CN110075282A - 一种缓解血栓的纳豆复合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种缓解血栓的纳豆复合物。本发明还公开了一种缓解血栓的纳豆复合物的制备方法，包括如下步骤：将活化后纳豆芽孢杆菌种子液均匀喷洒在发酵底物表面，再加入含硒溶液混合均匀，发酵，然后加入生理盐水，过滤，纯化得到富硒酶制剂；将富硒酶制剂和缓释保护剂混合均匀，接着微胶囊化得到缓解血栓的纳豆复合物。本发明通过多重手段综合作用，提高抗凝、溶栓的效果，而且大幅硒元素含量，提高抗氧化能力，还具有降血压作用，同时能有效防止纳豆激酶在体内由于温度或者pH环境的变化而引起失活。

Description

一种缓解血栓的纳豆复合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种缓解血栓的纳豆复合物及其制备方法。
背景技术
当血管壁受损时，皮下组织会暴露，此时血小板会粘附在受损部位并发生聚集和释放反应，聚集产生血小板血栓或血小板堵塞物，释放出凝血因子，而凝血因子会启动内源性和外源性凝血系统产生纤维蛋白，纤维蛋白在促凝物质作用下形成血栓。血栓的形成的目的是止血，促进受损组织恢复，这是人体一种重要的生理防御行为。当受损血管得到修复后，血栓会吸附血液中的纤溶酶原并激活其为纤溶酶，纤溶酶能够分解血栓的主要骨架纤维蛋白从而溶解血栓，以恢复血流通畅、促进组织恢复，相对血栓形成而言，血栓溶解是生理修复行为。
在正常生理状态下，血液的凝血和溶血两个系统维持着动态平衡，既能在需要时止血复创，又能及时疏通血管，维持着血液的正常循环。但当这种平衡被打破时，会出现两种情况：第一、凝血能力下降或溶栓能力亢进，从而导致内出血的发生；第二、溶栓能力下降或凝血能力增强导致过多血栓的形成，引起脑血栓、新血栓等血栓类疾病，这也是目前最为常见的心脑血管类疾病。
目前，血栓性疾病的治疗方法包括抗栓治疗、溶栓治疗、经皮冠状动脉介入治疗以及手术治疗等。溶栓治疗因其方便、快捷、易于在基层医院开展等优势而逐渐成为血栓性疾病的首选治疗方案。其中溶栓药物一般为纤溶酶原激活剂，可激活纤溶酶原转化为纤溶酶，从而降解纤维蛋白达到溶解血栓的目的。目前已经开发出多种溶栓剂用于临床治疗，但各种溶栓剂均存在价格昂贵、副作用过强、缺乏溶栓特异性、半衰期较短等问题。
纳豆激酶作为一种新型的溶栓剂，具有其它溶栓药物不可比拟的优点：首先纳豆激酶来源于食物，安全性能好，价格低廉；其次纳豆激酶的分子量为27728，是一个单链蛋白质，包含275个氨基酸，不含二硫键，易被人体吸收；最重要是纳豆激酶能直接溶解血栓，且溶栓作用强，其溶栓活性是纤溶酶的四倍，在体内作用时间长，无毒副作用。
然而，纳豆激酶作为蛋白酶类药物仍存在一些缺点，如容易受到外部环境的影响、对温度和pH的变化敏感、易失活等限制了其在溶血栓治疗中的应用。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种缓解血栓的纳豆复合物及其制备方法，能有效保护纳豆激酶，提高溶血栓的疗效，改善缓释速度，还能有效降低血压。
本发明提出的一种缓解血栓的纳豆复合物的制备方法，包括如下步骤：
S1、将活化后纳豆芽孢杆菌种子液均匀喷洒在发酵底物表面，再加入含硒溶液混合均匀，发酵，然后加入生理盐水，过滤，纯化得到富硒酶制剂；
S2、将富硒酶制剂和缓释保护剂混合均匀，接着微胶囊化得到缓解血栓的纳豆复合物。
优选地，S1中，纳豆芽孢杆菌采用高桥纳豆素。
优选地，S1中，发酵底物按重量百分比包括：菜籽粕20～30％，米糠8～15％，余量为花生粕。
优选地，S1中，含硒溶液为无机硒水溶液，优选为亚硒酸钠水溶液。
优选地，S1中，发酵底物、活化后纳豆芽孢杆菌种子液、亚硒酸钠的质量比为100：8～12：2×10-6～3×10-6。
优选地，S1中，含硒溶液为有机硒水溶液，优选为酵母硒水溶液。
优选地，S1中，发酵底物、活化后纳豆芽孢杆菌种子液、酵母硒的质量比为100：8～12：20～30。
优选地，S1中，发酵时间为24～36h，发酵温度为34～38℃。
优选地，S1中，加入生理盐水浸泡4～6h，浸泡温度为6～8℃。
优选地，S1中，纯化的具体操作如下：将滤液离心20～30min，离心速度为8000～12000r/min，离心温度为3～5℃，取一次上清液，向一次上清液中加入硫酸铵进行一级盐析，使一次上清液中硫酸铵质量分数达到13.3～13.6％，接着取二次上清液，向二次上清液中加入硫酸铵进行二级盐析，使二次上清液中硫酸铵质量分数达到31.6～31.7％，然后取沉淀物进行溶解，将溶解液进行透析，透析膜的截留分子量为10000～20000D，透析过程中换水频率为1.5-2.5h/次，直到滴加氯化钡溶液无沉淀生成。
当盐浓度高于某一数值时，蛋白质的溶解度会随着盐浓度的增加而下降，此过程即为盐析。盐析的发生主要是由于盐浓度升高到一定数值后，水活度降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚集，并从溶液中析出。
一般情况下，蛋白进行沉淀时多选用硫酸铵为盐析剂，其优点如下：溶解度大，对温度不敏感(即随着温度变化，其饱和溶解度变化较小)，分级效果好，有稳定蛋白质结构的作用，而且价格较低廉，溶液可以回收利用，污染少。
由于纳豆芽孢杆菌在发酵过程中不仅会产出纳豆激酶，而且会产生荚膜多糖，在低温离心后，荚膜多糖和纳豆激酶共同存在于一次上清液中，本发明采用分级盐析，先使硫酸铵质量分数达到13.3～13.6％，有效去除杂蛋白，再继续使硫酸铵质量分数达到31.6～31.7％，将纳豆激酶形成沉淀，保证了回收率和纯化倍数，回收率可达94.96％，纯化倍数为3.81，同时简化操作过程，降低成本，更利于纳豆激酶的商业化生产。
优选地，S2中，富硒酶制剂和缓释保护剂的质量比为1：20～26。
优选地，S2中，缓释保护剂为树枝状高分子、麦芽糊精、辛烯基琥珀酸淀粉中至少一种。
优选地，S2中，树枝状高分子为氨基酸类树枝状聚合物或改性所述氨基酸类树枝状聚合物。
氨基酸类树枝状聚合物以氨基酸为原料，分子结构中含有肽键的树枝状高分子。氨基酸类树枝状聚合物具有如下特点：类似蛋白一样的球状结构、多价结构产生的功能放大、优异的生物相容性、低细胞毒性、水溶性、耐蛋白酶水解、生物降解等。
优选地，S2中，氨基酸类树枝状聚合物为脯氨酸树枝状聚合物、赖氨酸树枝状聚合物、谷氨酸树枝状聚合物、精氨酸树枝状聚合物、天冬氨酸树枝状聚合物中的至少一种。
优选地，S2中，改性所述氨基酸类树枝状聚合物为改性天冬氨酸树枝状聚合物。
优选地，S2中，改性天冬氨酸树枝状聚合物由天冬氨酸树枝状聚合物与胺化β-环糊精反应生成。
优选地，S2中，天冬氨酸树枝状聚合物为三代天冬氨酸树枝状分子，天冬氨酸树枝状聚合物与胺化β-环糊精的摩尔比为1：8～9。
上述天冬氨酸树枝状聚合物的制备方法参考《魏军.具体按动氨酸水凝胶的合成及其应用[D].北京:北京化工大学,2016:107-112.》。
优选地，S2的改性天冬氨酸树枝状聚合物的制备工艺具体如下：将天冬氨酸树枝状聚合物与胺化β-环糊精混合均匀，升温，保温，接着透析，干燥得到改性天冬氨酸树枝状聚合物。
优选地，S2中，改性天冬氨酸树枝状聚合物的制备工艺具体如下：将天冬氨酸树枝状聚合物与胺化β-环糊精混合均匀，升温至60～80℃，保温30～36h，接着透析100～110h，透析过程中换水频率为3～4h/次，干燥得到改性天冬氨酸树枝状聚合物。
优选地，上述胺化β-环糊精采用如下工艺制备：将β-环糊精加入水中混合均匀，混合过程中滴加碱性水溶液，再滴加甲基苯磺酰氯乙腈溶液，室温搅拌，过滤，调节pH值至10，低温过夜，过滤，收集沉淀物，调节至中性，重结晶，干燥，接着溶于乙二胺中，调节温度，保温，旋转蒸发，将旋转蒸发后产物加入丙酮中过夜，将沉淀物抽滤，纯化，干燥得到胺化β-环糊精。
优选地，上述胺化β-环糊精制备工艺中，β-环糊精与甲基苯磺酰氯乙腈溶液的质量比为63.5～70.3：25～27。
优选地，上述胺化β-环糊精制备工艺中，甲基苯磺酰氯乙腈溶液的滴加过程中维持体系温度为3～4℃。
优选地，上述胺化β-环糊精制备工艺中，滴加甲基苯磺酰氯乙腈溶液后室温搅拌时间为1.5～3.5h。
优选地，上述胺化β-环糊精制备工艺中，低温过夜具体为：4～6℃保存12～16h。
优选地，上述胺化β-环糊精制备工艺中，溶于乙二胺中后调节温度为82～86℃，保温3.5～5.5h。
优选地，上述胺化β-环糊精制备工艺中，纯化的具体操作为：将抽滤后产物溶于甲醇水溶液，再用丙酮沉出。
本发明还提出的一种缓解血栓的纳豆复合物，采用上述缓解血栓的纳豆复合物的制备方法制得。
本发明S1中，采用菜籽粕、米糠、花生粕配合作为发酵底物，采用高桥纳豆素使发酵底物与含硒溶液同时被分解吸收，一方面为纳豆芽孢杆菌提供充足的碳源和氮源，使其生长良好，所分泌的蛋白酶可水解发酵底物中的蛋白成分，获得具有抗氧化活性的肽类，另一方面使所得产物为富硒酶制剂，大幅提高酶制剂中硒元素含量，提高抗氧化活性。
同时根据通过背景技术中血栓的形成机理可知，血栓的形成主要是由血管壁的损伤导致的，通过研究表明，血管壁的损伤主要是由于体内自由基的作用形成的，主要表现在以下三个方面：1、自由基会直接损伤血小板膜和血管内皮细胞膜，引起血小板和纤维蛋白在血管管壁上大量粘附和凝聚，从而导致血管管壁上血栓斑块的形成；2、自由基可以直接造成血管内壁组织的损伤；3、体内过量的氧自由基与低密度脂蛋白(LDL-C)结合生成脂质过氧化物，该脂质过氧化物可渗透到血管内壁细胞间隙里，然后被血管内壁里的巨噬细胞所吞噬，形成脂质泡沫细胞，大量的脂质泡沫细胞沉积在动脉血管管壁上，就形成了血栓斑块。
而S1所得富硒酶制剂针对血栓的形成机理，通过多种手段进行调控，一方面纳豆激酶作为丝氨酸蛋白酶，对纤维蛋白具有很强的水解作用，可以直接作用于交联纤维血栓的Leu-Tyr和Ser-His之间的酶切位点上，将纤维蛋白水解成可溶性的小分子，从而达到直接溶解血栓的作用，另一方面纳豆激酶可以刺激血管内皮细胞产生内原组织型纤溶酶原激活剂，而内原组织型纤溶酶原激活剂可激活体内的纤溶酶原转化为纤溶酶，纤溶酶可溶解将已形成的纤维蛋白，进一步促进其溶栓作用，而且纳豆激酶可以激活体内的尿激酶原转化为尿激酶，发挥溶栓作用，从而其增强溶栓效果，同时纳豆激酶可以降解PAI-1，从而达到调控PAI-1、t-PA、纤溶酶与纤维蛋白间的平衡，来改善体内的溶栓作用；其次由于S1所得富硒酶制剂中硒含量较高，能与具有抗氧化活性的肽类配合，能有效清除机体内的自由基，保护血管壁胶原和弹性组织的完整，防止血管壁的损伤，预防血栓的形成。
而含硒溶液既可以是有机硒也可以是无机硒，有机硒更利于纳豆芽孢杆菌吸收利用，但成本较高，而无机硒虽然成本较低，但具有细胞毒性，故本申请人经过反复试验验证，选取高桥纳豆素作为纳豆芽孢杆菌最优品种，保证所得富硒酶制剂的活性和产率；通过限定发酵的时间和温度，限定生理盐水浸提条件，一方面促进纳豆芽孢杆菌的生长繁殖，提高分泌的蛋白酶产量，另一方面促进发酵底物被适宜水解，避免具有抗氧化活性的肽类被二次分解，保证抗氧化肽的产量。
针对上述论证，本申请人还发现所得富硒酶制剂还含有血管紧张素转换酶抑制剂，抑制催化血管紧张素I转化为血管收缩剂血管紧张素Ⅱ，使血压下降，而且抑制降解血管扩张剂舒缓激肽，舒缓血管，降低血压，同时在上述论证过程中，富硒酶制剂既具有较强的溶栓效果，又具有较好的抗氧化能力，保护血管壁胶原和弹性组织的完整，从而进一步降低血压。
本发明S2中，麦芽糊精、辛烯基琥珀酸淀粉、树枝状高分子均作为保护剂，可以对S1所得富硒酶制剂起到保护、缓释的效果；其中麦芽糊精作为高分子多糖，可把富硒酶制剂包裹起来，以减少后续操作过程中的活性损失，辛烯基琥珀酸淀粉酯作为变性淀粉，既可包覆富硒酶制剂进行保护，又能起到乳化稳定的作用，而树枝状高分子内部具有空腔结构，通过静电引力、范德华力和氢键等作用将富硒酶制剂包封在外紧内松的空腔结构中，然后进入体内循环，通过扩散、水解、酶解等方式将富硒酶制剂释放出来，达到缓释的效果，从而维持相应的浓度和活性，保证溶栓、抗氧化、降血压的效果。
而通过限定树枝状高分子为氨基酸类树枝状聚合物或改性所述氨基酸类树枝状聚合物，提高树枝状高分子与富硒酶制剂相容性，而且能降低细胞毒性，减少对机体的损伤。进一步限定为改性天冬氨酸树枝状聚合物，不仅缓释效果好，而且提高树枝状高分子对富硒酶制剂的固定量。
β-环糊精的结构为略呈锥形的圆环，虽然是多羟基化合物，但羟基活性较低，难以直接参加反应，现利用其羟基与甲基苯磺酰氯进行反应，从而在β-环糊精上接枝磺酰化基团，再通过与乙二胺反应生成胺化β-环糊精，在β-环糊精上接枝有较强反应活性的伯氨基(乙二胺基团)，而胺化β-环糊精的伯氨基与天冬氨酸树枝状聚合物的羧基进行反应生成酰胺基团，从而使β-环糊精成功接枝在天冬氨酸树枝状聚合物上，使所得改性天冬氨酸树枝状聚合物既可以利用树枝状聚合物自身的分子空腔结构对富硒酶制剂进行固定，又能通过β-环糊精的空腔将富硒酶制剂固定，双管齐下提高改性天冬氨酸树枝状聚合物对富硒酶制剂的固定量，同时改性天冬氨酸树枝状聚合物细胞毒性低，生物相容性好，保证其在机体中缓释和治疗效果。
S2中针对富硒酶制剂和缓释保护剂的混合物再进行微胶囊化，形成双重保护，有效防止富硒酶制剂在体内由于温度或者pH环境的变化而引起失活。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。
实施例1
本发明提出的一种缓解血栓的纳豆复合物的制备方法，包括如下步骤：
S1、将活化后纳豆芽孢杆菌种子液均匀喷洒在发酵底物表面，发酵底物按重量百分比包括：菜籽粕20％，米糠15％，余量为花生粕；再加入亚硒酸钠水溶液混合均匀，发酵底物、活化后纳豆芽孢杆菌种子液、亚硒酸钠的质量比为100：8：3×10-6，发酵24h，发酵温度为38℃，然后加入生理盐水浸泡4h，浸泡温度为8℃，过滤，将滤液离心20min，离心速度为12000r/min，离心温度为3℃，取一次上清液，向一次上清液中加入硫酸铵进行一级盐析，使一次上清液中硫酸铵质量分数达到13.6％，接着取二次上清液，向二次上清液中加入硫酸铵进行二级盐析，使二次上清液中硫酸铵质量分数达到31.6％，然后取沉淀物进行溶解，将溶解液进行透析，透析膜的截留分子量为20000D，透析过程中换水频率为1.5h/次，直到滴加氯化钡溶液无沉淀生成，得到富硒酶制剂；
S2、将1g富硒酶制剂和26g麦芽糊精混合均匀，接着微胶囊化得到缓解血栓的纳豆复合物。
实施例2
本发明提出的一种缓解血栓的纳豆复合物的制备方法，包括如下步骤：
S1、将活化后纳豆芽孢杆菌种子液均匀喷洒在发酵底物表面，发酵底物按重量百分比包括：菜籽粕30％，米糠8％，余量为花生粕；再加入酵母硒水溶液混合均匀，发酵底物、活化后纳豆芽孢杆菌种子液、酵母硒的质量比为100：12：20，发酵36h，发酵温度为34℃，然后加入生理盐水浸泡6h，浸泡温度为6℃，过滤，将滤液离心30min，离心速度为8000r/min，离心温度为5℃，取一次上清液，向一次上清液中加入硫酸铵进行一级盐析，使一次上清液中硫酸铵质量分数达到13.3％，接着取二次上清液，向二次上清液中加入硫酸铵进行二级盐析，使二次上清液中硫酸铵质量分数达到31.7％，然后取沉淀物进行溶解，将溶解液进行透析，透析膜的截留分子量为10000D，透析过程中换水频率为2.5h/次，直到滴加氯化钡溶液无沉淀生成，得到富硒酶制剂；
S2、将1g富硒酶制剂和20g辛烯基琥珀酸淀粉混合均匀，接着微胶囊化得到缓解血栓的纳豆复合物。
实施例3
本发明提出的一种缓解血栓的纳豆复合物的制备方法，包括如下步骤：
S1、将活化后纳豆芽孢杆菌种子液均匀喷洒在发酵底物表面，发酵底物按重量百分比包括：菜籽粕21.5％，米糠14％，余量为花生粕；再加入亚硒酸钠水溶液混合均匀，发酵底物、活化后纳豆芽孢杆菌种子液、亚硒酸钠的质量比为100：12：2×10-6，发酵26h，发酵温度为37.5℃，然后加入生理盐水浸泡4.2h，浸泡温度为7.5℃，过滤，将滤液离心25min，离心速度为10000r/min，离心温度为4℃，取一次上清液，向一次上清液中加入硫酸铵进行一级盐析，使一次上清液中硫酸铵质量分数达到13.5％，接着取二次上清液，向二次上清液中加入硫酸铵进行二级盐析，使二次上清液中硫酸铵质量分数达到31.65％，然后取沉淀物进行溶解，将溶解液进行透析，透析膜的截留分子量为15000D，透析过程中换水频率为2h/次，直到滴加氯化钡溶液无沉淀生成，得到富硒酶制剂；
S2、将1kg富硒酶制剂和21kg谷氨酸树枝状聚合物混合均匀，接着微胶囊化得到缓解血栓的纳豆复合物。
实施例4
本发明提出的一种缓解血栓的纳豆复合物的制备方法，包括如下步骤：
S1、将活化后纳豆芽孢杆菌种子液均匀喷洒在发酵底物表面，发酵底物按重量百分比包括：菜籽粕28.5％，米糠7％，余量为花生粕；再加入酵母硒水溶液混合均匀，发酵底物、活化后纳豆芽孢杆菌种子液、酵母硒的质量比为100：8：30，发酵36h，发酵温度为34℃，然后加入生理盐水浸泡6h，浸泡温度为6℃，过滤，将滤液离心25min，离心速度为10000r/min，离心温度为4℃，取一次上清液，向一次上清液中加入硫酸铵进行一级盐析，使一次上清液中硫酸铵质量分数达到13.5％，接着取二次上清液，向二次上清液中加入硫酸铵进行二级盐析，使二次上清液中硫酸铵质量分数达到31.65％，然后取沉淀物进行溶解，将溶解液进行透析，透析膜的截留分子量为15000D，透析过程中换水频率为2h/次，直到滴加氯化钡溶液无沉淀生成，得到富硒酶制剂；
S2、将1kg富硒酶制剂和24kg赖氨酸树枝状聚合物混合均匀，接着微胶囊化得到缓解血栓的纳豆复合物。
实施例5
本发明提出的一种缓解血栓的纳豆复合物的制备方法，包括如下步骤：
S1、将活化后纳豆芽孢杆菌种子液均匀喷洒在发酵底物表面，发酵底物按重量百分比包括：菜籽粕23％，米糠12％，余量为花生粕；再加入亚硒酸钠水溶液混合均匀，发酵底物、活化后纳豆芽孢杆菌种子液、亚硒酸钠的质量比为100：9：2.8×10-6，发酵28h，发酵温度为37℃，然后加入生理盐水浸泡4.6h，浸泡温度为7℃，过滤，将滤液离心25min，离心速度为10000r/min，离心温度为4℃，取一次上清液，向一次上清液中加入硫酸铵进行一级盐析，使一次上清液中硫酸铵质量分数达到13.5％，接着取二次上清液，向二次上清液中加入硫酸铵进行二级盐析，使二次上清液中硫酸铵质量分数达到31.65％，然后取沉淀物进行溶解，将溶解液进行透析，透析膜的截留分子量为15000D，透析过程中换水频率为2h/次，直到滴加氯化钡溶液无沉淀生成，得到富硒酶制剂；
S2、将100g富硒酶制剂和2500g改性天冬氨酸树枝状聚合物混合均匀，接着微胶囊化得到缓解血栓的纳豆复合物。
改性天冬氨酸树枝状聚合物的制备工艺具体如下：将天冬氨酸树枝状聚合物与胺化β-环糊精按摩尔比为1：8.8混合均匀，升温至65℃，保温34h，接着透析103h，透析过程中换水频率为3.7h/次，干燥得到改性天冬氨酸树枝状聚合物。
实施例6
本发明提出的一种缓解血栓的纳豆复合物的制备方法，包括如下步骤：
S1、将活化后纳豆芽孢杆菌种子液均匀喷洒在发酵底物表面，发酵底物按重量百分比包括：菜籽粕27％，米糠8％，余量为花生粕；再加入亚硒酸钠水溶液混合均匀，发酵底物、活化后纳豆芽孢杆菌种子液、亚硒酸钠的质量比为100：11：2.2×10-6，发酵32h，发酵温度为35℃，然后加入生理盐水浸泡5.4h，浸泡温度为7℃，过滤，将滤液离心25min，离心速度为10000r/min，离心温度为4℃，取一次上清液，向一次上清液中加入硫酸铵进行一级盐析，使一次上清液中硫酸铵质量分数达到13.5％，接着取二次上清液，向二次上清液中加入硫酸铵进行二级盐析，使二次上清液中硫酸铵质量分数达到31.65％，然后取沉淀物进行溶解，将溶解液进行透析，透析膜的截留分子量为15000D，透析过程中换水频率为2h/次，直到滴加氯化钡溶液无沉淀生成，得到富硒酶制剂；
S2、将20g富硒酶制剂和440g改性天冬氨酸树枝状聚合物混合均匀，接着微胶囊化得到缓解血栓的纳豆复合物。
改性天冬氨酸树枝状聚合物的制备工艺具体如下：将天冬氨酸树枝状聚合物与胺化β-环糊精按摩尔比为1：8.2混合均匀，升温至75℃，保温32h，接着透析107h，透析过程中换水频率为3.3h/次，干燥得到改性天冬氨酸树枝状聚合物。
实施例7
本发明提出的一种缓解血栓的纳豆复合物的制备方法，包括如下步骤：
S1、将活化后纳豆芽孢杆菌种子液均匀喷洒在发酵底物表面，发酵底物按重量百分比包括：菜籽粕25％，米糠10％，余量为花生粕；再加入亚硒酸钠水溶液混合均匀，发酵底物、活化后纳豆芽孢杆菌种子液、亚硒酸钠的质量比为100：10：2.5×10-6，发酵30h，发酵温度为36℃，然后加入生理盐水浸泡5h，浸泡温度为7℃，过滤，将滤液离心25min，离心速度为10000r/min，离心温度为4℃，取一次上清液，向一次上清液中加入硫酸铵进行一级盐析，使一次上清液中硫酸铵质量分数达到13.5％，接着取二次上清液，向二次上清液中加入硫酸铵进行二级盐析，使二次上清液中硫酸铵质量分数达到31.65％，然后取沉淀物进行溶解，将溶解液进行透析，透析膜的截留分子量为15000D，透析过程中换水频率为2h/次，直到滴加氯化钡溶液无沉淀生成，得到富硒酶制剂；
S2、将500g富硒酶制剂和11.5kg改性天冬氨酸树枝状聚合物混合均匀，接着微胶囊化得到缓解血栓的纳豆复合物。
改性天冬氨酸树枝状聚合物的制备工艺具体如下：将天冬氨酸树枝状聚合物与胺化β-环糊精按摩尔比为1：8.5混合均匀，升温至70℃，保温33h，接着透析105h，透析过程中换水频率为3.5h/次，干燥得到改性天冬氨酸树枝状聚合物。
上述纳豆芽孢杆菌采用高桥纳豆素(日本高桥保藏研究所)。
上述天冬氨酸树枝状聚合物为三代天冬氨酸树枝状分子。
对比例1
与实施例7区别在于，S1中纳豆芽孢杆菌采用富康高纯度纳豆素(北京纳康保健销售中心)。
对比例2
与实施例7区别在于，S1中未添加亚硒酸钠水溶液。
对比例3
与实施例7区别在于，S1中发酵底物为豆粕。
对比例4
与实施例7区别在于，S2中无缓释保护剂，即：将富硒酶制剂微胶囊化得到纳豆复合物。
对比例5
与实施例7区别在于，S2中缓释保护剂为β-环糊精。
对比例6
与实施例7区别在于，S2中未进行微胶囊化处理。
将上述实施例4、实施例7所得产物与对比例1-6所得产物进行实验，具体如下：
试验例I
将实施例4、实施例7的S1所得富硒酶制剂与对比例1-3的S1所得酶制剂进行富硒效果评价：将各组分离纯化的富硒酶制剂经SDS-PAGE凝胶电泳后得到较纯的单一蛋白条带，切割此蛋白条带，通过氢化物原子荧光光谱法对其硒含量进行测定、对比，其结果如下：
由上表可知：本发明所用特定的高桥纳豆素通过发酵作用利用硒元素，并与纳豆激酶相结合得到富硒酶制剂，同时实施例7相对于实施例4不仅实现无机硒到有机硒的转化，而且提高硒的转化率，提高所得富硒酶制剂中的硒含量。
试验例II
将实施例4、实施例7的S1所得富硒酶制剂与对比例1-3的S1所得酶制剂采用枯草杆菌蛋白酶活力测定方法(Folin-酚法)进行酶活性检测，其结果如下：
酶活，U/mL
实施例4 256.85
实施例7 243.77
对比例1 192.13
对比例2 297.81
对比例3 208.14
通过上述实施例4、实施例7的对比结果可知：实施例4所得富硒酶制剂更高，但实施例4采用有机硒，成本相对于实施例7更高；通过实施例7与对比例2对比结果可知：对比例2所得酶制剂的酶活更高，但硒元素含量极低，抗氧化能力弱；综上所述，本发明所得富硒酶制剂在保证硒元素含量的同时，酶活较高。
试验例III
将实施例4、实施例7的S1所得富硒酶制剂与对比例1-3的S1所得酶制剂进行抗氧化实验(包括：DPPH·抑制率、·OH抑制率、O2 -·抑制率、抗脂质过氧化抑制率和总还原力测定)，其结果如下：
由上表可知：本发明一方面提高富硒酶制剂中硒含量，另一方面通过特定的菌种和发酵条件，提高具有抗氧化活性的肽类含量，综合作用提高机体的抗氧化能力。
试验例IV
将实施例4、实施例7的S1所得富硒酶制剂与对比例1-3的S1所得酶制剂采用紫外比色法进行血管紧张素转换酶(ACE)抑制率的测定：
(1)10mL小试管内依次加入50μL亮氨酸，25μL上述样品，摇匀，迅速放入37℃恒温水浴中保温5min；
(2)加入25μL血管紧张素转换酶溶液，迅速摇匀，于37℃恒温水浴中反应60min；
(3)加入0.35mL1mol/LHCl终止反应；
(4)加入1.5mL乙酸乙酯，振荡混匀15s以萃取被血管紧张素转换酶所释放的马尿酸，5000r/min离心10min；
(5)吸取出1.0mL乙酸乙酯层，转入到另一试管内，于120℃烘箱中烘干1h，重新溶于3.0mL蒸馏水中，摇匀，在228nm处测定吸光度值。
ACE抑制率＝[(B-A)÷(B-C)]×100％
其中：A为样品、血管紧张素转换酶溶液与亮氨酸反应的吸光度值；B为血管紧张素转换酶溶液与亮氨酸反应的吸光度值，即对照；C为亮氨酸的吸光度值，即空白。
其结果如下：
ACE抑制率，％
实施例4 71.6
实施例7 75.7
对比例1 64.9
对比例2 65.8
对比例3 60.4
由上表可知：本发明所用特定的高桥纳豆素通过发酵作用有效利用发酵底物，提高所得富硒酶制剂中血管紧张素转换酶抑制剂含量，通过多重因素影响降低血压，而且副作用小。
试验例V
将实施例4、实施例7的S2中所得富硒酶制剂和氨基酸树枝状聚合物的混合物与对比例5-6的S2中所得富硒酶制剂和氨基酸树枝状聚合物的混合物进行相对酶活检测(以各组S1所得富硒酶制剂的酶活力为100％)，其结果如下：
相对酶活，％
实施例4 119.72
实施例7 137.53
对比例5 106.34
对比例6 136.14
由上表可知：富硒酶制剂和改性天冬氨酸树枝状聚合物相互配合，可以提高纳豆激酶的活性。
由于微胶囊化往往用于阻止消化液的腐蚀，故在试验例VI和试验例VII中采用富硒酶制剂和氨基酸树枝状聚合物的混合物进行体外抗凝、溶栓试验。
试验例VI
将实施例4和实施例7的S2中所得富硒酶制剂和氨基酸树枝状聚合物的混合物、对比例4的S1所得富硒酶制剂、对比例5的S2中所得富硒酶制剂和氨基酸树枝状聚合物的混合物进行体外抗凝实验，具体如下：将10mg各组混合物和10mg生理盐水分别加入到无菌试管中；健康家兔用30mg/kg体重计量的戊巴比妥钠进行麻醉，颈部动脉插管取血，向上述每个试管中分别加入10mL新鲜兔血，轻轻震荡混合后均置于37℃水浴锅中，立即启动秒表记录时间，当试管完全导致而没有液体流出时，血液完全凝固，实验结束，其结果如下：
血液完全凝固时间，min
实施例4所得混合物 93.64
实施例7所得混合物 2h仍未见凝固
对比例4所得富硒酶制剂 2h仍未见凝固
对比例5所得混合物 75.81
生理盐水 15.36
由上表可知：本发明抗凝、缓释效果较好。
试验例VII
将实施例4和实施例7的S2中所得富硒酶制剂和氨基酸树枝状聚合物的混合物、对比例4的S1所得富硒酶制剂、对比例5的S2中所得富硒酶制剂和氨基酸树枝状聚合物的混合物进行体外溶栓实验，具体如下：
取新鲜兔血，置于培养皿中铺成一薄层，待其自然凝固后，弃去上层血清，下层凝块切成大小一致的血块，用吸水纸吸干表面水分后置于电子天平上称重，然后置于无菌试管中，并分别向其中加入10mg各组混合物和10mg生理盐水；将试管置于37℃恒温水浴锅中，每10min混匀一次，使酶充分发挥作用，4h后小心取出试管中的血凝块，轻轻吸干表明水分后再进行称重，其中血栓溶解率＝(作用前血块重量-作用后血块重量)/作用前血块重量×100％。其结果如下：
血栓溶解率，％
实施例4所得混合物 81.07
实施例7所得混合物 80.95
对比例4所得富硒酶制剂 82.63
对比例5所得混合物 78.46
生理盐水 12.54
由上表可知：本发明溶栓效果好。
试验例VIII
将实施例7所得富硒酶制剂、实施例4与实施例7所得缓解血栓的纳豆复合物和对比例4-6所得纳豆复合物在消化液中耐受性，具体如下：将各组纳豆复合物置于人工模拟胃液中，于摇床中以37℃、150r/min崩解4h，加入2mol/L氢氧化钠溶液以终止反应，取适量的上述混合液加入至模拟肠液中，于摇床中以37℃、150r/min分别崩解4h后取样，测定剩余纳豆激酶酶活，以未经消化液处理的富硒酶制剂中纳豆激酶活力为100％。
其中人工模拟胃液采用16.4mL盐酸加水摇匀后定容至1L，调节pH至1.2；人工模拟肠液采用6.8g磷酸二氢钾加500mL水溶解，用4g/L氢氧化钠溶液调pH值至6.8，混合后加水定容至1L。
其结果如下：
剩余纳豆激酶酶活，％
实施例7所得富硒酶制剂 1
实施例4所得缓解血栓的纳豆复合物 46
实施例7所得缓解血栓的纳豆复合物 50
对比例4所得纳豆复合物 41
对比例5所得纳豆复合物 45
对比例6所得纳豆复合物 32
由上表可知：本发明所得缓解血栓的纳豆复合物经过消化液腐蚀后仍然可以保持较高的酶活，为后续在机体中的抗凝、溶栓提高有利条件。
综上所述，本发明通过多重手段综合作用，提高抗凝、溶栓的效果，而且大幅硒元素含量，提高抗氧化能力，还具有降血压作用，同时能有效防止纳豆激酶在体内由于温度或者pH环境的变化而引起失活。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种缓解血栓的纳豆复合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将活化后纳豆芽孢杆菌种子液均匀喷洒在发酵底物表面，再加入含硒溶液混合均匀，发酵，然后加入生理盐水，过滤，纯化得到富硒酶制剂；
S2、将富硒酶制剂和缓释保护剂混合均匀，接着微胶囊化得到缓解血栓的纳豆复合物。
2.根据权利要求1所述缓解血栓的纳豆复合物的制备方法，其特征在于，S1中，发酵底物按重量百分比包括：菜籽粕20～30％，米糠8～15％，余量为花生粕。
3.根据权利要求1或2所述缓解血栓的纳豆复合物的制备方法，其特征在于，S1中，含硒溶液为无机硒水溶液，优选为亚硒酸钠水溶液；优选地，S1中，发酵底物、活化后纳豆芽孢杆菌种子液、亚硒酸钠的质量比为100：8～12：2×10-6～3×10-6。
4.根据权利要求1或2所述缓解血栓的纳豆复合物的制备方法，其特征在于，S1中，含硒溶液为有机硒水溶液，优选为酵母硒水溶液；优选地，S1中，发酵底物、活化后纳豆芽孢杆菌种子液、酵母硒的质量比为100：8～12：20～30。
5.根据权利要求1-4任一项所述缓解血栓的纳豆复合物的制备方法，其特征在于，S1中，发酵时间为24～36h，发酵温度为34～38℃；优选地，S1中，加入生理盐水浸泡4～6h，浸泡温度为6～8℃。
6.根据权利要求1-5任一项所述缓解血栓的纳豆复合物的制备方法，其特征在于，S2中，富硒酶制剂和缓释保护剂的质量比为1：20～26；优选地，S2中，缓释保护剂为树枝状高分子、麦芽糊精、辛烯基琥珀酸淀粉中至少一种。
7.根据权利要求6所述缓解血栓的纳豆复合物的制备方法，其特征在于，S2中，树枝状高分子为氨基酸类树枝状聚合物或改性所述氨基酸类树枝状聚合物；优选地，S2中，氨基酸类树枝状聚合物为脯氨酸树枝状聚合物、赖氨酸树枝状聚合物、谷氨酸树枝状聚合物、精氨酸树枝状聚合物、天冬氨酸树枝状聚合物中的至少一种。
8.根据权利要求7所述缓解血栓的纳豆复合物的制备方法，其特征在于，S2中，改性所述氨基酸类树枝状聚合物为改性天冬氨酸树枝状聚合物；优选地，S2中，改性天冬氨酸树枝状聚合物由天冬氨酸树枝状聚合物与胺化β-环糊精反应生成。
9.根据权利要求6-8任一项所述缓解血栓的纳豆复合物的制备方法，其特征在于，S2的改性天冬氨酸树枝状聚合物的制备工艺具体如下：将天冬氨酸树枝状聚合物与胺化β-环糊精混合均匀，升温，保温，接着透析，干燥得到改性天冬氨酸树枝状聚合物。
10.一种缓解血栓的纳豆复合物，其特征在于，采用权利要求1-9任一项所述缓解血栓的纳豆复合物的制备方法制得。
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