杆菌科的细菌(如，大肠埃希氏菌)中可自主复制的载体的特定实例包括，例如，pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、pBR322、pSTV29(全部这些可以从Takara Bio获得)、pACYC184、pMW219(NIPPON GENE)、pTrc99A(Pharmacia)、pPROK系列载体(Clontech)、pKK233-2(Clontech)、pET系列载体(Novagen)、pQE系列载体(QIAGEN)，和宽宿主范围载体RSF1010。
引入基因时，通过本发明的细菌可表达地携带基因就足够了。特别地，引入基因使得在本发明的细菌中起作用的启动子序列控制下表达就足够了。启动子可以是源自宿主的启动子，或异源启动子。启动子可以是待引入基因的天然启动子，或另一个基因的启动子。作为启动子，例如，也可以使用如之后提及的较强启动子。此外，例如，用于基因转录终止的终止子可以位于基因的下游。终止子没有特别限制，只要其在本发明的细菌中起作用。终止子可以是源自宿主的终止子，或是异源终止子。终止子可以是待引入基因的天然终止子，或是另一个基因的终止子。终止子的特定实例包括，例如，T7终止子、T4终止子、fd噬菌体终止子、tet终止子和trpA终止子。可用于各种微生物中的载体、启动子和终止子详细公开于“Fundamental Microbiology(基础微生物学)Vol.8，Genetic Engineering，KYORITSU SHUPPAN CO.，LTD，1987”，并且可以使用那些。
此外，引入两个或更多个基因时，通过本发明的细菌可表达地携带每个基因就足够了。例如，通过单个表达载体或染色体携带所有基因。此外，可以通过两个或更多个表达载体分开携带基因，或通过单个或两个或更多个表达载体或染色体分开携带基因。还可以引入由两个或多个基因组成的操纵子。
待引入的基因没有特别限制，只要其编码在宿主中起作用的蛋白质。待引入的基因可以是源自宿主的基因，或可以是异源基因。例如，可以通过使用基于基因的核苷酸序列设计的引物和具有基因的生物体的基因组DNA或携带基因的质粒作为模板的PCR，来获得待引入的基因。待引入的基因还可以是全部合成的，例如，基于基因的核苷酸顺序(Gene，60(1)，115-127(1987))。
此外，当蛋白质作为由多个亚基组成的复合物起作用时，可以修饰多个亚基的一部分或全部，只要最终提高了蛋白质的活性。即，例如，通过提高基因的表达来提高蛋白质的活性时，可以增强编码亚基的多个基因的一部分或全部的表达。通常优选增强编码亚基的多个基因的全部的表达。此外，组成复合物的亚基可以源自单种生物体或两种或多种生物体，只要复合物具有目标蛋白质的功能。即，例如，可以将编码多个亚基的相同生物体的基因引入宿主中，或将编码多个亚基的不同生物体的基因引入宿主中。
此外，可以通过提高基因的转录效率来提高基因的表达。可以通过，例如，用较强的启动子替代染色体上的基因的启动子，来提高基因的转录效率。“较强的启动子”意思是与固有存在的基因的野生型启动子相比，提供了提高的基因转录的启动子。较强的启动子的实例包括，例如，已知的高表达启动子，如T7启动子、trp启动子、lac启动子、tac启动子、thr启动子、trc启动子、tet启动子、araBAD启动子、rpoH启动子、PR启动子和PL启动子。此外，作为较强的启动子，还可以通过使用各种报告基因来获得现有启动子的高活性类型。例如，通过在接近于共有序列的启动子区域中形成-35和-10区域，可以增强启动子的活性(WO00/18935)。高活性类型启动子的实例包括各种tac-样启动子(Katashkina JI等，俄罗斯联邦专利申请No.2006134574)和pnlp8启动子(WO2010/027045)。用于评价启动子的强度的方法和强启动子的实例描述于Goldstein等的论文中(Prokaryotic Promoters inBiotechnology(生物技术中的原核生物启动子)，Biotechnol.Annu.Rev.，1，105-128(1995))，等等。
此外，还可以通过提高基因的翻译效率来提高基因的表达。可以通过，例如，用较强的SD序列替代针对染色体上的基因的Shine-Dalgarno(SD)序列(也称为核糖体结合位点(RBS))，来提高基因的翻译效率。“较强的SD序列”意思是与固有存在的基因的野生型SD序列相比，提供了提高的mRNA翻译的SD序列。较强的SD序列的实例包括，例如，源自噬菌体T7的基因10的RBS(Olins P.O.等，Gene，1988，73，227-235)。此外，已知在RBS和起始密码子之间的间隔区域中，尤其是就在起始密码子(5’-UTR)上游的序列中，几个核苷酸的置换、插入或删除，显著影响mRNA的稳定性和翻译效率，并且因此，也可以通过修饰它们来提高基因的翻译效率。
在本发明中，影响基因表达的位点，如启动子、SD序列以及RBS和起始密码子之间的间隔区，也总称为“表达控制区”。可以通过使用启动子搜寻载体或基因分析软件，如GENETYX，来鉴定表达控制区。可以通过，例如，使用温度敏感性载体的方法或Red驱动整合方法(WO2005/010175)，来修饰这样的表达控制区。
还可以通过，例如，修饰密码子，来提高基因的翻译效率。在大肠埃希氏菌等中，在mRNA分子群内发现的61个氨基酸密码子中存在明显的密码子偏爱，并且同源tRNA的水平显示出与密码子使用的频率成正比(Kane，J.F.，Curr.Opin.Biotechnol.，6(5)，494-500(1995))。即，如果存在大量的含有过量罕见密码子的mRNA，反应问题可能增多。根据最近的研究，表明AGG/AGA、CUA、AUA、CGA或CCC密码子簇尤其可能同时降低合成的蛋白质的数量和质量。尤其在异源基因表达时会出现这样的问题。因此，在基因异源表达等的情况中，可以通过用更常使用的同义密码子替代基因中存在的罕见密码子，来提高基因的翻译效率。例如，可以通过针对将目标突变引入目标DNA位点的位点特异性突变方法，来替代密码子。位点特异性突变方法的实例包括利用PCR的方法(Higuchi，R.，61，见PCR Technology(PCR技术)，Erlich,H.A.编辑，Stockton Press(1989)；Carter，P.，Meth.in Enzymol.，54，382(1987))，和利用噬菌体的方法(Kramer，W.和Frits,H.J.，Meth.in Enzymol.，154，350(1987)；Kunkel，T.A.等，Meth.in Enzymol.，154，367(1987))。或者，其中目标密码子被替代的基因片段可以全部合成。各种生物体中的密码子频率公开于“密码子使用数据库”(http://www.kazusa.or.jp/codon；Nakamura，Y.等，Nucl.Acids Res.，28，292(2000))。
此外，还可以通过扩增提高基因表达的调控子，或删除或减弱降低基因表达的调控子，来提高基因的表达。
如上提及的用于提高基因表达的方法可以单独使用或任意结合。
此外，还可以通过，例如，增强酶的特定活性，来获得提高蛋白质活性的修饰。特定活性的增强还包括反馈抑制的降低或消除。可以通过，例如，搜寻各种生物体，来获得显示出增强的特定活性的蛋白质。此外，也可以通过将突变引入现有蛋白质中，来获得现有蛋白质的高活性类型。待引入的突变可以是，例如，蛋白质的一个或几个位置的一个或几个氨基酸残基的置换、删除、插入或添加。可以通过，例如，如上所述的位点特异性突变方法，来引入突变。还可以通过，例如，诱变处理，来引入突变。诱变处理的实例包括X-射线照射、紫外线照射和使用突变剂的处理，所述突变剂如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、乙基甲烷磺酸酯(EMS)和甲基甲烷磺酸酯(MMS)。此外，可以通过在体外用羟胺直接处理DNA来诱导随机突变。特定活性的增强可以单独使用，或可以与如上所述的用于增强基因表达的方法任意组合。
用于转化的方法没有特别限制，并且可以使用通常已知的方法。例如，可以使用用氯化钙处理受体细胞的方法，使得提高其对DNA的渗透性，针对大肠埃希氏菌K-12菌株已经进行了报道(Mandel，M.和Higa,A.，J.Mol.Biol.，1970，53，159-162)，以及从生长期细胞制备全能细胞，接着用DNA转化的方法，针对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)已经进行了报道(Duncan，C.H.，Wilson，G.A.和Young,F.E.，Gene，1977，1:153-167)。或者，还可以使用将DNA-受体细胞制成原生质体或原生质球状体的方法，其可以容易地吸收重组DNA，结合将重组DNA引入DNA-受体细胞中，已知该方法适用于枯草芽孢杆菌、放线菌类和酵母(Chang，S.和Choen，S.N.，1979，Mol.Gen.Genet.，168:111-115；Bibb，M.J.，Ward,J.M.和Hopwood，O.A.，1978，Nature，274:398-400；Hinnen，A.，Hicks，J.B.和Fink，G.R.，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75:1929-1933)。此外，也可以使用针对棒状细菌报道的电脉冲方法(日本专利公开(Kokai)No.2-207791)。
可以通过测量蛋白质的活性来证实蛋白质活性的提高。
还可以通过证实编码蛋白质的基因的表达的提高来证实蛋白质活性的提高。可以通过证实基因的转录量的提高，或通过证实从所述基因表达的蛋白质量的提高，来证实基因表达的提高。
可以通过将从所述基因转录的mRNA量与在未修饰的菌株(如，野生型菌株或亲本菌株)中观察到的相比较，来证实基因转录量的提高。用于评价mRNA量的方法的实例包括Northern杂交、RT-PCR等等(Sambrook，J.等，Molecular Cloning A Laboratory Manual(分子克隆实验室手册)/第三版，Coldspring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor(USA)，2001)。与未修饰菌株相比，mRNA含量可以提高，例如，1.5倍或更高，2倍或更高，或3倍或更高。
可以使用抗体，通过Western印迹，证实蛋白质含量的提高(MolecularCloning(分子克隆)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor(USA),2001)。与未修饰菌株相比，蛋白质含量可以提高，例如，1.5倍或更高，2倍或更高，或3倍或更高。
上述用于提高蛋白质活性的方法适用于任意蛋白质的活性的增强，如L-氨基酸生物合成酶，和任意基因的表达的增强，如编码那些任意蛋白质的基因。
<2>用于生产本发明的L-氨基酸的方法
本发明的方法是用于生产L-氨基酸方法，其包括在培养基中培养本发明的细菌，以在细菌的培养基或细胞中产生并累积L-氨基酸，并且从培养基或细胞收集L-氨基酸。在本发明中，可以生产单种L-氨基酸，或可以生产两种或多种L-氨基酸。
待使用的培养基没有特别限制，只要本发明的细菌在其中可以增殖，并且可以产生目标L-氨基酸。作为培养基，例如，可以使用用于微生物(如，细菌)培养的常用培养基。培养基可以含有碳源、氮源、磷源和硫源，以及按照需要，选自其他各种有机成分和无机成分的成分。可以根据各种条件，如待使用的细菌类型，和待生产的L-氨基酸的类型，来合适地设定培养基成分的类型和浓度。
碳源没有特别限定，只要本发明的细菌可以利用选定的碳源并产生L-氨基酸。碳源的特定实例包括，例如，糖类，如葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、赤糖糊糖蜜、淀粉水解产物和生物质的水解产物，有机酸，如醋酸、富马酸、柠檬酸、琥珀酸和苹果酸，醇类，如甘油、粗制甘油和乙醇，以及脂肪酸。作为碳源，可以使用单种碳源，或可以结合使用两种或更多种碳源。
培养基中碳源的浓度没有特别限定，至少本发明的细菌可以增殖，并且产生L-氨基酸。优选使得培养基中的碳源浓度尽可能高，以在L-氨基酸产生不受抑制的范围中。培养基中的碳源初始浓度通常在5至30％(W/V)的范围中，优选10至20％(W/V)。此外，根据随着发酵进展的碳源的消耗，可以增补性地添加碳源。
氮源的特定实例包括，例如，铵盐，如硫酸铵、氯化铵和磷酸铵，有机氮源，如蛋白胨、酵母提取物、肉提取物和大豆蛋白分解产物，氨和脲。用于调节pH的氨气或氨水也可以用作氮源。作为氮源，可以使用单种氮源，或可以结合使用两种或更多种氮源。
磷酸盐来源的特定实例包括，例如，磷酸盐，如磷酸二氢钾和磷酸氢二钾，以及磷酸聚合物，如焦磷酸。作为磷酸盐来源，可以使用单种磷酸盐来源，或可以结合使用两种或更多种磷酸盐来源。
硫源的特定实例包括，例如，无机硫化合物，如硫酸盐、硫代硫酸盐和亚硫酸盐，以及含硫氨基酸，如半胱氨酸、胱氨酸和谷胱甘肽。作为硫源，可以使用单种硫源，或可以结合使用两种或更多种硫源。
其他各种有机成分和无机成分的实例包括，例如，无机盐，如氯化钠和氯化钾；微量元素，如铁、锰、镁和钙；维生素，如维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸、烟酰胺和维生素B12；氨基酸；核酸；和含有这些的有机成分，如蛋白胨、酪蛋白氨基酸、酵母提取物和大豆蛋白分解产物。作为其他各种有机成分和无机成分，可以使用单种成分，或可以结合使用两种或多种成分。
此外，使用需要氨基酸等用于其生长的营养缺陷型突变株时，优选给培养基补充需要的营养素。例如，在许多L-赖氨酸生产细菌中，增强L-赖氨酸生物合成途径并减弱L-赖氨酸降解能力。因此，培养这样的L-赖氨酸生产细菌时，例如，优选将选自L-苏氨酸、L-同型丝氨酸、L-异亮氨酸和L-甲硫氨酸的一种或多种氨基酸加入培养基中。
此外，还优选将合适量的商业可购得的消泡剂加入培养基中，以抑制培养过程中的起泡。
培养条件没有特别限定，只要本发明的细菌可以增殖，并且产生L-氨基酸。例如，可以在用于培养微生物(如，细菌)的常用条件下，进行培养。可以根据各种条件，如待使用的细菌的类型和待产生的L-氨基酸的类型，来合适地设定培养条件。
可以通过使用液体培养基来进行培养。对于培养，可以将在固体培养基(如，琼脂培养基)上培养的本发明的细菌直接引入液体培养基中，或将在液体培养基中作为种子培养物培养的本发明的细菌引入用于主培养的液体培养基中。即，可以作为分开的种子培养和主培养来进行培养。培养开始时在培养基中含有的本发明的细菌的含量没有特别限制。例如，在培养开始时，可以将显示出4至8的OD660的种子培养物以0.1至30质量％，优选1至10质量％的含量加入用于主培养的培养基中。
可以作为分批培养、流加-分批培养、连续培养，或这些的组合来进行培养。此外，作为分开的种子培养和主培养进行培养时，种子培养和主培养的培养条件可以相同或不同。例如，种子培养和主培养都可以作为分批培养来进行。或者，例如，种子培养可以作为分批培养来进行，而主培养可以作为流加-分批培养或连续培养来进行。
例如，培养可以需氧地进行。例如，可以作为通气培养或振荡培养来进行培养。可以将氧浓度控制为例如5至50％，优选约10％的饱和氧浓度。培养基pH可以为例如3至10，优选4.0至9.5。可以在培养过程中按照需要调节培养基的pH。可以通过使用各种碱和酸性物质，如氨气、氨水、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、碳酸镁、氢氧化钠、氢氧化钙和氢氧化镁，来调节培养基的pH。培养温度可以为，例如，20至45℃，优选25至37℃。培养时间可以为，例如，1小时或更长，4小时或更长，10小时或更长，或15小时或更长，并且可以为168小时或更短，120小时或更短，90小时或更短，或72小时或更短。特别地，培养时间段可以为，例如，10至120小时。例如，可以持续培养，直至培养基中所含的碳源被消耗，或直至本发明的细菌的活性丢失。通过在这样的条件下培养本发明的细菌，在细胞和/或培养基中累积L-氨基酸。
此外，生产L-谷氨酸时，可以进行培养，同时通过使用调节至满足L-谷氨酸沉淀条件的培养基来沉淀培养基中的L-谷氨酸。L-谷氨酸沉淀的条件的实例包括，例如，5.0至3.0的pH，优选pH 4.9至3.5，更优选pH 4.9至4.0，特别优选约pH 4.7(欧洲专利公开No.1078989)。培养的全部时间段或部分时间段可以在上述pH下进行。“部分时间段”可以是，例如，全部培养时间段的50％或更多，70％或更多，80％或更多，90％或更多，95％或更多，或99％或更多。
生产碱性氨基酸(如，L-赖氨酸)时，可以使用其中通过使用碳酸氢盐离子和/或碳酸盐离子作为用于碱性氨基酸的主要反离子的发酵来生产碱性氨基酸的方法(日本专利公开(Kokai)No.2002-65287，美国专利公开申请No.20020025564，EP 1813677A)。通过这样的方法，可以生产碱性氨基酸，同时降低待使用的硫酸盐离子和/或氯化物离子的含量，这两种离子通常用作用于碱性氨基酸的反离子。
可以通过用于检测或鉴定化合物的已知方法来证实L-氨基酸的产生。这样的方法的实例包括，例如，HPLC、LC/MS、GC/MS和NMR。这些方法可以适当的结合使用。
可以通过用于分离和纯化化合物的已知方法来收集所产生的L-氨基酸。这样的方法的实例包括，例如，离子交换生树脂方法、膜处理方法、沉淀方法和结晶方法。这些方法可以适当的结合使用。当L-氨基酸在细胞中累积时，可以用例如超声波等破坏细胞，并且随后可以通过离子交换树脂方法等从上清液中收集L-氨基酸，所述上清液通过离心从细胞破坏的悬浮液除去细胞来获得。待收集的L-氨基酸可以是游离化合物、其盐，或其混合物。盐的实例包括，例如，硫酸盐、盐酸盐、碳酸盐、铵盐、钠盐和钾盐。L-赖氨酸可以是，例如，游离形式的L-赖氨酸、L-赖氨酸的盐酸盐、L-赖氨酸的碳酸盐，或其混合物。此外，L-谷氨酸可以是，例如，游离形式的L-谷氨酸、L-谷氨酸单钠(MSG)、L-谷氨酸单铵，或其混合物。
此外，当L-氨基酸在培养基中沉淀时，可以通过离心、过滤等来进行收集。可以在培养基中溶解的L-氨基酸结晶后，一起分离培养基中沉淀的L-氨基酸和培养基中溶解的L-氨基酸。
收集的L-氨基酸除了L-氨基酸以外，可以含有，例如，细菌细胞、培养基成分、水分和细菌的副产物代谢物。收集的L-氨基酸的纯度可以是，例如，30％(w/w)或更高，50％(w/w)或更高，70％(w/w)或更高，80％(w/w)或更高，90％(w/w)或更高，或95％(w/w)或更高(JP1214636B、USP5,431,933、USP4,956,471、USP4,777,051、USP4,946,654、USP5,840,358、USP6,238,714、US2005/0025878)。
本发明方法的实施方案可以是用于生产L-赖氨酸的方法，其包括：在培养基中培养具有L-赖氨酸生产能力的大肠埃希氏菌，以在大肠埃希氏菌的培养基或细胞中产生并累积L-赖氨酸；和从培养基或细胞收集L-赖氨酸，其中已经通过修饰基因的表达控制序列，减弱了大肠埃希氏菌中acpP-fabF操纵子的基因的表达。本发明的方法的实施方案还可以是用于生产L-赖氨酸的方法，其包括：在培养基中培养具有L-赖氨酸生产能力的大肠埃希氏菌，以在大肠埃希氏菌的培养基或细胞中产生并累积L-赖氨酸；和从培养基或细胞收集L-赖氨酸，其中已经在大肠埃希氏菌中用另一个碱基替代了acpP基因的比翻译起始位点靠上游的位置-34的胞嘧啶。本发明的方法的实施方案还可以是用于生产L-赖氨酸的方法，其包括：在培养基中培养具有L-赖氨酸生产能力的大肠埃希氏菌，以在大肠埃希氏菌的培养基或细胞中产生并累积L-赖氨酸；和从培养基或细胞收集L-赖氨酸，其中已经在大肠埃希氏菌中用腺嘌呤替代了acpP基因的比翻译起始位点靠上游的位置-34的胞嘧啶。加以必要的变更，以上关于本发明的细菌和本发明的方法的描述适用于这些实施方案。
实施例
下文，将参照实施例更具体地解释本发明。
实施例1：显示出降低的acpP和fabF基因表达的L-赖氨酸生产细菌的构建(1)
作为L-赖氨酸生产细菌，使用了大肠埃希氏菌WC196ΔcadAΔldc菌株(FERM BP-11027，WO2010/061890，下文中也称为WC196LC菌株)。通过使用称为“Red-驱动整合”的方法，在由菌株的acpP基因和fabF基因组成的acpP-fabF操纵子的上游引入点突变，该方法首先是由Datsenko和Wanner研发的(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，vol.97，No.12，pp.6640-6645)。根据这种方法，通过使用合成寡核苷酸获得的PCR产物，可以一步构建引入突变的菌株，其中在5’端一侧设计对应于目标基因的序列，并且在3’端一侧设计对应于抗生素抗性基因的序列。以下显示了程序。
通过使用大肠埃希氏菌MG1655菌株(ATCC 47076)的染色体DNA作为模板以及如SEQ ID NO:1和2所示的合成寡核苷酸作为引物来进行PCR。SEQ ID NO:1的引物具有对应于引物5’端的质粒pMW118(λattL-Kmr-λattR)(WO2006/093322)的BglII位点周围序列的序列和对应于引物3’端的acpP基因的上游序列一部分的序列。SEQ ID NO:2的引物具有对应于引物5’端的质粒pMW118(λattL-Kmr-λattR)(WO2006/093322)的BglII位点周围序列的序列和对应于引物3’端的fabF基因的下游序列一部分的序列。通过使用In-Fusion HD克隆试剂盒(TAKARA BIO)，将所获得的DNA片段连接用限制性酶BglII处理过的载体pMW118(λattL-Kmr-λattR)。通过使用In-Fusion反应混合物，转化了大肠埃希氏菌JM109菌株。在含有50mg/L卡那霉素的L-琼脂培养基上选择转化体。从转化体提取质粒，并且证实了目标片段的插入。将这种质粒称为pMW118(λattL-Kmr-λattR)-acpP-fabF。
通过使用pMW118(λattL-Kmr-λattR)-acpP-fabF作为模板，SEQ ID NO:3和4所示的合成寡核苷酸作为引物，和QuikChange定点诱变试剂盒(AgilentTechnologies)，构建了引入了点突变的质粒。这种突变用腺嘌呤替代了位于acpP基因翻译起始位点的上游34个碱基的胞嘧啶。将这种质粒称为pMW118(λattL-Kmr-λattR)-acpP*-fabF。
通过使用pMW118(λattL-Kmr-λattR)-acpP*-fabF作为模板，以及SEQ IDNO:5和6所示的合成寡核苷酸作为引物，进行了PCR。根据美国专利公开申请No.2006/0160191和WO2005/010175中描述的λ-Red方法，通过使用所获得的DNA片段，从大肠埃希氏菌WC196LC菌株构建了WC196LCacpP*菌株。在WC196LCacpP*菌株中，用腺嘌呤替代了位于acpP基因的翻译起始位点的上游34个碱基的胞嘧啶。在λ-Red方法中，通过在37℃下在含有50mg/L卡那霉素的L-琼脂培养基上进行平板培养，并且选择卡那霉素抗性重组体，获得了卡那霉素抗性重组体。
用质粒pCABD2(美国专利No.6,040,160)转化WC196LCacpP*菌株，并且在含有20mg/L链霉素的L-琼脂培养基上选择转化体，以获得WC196LCacpP*/pCABD2菌株。质粒pCABD2含有源自大肠埃希氏菌并且编码具有对L-赖氨酸反馈抑制脱敏的突变的二氢吡啶二羧酸合成酶(DDPS)的突变dapA基因，源自大肠埃希氏菌并且编码具有对L-赖氨酸反馈抑制脱敏的突变的天冬氨酸激酶III的突变lysC基因，源自大肠埃希氏菌并且编码二氢吡啶二羧酸还原酶的dapB基因和源自乳酸发酵短杆菌并且编码二氨基庚二酸脱氢酶的ddh基因。
实施例2：L-赖氨酸生产培养(1)
通过使用制备的WC196LCacpP*/pCABD2菌株进行了L-赖氨酸生产培养。在37℃下在含有20mg/L链霉素的L-培养基上培养菌株，直至OD600变成约0.6，并且加入体积等于培养基体积的40％甘油溶液，并且搅拌混合物。然后，将混合物分成合适的体积，并且保存在-80℃下，作为甘油储液。
将WC196LCacpP*/pCABD2菌株的甘油储液均匀地加入含有20mg/L链霉素的L-琼脂培养基中，并且在37℃下培养24小时。在含有20mg/L链霉素的L-琼脂培养基上相似地培养WC196LC/pCABD2菌株，其是通过将pCABD2引入WC196LC菌株获得的对照菌株。将生长的细胞悬浮于3.0mL表1中所示的L-赖氨酸生产培养基(MS-Glc培养基)中，并且用相同的培养基稀释所获得的悬浮液，使得悬浮液的OD600变成15。将所获得的1.0mL体积的稀释悬浮液接种于含有20mg/L链霉素并且包含在500mL-体积Sakaguchi烧瓶中的L-赖氨酸生产培养基中，并且通过使用往复式振荡培养装置，在37℃下进行培养。在培养开始后四十八小时，定量了残余葡萄糖和所产生的L-赖氨酸的含量。
[表1]
表1：L-赖氨酸生产培养基(MS-Glc培养基)
用KOH将培养基调节至pH7.0，并且在115℃下高压灭菌10分钟，只要葡萄糖和MgSO4·7H2O与其他成分分开高压灭菌。在热空气灭菌后，加入CaCO3。
培养48小时后获得的残余葡萄糖浓度和所获得的L-赖氨酸累积浓度显示于表2中。与对照菌株WC196LC/pCABD2相比，使用其中降低了acpP和fabF基因表达的WC196CacpP*/pCABD2菌株，很大程度地提高了L-赖氨酸产量。
[表2]
表2：培养48小时后残余的葡萄糖浓度和所获得的L-赖氨酸累积浓度
实施例3：通过RT-PCR证实acpP基因的表达量(1)
在按照实施例2中所述的相同条件下各自培养WC196CacpP*/pCABD2菌株和WC196LC/pCABD2菌株，并且在培养17小时后对培养液取样。通过使用RNAprotect细菌试剂(Qiagen)和RNeasy迷你试剂盒(Qiagen)，从培养液提取RNA。通过使用所获得的RNA作为模板并且通过使用PrimeScriptRT试剂试剂盒(TAKARA Bio)，进行了逆转录PCR。通过使用所获得的cDNA作为模板，以及SEQ ID NO:13和14所示的合成寡核苷酸和SEQ ID NO:15和16所示的合成寡核苷酸作为引物，并且通过使用Power SYBR GreenPCR Master Mix(Applied Biosystems)，进行了定量PCR。SEQ ID NO:13和14显示的寡核苷酸各自对应于acpP基因的核苷酸序列。SEQ ID NO:15和16显示的寡核苷酸各自对应于rrsA(16s rRNA)的ORF的内部序列。通过使用rrsA(16s rRNA)作为内标，计算了acpP基因的mRNA量。
培养17小时后获得的acpP基因的mRNA量显示于表3中。数据显示为设定为1的WC196LC/pCABD2菌株中的acpP基因的mRNA量的相对值。与对照菌株WC196LC/pCABD2相比，WC196CacpP*/pCABD2菌株中acpP基因的mRNA量显著降低。
[表3]
表3：培养17小时后获得的acpP基因的mRNA量
实施例4：表现出降低的acpP和fabF基因表达的L-赖氨酸生产菌的构建(2)
作为L-赖氨酸生产菌株，使用WC196LC菌株。通过“Red-驱动整合”方法用Ptac84启动子(俄罗斯专利公开No.2006/134574)或lac启动子替代由菌株的acpP和fabF基因组成的acpP-fabF操纵子上游区。所要替代的区域可以是离acpP-fabF操纵子转录起始位点上游-200至-1区域的一部分或全部。例如，可以替代离acpP-fabF操纵子转录起始位点上游-100至-1，-50至-1，-30至-1或-30至-10的区域。
此后，通过用Ptac84启动子替代acpP-fabF操纵子上游区域而从WC196LC菌株获得的菌株命名为WC196LCPtac84acpP菌株，而通过用lac启动子替代acpP-fabF操纵子上游区域而从WC196LC菌株获得的菌株命名为WC196LCPlacacpP菌株。
WC196LCPtac84acpP菌株和WC196LCPlacacpP菌株用质粒pCABD2转化，且在含有20mg/L链霉素的L-琼脂培养基上选择转化体，以获得WC196LCPtac84acpP/pCABD2菌株和WC196LCPlacacpP/pCABD2菌株。
实施例5：L-赖氨酸生产培养(2)
根据实施例2所述的方法通过使用实施例4中获得的WC196LCPtac84acpP/pCABD2菌株和WC196LCPlacacpP/pCABD2菌株进行L-赖氨酸生产培养，WC196LC/pCABD2菌株作为对照菌株。
实施例6：通过RT-PCR证实acpP基因的表达量(2)
实施例4中获得的WC196LCPtac84acpP/pCABD2菌株和WC196LCPlacacpP/pCABD2菌株，和WC196LC/pCABD2菌株在实施例2所述的条件下各自培养，通过使用实施例3所述的方法计算acpP基因的mRNA的量。
实施例7：表现出降低的acpP和fabF基因表达的L-苏氨酸生产菌的构建
作为L-苏氨酸生产菌株，使用大肠杆菌TDH-6菌株(日本专利申请案公开(Kokai)No.2011-346578)。所述TDH-6菌株可通过处理质粒pVIC40(日本专利申请案公开(Kokai)No.2011-346578)而从大肠杆菌TDH-6/pVIC菌株(VKPM B-3996)而获得。通过使用实施例1所述的方法用腺嘌呤替代位于TDH-6菌株的acpP基因转录起始位点上游34个碱基的胞嘧啶。或者，通过使用实施例4所述的方法用Ptac84启动子或lac启动子替代TDH-6菌株的acpP-fabF操纵子的上游区域。所要替代的区域可以是离acpP-fabF操纵子转录起始位点上游-200至-1区域的一部分或全部。例如，可以替代离acpP-fabF操纵子转录起始位点上游-100至-1，-50至-1，-30至-1或-30至-10的区域。
此后，通过用腺嘌呤替代位于acpP基因转录起始位点上游34个碱基处的胞嘧啶而从TDH-6菌株获得的菌株命名为TDH-6acpP*，通过用Ptac84启动子替代acpP-fabF操纵子上游区域而从TDH-6菌株获得的菌株命名为TDH-6Ptac84acpP菌株，而通过用lac启动子替代acpP-fabF操纵子上游区域而从TDH-6菌株获得的菌株命名为TDH-6PlacacpP菌株。
TDH-6acpP*菌株，TDH-6Ptac84acpP菌株以及TDH-6PlacacpP菌株用质粒pVIC40(美国专利No.5705371)转化，以分别获得TDH-6acpP*/pVIC40菌株，TDH-6Ptac84acpP/pVIC40菌株以及TDH-6PlacacpP/pVIC40菌株。
实施例8：L-苏氨酸生产培养(2)
根据美国专利No.7915018所述的方法通过使用实施例7中获得的TDH-6acpP*/pVIC40菌株，TDH-6Ptac84acpP/pVIC40菌株以及TDH-6PlacacpP/pVIC40菌株进行L-苏氨酸生产培养，TDH-6/pVIC40菌株作为对照菌株。
实施例9：通过RT-PCR证实acpP基因的表达量(3)
根据美国专利No.7915018所述的方法通过使用实施例7中获得的TDH-6acpP*/pVIC40菌株，TDH-6Ptac84acpP/pVIC40菌株以及TDH-6PlacacpP/pVIC40菌株进行L-苏氨酸生产培养，TDH-6/pVIC40菌株作为对照菌株，且根据实施例3所述的方法通过使用肉汤培养基计算acpP基因的mRNA的量。
工业实用性
根据本发明，可以改善细菌的L-氨基酸生产能力，且可以有效生产L-氨基酸。
<序列表的解释>
SEQ ID NO:1至6，引物
SEQ ID NO:7，大肠埃希氏菌MG1655的acpP-fabF操纵子的核苷酸序列及其上游序列
SEQ ID NO:8，大肠埃希氏菌MG1655的AcpP蛋白质的氨基酸序列
SEQ ID NO:9，大肠埃希氏菌MG1655的FabF蛋白质的氨基酸序列
SEQ ID NO:10：菠萝泛菌AJ13355的acpP-fabF操纵子的核苷酸序列及其上游序列
SEQ ID NO:11：菠萝泛菌AJ13355的AcpP蛋白质的氨基酸序列
SEQ ID NO:12：菠萝泛菌AJ13355的FabF蛋白质的氨基酸序列
SEQ ID NO:13至16，引物
Claims (14)
1.一种用于生产L-氨基酸的方法，其包括：
在培养基中培养属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)并具有L-氨基酸生产能力的细菌，以在细菌的培养基或细胞中产生并累积L-氨基酸；和
从培养基或细胞收集L-氨基酸；
其中细菌已经进行了修饰，使得acpP-fabF操纵子减弱。
2.根据权利要求1的方法，其中所述acpP-fabF操纵子的减弱指由acpP-fabF操纵子的基因编码的蛋白质的活性的下降。
3.根据权利要求1或2的方法，其中通过减弱acpP-fabF操纵子的基因的表达来减弱acpP-fabF操纵子。
4.根据权利要求3的方法，其中通过修饰基因的表达控制序列来减弱acpP-fabF操纵子的基因的表达。
5.根据权利要求2至4任一项的方法，其中acpP-fabF操纵子的基因由acpP基因和/或fabF基因组成。
6.根据权利要求5的方法，其中acpP-fabF操纵子的基因由由acpP基因和fabF基因组成。
7.根据权利要求3至6任一项的方法，其中通过用另一个碱基替代acpP基因的比翻译起始位点靠上游的位置-34的胞嘧啶来减弱acpP-fabF操纵子的基因的表达。
8.根据权利要求7的方法，其中通过用腺嘌呤替代acpP基因的比翻译起始位点靠上游的位置-34的胞嘧啶来减弱acpP-fabF操纵子的基因的表达。
9.根据权利要求1至8任一项的方法，其中细菌是属于埃希氏菌属(Escherichia)、泛菌属(Pantoea)或肠杆菌属(Enterobacter)的细菌。
10.根据权利要求9的方法，其中细菌是大肠埃希氏菌(Escherichia coli)。
11.根据权利要求1至10任一项的方法，其中L-氨基酸是L-赖氨酸。
12.一种用于生产L-赖氨酸的方法，其包括：
在培养基中培养具有L-赖氨酸生产能力的大肠埃希氏菌，以在该大肠埃希氏菌的培养基或细胞中产生并累积L-赖氨酸；和
从培养基或细胞收集L-赖氨酸；
其中该大肠埃希氏菌中的acpP-fabF操纵子的基因的表达已通过修饰该基因的表达调控序列而减弱。
13.一种用于生产L-赖氨酸的方法，其包括：
在培养基中培养具有L-赖氨酸生产能力的大肠埃希氏菌，以在该大肠埃希氏菌的培养基或细胞中产生并累积L-氨基酸；和
从培养基或细胞收集L-赖氨酸；
其中该大肠埃希氏菌中的acpP基因的比翻译起始位点靠上游的位置-34的胞嘧啶已用其他碱基替代。
14.一种用于生产L-赖氨酸的方法，其包括：
在培养基中培养具有L-赖氨酸生产能力的大肠埃希氏菌，以在该大肠埃希氏菌的培养基或细胞中产生并累积L-赖氨酸；和
从培养基或细胞收集L-赖氨酸；
其中该大肠埃希氏菌中的acpP基因的比翻译起始位点靠上游的位置-34的胞嘧啶已用腺嘌呤替代。
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