CN112111434A - 一种优良乳酸菌、筛选方法及其在小曲制作中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种优良乳酸菌、筛选方法及其在小曲制作中的应用，所述乳酸菌的分类命名为类干酪乳杆菌Lg‑1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO:M 2017669，保藏日期：2017年11月8日。该筛选方法步骤为：称取小曲粉或酒醅放入MRS液体培养基的三角瓶中培养；采用十倍稀释涂布法进行初筛，用溶钙圈法进行复筛，再进行定性实验分析。该优良乳酸菌的筛选简单，应用于小曲制作中可抑制腐败菌的生长繁殖，改善了小曲的品质，使小曲更具有甜清香味，菌丝生长更均匀致密，色白光滑，菌丝过心，曲心空隙更多，促进了小曲的优质、稳定生产；采用该小曲制作的红枣蒸馏酒口感更柔和、醇厚，酒体丰满，香味突出。

Description

一种优良乳酸菌、筛选方法及其在小曲制作中的应用
技术领域
本发明涉及酿酒技术领域，特别涉及一种优良乳酸菌、筛选方法及其在小曲制作中的应用。
背景技术
饮料酒可以分成发酵酒、蒸馏酒和配制酒三大类，其中蒸馏酒是以粮谷、薯类、水果、乳类为主要原料，经发酵、蒸馏、勾兑而成的饮料酒。红枣是一种营养丰富的果实，其富含蛋白质、脂肪、糖类、胡萝卜素、B族维生素、维生素C、维生素P以及钙、磷、铁和环磷酸腺苷等营养成分，具有较强的滋补作用，能提高人体免疫功能，增强抗病能力。
红枣蒸馏酒是主要以红枣为原料，通过添加酒曲发酵制备而成。酒曲可分为5大类，分别是大曲、小曲、红曲、麸曲和麦曲。小曲在制作高品质的红枣蒸馏酒中发挥了巨大作用，是用米粉或米粉、米糠为原料，添加中草药或辣蓼粉为辅料，有的加入少量白土为填充料，接入一定量的优良小曲为母种，加入一定量水制成曲坯，在人工控制合适的品温、温度条件下培养而成。
目前，用于制作红枣蒸馏酒的小曲存在出酒率不高，风味不足的问题，因此，如何制作出高品质的小曲以提高红枣蒸馏酒的口感成为亟待解决的问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：克服现有技术的不足，提供一种可改善小曲的特性并提高红枣蒸馏酒的品质的优良乳酸菌、筛选方法及其在小曲制作中的应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种优良乳酸菌，所述乳酸菌的分类命名为类干酪乳杆菌Lg-1，其拉丁文名称为：Lactobacillus paracasei Lg-1，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO: M2017669，保藏日期：2017年11月8日。
本发明还提高供一种如上所述优良乳酸菌的筛选方法，包括如下步骤：称取小曲粉或红枣发酵酒的酒醅1 g，放入装有100 mL MRS液体培养基的三角瓶中，在37 ℃培养1-3d后，得到菌悬液；再采用十倍稀释涂布法进行初筛，然后用溶钙圈法进行复筛，并对筛选出的菌株进行定性实验分析。
进一步，所述MRS液体培养基的制备方法包括如下步骤：将蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母提取液5g、葡萄糖20g、乙酸钠5g、柠檬酸二钠2g、吐温-80 1 mL、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.58g、四水硫酸锰0.25g、琼脂15-20g混合均匀后调节pH6.2～6.4，在121℃灭菌20min。
进一步，所述十倍稀释涂布法包括如下步骤：用一支1 mL无菌吸管从三角瓶中吸取1 mL菌悬液注入盛有9 mL无菌水的试管中，以此类推，制成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6各种不同稀释度的溶液，涂布于MRS碳酸钙培养基的平板上，37 ℃培养3-4 d，用平板划线的方法进行纯化。
进一步，所述MRS碳酸钙培养基的制备方法包括如下步骤：在MRS液体培养基中加入1 %-3 %的碳酸钙和200 mL番茄、汁自然pH，121 ℃灭菌20 min。
进一步，所述溶钙圈法包括如下步骤：先挑取一环活化好的乳酸菌接种于100 mLMRS液体培养基上，于37 ℃培养1 d，将无菌的牛津杯置于加入CaCO3的MRS琼脂平板中央，在牛津杯中分别注入500μL菌悬液，37 ℃下培养，待牛津杯中菌液干后，取下牛津杯继续培养2-3 d。由于培养基中加入了碳酸钙，所以，菌落周围会开成一圈透明圈，根据透明圈的大小可以初步判断乳酸菌产酸能力的强弱。
进一步，所述定性实验采用革兰氏染色法。
进一步，红枣发酵酒的酒醅的制备方法包括如下步骤：称取干红枣，洗净，加水进行蒸煮，煮熟后，搅拌冷却至30℃、接曲，搅拌均匀、进行发酵，待发酵数天后，取红枣发酵酒的酒糟。
本发明还提供一种如上所述优良乳酸菌在小曲制作中的应用，包括如下步骤：
1）将一株类干酪乳杆菌Lg-1接至三角瓶装500ml MRS液态培养基中，于培养箱中37℃培养1-3天后，即得类干酪乳杆菌Lg-1种子培养液；
2）浸米及粉粹：将大米浸泡3-5h后沥水、粉碎，中草药粉碎，得到米粉、米糠和粉碎后的中草药；
3）拌料制坯：制坯前在培曲盒上撒上一层厚厚的稻壳，然后将米粉、米糠、粉碎后的中草药和母曲相混拌匀，加入10%-15%类干酪乳杆菌Lg-1种子培养液，混匀，再用纯净水搅拌均匀即可制坯；
4）入箱培养：培曲初期，室内温度保持在30-32℃，该阶段霉菌在坯表面生长，并布满表面形成菌膜，且在该阶段曲块水份大量挥发，曲心酸度略有上升；培曲中后期，室内温度保持在28-30℃，该阶段霉菌菌丝向曲心生长，曲心颜色逐渐转白并逐渐成熟，酸味也逐渐消失；
5）烘曲：曲柸入箱培养3-6天后，品温降至室温24小时后，即可出曲，将其移至于40℃烘干箱中烘干，使其水分降至12%以下，再存放于干燥、低温处。
进一步，所述大米和中草药粉碎后均过40目筛。
本发明一种优良乳酸菌、筛选方法及其在小曲制作中的应用的有益效果：本发明的优良乳酸菌的筛选方法简单、可操作性强，该优良乳酸菌最适生长温度在37℃，是一类有利于人体健康活性微生物食品原料，将其应用于小曲制作中不仅能够抑制小曲中的腐败菌的生长繁殖，还能够极大地改善小曲的品质，使小曲更具有甜清香味，菌丝生长更均匀致密，色白光滑，菌丝过心，曲心空隙更多，促进了小曲的优质、稳定的生产；采用该小曲制作的红枣蒸馏酒的口感更加柔和、醇厚，酒体丰满，香味突出，提高了红枣蒸馏酒的品质。
附图说明
图1—为类干酪乳杆菌Lg-1平板菌落图；
图2—为类干酪乳杆菌Lg-1的显微镜（1000X）观察图；
图3—为类干酪乳杆菌Lg-1制作的小曲图。
具体实施方式
以下结合附图及实施例对本发明作进一步说明，但这些具体实施方案不以任何方式限制本发明的保护范围。
实施例1
一种优良乳酸菌，所述乳酸菌的分类命名为类干酪乳杆菌Lg-1, 其拉丁文名称为：Lactobacillus paracasei Lg-1，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO: M 2017669，保藏日期：2017年11月8日。
实施例2
一种优良乳酸菌的筛选方法，包括如下步骤：
1）称取小曲粉或红枣发酵酒的酒醅1 g，放入装有100 mL MRS液体培养基的三角瓶中，在37 ℃培养1-3 d后，得到菌悬液；
其中，所述红枣发酵酒的酒醅的制备方法包括如下步骤：称取干红枣，洗净，加水进行蒸煮，煮熟后，搅拌冷却至30℃、接曲，搅拌均匀、进行发酵，待发酵数天后，取红枣发酵酒的酒糟；
所述MRS液体培养基的制备方法包括如下步骤：将蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母提取液5g、葡萄糖20g、乙酸钠5g、柠檬酸二钠2g、吐温-80 1 mL、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.58g、四水硫酸锰0.25g、琼脂15-20g混合均匀后调节pH6.2～6.4，在121℃灭菌20min；
2）十倍稀释涂布法初筛，具体操作为：用一支1 mL无菌吸管从三角瓶中吸取1 mL菌悬液注入盛有9 mL无菌水的试管中，以此类推，制成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6各种不同稀释度的溶液，涂布于MRS碳酸钙培养基的平板上，37 ℃培养3-4 d，用平板划线的方法进行纯化，划线分离出单菌落，其类干酪乳杆菌Lg-1平板单菌落形态图如图1所示；
其中，所述MRS碳酸钙培养基的制备方法包括如下步骤：在MRS液体培养基中加入1 %-3%的碳酸钙和200 mL番茄、汁自然pH，121 ℃灭菌20 min；
3）溶钙圈法复筛，具体操作为：先挑取一环活化好的乳酸菌接种于100 mL MRS液体培养基上，于37 ℃培养1 d，将无菌的牛津杯置于加入CaCO3的MRS琼脂平板中央，在牛津杯中分别注入500μL菌悬液，37 ℃下培养，待牛津杯中菌液干后，取下牛津杯继续培养2-3 d。由于培养基中加入了碳酸钙，所以，菌落周围会开成一圈透明圈，根据透明圈的大小可以初步判断乳酸菌产酸能力的强弱；
4）定性实验分析：采用革兰氏染色法对筛选出的菌株进行定性实验分析，具体操作为：
涂片：在一片干净的载玻片，滴上一滴蒸馏水，用接种环挑取可疑菌落，均匀的涂在载玻片上；
晾干：置通风处晾干；
固定：将载玻片在酒精灯火焰上迅速的来回几次；
结晶紫色染色：将玻片置于废液缸玻片搁架上，加适量（以盖满细菌涂面）的结晶紫染色液染色1分钟；
水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗；
媒染：滴加卢哥氏碘液，媒染1min；
水洗：用水洗去碘液；
脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色20—25s至流出液无色，立即水洗；
复染：滴加蕃红复染5min；
水洗：用水洗去涂片上的蕃红染色液；
晾干：将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干；
镜检：镜检时先用低倍，再用高倍观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。
类干酪乳杆菌Lg-1的显微镜（1000X）观察图如图2所示，将经过三级筛选后的选出的乳酸菌送到中国典型培养物保藏中心进行分子生物学鉴定，通过对乳酸菌株16S rRNA基因序列的测定与分析，并通过测序对比分析，最终获得一株优良乳酸菌，命名为类干酪乳杆菌Lg-1，其拉丁文名称为：Lactobacillus paracasei Lg-1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO: M 2017669，保藏日期：2017年11月8日，该16S rRNA基因的序列如序列表1所示。
实施例3
本发明还提供一种如上所述优良乳酸菌在小曲制作中的应用，包括如下步骤：
1）将一株类干酪乳杆菌Lg-1接至三角瓶装500ml MRS液态培养基中，于培养箱中37℃培养1-3天后，即得类干酪乳杆菌Lg-1种子培养液；
2）浸米及粉粹：将大米浸泡3-5h后沥水、粉碎后过40目筛，中草药粉碎后过40目筛，得到米粉、米糠和粉碎后的中草药；
3）拌料制坯：制坯前在培曲盒上撒上一层厚厚的稻壳，然后将米粉、米糠、粉碎后的中草药和母曲相混拌匀，加入10%-15%类干酪乳杆菌Lg-1种子培养液，混匀，再用纯净水搅拌均匀即可制坯；
4）入箱培养：培曲初期，室内温度保持在30-32℃，该阶段霉菌在坯表面生长，并布满表面形成菌膜，且在该阶段曲块水份大量挥发，曲心酸度略有上升；培曲中后期，室内温度保持在28-30℃，该阶段霉菌菌丝向曲心生长，曲心颜色逐渐转白并逐渐成熟，酸味也逐渐消失；
5）烘曲：曲柸入箱培养3-6天后，品温降至室温24小时后，即可出曲，将其移至于40℃烘干箱中烘干，使其水分降至12%以下，再存放于干燥、低温处。
采用本发明中的类干酪乳杆菌Lg-1制作的小曲的图片如图3所示。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
序列表
<110> 湖南鼎康酒业发展有限公司
<120> 一种优良乳酸菌、筛选方法及其在小曲制作中的应用
<130> 2020.10.12
<141> 2020-10-14
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1450
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
gctatacatg cagtcgaacg agttctcgtt gatgatcggt gcttgcaccg agattcaaca 60
tggaacgagt ggcggacggg tgagtaacac gtgggtaacc tgcccttaag tgggggataa 120
catttggaaa cagatgctaa taccgcatag atccaagaac cgcatggttc ttggctgaaa 180
gatggcgtaa gctatcgctt ttggatggac ccgcggcgta ttagctagtt ggtgaggtaa 240
tggctcacca aggcgatgat acgtagccga actgagaggt tgatcggcca cattgggact 300
gagacacggc ccaaactcct acgggaggca gcagtaggga atcttccaca atggacgcaa 360
gtctgatgga gcaacgccgc gtgagtgaag aaggctttcg ggtcgtaaaa ctctgttgtt 420
ggagaagaat ggtcggcaga gtaactgttg tcggcgtgac ggtatccaac cagaaagcca 480
cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgtta tccggattta 540
ttgggcgtaa agcgagcgca ggcggttttt taagtctgat gtgaaagccc tcggcttaac 600
cgaggaagcg catcggaaac tgggaaactt gagtgcagaa gaggacagtg gaactccatg 660
tgtagcggtg aaatgcgtag atatatggaa gaacaccagt ggcgaaggcg gctgtctggt 720
ctgtaactga cgctgaggct cgaaagcatg ggtagcgaac aggattagat accctggtag 780
tccatgccgt aaacgatgaa tgctaggtgt tggagggttt ccgcccttca gtgccgcagc 840
taacgcatta agcattccgc ctggggagta cgaccgcaag gttgaaactc aaaggaattg 900
acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt 960
accaggtctt gacatctttt gatcacctga gagatcaggt ttccccttcg ggggcaaaat 1020
gacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa 1080
cgagcgcaac ccttatgact agttgccagc atttagttgg gcactctagt aagactgccg 1140
gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta tgacctgggc 1200
tacacacgtg ctacaatgga tggtacaacg agttgcgaga ccgcgaggtc aagctaatct 1260
cttaaagcca ttctcagttc ggactgtagg ctgcaactcg cctacacgaa gtcggaatcg 1320
ctagtaatcg cggatcagca cgccgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc 1380
cgtcacacca tgagagtttg taacacccga agccggtggc gtaacccttt tagggagcga 1440
gccgtctaag 1450

Claims (10)

1.一种优良乳酸菌，其特征在于：所述乳酸菌的分类命名为类干酪乳杆菌Lg-1，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO: M2017669，保藏日期：2017年11月8日。
2.一种如权利要求1所述优良乳酸菌的筛选方法，其特征在于：包括如下步骤：称取小曲粉或红枣发酵酒的酒醅1 g，放入装有100 mL MRS液体培养基的三角瓶中，在37 ℃培养1-3 d后，得到菌悬液；再采用十倍稀释涂布法进行初筛，然后用溶钙圈法进行复筛，并对筛选出的菌株进行定性实验分析。
3.一种如权利要求2所述优良乳酸菌的筛选方法，其特征在于：所述MRS液体培养基的制备方法包括如下步骤：将蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母提取液5g、葡萄糖20g、乙酸钠5g、柠檬酸二钠2g、吐温-80 1 mL、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.58g、四水硫酸锰0.25g、琼脂15-20g混合均匀后调节pH6.2～6.4，在121℃灭菌20min。
4.如权利要求3所述一种优良乳酸菌的筛选方法，其特征在于：所述十倍稀释涂布法包括如下步骤：用一支1 mL无菌吸管从三角瓶中吸取1 mL菌悬液注入盛有9 mL无菌水的试管中，以此类推，制成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6各种不同稀释度的溶液，涂布于MRS碳酸钙培养基的平板上，37 ℃培养3-4 d，用平板划线的方法进行纯化。
5.如权利要求4所述一种优良乳酸菌的筛选方法，其特征在于：所述MRS碳酸钙培养基的制备方法包括如下步骤：在MRS液体培养基中加入1 %-3 %的碳酸钙和200 mL番茄、汁自然pH，121 ℃灭菌20 min。
6.如权利要求2所述一种优良乳酸菌的筛选方法，其特征在于：所述溶钙圈法包括如下步骤：先挑取一环活化好的乳酸菌接种于100 mL MRS液体培养基上，于37 ℃培养1 d，将无菌的牛津杯置于加入CaCO3的MRS琼脂平板中央，在牛津杯中分别注入500μL菌悬液，37 ℃下培养，待牛津杯中菌液干后，取下牛津杯继续培养2-3 d。
7.如权利要求2所述一种优良乳酸菌的筛选方法，其特征在于：所述定性实验采用革兰氏染色法。
8.如权利要求2所述一种优良乳酸菌的筛选方法，其特征在于：红枣发酵酒的酒醅的制备方法包括如下步骤：称取干红枣，洗净，加水进行蒸煮，煮熟后，搅拌冷却至30℃、接曲，搅拌均匀、进行发酵，待发酵数天后，取红枣发酵酒的酒糟。
9.一种如权利要求1所述优良乳酸菌在小曲制作中的应用，其特征在于：包括如下步骤：
1）将一株类干酪乳杆菌Lg-1接至三角瓶装500ml MRS液态培养基中，于培养箱中37℃培养1-3天后，即得类干酪乳杆菌Lg-1种子培养液；
2）浸米及粉粹：将大米浸泡3-5h后沥水、粉碎，中草药粉碎，得到米粉、米糠和粉碎后的中草药；
3）拌料制坯：制坯前在培曲盒上撒上一层厚厚的稻壳，然后将米粉、米糠、粉碎后的中草药和母曲相混拌匀，加入10%-15%类干酪乳杆菌Lg-1种子培养液，混匀，再用纯净水搅拌均匀即可制坯；
4）入箱培养：培曲初期，室内温度保持在30-32℃；培曲中后期，室内温度保持在28-30℃；
5）烘曲：曲柸入箱培养3-6天后，品温降至室温24小时后，即可出曲，将其移至于40℃烘干箱中烘干，使其水分降至12%以下，再存放于干燥、低温处。
10.如权利要求9一种所述优良乳酸菌在小曲制作中的应用，其特征在于：所述大米和中草药粉碎后均过40目筛。
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