CN103709021A - 一种香兰素的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于香精香料和食品添加剂领域，具体涉及一种香兰素的提取方法，包括：将含有香兰素的微生物转化发酵液依次经酸化、过滤、滤液浓缩、中性萃取、弱碱水洗、萃取液浓缩和结晶陈化处理，得到香兰素的微黄色或类白色结晶性粉末，其中在萃取过程中加入离子型破乳剂。本发明的提取方法可以有效去除发酵液中的香兰酸、阿魏酸和愈创木酚等杂质；对于不同质量的发酵液适应性强；高效的破乳方法使提取过程流畅、保证工业化生产连续稳定运行。
Description
技术领域
本发明属于香精香料和食品添加剂领域，具体涉及一种香兰素的提取方法。
背景技术
香兰素（Vanillin），学名 3-甲氧基-4-羟基苯甲醛，也称之为香草醛。自然界存在于香荚兰豆、丁香油、秘鲁香脂、吐鲁香脂等精油中。不同的生产方法获得的香兰素价格相差很大，主要有：（1）从含天然香兰素的植物中提取，市场售价4000美元/kg。（2）化学合成方法，按照起始合成原料可以分为愈创木酚法、木质素法、黄樟素法、丁香酚法、对羟基苯甲醛、4-甲基愈创木酚法、对甲酚法等几种，目前工业上主要利用愈创木酚法，市场售价10美元/kg。（3）微生物发酵法转化生产香兰素，然后分离提纯，市场售价1000美元/kg。
目前，香兰素世界年需求量为20000吨，但是从植物中提取生产存在着香兰素含量低（比如在干香荚兰豆中的含量仅15~20g/kg）、种植面积小、生产周期长等因素的制约，每年从香荚兰豆中提取的天然香兰素不足20吨，远远不能满足市场的需求。化学合成香兰素虽然成本低廉、规模大，但容易造成环境污染，而且不能满足人们对天然食品的要求。而以微生物发酵法生产天然香兰素的工艺简便，收率高，能耗低，污染小，产品安全可靠。美国FDA规定“天然香料必须是由来自于植物或动物的原料，经物理、酶法或微生物加工过程得到的产品”。因此，用微生物发酵法合成香兰素，并广泛应用于工业生产中，是今后发展的趋势。
目前，用微生物转化法生产香兰素的技术，主要集中于对微生物发酵方法的研究报道，而对于提取方法的研究报道很少，一般只在实施例中有简单描述。比如公开号为CN1629301A的发明中，粗提物含量36%，而收率仅60%，该工艺存在着萃取溶剂为混合溶剂不利于工业化生产连续进行，提取收率低，提取流程长、设备投资大（需进行超临界二氧化碳萃取）等不足；公开号为CN102321563A、CN101165168A的发明实施例中采用树脂吸附法提取，收率也只有65%。在微生物发酵法制备香兰素的提取分离过程中，如何有效去除阿魏酸、香兰酸以及愈创木酚等杂质，尚未见诸专利。另外，香兰素萃取过程中的乳化问题也是生产上的难题，如果不能快速破乳，势必延长分层时间，影响香兰素的质量，同时分层不彻底还会影响收率，增加溶媒消耗量。因此，寻找有效的破乳方法是保证生产顺利进行首先要解决的问题。
发明内容
针对上述现有技术存在的缺点和不足，发明人旨在提供一种针对微生物转化法生产的天然香兰素的提取方法。用以满足市场对天然绿色产品的需求，一方面解决现有技术在微生物发酵法制备香兰素的提取分离过程中，不能有效去除阿魏酸、香兰酸以及愈创木酚等杂质的问题；另一方面解决香兰素萃取过程中的乳化问题。
本发明的目的是通过以下技术方案得以实施的：
一种香兰素的提取方法，包括如下步骤：
将含有香兰素的微生物转化发酵液依次经酸化、过滤、滤液浓缩、中性萃取、弱碱水洗、萃取液浓缩和结晶陈化处理，得到香兰素的微黄色或类白色结晶性粉末，其中：
酸化处理中：含有香兰素的微生物转化发酵液酸化的pH值为2.0~4.5；
中性萃取前需要将浓缩后的滤液用酸或碱调pH值至5.0~8.0；
浓缩后的滤液用有机溶剂在近中性条件下进行两次萃取，为了使生产顺利进行，在萃取过程中加入0.1~1%（w/v）的离子型破乳剂；
萃取液中加入其体积10~50%的水，并调水相pH值至6.0~7.5进行弱碱水洗以进一步除去香兰酸和阿魏酸等杂质；
萃取液浓缩为真空浓缩，浓缩的温度为40~70℃，浓缩至香兰素含量为30%~60%；
结晶陈化处理中：结晶的温度为20℃以下，结晶陈化的时间为2~10小时。
作为优选方案，根据本发明所述的一种香兰素的提取方法，在中性萃取前需要将浓缩后的滤液用酸或碱调pH值至6.5~7.5，以保证较高萃取收率和质量。
作为优选方案，根据本发明所述的一种香兰素的提取方法，其中所述的有机溶剂为乙酸乙酯、乙酸丁酯、石油醚或正己烷等。
作为优选方案，根据本发明所述的一种香兰素的提取方法，其中所述的离子型破乳剂为十二烷基三甲基氯化铵。十二烷基三甲基氯化铵具有用量小、破乳效率高、安全无毒等优点。
作为优选方案，根据本发明所述的一种香兰素的提取方法，其中所述的弱碱水洗采用NaOH、KOH、K2CO3或Na2CO3调水相pH值到6.0~7.5。经试验，在此pH范围内，90%以上的香兰酸和阿魏酸分配于水相被去除，而只有不到5%的香兰素损失。香兰酸和阿魏酸与产品得到有效分离。
作为优选方案，根据本发明所述的一种香兰素的提取方法，其中所述的萃取液浓缩的温度为50~60℃。由于香兰素是挥发性物质，浓缩温度太高随溶剂蒸馏出的比例会增大，从而降低收率，温度太低则影响浓缩速度。
作为优选方案，根据本发明所述的一种香兰素的提取方法，其中所述的萃取液浓缩至香兰素含量为35~40%。浓度低，结晶收率就低，浓度太高，则愈创木酚不能有效分离。
作为优选方案，根据本发明所述的一种香兰素的提取方法，其中所述的结晶陈化中陈化的时间为3~4小时。
本发明所称“含有香兰素的微生物转化发酵液”是指先在培养基中扩增培养微生物，然后加入原料阿魏酸，经微生物转化后得到含有香兰素的发酵液。可以按照文献CN1629301A报道的方法来获得。
本发明所称“不同质量的发酵液”是指不同批次的发酵液中香兰酸、阿魏酸和愈创木酚等杂质含量水平波动范围很大，具体见表1“实施例发酵液质量汇总表”。
本发明采用的含量检测方法为高压液相色谱法，检测波长280nm。
本发明与现有技术相比，具有以下优点：
（1）本发明的提取方法可以有效去除发酵液中的香兰酸、阿魏酸和愈创木酚等杂质。对于不同质量的发酵液适应性强，从而降低了对发酵的要求，特别适用于工业化生产。按照本发明的提取方法所得产品质量稳定，经高压液相色谱检测，其含量稳定在96~98%；（2）收率高，达到80~90%；（3）高效的破乳方法使提取过程流畅、保证工业化生产连续稳定运行。
具体实施方式
下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
实施例1
一种香兰素的提取方法，包括如下步骤：
经微生物转化法生产的含香兰素10.6g/L的发酵液2L，用10mol/L硫酸调pH值至3.0，加入珍珠岩粉（发酵工业过滤操作中常用的助滤剂）30g，真空抽滤后加水300ml淋洗，得到2230ml酸化滤液。
滤液用NaOH调pH值至7.0，然后于70℃真空浓缩至450ml，冷却至24℃，用硫酸调滤液的pH值至6.5，然后用等体积乙酸乙酯萃取两次，每次搅拌萃取30分钟后加入0.5g十二烷基三甲基氯化铵，继续搅拌5分钟后静置，分层，合并两次萃取液，得到萃取液共890ml。
萃取液中加入100ml水，一边搅拌一边加入NaOH溶液调水相pH值至7.2进行弱碱水洗，静置，分层。
经弱碱水洗过的萃取液于50℃真空浓缩至约40ml，然后于15℃下结晶陈化4小时后真空抽滤，再用10ml乙酸乙酯洗晶，得到微黄色湿晶体。
湿晶体于50℃真空干燥2小时得到香兰素的微黄色结晶性粉末18.8g，HPLC含量为97.2%，收率86.2%。
实施例2
一种香兰素的提取方法，包括如下步骤：
经微生物转化法生产的含香兰素9.7g/L的发酵液2L，用10mol/L硫酸调pH值至3.5，加入珍珠岩粉30g，真空抽滤后加水300ml淋洗，得到2220ml酸化滤液。
滤液用NaOH调pH值至6.0，然后于70℃真空浓缩至470ml，冷却至24℃，用硫酸调滤液的pH值至5.0，然后用等体积乙酸乙酯萃取两次，每次搅拌萃取30分钟后加入0.1g十二烷基三甲基氯化铵，继续搅拌5分钟后静置，分层，合并两次萃取液，得到萃取液共930ml。
萃取液中加入300ml水，一边搅拌一边加入KOH溶液调水相pH值至6.0进行弱碱水洗，静置，分层。
经弱碱水洗过的萃取液于40℃真空浓缩至约35ml，然后于18℃下结晶陈化2小时后真空抽滤，用20ml乙酸乙酯洗晶，得到微黄色湿晶体。
湿晶体于50℃真空干燥2小时得到香兰素的微黄色结晶性粉末16.1g，HPLC含量为98.3%，收率81.5%。
实施例 3
一种香兰素的提取方法，包括如下步骤：
经微生物转化法生产的含香兰素10.2g/L的发酵液2L，用10mol/L硫酸调pH值至3.8，加入珍珠岩粉30g，真空抽滤后加水300ml淋洗，得到2230ml酸化滤液。
滤液用NaOH调pH值至6.7，然后于70℃真空浓缩至450ml，冷却至24℃，用NaOH调浓缩滤液的pH值至8.0，然后用等体积乙酸丁酯萃取两次，每次搅拌萃取30分钟后加入0.5g十二烷基三甲基氯化铵，继续搅拌5分钟后静置，分层，合并两次萃取液，得到萃取液共890ml。
萃取液中加入500ml水，一边搅拌一边加入KOH溶液调水相pH值至6.8进行弱碱水洗，静置，分层。
经弱碱水洗过的萃取液于70℃真空浓缩至约40ml，然后于20℃下结晶陈化6小时后真空抽滤，用20ml乙酸乙酯洗晶，得到类白色湿晶体。
湿晶体于50℃真空干燥2小时得到香兰素的类白色结晶性粉末16.9g，HPLC含量为96.7%，收率80.1%。
实施例4
一种香兰素的提取方法，包括如下步骤：
经微生物转化法生产的含香兰素8.3g/L的发酵液2L，用10mol/L硫酸调pH值至4.4，加入珍珠岩粉30g，真空抽滤后加水300ml淋洗，得到2210ml酸化滤液。
滤液用NaOH调pH值至7.5，然后于70℃真空浓缩至450ml，冷却至24℃，用硫酸调浓缩滤液的pH值至7.0，然后用等体积石油醚萃取两次，每次搅拌萃取30分钟后加入0.8g十二烷基三甲基氯化铵，继续搅拌5分钟后静置，分层，合并两次萃取液，得到萃取液共890ml。
萃取液中加入200ml水，一边搅拌一边加入K2CO3溶液调水相pH值至7.5进行弱碱水洗，静置，分层。
经弱碱水洗过的萃取液于65℃真空浓缩至约40ml，然后于10℃下结晶陈化10小时后真空抽滤，用15ml乙酸乙酯洗晶，得到类白色湿晶体。
湿晶体于50℃真空干燥2小时得到香兰素的类白色结晶性粉末14.7g，HPLC含量为97.7%，收率86.5%。
实施例5
一种香兰素的提取方法，包括如下步骤：
经微生物转化法生产的含香兰素8.8g/L的发酵液6.0吨，用10mol/L硫酸调pH值至2.5，加入珍珠岩粉90kg，真空抽滤后加水900L淋洗，得到6690L酸化滤液。
滤液用NaOH调pH值至7.2，然后于70℃真空浓缩至1340L，冷却至24℃，用硫酸调浓缩滤液的pH值至6.0，然后用等体积正己烷萃取两次，每次搅拌萃取30分钟后加入3kg十二烷基三甲基氯化铵，继续搅拌5分钟后静置，分层，合并两次萃取液，得到萃取液共2650L。
萃取液中加入1200L水，一边搅拌一边加入Na2CO3溶液调水相pH值至7.1进行弱碱水洗，静置，分层。
经弱碱水洗过的萃取液于60℃真空浓缩至约120L，然后于14℃下结晶陈化5小时后离心，用少量乙酸乙酯洗晶，得到微黄色湿晶体。
湿晶体于50℃真空干燥2小时得到香兰素的微黄色结晶性粉末45.6kg，HPLC含量为98.1%，收率84.7%。
实施例6
一种香兰素的提取方法，包括如下步骤：
经微生物转化法生产的含香兰素10.3g/L的发酵液6.0吨，用10mol/L硫酸调pH值至2.7，加入珍珠岩粉90kg，真空抽滤后加水900L淋洗，得到6720L酸化滤液。
滤液用NaOH调pH值至7.0，然后于70℃真空浓缩至1350L，冷却至24℃，用NaOH调浓缩滤液的pH值至7.5，然后用等体积乙酸丁酯萃取两次，每次搅拌萃取30分钟后加入1kg十二烷基三甲基氯化铵，继续搅拌5分钟后静置，分层，合并两次萃取液，得到萃取液共2670L。
萃取液中加入600L水，一边搅拌一边加入Na2CO3溶液调水相pH值至7.5进行弱碱水洗，静置，分层。
经弱碱水洗过的萃取液于50℃真空浓缩至约120L，然后于17℃下结晶陈化2小时后离心，用20~30L乙酸乙酯洗晶，得到微黄色湿晶体。
湿晶体于50℃真空干燥2小时得到香兰素的微黄色结晶性粉末55.7kg，HPLC含量为97.8%，收率88.1%。
表1 实施例发酵液质量汇总表（单位 g/L）
| 香兰素 | 香兰酸 | 阿魏酸 | 愈创木酚 | |
| 实施例1 | 10.6 | 3.7 | 0.7 | 2.7 |
| 实施例2 | 9.7 | 4.8 | 1.1 | 4.5 |
| 实施例3 | 10.2 | 3.4 | 0.4 | 5.3 |
| 实施例4 | 8.3 | 5.2 | 5.3 | 6.2 |
| 实施例5 | 8.8 | 5.1 | 3.0 | 6.4 |
| 实施例6 | 10.3 | 2.9 | 0.3 | 1.6 |
表1说明了实施例中所用的不同批次的发酵液里面香兰酸、阿魏酸和愈创木酚的含量变动范围很大，造成了发酵液中香兰素的含量在30%~70%之间不等。但是，经过本发明所述方法提取之后，香兰酸、阿魏酸和愈创木酚几乎被去除干净，产品中香兰素的含量都达到了96~98%，验证了本发明“对于不同质量的发酵液适应性强”的特点。背景技术中涉及到的现有专利文献中的实施例的收率一般只有30%~70%，因此本发明也具有收率高的特点。
上述优选实施例只是用于说明和解释本发明的内容，并不构成对本发明内容的限制。尽管发明人已经对本发明做了较为详细地列举，但是，本领域的技术人员根据发明内容部分和实施例所揭示的内容，能对所描述的具体实施例做各种各样的修改或/和补充或采用类似的方式来替代是显然的，并能实现本发明的技术效果，因此，此处不再一一赘述。本发明中出现的术语用于对本发明技术方案的阐述和理解，并不构成对本发明的限制。
Claims (8)
1. 一种香兰素的提取方法，其特征在于包括如下步骤：
将含有香兰素的微生物转化发酵液依次经酸化、过滤、滤液浓缩、中性萃取、弱碱水洗、萃取液浓缩和结晶陈化处理，得到香兰素的微黄色或类白色结晶性粉末，其中：
酸化处理中：含有香兰素的微生物转化发酵液酸化的pH值为2.0~4.5；
中性萃取前需要将浓缩后的滤液用酸或碱调pH值至5.0~8.0；
浓缩后的滤液用有机溶剂在近中性条件下进行两次萃取，萃取过程中加入0.1~1%（w/v）的离子型破乳剂；
萃取液中加入其体积10~50%的水，并调水相pH值至6.0~7.5进行弱碱水洗；
萃取液浓缩为真空浓缩，浓缩的温度为40~70℃，浓缩至香兰素含量为30%~60%；
结晶陈化处理中：结晶的温度为20℃以下，结晶陈化的时间为2~10小时。
2.根据权利要求1所述的一种香兰素的提取方法，其特征在于滤液浓缩前需用碱回调滤液的pH值至6.0~7.5。
3.根据权利要求1所述的一种香兰素的提取方法，其特征在于所述的有机溶剂为乙酸乙酯、乙酸丁酯、石油醚或正己烷。
4.根据权利要求1所述的一种香兰素的提取方法，其特征在于所述的离子型破乳剂为十二烷基三甲基氯化铵。
5.根据权利要求1所述的一种香兰素的提取方法，其特征在于所述的弱碱水洗中采用NaOH、KOH、K2CO3或Na2CO3调水相pH值至6.5~7.0。
6.根据权利要求1所述的一种香兰素的提取方法，其特征在于所述的萃取液浓缩中浓缩的温度为50~60℃。
7.根据权利要求1所述的一种香兰素的提取方法，其特征在于所述的萃取液浓缩中浓缩至至香兰素含量为35~40%。
8. 根据权利要求1所述的一种香兰素的提取方法，其特征在于所述的结晶陈化中陈化的时间为3~4小时。
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