CN107760630A - 一种甲基营养型芽孢杆菌b18及其菌剂和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophi cus)B18及其菌剂和应用，该菌株已经于2017年9月18日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.14641。本发明甲基营养型芽孢杆菌B18可制成菌剂，对于茎腐病和黑曲霉病具有良好的防治效果，同时本发明菌种可应用于植物病害生物防治中，绿色环保无公害，且用一次可长期有效、能持续控病，大幅降低成本。

Description

一种甲基营养型芽孢杆菌B18及其菌剂和应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及一种甲基营养型芽孢杆菌B18及其菌剂和应用。

背景技术

茎腐病是仙人掌、仙人球、霸王鞭、麒麟掌、量天尺等多种仙人掌类观赏植物普遍而严重的病害，常引起茎部腐烂，最后导致全株死亡。该病通常发生于茎基部，然后向上逐渐蔓延到植株的上部茎节。发病初期，病斑呈水渍状、黄绿色至黄褐色，随着病情的发展，病部组织逐渐软化腐烂，最后茎肉组织腐烂失水，剩下一层干缩的外皮，或病部组织腐烂后仅残留一个芯部。病组织腐烂的快慢随病菌不同而异，症状上有时很难区别。最后全株死亡。病组织上出现灰白色、灰黑色或深红色霉状物，或黑色粒状物，即为病菌的子实体。

茎腐病侵入点在根茎处，病菌存活于土壤中，土壤环境相对稳定，最适宜于生物防治，相对化学药剂，以生物农药为基础的生物防治方法不污染环境、持久性强，且对动植物与人类安全，特别是很多内生细菌在植物体内稳定定殖时，除能促进植物生长外，还可显著增强宿主植物的抗逆性，是植物病害生防技术的重要途径。在植物体表、体内及不同部位，有不同生理功能微生物存在，对于附着于植物表面和根际微生物的作用已有不少报道，而植物体内微生物的研究却起步相对较晚，拮抗性内生微生物是生物农药的重要来源，由于其具有易定殖、无污染、无残留、可再生、难以使有害生物产生抗药性、易于产业化、成本低等特点已成为无公害农药的主体和未来农药的发展方向。

植物内生细菌作为植物病虫害的生物防治天然菌资源，有着广阔的开发应用前景和重大理论研究价值，充分挖掘植物内生微生物在有害生物综合治理上的潜能具有重要的理论和实践意义，但拮抗性内生微生物在园林植物病害控制上，特别对茎腐病生物防治方面的研究尚未涉及，本发明从健康杜仲树皮中筛选出对茎腐病菌(Aspergillusalliaceus)具有明显拮抗作用的内生微生物，探索该内生菌对仙人掌茎腐病防治效果，以期为园林植物无公害治理提供技术参考。

发明内容

本发明从黄柏树皮中分离得到一株甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)B18，主要目的在于解决现有技术在仙人掌茎腐病生物防治上的不足，本发明还提供了该甲基营养型芽孢杆菌B18的生物菌剂及在生物方面的应用。

本发明具体通过以下技术方案实现：

本发明的甲基营养型芽孢杆菌B18菌株于2016年11月20日采用平板稀释涂布法分离于四川大邑仰天窝药场健康杜仲树皮，该菌株已经于2017年9月18日保藏于中国科学院微生物研究所中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.14641。

本发明甲基营养型芽孢杆菌B18在NA平板培养基上培养了2d的单菌落呈白色，圆形，边缘不整齐，表面干燥，有褶皱，无粘性，不透明。

本发明甲基营养型芽孢杆菌B18的16S rDNA的序列为SEQ ID NO:1。

本发明以甲基营养型芽孢杆菌为活性成分的菌剂，由甲基营养型芽孢杆菌B18为菌种，经种子培养、发酵培养得到液体菌剂。

本发明所述的以甲基营养型芽孢杆菌B18为菌种的菌剂中含活芽孢数大于1×10⁸cfu/g。

进一步，本发明所述的以甲基营养型芽孢杆菌B18为菌种的菌剂通过以下方法制备：

1)一级斜面种子：常规方法制作牛肉膏蛋白胨斜面培养基，接种B18后在26-28℃下培养24-36小时制成一级种子；

2)二级液体种子：改订营养肉质培养液经高压灭菌后，按200mL液体盛于500mL三角瓶比例装瓶，在无菌状态接种B18斜面种子，温度26-28℃，初始pH值6.0，120r/min振荡培养36h，制成B18液体种子；

3)液体发酵：改订营养肉质培养液经高压灭菌后，按400mL液体盛于1000mL三角瓶比例装瓶，在无菌状态接种B18液体种子，接种量按体积比为10％，温度26-28℃，初始pH值6.0，120r/min振荡培养72h，制成B18液体制剂。

所述的牛肉膏蛋白胨斜面培养基为：牛肉膏7.0g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂17g，水1000mL。

所述的改订营养肉质培养液为：牛肉膏7.0g，蛋白胨10g，NaCl5g，仙人掌侧根组织浸渍液1000mL。

本发明甲基营养型芽孢杆菌B18在植物病害生物防治中的应用，所述的植物为仙人掌、洋葱和蓝花楹，所述的病害为茎腐病和黑曲霉病。

本发明甲基营养型芽孢杆菌B18在作为制备防治茎腐病或黑曲霉病药物中的应用。

当然本发明所述的甲基营养型芽孢杆菌B18的菌悬液或次级代谢产物在作为制备防治茎腐病或黑曲霉病药物中的应用也在本发明的保护范围内。

本发明甲基营养型芽孢杆菌B18防治茎腐病或黑曲霉病的方法也属于本发明的保护范围，该方法是在植物生长过程中进行喷雾处理或灌根施用；所述喷雾或灌根为该甲基营养型芽孢杆菌B18的菌悬液或发酵液或代谢产物或制备的农药制剂。

本发明的有益效果为：

1)生防菌商品贮藏寿命长，对环境适宜性强是商品化生物制剂和成功生防的前提和保障。本发明筛选出的甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)B18菌株具有抗逆性强的芽孢体，贮藏性好，抗高温、低温、耐干燥，适宜于商品化生产，且施用一次可长期有效、能持续控病，大幅降低成本。

2)本发明筛选出的甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophi cus)B18新菌株对仙人掌茎腐病、洋葱黑曲霉病效果显著，且无公害、绿色环保。

附图说明

图1是本发明甲基营养型芽孢杆菌B18rDNA-ITS序列PCR扩增产物电泳图；

图2是本发明基于16S rDNA序列构建的菌株B18的系统发育树。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明技术方案作进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与改型，均落在本发明的保护范围内。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1甲基营养型芽孢杆菌B18的分离与鉴定

1.1甲基营养型芽孢杆菌B18的分离

在四川大邑仰天窝药场黄柏烂皮病发生区取健康黄柏树皮。采回的样本用无菌水冲洗干净，称取1.0g组织，在70％的酒精中浸泡1-2min，再用1-3％次氯酸钠溶液消毒3-5min，无菌水洗涤若干遍后，吸取最后一次洗涤液100μL涂抹NA平板(牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂粉15-20g，蒸馏水1000mL，pH 7.0，混匀分装后121℃高压灭菌30min)，27℃黑暗培养24h，用于表面消毒的对照，检查表面消毒是否彻底。

将已表面消毒的树皮组织剪碎，放入无菌的研钵，加入灭菌的石英砂和10mL无菌水，充分研磨，静置30min，稀释10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5共5个梯度，分别吸取100μL 10^-3，10^-4，10^-5这3个梯度研磨液分别涂布NA平板(牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂粉15-20g，蒸馏水1000mL，pH 7.0，混匀分装后121℃高压灭菌30min)，每个处理3次重复，27℃培养48h，挑取菌落形态差异明显的单菌落进入初筛。

依据菌落的大小、颜色、是否突起，边缘特征、表面光滑与否、透明度等方面的差异，挑取单菌落在NA平板上划线纯化，纯化后转接NA斜面于4℃保藏备用。共获31个内生细菌。

按五点对峙法，在PDA平板中心接种直径5mm仙人掌茎腐病病原菌菌饼，四周等距离接种上述待筛选菌株，25℃恒温培养，每个处理3个重复。根据各筛选菌产生的抑菌圈的大小确定拮抗程度，保留效果优良的菌株(B18)，如表1所示。

表1 Bacillus methylotrophicus B18对洋葱曲霉(Aspergillus alliaceus)的抑制作用

1.2菌株的鉴定

经形态学观察，结合生理生化指标(表2)和分子生物学鉴定该内生菌B18为甲基营养型芽孢杆菌。

表2菌株B18生理生化指标

在NA平板培养基上培养了2d的B18菌株的单菌落白色，呈圆形，边缘不整齐，表面干燥，有褶皱，无粘性，不透明。

分子生物学鉴定(16S rDNA)：通过提取细菌DNA进行PCR扩增及电泳，回收产物送至生物技术公司测序；将所测序列与GenBank数据库中已经报道的序列进行同源性BLAST分析，并用Clustalx(1.83)软件进行多重序列比较，再用Mega4.0软件中的邻接法构建系统发育树，确定B18菌株在微生物系统发育学上的地位。分子生物学鉴定得到长度为959bp的DNA片段(图1)，将B18菌株的16S rDNA序列递交GenBank数据库进行BLAST分析，选取其中与之同源性较高的细菌16S rDNA序列，并用Clustalx软件进行多重匹配排列分析，用Mega分析软件构建系统发育树(图2)。可以看出，B18菌株与HQ662592和KC790268以99％的16SrRNA基因核苷酸序列相似性和较高的自展值支持聚为1个分支，而与其他芽孢杆菌相距较远，表明B18与Bacillus methylotrophicus的亲缘关系最近。

基于以上特征，所述菌种其分类命名为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)B18，已于2017年9月18日保存在中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14641。

实施例2甲基营养型芽孢杆菌B18液体制剂的制备

本发明提供的甲基营养型芽孢杆菌B18液体制剂具体通过以下方法得到：

1)一级斜面种子：常规方法制作牛肉膏蛋白胨斜面培养基(牛肉膏7.0g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂17g，水1000mL)，接种B18后在26-28℃下培养24-36小时制成一级种子。

2)二级液体种子：改订营养肉质培养液(牛肉膏7.0g，蛋白胨10g，NaCl 5g，仙人掌侧根组织浸渍液1000mL)经高压灭菌后，按200mL液体盛于500mL三角瓶比例(通氧控制)装瓶，在无菌状态接种BP5斜面种子，每瓶接种2支斜面种子，温度26-28℃，初始pH值6.0，120r/min振荡培养36h，制成BP5液体种子。

3)液体发酵：改订营养肉质培养液(牛肉膏7.0g，蛋白胨10g，NaCl 5g，仙人掌侧根组织浸渍液1000mL)经高压灭菌后，按400mL液体盛于1000mL三角瓶比例(通氧控制)装瓶，在无菌状态接种B18液体种子，接种量10％(体积比)，温度26-28℃，初始pH值6.0，120r/min振荡培养72h，制成B18液体制剂。

4)制剂保存：瓶装制剂常温保存2年或低温(4℃)3年半不影响防治。

在制备得到甲基营养型芽孢杆菌液体制剂中含活芽孢数大于1×10⁸cfu/g。

本发明甲基营养型芽孢杆菌液体制剂的使用方法包括喷雾施用和灌根施用，具体的喷雾施用：分不同发生程度，在春季，用B18液体制剂(活体与代谢物混合剂)稀释成不同浓度沿根茎喷雾一次(30mL/株)。轻度发生，以1000倍液为经济浓度，中度发生区以400倍液为经济浓度，重度发生区以100倍至原液为经济浓度。

灌根施用：分不同发生程度，在春、夏季，用B18液体制剂(活体与代谢物混合剂)稀释成不同浓度灌根50mL/株各一次。轻度发生，以800－1600倍液为经济浓度，中度发生区以200－400倍液为经济浓度，重度发生区以100－200倍液为经济浓度。

实施例3甲基营养型芽孢杆菌液体制剂对仙人掌茎腐病的防治1.1供试药剂

本发明上述制备得到的甲基营养型芽孢杆菌B18液体制剂。

1.2供试作物与防治对象

供试作物为盆栽仙人掌，防治对象：仙人掌茎腐病。

1.3试验设计及安排

本试验以甲基营养型芽孢杆菌B18液体菌剂为原液，在此基础上稀释50倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1000倍、1600倍、2000倍液进行喷雾处理。将盆栽仙人掌患茎腐病按照不同程度分为轻度发生、中度发生和重度发生三类别，用B18液体制剂沿根茎喷雾，每盆施用30mL。

1.4试验调查

仙人掌茎腐病的发病过程为根茎部初为灰褐色水渍状扩展绕茎一圈，使整个根茎部腐烂，以致全株死亡。处理后7天调查病情指数并计算防效。每个类别随机选取5盆取样，每株调查全部根茎，以根茎上的病斑面积相比施药钱面积的百分率来计算防治效果，如表2所示。

表2 Bacillus methylotrophicus B18生防仙人掌茎腐病参数

由表2可知，对于轻度茎腐病病害仙人掌，B18液体制剂原液表现出了优良的防治效果，防治效果高达96％，将原液稀释1000倍后还保持着良好的防治效果，防效高达80％以上。对于中度茎腐病B18液体制剂原液的防治效果高达90％以上，稀释1000倍后防效可达60％以上。对于重度茎腐病B18液体制剂原液的防效高达70％以上，稀释100倍依然具有60％以上的防效。说明本发明B18液体制剂喷雾处理在防治仙人掌茎腐病方面具有优异的效果。同时可得到，轻度发生，以1000倍液为经济浓度，中度发生区以400倍液为经济浓度，重度发生区以100倍至原液为经济浓度。

实施例4甲基营养型芽孢杆菌液体制剂对仙人掌茎腐病的防治1.1供试药剂

本发明上述制备得到的甲基营养型芽孢杆菌B18液体制剂。

1.2供试作物与防治对象

供试作物为盆栽仙人掌，防治对象：仙人掌茎腐病。

1.3试验设计及安排

本试验以甲基营养型芽孢杆菌B18液体菌剂为原液，在此基础上稀释50倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1000倍、1600倍、2000倍液进行灌根处理。将盆栽仙人掌患茎腐病按照不同程度分为轻度发生、中度发生和重度发生三类别，用B18液体制剂沿根茎灌根施用，每盆施用50mL。

1.4试验调查

仙人掌茎腐病的发病过程为根茎部初为灰褐色水渍状扩展绕茎一圈，使整个根茎部腐烂，以致全株死亡。处理后7天调查病情指数并计算防效。每个类别随机选取5盆取样，每株调查全部根茎，以根茎上的病斑面积相比施药钱面积的百分率来计算防治效果，如表3所示。

表3 Bacillus methylotrophicus B18生防仙人掌茎腐病参数

由表3可知，对于轻度茎腐病病害仙人掌，B18液体制剂原液表现出了优良的防治效果，防治效果高达97％，将原液稀释1000倍后还保持着良好的防治效果，防效高达86％以上。对于中度茎腐病B18液体制剂原液的防治效果高达92％以上，稀释1000倍后防效可达73％以上。对于重度茎腐病B18液体制剂原液的防效高达73％以上，稀释100倍依然具有65％以上的防效。说明本发明B18液体制剂喷雾处理在防治仙人掌茎腐病方面具有优异的效果。同时得出本发明液体制剂对于轻度发生，以800－1600倍液为经济浓度，中度发生区以200－400倍液为经济浓度，重度发生区以100－200倍液为经济浓度。

综上所述，本发明分离得到的甲基营养型芽孢杆菌B18菌株对茎腐病表现出了良好的拮抗作用，且该菌株具有抗逆性强的芽孢，商品贮藏寿命长，对环境适宜性强的特点，生产成商品生物制剂，对环境亲和性好，符合可持续发展的战略要求，具有广阔的市场前景。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 一种甲基营养型芽孢杆菌B18及其菌剂和应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 959

<212> DNA

<213> 甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)

<400> 1

actgcggcgt gctataatgc aagtcgagcg gacagatggg agcttgctcc ctgatgttag 60

cggcggacgg gtgagtaaca cgtgggtaac ctgcctgtaa gactgggata actccgggaa 120

accggggcta ataccggatg gttgtctgaa ccgcatggtt cagacataaa aggtggcttc 180

ggctaccact tacagatgga cccgcggcgc attagctagt tggtgaggta acggctcacc 240

aaggcgacga tgcgtagccg acctgagagg gtgatcggcc acactgggac tgagacacgg 300

cccagactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttccgc aatggacgaa agtctgacgg 360

agcaacgccg cgtgagtgat gaaggttttc ggatcgtaaa gctctgttgt tagggaagaa 420

caagtgccgt tcaaataggg cggcaccttg acggtaccta accagaaagc cacggctaac 480

tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt tgtccggaat tattgggcgt 540

aaagggctcg caggcggttt cttaagtctg atgtgaaagc ccccggctca accggggagg 600

gtcattggaa actggggaac ttgagtgcag aagaggagag tggaattcca cgtgtagcgg 660

tgaaatgcgt agagatgtgg aggaacacca gtggcgaagg cgactctctg gtctgtaact 720

gacgctgagg agcgaaagcg tggggagcga acaggattag ataccctggt agtccacgcc 780

gtaaacgatg agtgctaagt gttagggggt ttccgcccct tagtgctgca gctaacgcat 840

taagcactcc gcctggggag tacggtcgca agactgaaac tcaaaggaat tgacgggggc 900

ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggt 959

Claims (10)

1.一种甲基营养型芽孢杆菌B18，其特征在于，该菌株已于2017年9月18日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.14641。

2.根据权利要求1所述的甲基营养型芽孢杆菌B18，其特征在于，所述的甲基营养型芽孢杆菌B18的16S rDNA的序列为SEQ ID NO:1。

3.一种以甲基营养型芽孢杆菌B18为活性成分的菌剂，其特征在于，以甲基营养型芽孢杆菌B18为菌种，经种子培养、发酵培养得到液体菌剂。

4.根据权利要求3所述的菌剂，其特征在于，所述的菌剂中含活芽孢数大于1×10⁸cfu/g。

5.权利要求3所述菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)一级斜面种子：常规方法制作牛肉膏蛋白胨斜面培养基，接种B18后在26-28℃下培养24-36小时制成一级种子；

2)二级液体种子：改订营养肉质培养液经高压灭菌后，将液体盛于三角瓶，在无菌状态接种B18斜面种子，保持温度26-28℃，初始pH值6.0，120r/min振荡培养36h，制成B18液体种子；

3)液体发酵：改订营养肉质培养液经高压灭菌后置于三角瓶中，按体积比10％在无菌状态接种B18液体种子，温度26-28℃，初始pH值6.0，120r/min振荡培养72h，制成B18液体制剂。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的牛肉膏蛋白胨斜面培养基为：牛肉膏7.0g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂17g，水1000mL；所述的改订营养肉质培养液为：牛肉膏7.0g，蛋白胨10g，NaCl 5g，仙人掌侧根组织浸渍液1000mL。

7.权利要求1所述的甲基营养型芽孢杆菌B18在植物病害生物防治中的应用，其特征在于，所述的植物为仙人掌、洋葱或蓝花楹，所述的病害为茎腐病或黑曲霉病。

8.权利要求1所述的甲基营养型芽孢杆菌B18在作为制备防治茎腐病或黑曲霉病药物中的应用。

9.权利要求1所述的甲基营养型芽孢杆菌B18的菌悬液或代谢产物在作为制备防治茎腐病或黑曲霉病药物中的应用。

10.权利要求1所述的甲基营养型芽孢杆菌B18防治茎腐病或黑曲霉病的方法，其特征在于，所述的方法是在植物生长过程中进行喷雾处理或灌根施用。