CN102154112B

CN102154112B - 一种血栓溶酶高产菌株及血栓溶酶的制备方法

Info

Publication number: CN102154112B
Application number: CN2010105717421A
Authority: CN
Inventors: 王海宽; 罗宇东; 戚薇; 杜连祥; 曹兴南; 刘建军
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2010-12-03
Filing date: 2010-12-03
Publication date: 2012-11-14
Anticipated expiration: 2030-12-03
Also published as: CN102154112A

Abstract

本发明涉及一种血栓溶酶高产菌株及血栓溶酶的制备方法，菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号No.4368；制备血栓溶酶的步骤为：(1)活化菌株；(2)种子培养；(3)发酵培养；(4)分离纯化。本发明所涉及的丝状小孢根霉来源于酒曲中，产酶稳定，原料来源广泛，生产成本低廉；所获得的血栓溶酶对急性心肌梗死，脑梗死，肺血栓栓塞症等具有良好的治疗效果，血栓溶酶源自酒曲，安全性好，毒副作用小，因此适合开发成口服类溶栓剂。

Description

一种血栓溶酶高产菌株及血栓溶酶的制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其一种血栓溶酶高产菌株及血栓溶酶的制备方法。

背景技术

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)等血栓栓塞性疾病的致残率和致死率都很高，是引起人类死亡的三大疾病之一，严重威胁人类生命和健康，目前全世界约有1500万病人，而且发病率有增无减。

血栓的主要成分是血纤维蛋白(Fibrin)。血液凝固与纤维蛋白溶解是一对重要的生理过程，二者相互矛盾又彼此联系，各受一系列酶促反应的调节。血纤维蛋白的生成是血浆中各凝血因子按一定方式、次序的激活过程和一系列酶促反应的结果，凝血酶(Thrombin)的生成是中心环节。人血浆中主要依靠纤溶酶(Plasmin)降解纤维蛋白。血浆中的纤溶酶以前体物纤溶酶原(Plasminogen)形式存在，激活血纤维蛋白溶酶原的酶称为血纤维蛋白溶酶原激活剂(PA)。此外，血浆中还存在抑制各酶活性的抑制因子，在正常的血液中，抑制作用占优势。在人体正常情况下，凝血系统、纤维蛋白溶解系统及其抑制系统处于平衡状态，人体既不出血也不形成血栓。在病理情况下，凝血系统功能亢进或纤溶系统功能降低，就形成血栓或有形成血栓的倾向。

纤维蛋白溶解与溶血栓密切相关，纤溶酶在人体内含量少，又难提纯，所以临床治疗中常用纤溶激活剂和纤溶酶作为外来物增强纤溶作用。因此纤溶酶原激活剂和纤溶酶的研究占有重要地位。

溶栓疗法是早期急性心肌梗塞和其它血栓栓塞性心血管疾病的有效治疗方法，其主要是通过药物溶解血栓中的主要基质血纤维蛋白，或激活血液中无活性的血浆纤溶酶原，形成有活性的纤溶酶来催化血纤维蛋白的水解，使血栓溶解，血管再通。溶栓疗法被誉为20世纪心脑血管学方面的十大发现之一，受到各国的高度重视。

国内外已正式批准临床使用的主要溶栓剂有：链激酶(streptokinase，SK)、尿激酶(urokinase-type plasminogen activator，UK，u-PA)、重组组织型纤溶酶原激活剂(recombinant tissue-type plaminogen activator，rt-PA)，对-甲氧苯甲酰纤溶酶原链激酶激活剂复合物(anisoylated plasminogen streptokinase activatorcomplex，APSAC)和重组链激酶(recombinant streptokinase，r-SK)。SK和UK常称为第一代溶剂，它们没有纤维蛋白的特异性；t-PA、rt-PA、APSAC和r-SK称为第二代溶栓剂，有纤维蛋白的特异性。

现有的溶栓药物疗效肯定，明显降低了AMI患者的死亡率和致残率，但还存在许多缺陷，主要表现在初始再灌注延迟或失败、出血等不良反应，以及再梗死等问题，而且大多数现有溶栓药物价格昂贵，因此，研制高效、快速、防止再栓塞及减低出血等不良反应的新型溶栓药物的需求迫切。全球每年所需溶栓剂的潜在市场约20亿美元。

溶栓药物的研究开发相当活跃，已成为生物工程和生物医学领域的一个研究热点。一方面，对现有溶栓药物进行改造，以提高其特异性和溶栓效果；另一方面，从不同生物体中寻找新型的、相对廉价有效的溶栓剂也是一个热点。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了血栓溶酶高产菌株及血栓溶酶的制备方法，本血栓溶酶最适pH接近人体血液pH而且具有较好的pH稳定性的血栓溶酶的制备方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种血栓溶酶高产菌株，菌株属于菊芋小孢根霉菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2010年11月26日，保藏编号No.4368，分类命名：Rhizopus microsporus var.tuberosus。

一种血栓溶酶的制备方法，其特征在于：制备方法的步骤是：

(1)挑取菊芋小孢根霉菌CGMCC No.4368，接种于种子培养基中，在28-32℃、150-170r/min条件下培养10-12h，得到种子培养液；

(2)将种子培养液以20％的接种量接种于发酵培养基上，28-32℃、170-175r/min培养50-70h，至产酶高峰期，得到发酵培养液；

(3)将上述发酵培养液低温高速离心除菌体，上清即为血栓溶酶粗酶液；

所述种子培养基与发酵培养基内包括碳源、氮源、水，pH自然。

而且，所述步骤(1)前还包括将保藏的菊芋小孢根霉菌株进行活化，将活化出菌株用于种子培养。

而且，所述碳源为糊精、麸皮或淀粉中的一种或两种以上的组合物，所述氮源为铵盐、硝酸盐、豆粕、牛肉浸膏、蛋白胨或酵母浸膏中的一种或两种以上的混合物。

而且，所述碳源优选糊精，其加入量为培养基总重量的1.0-1.5％。

而且，所述氮源为优选豆粕和蛋白胨作为组合氮源，其加入量为培养基总重量的2％，其中蛋白胨既作为氮源，又作为诱导物。

而且，所述血栓溶酶粗酶液，经饱和度为70％的硫酸铵水溶液进行盐析，对沉淀物质进行除盐，然后真空冷冻干燥机制成粉末，即得到血栓溶酶粗酶粉。

而且，所述种子培养基的优选成分为每1L水含如下重量份数的成分：糊精15-25份、蛋白胨10-20份、pH自然，所述发酵培养基的优选成分为每1L水含如下重量份数的成分：糊精5-15份、蛋白胨15-25份、豆粕15-25份。

而且，所述血栓溶酶粗酶液中血栓溶酶的最适酶作用温度为37℃，最适酶作用pH为7.0。

本发明的优点和积极效果是：

1、本发明的菊芋小孢根霉及其变异菌株能够有效的产生本发明的血栓溶酶，涉及的菌株使用的碳源是选用微生物菌种中可利用的且适于发酵产生血栓溶酶的碳源，其氮源则选择蛋白胨和豆粕，其中蛋白胨既可以作为氮源，又可以作为诱导物，豆粕的原料来源广泛，为大规模生产提供便利条件。

2、本发明菌株菊芋小孢根霉产生的血栓溶酶最适酶作用温度为37℃，与人体体温基本一致，作为治疗心脑血管疾病的口服药剂有较大的优势，该酶在37℃保温4h酶活力仍保存80％，47℃和52℃下保温4h酶活力均保存35％，57℃下保温4h后仍有一定酶活，说明该酶具有一定的耐热性。

3、本发明菌株菊芋小孢根霉产生的血栓溶酶最适作用pH为7.0，且该酶最稳定的pH范围是6-8，与人体血液的pH 7.35-7.45相适应，该血栓溶酶在此pH和37℃保温24h，酶活力保存80％以上。

4、本发明菌株菊芋小孢根霉产生的血栓溶酶在4＜pH＜11范围内酸性或碱性条件引起的酶活性降低是可以部分恢复的，具有一定程度的可逆性。

附图说明

图1为本发明血栓溶酶的反应温度和相对酶活的关系图；

图2为本发明血栓溶酶的反应pH和相对酶活的关系图；

图3为本发明血栓溶酶在不同作用时间下各种温度的残余酶活的图；

图4为本发明血栓溶酶在不同作用温度下的残余酶活的图；

图5为本发明血栓溶酶在不同pH下处理后残余酶活的图；

图6为本发明血栓溶酶在pH处理后调整pH与不调整pH的比较图；

图7为本发明血栓溶酶在不同金属离子存在下相对酶活的图。

具体实施方式

以下将本发明的内容通过下列的较优的实施例作进一步的阐述，但这些实施例并不限制本发明的保护范围。

1、菊芋小孢根霉菌种Cq-1的分离

将酒曲样本置于无菌研体中，加入10mL无菌水，研磨成均匀的悬浮液，通过以PDA培养基作为初筛底物，纤维蛋白作为复筛底物，透明圈作为筛选标记，进行微生物菌种的培养、分离和筛选，获得了一批产血栓溶酶的微生物菌株，并从中分离出1株高产血栓溶酶产生菌株，编号为Cq-1，分类为Rhizopus，该菌具有产生血栓溶酶的优良特性，该菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号CGMCC No.4368。

2、菊芋小孢根霉Cq-1的保藏，以及长期保藏的菌种的活化

保藏：该菌采用常规的斜面传代保藏法，具体方法是：将分离出的菌种接种于霉菌基本培养基斜面的表面，28℃培养5天，再于4℃下保藏，每3到4个月转接一次，或者添加15％甘油制成液体菌种，-70℃超低温保藏可达6个月，或者利用真空冷冻干燥法将本发明菌种制成干粉菌种，低温和常温保藏可达1年以上。

活化：长期保藏的菌种依照如下方法进行活化，将长期保藏的菊芋小孢根霉菌种接种于霉菌基本培养基或者PDA培养基等其他适于霉菌生长的培养基表面，28℃培养5天。本步骤优先选用PDA培养基，其配方为：去皮马铃薯200g，切成小块，加1000mL水煮沸1h，用双层纱布滤成清液。补水至1000mL，然后加入20g葡萄糖完全溶解，pH自然。加入琼脂20g。

3、利用菊芋小孢根霉生产血栓溶酶的方法如下：

(1)将长期保藏的菊芋小孢根霉菌种CGMCC No.4368经过活化，将活化出菌株用于血栓溶酶的发酵培养；

(2)挑取上述菌株，接种于60mL/250mL种子培养基中，28℃、150r/min条件下培养11h，得到种子培养液；

种子培养基成分为：糊精20g、蛋白胨15g、蒸馏水1000mL、pH自然。

(3)将种子培养液以20％的接种量接种于发酵培养基上，28℃、170r/min培养60h，至产酶高峰，得到富含血栓溶酶的培养液；

发酵培养基成分为：糊精10g、蛋白胨20g、豆粕20g、蒸馏水1000mL、pH自然。

(4)将上述培养液在4℃、8000r/min条件下离心15min，弃去固形物，上清即为粗酶液，将得到的粗酶液，以饱和度为70％的硫酸铵进行盐析，对沉淀物质进行除盐，然后真空冷冻干燥机制成粉末，即得到粗酶粉。

在上述实验中涉及的种子培养基和发酵培养基，其中的培养基的营养源，可广泛使用通常用于生产的营养源，碳源、氮源以及产酶诱导剂的说明如下：

碳源：选用微生物菌种可利用的、适于发酵产生本发明的血栓溶酶的碳源即可，例如，可使用糊精、麸皮、淀粉等。本发明中优选糊精，其用量为1.0-1.5％，葡萄糖对产酶有一定的葡萄糖抑制效应。

氮源：只要是可作为氮源同化的含氮物质即可，例如，可用铵盐、硝酸盐、豆粕、牛肉浸膏、蛋白胨、酵母浸膏等，用量根据其它营养成分的不同而定。本发明中，优选豆粕和蛋白胨作为组合氮源，其用量均在2％。

产酶诱导剂：蛋白胨在本发明里既作为氮源，又作为诱导物。

4、以下是对本实验产生的血栓溶酶的理化性质进行检测分析

(1)血栓溶酶酶活的测定方法

方法：平板溶圈法

溶液A：0.2g血纤维蛋白原溶于50ml巴比妥(pH7.8)溶液中。

溶液B：0.25g琼脂糖溶于50ml医用生理盐水，加热溶解。

溶液A在45℃水浴锅中保温5min，溶液B在45℃水浴锅中保温30min，然后加入200U/ml的凝血酶1ml，混匀。分别取5ml溶液A和5ml溶液B铺在平板上混匀，即为血纤维蛋白平板。

用尿激酶标准品做纤溶酶活性标准曲线，37℃保温6h，标准曲线采用指数回归，其方程Y＝0.1052e^4.013x，R₂＝0.9965；式中Y为酶活力，X为溶圈直径。取待测样品10μL点在血纤维蛋白平板上，37℃保温6h后测定溶圈直径，通过上述回归方程计算待测样品酶活力。

(2)作用温度对血栓溶酶活性的影响

最适作用温度的确定，是参照实施例4所述的酶活力检测方法，在27-57℃范围内，以5℃为间隔，测定温度对酶活力的影响。以所测得酶活力最高的温度下的酶活力值为对照，设定其相对酶活力为100％，则反应温度和相对活性的关系如图1所示。结果表明，在27℃-37℃范围内，随温度的升高，酶反应速度加快，酶活力升高；高于37℃，酶活力下降。其最适作用温度为37℃，明显表现出作为口服药品的活性优势。

(3)作用pH对血栓溶酶活性的影响

最适作用pH的确定，参照实施例4所述的酶活力检测方法进行，配制pH值为2.8-11.8的广范围的缓冲液作为溶剂，以0.6为间隔，测定pH对酶活力的影响。以所测得酶活力最高的pH条件下的酶活力值为对照，设定其相对酶活力为100％，则作用pH和相对活性的关系如图2所示。人体血液的pH在7.35-7.45之间，该酶最适作用pH为7.0，表现出治疗优势。

(4)血栓溶酶的温度稳定性

依照实施例3获得血栓溶酶粗酶液，分别在27、32、37、42、47、52、57℃下保温30min、1h、2h、4h，然后按照上述实施例4所述的酶活力测定方法对残余酶活里进行测定。以未进行保温处理的酶活力值作为对照，设定其相对酶活力为100％，则此时的处理温度和残余活力关系如图3和图4所示。结果可见，该酶在37℃下比较稳定，37℃保温4h酶活力保存80％，47℃和52℃下保温4h酶活力均保存35％，57℃下保温4h后仍有一定酶活，说明该酶具有较好的耐热性。

(5)血栓溶酶的pH稳定性

需配制pH3、4、5、6、7磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，pH8、9巴比妥钠-盐酸缓冲液，pH10硼砂-氢氧化钠缓冲液，pH11磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲液和pH12氯化钾-氢氧化钠缓冲液，浓度均为0.02M。依照实施例3获得血栓溶酶粗酶液，以1∶1分别与pH3-12的缓冲液进行混合，均匀混合后置37℃恒温箱下保温2h、4h、12h、24h，调整酶液pH为7.0，然后按照上述实施例4所述的酶活力测定方法对残余酶活力进行测定。以未进行处理的酶活力值作为对照，设定其相对酶活力为100％，则不同处理pH和残余活力关系如图5所示。本发明所获得的血栓溶酶的pH稳定性曲线是典型的钟罩形曲线，该酶最稳定的pH范围是6-8，37℃保温24h，酶活力保存80％以上，可见该酶的pH稳定性很好。

(6)pH对血栓溶酶引起的失活的可逆性

为了考察pH对根霉纤溶酶引起的失活是否可逆，还进行了纤溶酶在不同pH值37℃保温一定时间后，不调整pH为7.0，而直接测定纤溶酶活力的实验。图6显示纤溶酶在不同pH值37℃保温一定时间后，不调整pH为7.0，直接测定的纤溶酶活力与调整pH为7.0测定的纤溶酶活力的差别。图6表明，pH大于4、小于11范围内酸性和碱性条件引起的酶活性降低是可以部分恢复的，具有一定程度的可逆性。这些实验结果说明pH对血栓溶酶活性的影响一方面是酶的空间结构改变，引起酶活力降低；另一方面pH值影响酶活性部位催化基团的解离状态，使血纤维蛋白的分解反应速率下降；此外可能还影响酶活性部位结合基团的解离状态，使血栓溶酶对血纤维蛋白的结合能力下降。

(7)金属离子对血栓溶酶活性的影响

金属离子对血栓溶酶活性影响的测定，用去离子水配制10mmol/L和1mmol/L的NaCl、KCl、CaCl₂、MnSO₄、AlCl₃、CuSO₄、FeSO₄、ZnSO₄溶液，取血栓溶酶酶液与同体积的不同浓度金属离子溶液混合，放入37℃恒温箱中保温18h，测定其酶活力，用血栓溶酶与去离子水混合作对照，设定其相对酶活力为100％，则不同离子对酶活性的影响如图7所示。结果显示，除了CuSO₄和ZnSO₄抑制血栓溶酶的活性之外，其他金属离子都对酶有一定的激活作用，其中NaCl、CaCl₂和MnSO₄的作用较为明显，且当金属离子浓度为10mmol/L时的激活作用比1mmol/L时要高。

通过本发明如上的阐述，得到后面实施例的进一步验证，得知本发明血栓溶酶的酶学特性。

作为本发明血栓溶酶的产生菌种，既可为本发明所保护的菌种，也可为自然筛选的原始菌株，或为保护菌株通过自然变异或人工诱导变异的变异菌株，通过本发明所述的方法，均可实现本发明阐述的技术效果。

作为上述变异菌株的研制方法，包括常规物理诱变，如紫外线辐射、离子注入、激光辐照等各种射线处理；化学诱变，如硫酸二乙酯(DES)、亚硝基胍(NTG)等化学诱变剂处理，以及用常规血栓溶酶产生菌筛选培养基及方法优选出生产性能优异的菌种等。

另外，也可通过分子生物学技术，从原始菌株或诱变菌株中获取血栓溶酶基因，通过shuffling等手段获得突变基因，以原核微生物，如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等作为基因受体菌构建基因工程生产菌株，也可作为本发明的血栓溶酶产生菌种。

Claims

1.一种血栓溶酶高产菌株，其特征在于：菌株属于菊芋小孢根霉菌(Rhizopusmicrosporus)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号CGMCC No.4368。

2.一种血栓溶酶的制备方法，其特征在于：制备方法的步骤是：

3.根据权利要求2所述的血栓溶酶的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)前还包括将保藏的菊芋小孢根霉菌株CGMCC No.4368进行活化，将活化出菌株用于种子培养。

4.根据权利要求2所述的血栓溶酶的制备方法，其特征在于：所述碳源为糊精、麸皮或淀粉中的一种或两种以上的组合物，所述氮源为铵盐、硝酸盐、豆粕、牛肉浸膏、蛋白胨或酵母浸膏中的一种或两种以上的混合物。

5.根据权利要求4所述的血栓溶酶的制备方法，其特征在于：所述碳源优选糊精，其加入量为培养基总重量的1.0-1.5％。

6.根据权利要求4所述的血栓溶酶的制备方法，其特征在于：所述氮源为优选豆粕和蛋白胨作为组合氮源，其加入量为培养基总重量的2％，其中蛋白胨既作为氮源，又作为诱导物。

7.根据权利要求2所述的血栓溶酶的制备方法，其特征在于：所述血栓溶酶粗酶液，经饱和度为70％的硫酸铵水溶液进行盐析，对沉淀物质进行除盐，然后真空冷冻干燥机制成粉末，即得到血栓溶酶粗酶粉。

8.根据权利要求2或4所述的血栓溶酶的制备方法，其特征在于：所述种子培养基的优选成分为每1L水含如下重量份数的成分：糊精15-25份、蛋白胨10-20份、pH自然，所述发酵培养基的优选成分为每1L水含如下重量份数的成分：糊精5-15份、蛋白胨15-25份、豆粕15-25份。

9.根据权利要求2所述的血栓溶酶的制备方法，其特征在于：所述血栓溶酶粗酶液中的血栓溶酶的最适酶作用温度为37℃，最适酶作用pH为7.0。