CN106399187A - 一株海洋细菌ba‑3及其在防治兰花病害中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一株海洋细菌BA‑3及其在防治兰花茎腐病病害中的应用。属于微生物技术领域。该海洋细菌解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BA‑3,保藏号为:CGMCC No.12745。该海洋细菌解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BA‑3可以防治兰花茎腐病菌和根腐病菌等引起的植物病害,特别可以与兰花共生,在兰花植株体内稳定生存并有效防治兰花茎腐病或根腐病。

Description

一株海洋细菌BA-3及其在防治兰花病害中的应用
技术领域
本发明涉及一株海洋细菌BA-3及其在防治兰花病害中的应用,属于微生物防治领域。
背景技术
当前对植物病害的防治主要以化学防治为主,然而化学农药的长期大量使用往往会导致环境污染、农药残留及致病菌产生抗药性等诸多问题,而生防菌以其低毒、无污染、不易产生抗药性和原料易得等特性被人们公认为为理想的微生物。用于防治植物病害的微生物主要是真菌和细菌两大类。其中生防细菌作用机理主要包括三个方面。一是拮抗作用,通过产生的抗生物质抑制病原菌生长;二是竞争作用,即生防菌株与致病性菌株间存在竞争作用,表现为土壤环境或作物根系中的营养竞争,以及根表或根内的侵染位点竞争,通过优先进入植株体内且稳定定殖,阻止或延迟致病性菌株的侵入,起到防病效果;三是诱导寄主产生抗性,通过生物或非生物处理诱导植物的一种自然防御机能,在此过程中抗病相关酶发挥了重要作用。目前,我国登记防治土传病害的生防菌均筛选自陆地寄主,因其耐盐性差在福建省沿海城市盐渍化地中难以发挥正常药效。海洋环境具有高盐、高压、低温、无光照等特点,造就了微生物种类更丰富的多样性和特殊性。海洋细菌作为海洋微生物中一个重要的类群,广泛分布在海洋各种环境中,如近岸、海滩、海洋动植物体内、海水和深海沉积物等。在这些所谓生命的极限环境中,海洋细菌通常具有独特的代谢途径和遗传背景,不仅确保其在极端环境中生存,也使其具备了产生特殊结构和功能的活性物质的能力。因此,海洋环境将成为细菌和细菌代谢产物的重要新来源,从海洋环境中分离筛选对植物病原物具有拮抗活性的细菌对于植物病害的生物防治具有重要的意义。
由尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)引起的兰花茎腐病是兰花种植过程中的毁灭性病害,它是一种世界性土传病害。在福建漳州、龙岩、三明等兰花产区发生严重,一般造成15%-30%产量损失。该病病原菌从假鳞茎伤口入侵,前期,叶片表现失水、扭曲;后期,假鳞茎及根部腐烂,水渍状,最后造成兰花整株死亡。在适宜温度和高湿条件下,极易发生该病害,严重影响植株生长。据报道,因茎腐病造成兰花死亡率可达20-30%,该病害被称之为兰花的“不治之症”。因此,及时有效防控成为兰花安全生产的重大需求。目前,防治茎腐病的主要策略为化学防治和培育抗病品种,化学防治污染环境且危害人类健康,抗病品种培育困难且存在抗性减弱的风险,因此,生物防治因其安全、高效、无残留成为人们最青睐的方法。特别是利用海洋微生物防治植物病害已有不少成功的例子,而有关运用海洋微生物防治兰花茎腐病在国内外未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一株海洋细菌BA-3及其在防治兰花病害中的应用,可用于防治由兰花茎腐病菌或根腐病菌引起的植物病害。
本发明提供的海洋细菌为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BA-3,保藏号为:CGMCC No.12745。
本发明提供了所述的海洋细菌BA-3在兰花茎腐病害中的应用。所述植物病害为兰
花茎腐病菌引起的植物病害。
本发明所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BA-3,已于2016年7月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC),保藏号为:CGMCC No.12745,地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
以上所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BA-3为活性成分的生物菌剂也
属于本发明的保护范围,在需要的时候,该菌剂中还可包含菌剂制备中常用的载体和辅料。
所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BA-3 为革兰氏阳性杆菌,菌株在营养琼脂(NA)培养基(每1000 mL含有蛋白胨 5 g,酵母浸膏1 g,牛肉膏 3 g,琼脂粉20 g ,葡萄糖10 g,pH值7.0 )平板上生长良好,菌落浅白色,边缘突起,细胞杆状(0.7-0.9×1.8-3.0μm)、链状生长、依靠周生鞭毛运动。产芽孢、芽孢圆形(0.6-0.8×1.0-1.4μm)、中生或端生、孢子囊不膨大。适宜生长温度为25-40℃,低于15℃或高于50℃时菌株不生长。
本发明的显著优点:
本发明的海洋细菌解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BA-3对兰花茎腐病有很强的抑制作用,具有对其引起的真菌病害起到防治作用的潜力。
本发明的海洋细菌解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BA-3分离自海南省海口市海边采集的海洋鱼类鱼体,实验证明接种兰花植株后能够有效防治兰花茎腐病,为兰花茎腐病的防治提供了一条环保、简单、有效的途径。
附图说明
图1为菌株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BA-3在NA培养基上的培养特征。
图2为不同温度处理对解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BA-3培养滤液抑制作用的影响。
图3为不同pH值处理对解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BA-3培养滤液抑制作用的影响。
图4为菌株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BA-3孢子悬浮液对兰花茎腐病的防效结果。其中处理I为同时接种解淀粉芽孢杆菌BA-3培养溶液和茎腐病菌孢子悬浮液的实验结果;处理Ⅱ先接种解淀粉芽孢杆菌培养液,2 d后接种茎腐病菌孢子悬浮液的实验结果;处理Ⅲ先接种茎腐病菌孢子悬浮液,2 d后接种解淀粉芽孢杆菌培养液的实验结果;以只接茎腐病菌孢子悬浮液为对照(CK)的实验结果。
具体实施方式
下述实施例中的方法,如无特别说明,均为常规方法。
下述实施例中的百分比(%),如无特别说明,均表示质量百分比。
其中兰花茎腐病菌菌株F-02分离自发病症状典型的根茎部,按常规方法进行组织分离培养获得,单孢纯化后按柯赫氏法则验证其致病性后移入PDA培养基试管斜面保存。菌株保藏于福建省农业科学院植物保护研究所生态调控室。
实施例1:海洋细菌的筛选与鉴定
1、海洋细菌的筛选
本发明的菌株是从海南海口市海洋鱼类上分离获得的,具体方法为:取海鱼的内脏、肠道、鳃和鳍等不同部位进行海洋细菌的分离筛选。采用平板稀释法分离海洋鱼类共附生细菌,取适量样品,分别用无菌海水反复冲洗,尽可能除去样品表面的非共附生微生物,再用无菌吸水纸将样品表面水分吸干,用 75%乙醇擦拭,接着将样品称重,匀浆,取上清液,用无菌海水分别按照 10-8、10-9、10-10、10-11、10-12稀释,吸取 200 μL 液体,均匀涂布于琼脂培养基(NA)培养基平板上,于培养箱中 28 ℃倒置培养,每天观察培养情况,根据菌株的形态特征和培养特征,去除重复的菌株。纯化的细菌菌株接种斜面培养基中培养后置于4℃冰箱保存备用。在倒好的PDA平板中央接入新鲜的兰花茎腐病菌块,将纯化后的细菌菌株用灭菌牙签点接于距离茎腐病菌琼脂块2 cm处。筛选抑菌活性最强的的菌株(抑菌圈直径为35mm),结果获得一株对兰花茎腐病具有很强拮抗作用的菌株(见图1),将该菌株命名为BA-3。
2、菌株BA-3的种属鉴定
采用常规生理生化特性对BA-3菌株进行鉴定,该菌株为革兰氏阳性杆菌,在营养琼脂(NA)培养基(每1000 mL含有蛋白胨 5 g,酵母浸膏1 g,牛肉膏 3 g,琼脂粉20 g ,葡萄糖10 g,pH值7.0 )平板上生长良好,菌落浅白色,边缘突起,细胞杆状(0.7-0.9×1.8-3.0 μm)、链状生长、依靠周生鞭毛运动。产芽孢、芽孢圆形(0.6-0.8×1.0-1.4 μm)、中生或端生、孢子囊不膨大。适宜生长温度为25–40℃,低于15℃或高于50℃时菌株不生长。生化实验结果表明,能水解明胶、淀粉;不水解纤维素;硝酸钠被还原成亚硝酸钠;能利用柠檬酸盐作为唯一的碳源;在1-7%NaCl盐浓度能生长;使用Gordon等人研究所用的培养基培养时,菌株能利用下列碳源产酸:阿拉伯糖、果糖、葡萄糖、乳糖、棉子糖、木糖、甘露醇和蔗糖;具有运动性,V.P反应阳性,接触酶反应呈阳性;依据《常见细菌鉴定手册》,BA-3菌株的以上生理生化特征均与解淀粉芽孢杆菌项目,因此,将其命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BA-3。其基本生物学特性详见表1。其16S rRNA 序列如SEQ ID NO.1所示。
表1解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BA-3的鉴定及其生理生化特性
注:“+”表示测定结果为阳性;“-”表示测定结果为阴性。
实施例2:解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BA-3培养滤液对兰花茎腐病菌的生物活性
1、BA-3培养滤液对兰花茎腐病菌孢子萌发的抑制作用
采用载玻片孢子萌发法,将兰花茎腐病菌孢子悬浮液培养12 h后,在放大160倍的光学
显微镜下观察,不接BA-3培养液的对照中,约有98%的孢子萌发,形成细长而均匀的芽管,但在接海洋功能细菌BA-3的培养滤液10倍、40倍、100倍中的孢子只有1-40%的萌发率,且芽管短,有些芽管变形,不均匀。具体萌发率及抑制率详见表2。
表2 海洋细菌BA-3培养滤液对兰花茎腐病孢子萌发的影响
2、不同浓度BA-3培养液对兰花茎腐病菌菌丝生长的影响
采用菌丝生长速率法。将BA-3菌株在NA上培养48~72 h,取各菌一接种环的菌苔分别接入100 mL 1号培养液(配方为:每1000 mL含有200 g马铃薯煮水滤汁、葡萄糖10 g,蛋白胨:10 g,MnSO4·7H2O 0.1 g,FeSO4·7H2O 0.1 g,KH2PO4 0.1 g)中培养24 h作种子液,再分别吸取20 μl种子液注入新培养液中,各培养液定量20 mL,瓶定量为150 mL,置于摇床28℃、150 r/min条件下培养120 h。取培养液于12000 r/min离心5 min,再取上清液,经0.22μm滤膜过滤获得上清滤液,置4℃保存备用。吸取各上清滤液与PDA培养基(温度45℃)混合制成含8%上清滤液的平板,于平板中央接种5 mm兰花茎腐病菌菌饼,倒置于培养箱中28℃下进行12 h黑暗交替培养,重复3次,以无菌水为对照, 11d观察兰花茎腐病菌菌丝生长情况,用十字交叉法测量各处理的菌落直径,计算生长速度抑制率。测定结果表明(表3),兰花茎腐病菌菌丝在含有不同浓度BA-3培养液的平板上生长受到不同程度的抑制作用。BA-3培养滤液的浓度对抗菌活性的影响较大,BA-3培养滤液被稀释500倍后几乎失去活性,在10倍时,生长6d后对兰花茎腐病菌菌丝生长的抑制效果最好,高达69.4%,且具有持续抑制率,11d时仍有65.1%的抑制率。同时,在滤液稀释100倍时,在11d时对兰花茎腐病菌菌丝生长的抑制作用仍比咪鲜胺500倍液的强。
抑制率(%)=[(空白对照菌落直径-菌饼直径)]-(处理菌落直径-菌饼直径)/(空白对照菌落直径-菌饼直径)×100。
表3 不同处理浓度BA-3培养滤液对兰花茎腐病菌菌丝生长的影响
3、不同温度处理对海洋细菌BA-3培养滤液抗菌活性的影响
PDA培养基溶化冷却到45℃左右时加入10 mL经不同温度处理的BA-3培养滤液(
培养滤液制作方法同上)和原始BA-3培养滤液,倒平板,以不加BA-3培养液的平板为对照;用无菌打孔器从长满兰花茎腐病菌的平板边缘打取直径为5 mm的菌苔,把菌苔移置平板中央,每皿一片,平板倒置于28℃培养箱中光暗交替培养。11 d观察兰花茎腐病菌菌丝生长情况并记载菌落大小。结果表明,温度对BA-3培养滤液的活性有一定的影响,经100 ℃处理30 min后活性有所下降,120 ℃处理30 min后失去活性,90 ℃以下的温度处理对BA-3培养滤液的活性没有影响,对兰花茎腐病菌的菌丝生长的抑制率也没有影响,和原液相差不大(图2)。
4、pH值对海洋细菌BA-3培养滤液稳定性的影响
用NaOH调节海洋细菌BA-3培养滤液pH值,60000 r/min离心20 min后,取上清液
备用。PDA培养基溶化冷却到45℃左右时加入10 mL经不同pH处理的BA-3培养滤液(
培养滤液制作方法同上)和相应pH值的无菌水。倒平板,以加相应pH值的无菌水的平板作为对照;用无菌打孔器从长满兰花茎腐病菌的平板边缘打取直径为5 mm的菌苔,把菌苔移置平板中央,每皿一片,平板倒置于28℃培养箱中光暗交替培养。11 d观察兰花茎腐病菌菌丝生长情况并记载菌落大小。结果表明(图3),pH为6.5时,BA-3培养滤液的抗菌活性最强,碱性条件下比酸性条件下的抑菌活性强;在酸性条件下,培养滤液的抗菌活性较弱。由此可见BA-3培养滤液在碱性条件下会比较稳定,但在略偏酸性条件下活性最强。
实施例3、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BA-3培养滤液对兰花茎腐病菌的防效测定
1、菌株BA-3培养滤液对茎腐病菌的防效测定:将所得培养滤液以无菌水稀释配制成浓度为200 mg/L、400 mg/L和800 mg/L的溶液。兰花茎腐病菌用PDA培养基培养,然后配成108 cfu/mL的孢子悬浮液备用。设3个接种处理:处理I为同时接种解淀粉芽孢杆菌BA-3培养溶液和茎腐病菌孢子悬浮液;处理Ⅱ先接种解淀粉芽孢杆菌培养液,2 d后接种茎腐病菌孢子悬浮液;处理Ⅲ先接种茎腐病菌孢子悬浮液,2 d后接种解淀粉芽孢杆菌培养液;以只接茎腐病菌孢子悬浮液为对照,三次重复。将接种后的兰花植株置于28℃下保湿培养14d后测量发病面积,计算抑制率。结果如图4所示,表明处理Ⅱ先接种解淀粉芽孢杆菌培养液,2 d后接种茎腐病菌孢子悬浮液病斑很小,几乎没有,防治效果最好;处理I同时接种解淀粉芽孢杆菌BA-3培养溶液和茎腐病菌孢子悬浮液的有少许病斑,但是均也很小;处理Ⅲ先接种茎腐病菌孢子悬浮液,2 d后接种解淀粉芽孢杆菌培养液病斑较大,但是比对照小;表明该解淀粉芽孢杆菌BA-3对兰花茎腐病有防治效果。
兰花植株发病情况分级标准:
0级———无病;
1级———病斑占根茎面积的5%以下;
3级———病斑占根茎面积的6%~10%;
5级———病斑占根茎面积的11%~25%;
7级———病斑占根茎面积的26%~50%;
9级———病斑占根茎面积的51%以上。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰,皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建省农业科学院植物保护研究所
<120> 一株海洋细菌BA-3及其在防治兰花病害中的应用
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1428
<212> DNA
<213> 芽孢杆菌菌属(Bacillus sp.)
<400> 1
tcaccccaat catctgtccc accttcggcg gctggctcct aaaaggttac ctcaccgact 60
tcgggtgtta caaactctcg tggtgtgacg ggcggtgtgt acaaggcccg ggaacgtatt 120
caccgcggca tgctgatccg cgattactag cgattccagc ttcacgcagt cgagttgcag 180
actgcgatcc gaactgagaa cagatttgtg ggattggctt aacctcgcgg tttcgctgcc 240
ctttgttctg tccattgtag cacgtgtgta gcccaggtca taaggggcat gatgatttga 300
cgtcatcccc accttcctcc ggtttgtcac cggcagtcac cttagagtgc ccaactgaat 360
gctggcaact aagatcaagg gttgcgctcg ttgcgggact taacccaaca tctcacgaca 420
cgagctgacg acaaccatgc accacctgtc actctgcccc cgaaggggac gtcctatctc 480
taggattgtc agaggatgtc aagacctggt aaggttcttc gcgttgcttc gaattaaacc 540
acatgctcca ccgcttgtgc gggcccccgt caattccttt gagtttcagt cttgcgaccg 600
tactccccag gcggagtgct taatgcgtta gctgcagcac taaggggcgg aaacccccta 660
acacttagca ctcatcgttt acggcgtgga ctaccagggt atctaatcct gttcgctccc 720
cacgctttcg ctcctcagcg tcagttacag accagagagt cgccttcgcc actggtgttc 780
ctccacatct ctacgcattt caccgctaca cgtggaattc cactctcctc ttctgcactc 840
aagttcccca gtttccaatg accctccccg gttgagccgg gggctttcac atcagactta 900
agaaaccgcc tgcgagccct ttacgcccaa taattccgga caacgcttgc cacctacgta 960
ttaccgcggc tgctggcacg tagttagccg tggctttctg gttaggtacc gtcaaggtgc 1020
cgccctattt gaacggcact tgttcttccc taacaacaga gctttacgat ccgaaaacct 1080
tcatcactca cgcggcgttg ctccgtcaga ctttcgtcca ttgcggaaga ttccctactg 1140
ctgcctcccg taggagtctg ggccgtgtct cagtcccagt gtggccgatc accctctcag 1200
gtcggctacg catcgtcgcc ttggtgagcc gttacctcac caactagcta atgcgccgcg 1260
ggtccatctg taagtggtag ccgaagccac cttttatgtc tgaaccatgc ggttcagaca 1320
accatccggt attagccccg gtttcccgga gttatcccag tcttacaggc aggttaccca 1380
cgtgttactc acccgtccgc cgctaacatc agggagcaag ctcccatc 1428

Claims (3)

1.一株海洋细菌,其特征在于:所述海洋细菌为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BA-3,已于2016年7月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为:CGMCC No.12745。
2.一种包含权利要求1所述海洋细菌的生物菌剂。
3.如权利要求1所述的海洋细菌在防治兰花病害中的应用。
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