CN111067081B - 基于纳豆芽胞杆菌诱变株为优势菌系的大豆酱及制作方法 - Google Patents

基于纳豆芽胞杆菌诱变株为优势菌系的大豆酱及制作方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于纳豆芽胞杆菌诱变株为优势菌系的大豆酱及制作方法，属于调味品制作技术领域。选用优质大豆为原料，利用米曲霉3.042、纳豆芽孢杆菌诱变株BNM1、枯草芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌、四联耐盐球菌、凝结芽孢杆菌、耐盐酵母组合成的复合菌种进行三段式发酵，增强了传统农家酱的特殊香气，使豆酱色泽金黄、鲜味突出、回味无穷。本发明在保留大豆酱自身营养的同时富含纳豆激酶和维生素K,具有缓解三高：高血糖，高血压，高血脂和溶解血栓的功效，同时提升产能，缩短生产周期，具有良好的社会效益。

Description

基于纳豆芽胞杆菌诱变株为优势菌系的大豆酱及制作方法
技术领域
本发明属于调味品制作技术领域，公开了一种以纳豆芽胞杆菌为优势菌种的复合菌种大豆酱及其制作方法。
背景技术
传统大豆酱，采用传统工艺，自然发酵、生产周期长，生产效率低，能源消耗较大，但保持了大豆酱特有的风味和香气。现在工业化生产大豆酱采用单一菌种进行制曲，缩短了生产周期，提高了产品品质，但单一菌种制曲，导致原料利用率降低，使生产出的酱品风味和口感不如传统发酵的酱，酱的颜色较深。
豆酱的自然发酵受到许多因素的影响,如食盐浓度、发酵pH值、溶氧浓度、气温高低、谷物的化学成分、原料附生微生物的数量及菌相比例等。这些因素以及它们之间的相互作用影响到整个自然发酵的进程和菌系变化,进而影响到最终产品的质量。
优良的豆酱发酵剂应来源于自然发酵的优质酱类。发酵剂质量的优劣直接影响到产品的口感、风味和香气等感官特征。因此,优良的发酵剂菌株对于研制豆酱发酵剂来说是十分重要的。自然发酵的豆酱风味独特,这与其中微生物的发酵作用是密不可分的。因此,对自然发酵的优质豆酱进行菌系分析,确定其菌相组成和比例,成为研究豆酱接种发酵的一个首要条件。
大豆中激活的脂肪氧化酶可将多不饱和脂肪酸氧化成过氧化物,最终降解为低分子醛、酮、醇等挥发性成分,这些小分子物是大豆腥味的主要来源。有研究表明,微量(500μg/kg)的己醛能够使得食品有令人非常不愉快的气味。
米曲霉是一类产复合酶的菌株，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等。在淀粉酶的作用下，将原料中的直链、支链淀粉降解为糊精及各种低分子糖类；在蛋白酶的作用下，将不易消化的大分子蛋白质降解为蛋白胨、多肽及各种氨基酸。米曲霉3.042，具有产孢快、生长迅速的特点，生命力顽强，对环境的适应力强，有利于生产控制。米曲霉3.042在产生酯类物质方面具有优势，酯类在酱料中起着香甜、浓郁而柔和的基底作用；米曲霉3.042产物中含量较多的有2－甲基丁酸乙酯、异戊酸乙酯、棕榈酸乙酯、亚油酸乙酯等，与酱香气的浓重有着直接关系。
孢子型纳豆菌是具有耐酸、耐热特性的有益菌,在胃酸下四小时存活率为100％,同时具有强力的病原菌抑制能力,对环境耐受力是各种益菌当中最好的，可以直达小肠的菌种之一,口服后可改变人体肠道菌丛生态,帮助消化道机能正常化,以使排便顺畅,维持体内生理环保。可以产酸，调节肠道菌群，增强动物细胞免疫放应。并能生成多种蛋白酶(特别是碱性蛋白酶)、糖化酶、脂肪酶、淀粉酶，降解植物性饲料中某些复杂的碳水化合物
纳豆菌在通过吞噬大豆蛋白来繁殖的时候,产生出的无数酵素纳豆激酶和维生素K,具有神奇的药效,可以治疗三高(高血糖，高血压，高血脂)和溶解血栓的作用，而且还能产生出氨基酸的美味。
枯草芽孢杆菌能迅速消耗肠道中的游离氧，造成肠道低氧，促进有益厌氧菌生长，间接抑制其它致病菌生长。还可刺激动物(人体)免疫器官的生长发育，激活T、B淋巴细胞，提高免疫球蛋白和抗体水平，增强细胞免疫和体液免疫功能，提高群体免疫力。
贝莱斯芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一个新种，为革兰氏染色呈阳性菌，温度生长范围在15-45℃，pH范围在5-10，研究发现该菌株在农业生产上有促进植物生长和抵御病原微生物作用，具有广谱抗菌活性，是开发生物药剂潜力较大的微生物。
四联嗜盐球菌可以提高发酵产品中有机酸、醛类、酯类、氨基酸等多种风味物质含量,部分菌株具有降低生物胺、氨基甲酸乙酯等氨(胺)类危害物的作用。
凝结芽孢杆菌能适应低氧的肠道环境，对酸和胆汁有较高的耐受性，能够进行乳酸发酵，产生的L-乳酸能降低肠道pH值，抑制有害菌，并能促进有益菌的生长和繁殖。凝结芽孢杆菌能够形成芽孢，与其他不产乳酸的芽孢杆菌相比有利于恢复胃肠道的微生态平衡。
马克斯克鲁维酵母，是一种新型的食品安全级酵母，它可以耐受高温、高渗透压及酸性环境。它具有生长迅速、耐高温、能吸收糖类、产生乙醇等多种特点,因而适合大批量的工业生产。此外,将马克斯克鲁维酵母能够发酵产生矿物质、小分子肽等有机物质和醇类、酯类等风味物质，有益于身心健康。
耐盐酵母，一般耐盐酵母，两个细胞相结合形成孢子，主要是赋予酱油、酱类特定香气成分。
现有技术存在的问题是：
传统大豆酱，采用传统工艺，自然发酵，菌种不明确，具体风味物质不明确，安全没保障，生产周期长，生产效率低，能源消耗较大；
现在工业化生产大豆酱采用单一菌种进行制曲，缩短了生产周期，提高了产品品质，但单一菌种制曲，导致原料利用率降低，使生产出的酱品风味和口感不如传统发酵的酱，酱的颜色较深；
自然发酵过程中容易因外界条件变化产生不良气味，成品风味总有不同，难以完全统一风味，产品难以实现标准化。
上述技术问题虽然早已被厂家和研究人员发现，但一直无法得到有效的解决，其难度主要表现在：
需要对比国内外对酱的研究，进行大量实验，探索可以改良的发酵条件或工艺环节，通过标准化工艺，不受环境温度限制，控制温度，缩短生产周期；
需要对传统大豆酱的风味成分进行分析，找出影响风味的靶向物质和优势菌群，单一菌种可对风味进行分析，确定靶向风味物质；
需要对优势菌群进行分离纯化，将分离出的菌群重新接种，分析风味变化，不断对风味进行改良，继续分离纯化菌株，依次循环进行大量实验；
对于风味单一问题：对比传统农家酱为突出其独特风味，需控制其菌种添加的合理性，以免产生不良风味问题，得出能够改善风味的菌剂组成。
发明内容
本发明提供一种基于纳豆芽胞杆菌诱变株为优势菌系的大豆酱及制作方法，以解决传统大酱风味物质不明确，安全没保障，生产周期长，生产效率低，能源消耗较大，原料利用率，降低，很难实现标准化。
本发明采取的技术方案是：是由下列步骤得到的：
步骤一、精选大豆：选取大豆要求蛋白含量＞40％，脂肪含量＞20％，经过机械分级精选；
步骤二、气蒸祛腥：120℃下气蒸3-5min；
步骤三、糖液煮制熟化：加入β-葡聚糖溶液进行高温熟化，加入0.5％-1％β-葡聚糖溶液，溶液添加量为干豆体积的1.5-2.5倍，进行高温熟化，熟化参数为100℃，35-40min，熟化后冷却备用；
步骤四、酶解:加入中性蛋白酶和谷氨酰胺转胺酶对大豆蛋白进行复合改性，混合比例：中性蛋白酶：谷氨酰胺转胺酶＝1:1.5，温度55℃、时间0.5h、pH7.0、酶用量为上一步中全部物料重量的2.5％-5％；
步骤五、辗绊：将物料转移至斩拌机充分辗绊；
步骤六、一次接菌：接入米曲霉3.042，接种温度25-32℃，接菌量为上一步中全部物料重量的1％-2％；
步骤七、制酱醅：将接菌后的酱料挤压置于发酵池中；
步骤八：前发酵；
步骤九、辗绊、一次注盐水：盐水浓度18％-20％,加水量为干豆体积的一倍；
步骤十、二次接菌：接入纳豆芽孢杆菌诱变株BNM1，枯草芽孢杆菌，贝莱斯芽孢杆菌，四联耐盐球菌，凝结芽孢杆菌；菌种比例为纳豆芽孢杆菌诱变株BNM1：枯草芽孢杆菌：贝莱斯芽孢杆菌：四联耐盐球菌：凝结芽孢杆菌＝5:2：1:1：1，接种温度35-40℃，接菌量为上一步中全部物料重量的2-3％；
步骤十一、稀盐半固态发酵；35-40℃，发酵30-45天；
步骤十二、二次注水：稀释至含盐量10％-13％；
步骤十三、三次接菌；注水后接入耐盐酵母，接种温度26-32℃，接菌量为上一步中全部物料重量的0.5％-1％；
步骤十四：后发酵，温度为26-32℃，发酵30-40天；
步骤十五、罐装；封口；灭菌；成品。
本发明所述大豆选取大豆绥农29，蛋白含量41.92％，脂肪含量21.28％。
本发明所述在步骤八中，发酵温度25-32℃，发酵时间保持48-72h。
本发明所述所述纳豆芽孢杆菌诱变株BNM1，Bacillus subtilis natto BNM1在中国典型培养物保藏中心的保藏号为：CCTCC No.M2019882，保藏日期2019年10月31日，地址：中国，武汉，武汉大学。
本发明所述步骤十五中，发酵好后的大豆酱采用自动包装机进行灌装、封口；灌装后采用水浴杀菌，杀菌温度80℃，时间30分钟，然后冷却至15℃；将冷却后的包装袋装箱，即为成品。
一种基于纳豆芽胞杆菌诱变株为优势菌系的大豆酱的制作方法，包括下列步骤：
步骤一、精选大豆：选取大豆要求蛋白含量＞40％，脂肪含量＞20％，经过机械分级精选；
步骤二、气蒸祛腥：120℃下气蒸3-5min；
步骤三、糖液煮制熟化：加入β-葡聚糖溶液进行高温熟化，加入0.5％-1％β-葡聚糖溶液，溶液添加量为干豆体积的1.5-2.5倍，进行高温熟化，熟化参数为100℃，35-40min，熟化后冷却备用；
步骤四、酶解:加入中性蛋白酶和谷氨酰胺转胺酶对大豆蛋白进行复合改性，混合比例：中性蛋白酶：谷氨酰胺转胺酶＝1:1.5，温度55℃、时间0.5h、pH7.0、酶用量为上一步中全部物料重量的2.5％-5％；
步骤五、辗绊：将物料转移至斩拌机充分辗绊；
步骤六、一次接菌：接入米曲霉3.042，接种温度25-32℃，接菌量为上一步中全部物料重量的1％-2％；
步骤七、制酱醅：将接菌后的酱料挤压置于发酵池中；
步骤八：前发酵；
步骤九、辗绊、一次注盐水：盐水浓度18％-20％,加水量为干豆体积的一倍；
步骤十、二次接菌：接入纳豆芽孢杆菌诱变株BNM1，枯草芽孢杆菌，贝莱斯芽孢杆菌，四联耐盐球菌，凝结芽孢杆菌；菌种比例为纳豆芽孢杆菌诱变株BNM1：枯草芽孢杆菌：贝莱斯芽孢杆菌：四联耐盐球菌：凝结芽孢杆菌＝5:2：1:1：1，接种温度35-40℃，接菌量为上一步中全部物料重量的2-3％；
步骤十一、稀盐半固态发酵；35-40℃，发酵30-45天；
步骤十二、二次注水：稀释至含盐量10％-13％；
步骤十三、三次接菌；注水后接入耐盐酵母，接种温度26-32℃，接菌量为上一步中全部物料重量的0.5％-1％；
步骤十四：后发酵，温度为26-32℃，发酵30-40天；
步骤十五、罐装；封口；灭菌；成品。
本发明所述大豆选取大豆绥农29，蛋白含量41.92％，脂肪含量21.28％。
本发明所述步骤八中，发酵温度25-32℃，发酵时间保持48-72h。
本发明所述所述纳豆芽孢杆菌诱变株BNM1，Bacillus subtilis natto BNM1在中国典型培养物保藏中心的保藏号为：CCTCC No.M2019882，保藏日期2019年10月31日，地址：中国，武汉，武汉大学。
本发明所述在步骤十五中，发酵好后的大豆酱采用自动包装机进行灌装、封口；灌装后采用水浴杀菌，杀菌温度80℃，时间30分钟，然后冷却至15℃；将冷却后的包装袋装箱，即为成品。
本发明解决了传统大豆酱生产周期长，生产效率低，能源消耗较大问题，缩短了生产周期；改良了大豆酱风味，使大豆酱酯香浓厚，后味香甜，酱香浓郁而柔和；提高了产品品质，大豆蛋白利用率增加，复合菌剂的改变增加了酵素纳豆激酶和维生素K含量,具有缓解三高(高血糖，高血压，高血脂)和溶解血栓的作用；不同配比的菌种分阶段发酵，增加了其功效成分，产生独特风味；实现了发酵时间的可控性，缩短了生产周期。
本发明的有益效果是：通过糖液煮制熟化、中性蛋白酶和谷氨酰胺转胺酶复合作用，在脱除大豆豆腥味的同时，提高了大豆蛋白的溶解性、乳化性、发泡性；通过分段式接种充分协同各菌种优势特征，米曲霉3.042促进了蛋白、脂质、有机酸融出，纳豆芽胞杆菌诱变株BNM1的接入促进酶系作用，结合枯草芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌、四联耐盐球菌、凝结芽孢杆菌，构建出优势共生体系，增强了传统农家酱的特殊香气，使豆酱色泽金黄、鲜味突出、回味无穷。本发明在保留大豆酱自身营养的同时富含纳豆激酶和维生素K,具有缓解三高(高血糖，高血压，高血脂)和溶解血栓的功效，同时提升产能，缩短生产周期，具有良好的社会效益。
附图说明
图1是本发明优势菌的菌种鉴定图
图2是本发明优势菌菌种鉴定结果图。
具体实施方式
实施例1
是由下列步骤得到的：
步骤一、精选大豆：选取大豆绥农29，蛋白含量41.92％，脂肪含量21.28％，经过机械分级精选；
步骤二、气蒸祛腥：120℃下气蒸3min；
步骤三、糖液煮制熟化：加入β-葡聚糖溶液进行高温熟化，加入0.5％β-葡聚糖溶液，溶液添加量为干豆体积的1.5倍，进行高温熟化，熟化参数为100℃，35min，熟化后冷却备用；
步骤四、酶解:加入中性蛋白酶和谷氨酰胺转胺酶对大豆蛋白进行复合改性，混合比例：中性蛋白酶：谷氨酰胺转胺酶＝1:1.5，温度55℃、时间0.5h、pH7.0、酶用量为上一步中全部物料重量的2.5％；
步骤五、辗绊：将物料转移至斩拌机充分辗绊；
步骤六、一次接菌：接入米曲霉3.042，接种温度25℃，接菌量为上一步中全部物料重量的1％；
步骤七、制酱醅：将接菌后的酱料挤压置于发酵池中；
步骤八：前发酵，发酵温度25℃，发酵时间保持48h；
步骤九、辗绊、一次注盐水：盐水浓度18％，加水量为干豆体积的一倍；
步骤十、二次接菌：接入纳豆芽孢杆菌诱变株BNM1，枯草芽孢杆菌，贝莱斯芽孢杆菌，四联耐盐球菌，凝结芽孢杆菌；菌种比例为纳豆芽孢杆菌诱变株BNM1：枯草芽孢杆菌：贝莱斯芽孢杆菌：四联耐盐球菌：凝结芽孢杆菌＝5：2：1：1：1，接种温度35℃，接菌量为上一步中全部物料重量的2％；所述纳豆芽孢杆菌诱变株BNM1，Bacillus subtilis natto BNM1在中国典型培养物保藏中心的保藏号为：CCTCC No.M2019882，保藏日期2019年10月31日，地址：中国，武汉，武汉大学；
步骤十一、稀盐半固态发酵；35℃，发酵30天；
步骤十二、二次注水：稀释至含盐量10％；
步骤十三、三次接菌；注水后接入耐盐酵母，接种温度26℃，接菌量为上一步中全部物料重量的0.5％；
步骤十四：后发酵，温度为26℃，发酵30天；
步骤十五、发酵好后的大豆酱采用自动包装机进行灌装、封口；灌装后采用水浴杀菌，杀菌温度80℃，时间30分钟，然后冷却至15℃；将冷却后的包装袋装箱，即为成品。
实施例2
是由下列步骤得到的：
步骤一、精选大豆：选取大豆绥农29，蛋白含量41.92％，脂肪含量21.28％，经过机械分级精选；
步骤二、气蒸祛腥：120℃下气蒸4min；
步骤三、糖液煮制熟化：加入β-葡聚糖溶液进行高温熟化，加入0.75％β-葡聚糖溶液，溶液添加量为干豆体积的2.0倍，进行高温熟化，熟化参数为100℃，37.5min，熟化后冷却备用；
步骤四、酶解:加入中性蛋白酶和谷氨酰胺转胺酶对大豆蛋白进行复合改性，混合比例：中性蛋白酶：谷氨酰胺转胺酶＝1:1.5，温度55℃、时间0.5h、pH7.0、酶用量为上一步中全部物料重量的3.8％；
步骤五、辗绊：将物料转移至斩拌机充分辗绊；
步骤六、一次接菌：接入米曲霉3.042，接种温度29℃，接菌量为上一步中全部物料重量的1.5％；
步骤七、制酱醅：将接菌后的酱料挤压置于发酵池中；
步骤八：前发酵，发酵温度29℃，发酵时间保持60h；
步骤九、辗绊、一次注盐水：盐水浓度19％,加水量为干豆体积的一倍；
步骤十、二次接菌：接入纳豆芽孢杆菌诱变株BNM1，枯草芽孢杆菌，贝莱斯芽孢杆菌，四联耐盐球菌，凝结芽孢杆菌；菌种比例为纳豆芽孢杆菌诱变株BNM1：枯草芽孢杆菌：贝莱斯芽孢杆菌：四联耐盐球菌：凝结芽孢杆菌＝5：2：1：1：1，接种温度38℃，接菌量为上一步中全部物料重量的2.5％；所述纳豆芽孢杆菌诱变株BNM1，Bacillus subtilis natto BNM1在中国典型培养物保藏中心的保藏号为：CCTCC No.M2019882，保藏日期2019年10月31日，地址：中国，武汉，武汉大学；
步骤十一、稀盐半固态发酵；37℃，发酵38天；
步骤十二、二次注水：稀释至含盐量11.5％；
步骤十三、三次接菌；注水后接入耐盐酵母，接种温度29℃，接菌量为上一步中全部物料重量的0.75％；
步骤十四：后发酵，温度为29℃，发酵35天；
步骤十五、发酵好后的大豆酱采用自动包装机进行灌装、封口；灌装后采用水浴杀菌，杀菌温度80℃，时间30分钟，然后冷却至15℃；将冷却后的包装袋装箱，即为成品。
实施例3
是由下列步骤得到的：
步骤一、精选大豆：选取大豆绥农29，蛋白含量41.92％，脂肪含量21.28％，经过机械分级精选；
步骤二、气蒸祛腥：120℃下气蒸5min；
步骤三、糖液煮制熟化：加入β-葡聚糖溶液进行高温熟化，加入1％β-葡聚糖溶液，溶液添加量为干豆体积的2.5倍，进行高温熟化，熟化参数为100℃，40min，熟化后冷却备用；
步骤四、酶解:加入中性蛋白酶和谷氨酰胺转胺酶对大豆蛋白进行复合改性，混合比例：中性蛋白酶：谷氨酰胺转胺酶＝1:1.5，温度55℃、时间0.5h、pH7.0、酶用量为上一步中全部物料重量的5％；
步骤五、辗绊：将物料转移至斩拌机充分辗绊；
步骤六、一次接菌：接入米曲霉3.042，接种温度32℃，接菌量为上一步中全部物料重量的2％；
步骤七、制酱醅：将接菌后的酱料挤压置于发酵池中；
步骤八：前发酵，发酵温度32℃，发酵时间保持72h；
步骤九、辗绊、一次注盐水：盐水浓度20％,加水量为干豆体积的一倍；
步骤十、二次接菌：接入纳豆芽孢杆菌诱变株BNM1，枯草芽孢杆菌，贝莱斯芽孢杆菌，四联耐盐球菌，凝结芽孢杆菌；菌种比例为纳豆芽孢杆菌诱变株BNM1：枯草芽孢杆菌：贝莱斯芽孢杆菌：四联耐盐球菌：凝结芽孢杆菌＝5：2：1：1：1，接种温度40℃，接菌量为上一步中全部物料重量的3％；所述纳豆芽孢杆菌诱变株BNM1，Bacillus subtilis natto BNM1在中国典型培养物保藏中心的保藏号为：CCTCC No.M2019882，保藏日期2019年10月31日，地址：中国，武汉，武汉大学；
步骤十一、稀盐半固态发酵；40℃，发酵45天；
步骤十二、二次注水：稀释至含盐量13％；
步骤十三、三次接菌；注水后接入耐盐酵母，接种温度32℃，接菌量为上一步中全部物料重量的1％；
步骤十四：后发酵，温度为32℃，发酵40天；
步骤十五、发酵好后的大豆酱采用自动包装机进行灌装、封口；灌装后采用水浴杀菌，杀菌温度80℃，时间30分钟，然后冷却至15℃；将冷却后的包装袋装箱，即为成品。
下边通过具体实验例来进一步说明本发明。
实验例1：优势菌种的分离、纯化及鉴定
实验材料
1.1实验原料，大豆绥农29
1.2菌种，米曲霉3.042、纳豆芽孢杆菌诱变株BNM1，来自于吉林省田野泉酿造有限公司，已进行菌种保藏、枯草芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌、四联耐盐球菌、凝结芽孢杆菌、耐盐酵母；
1.3培养基：Luria-Bertani培养基、32778毛霉培养基；
1.4实验试剂：基因组DNA(20ng/μl)，10×Buffer(含2.5mM Mg2+)，Taq聚合酶(5u/μl)，dNTP(10mM)，27F引物(10uM)，1492R引物(10uM)
1.5实验仪器：
旋涡震荡器QL-861江苏省海门市麒麟医用仪器厂
洁净工作台SW-CJ-2D苏州净化设备有限公司
台式高速冷冻离Neofuge13R上海力申科学仪器有限公司
PCR仪ABI-2720美国AppliedBiosystems公司
精密移液器EppendorfCo,Germany
ND2000 NanoDrop2000 Thermo,USA
电泳仪MiniPro300VPowerSupply majorscience.,USA
电泳槽LabnetSubSystem70 LabnetInc.,USA
测序仪ABI3730XL美国AppliedBiosystems公司
实验方法
(一)细菌基因组DNA的提取
(1)用2ml离心管收集1.0×109(1ml菌液OD600为1-1.5)的细菌培养物，12,000×g离心30s，弃尽上清。用150μl已加入RNase A的Buffer S悬浮沉淀；
(2)加入20μl溶菌酶贮存液，混合均匀，室温静置5min；
(3)加入30μl 0.25M EDTA(pH 8.0)，混合均匀，冰浴5min；
(4)加入450μl Buffer G-A,旋涡振荡15s，65℃水浴10min；
(5)加入400μl Buffer G-B和1ml Buffer DV(4℃预冷)，用力混合，12,000×g离心2min；
(6)尽可能丢弃上相，保留相间沉淀和下相。加入1ml 4℃预冷Buffer DV，用力混合，12,000×g离心2min；
(7)丢弃上相，将下相转移至滤器(滤器置于2ml离心管中)。12,000×g离心1min；
(8)弃滤器，在滤液中加入400μl Buffer BV，混合均匀；
(9)将制备管置于2ml离心管中，将步骤8中的混合液移入制备管中，12,000×g离心1min；
(10)弃滤液，将制备管置回到原2ml离心管中，加入500μl Buffer W1，12,000×g离心1min；
(11)弃滤液，将制备管置回到原2ml离心管中，加入700μl Buffer W2，12,000×g离心1min；
(12)以同样的方法再用700μl Buffer W2洗涤一次；
(13)弃滤液，将制备管置回到原2ml离心管中，12,000×g离心1min；将制备管置于另一洁净的1.5ml离心管中，在silica膜中央加100-200μl Eluent或去离子水，室温静置1min。12,000×g离心1min洗脱DNA。
(二)细菌基因组PCR扩增
表1引物设计
引物名称 序列
27F 5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3
1492R 5-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3
PCR扩增反应体系：在0.2ml离心管中加入以下成分：
表2 PCR扩增反应体系
试剂 体积
基因组DNA(20ng/ul) 1.0ul
10×Buffer(含2.5mMMg2+) 5.0ul
Taq聚合酶(5u/μL) 1.0ul
dNTP(10mM) 1.0ul
27F引物(10uM) 1.5ul
1492R引物(10uM) 1.5ul
ddH2O 39.0ul
总体积 50.0ul
轻弹混匀，瞬时离心收集管壁上的液滴至管底,在PCR扩增仪上进行PCR反应，反应参数如下：
表3 PCR扩增反应程序
预变性 变性 退火 延伸 终延伸 循环数
95℃，5min 95℃，30s 58℃，30s 72℃，1min 72℃，7min 35
反应完成后，取3ulPCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。确认PCR扩增片段。
(三)PCR产物的回收
PCR产物用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒回收，具体操作按试剂盒说明书进行，步骤如下：
1.在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶放入干净的离心管中，称取重量；
2.加入3个凝胶体积的BufferDE-A，混合均匀后于75℃加热直至凝胶块完全熔化；
3.加0.5个BufferDE-A体积的BufferDE-B，混合均匀；当分离的DNA片段小于400bp时，加入1个凝胶体积的异丙醇；
4.将混合液，转移到DNA制备管12,000×g离心1min，弃滤液；
5.将制备管置回2ml离心管，加500μlBufferW1，12,000×g离心30s，弃滤液；
6.将制备管置回2ml离心管，加700μlBufferW2，12,000×g离心30s，弃滤液。以同样的方法再用700μlBufferW2，12,000×g离心1min；
7.将制备管置回2ml离心管中，12,000×g离心1min；
8.将制备管置于洁净的1.5ml离心管(试剂盒内提供)中，在制备膜中央加25-30μl去离子水，室温静置1min。12,000×g离心1min洗脱DNA。
表4：各样品NCBI比对结果
DNA identificationresults Identities
Bacillus velezensis 99.66％
Bacillus haynesii(ID.NO12) 99.66％
Bacillus haynesii(ID.NO13) 99.52％
Kerstersia gyiorum 99.08％
图1为菌种鉴定过程PCR电泳图，从图中可以看出所检测菌种为纯菌，表4及图2为优势菌菌种鉴定相似度比对和斜面菌照片
实验例2：成品酱工艺、配方优化
按本发明步骤中工艺及配方范围进行六因素五水平正交试验优化，以感官评分为评价指标，筛选出综合感官评分大于85分的工艺及配方，作为风味及营养成分评定基础。
表5：大豆酱感官评分标准
Figure BDA0002352254720000121
Figure BDA0002352254720000131
表6：正交试验因素水平表
Figure BDA0002352254720000132
表7：正交试验结果分析表
Figure BDA0002352254720000133
Figure BDA0002352254720000141
(该表为六因素五水平正交试验分析表结果，其中感官评分是按表5标准进行评价，表中“1-5”各水平按表6对应添加)
实验例3：成品酱风味及营养成分分析
将成品酱工艺、配方优化试验中筛选出的感官评分大于85分的酱料进行植物库广靶测序分析和动物库广靶测序分析，分析不同参数所得酱料的营养成分含量(主要为部分氨基酸)、风味物质种类及含量。
表8：挥发性成分检测表
Figure BDA0002352254720000151
Figure BDA0002352254720000161
(该表分析样品是本发明试验组合中经过感官评分后综合评分大于85分的酱料样品，表中结果是委托武汉迈特维尔生物科技有限公司进行植物库广靶测序和动物库广靶测序所得)
表9：保证同等氨基酸含量下发酵周期比较
发酵类型 发酵时间
自然发酵 270d-360d
单种制曲发酵 170d-300d
混合菌种制曲发酵(本发明) 62d-88d
依照表5标准进行感官评分，依照表6添加量进行试验，依照表7分析结果中感官评分不低于85分的酱料样品进行植物库广靶测序和动物库广靶测序，表8为检测结果。综合表7和表8中因素水平组合，在保证感官评分不低于85分，氨基酸及其衍生物含量不低于20％的情况下，本发明利用发酵中期，以纳豆芽胞杆菌诱变株BNM1为主的细菌共生菌系协同作用，所含菌种明确，在原料大豆品种、数量不改变的基础上，提高了豆酱中以L-天冬氨酸、3-羟基-3-甲基谷氨酸、谷氨酸、N-乙酰天冬氨酸为代表的氨基酸及其衍生物含量，大大提高了产品品质及原料利用率。
在保证感官评分不低于85分，氨基酸及其衍生物含量不低于20％的情况下，本发明利用发酵中期，以纳豆芽胞杆菌诱变株BNM1为主的细菌共生菌系协同作用，使成品酱中风味物质明确可控，提高了酯类物质含量、醇类物质含量、以及十二烷基亚硫酸戊酯、戊基亚硫酸十四酯等含硫物质含量(见表8)，改善了自然发酵过程中因外界条件变化产生的不良气味，增强了传统农家酱的特殊香气，使豆酱鲜味突出、回味无穷。
本发明所制大豆酱通过二次注水稀释降低了发酵豆酱的含盐量，结合纳豆芽胞杆菌诱变株BNM1菌落特征和产纳豆激酶的代谢特征，抑制了豆酱发酵过程中的氧化褐变，改良了酱品颜色，所制成品低盐可口、色泽金黄。
本发明在保证感官评分不低于85分，氨基酸及其衍生物含量不低于20％的情况下，本发明大大缩短了生产周期(见表9)，提高了生产效率，降低了能耗，具有良好的社会效益。

Claims (6)

1.一种基于纳豆芽胞杆菌诱变株为优势菌系的大豆酱，其特征在于，是由下列步骤得到的：
步骤一、精选大豆：选取大豆绥农29，蛋白含量41.92%，脂肪含量21.28%，经过机械分级精选；
步骤二、气蒸祛腥：120℃下气蒸3-5min；
步骤三、糖液煮制熟化：加入β-葡聚糖溶液进行高温熟化，加入0.5%-1%β-葡聚糖溶液，溶液添加量为干豆体积的1.5-2.5倍，进行高温熟化，熟化参数为100℃，35-40min，熟化后冷却备用；
步骤四、酶解: 加入中性蛋白酶和谷氨酰胺转氨酶对大豆蛋白进行复合改性，混合比例：中性蛋白酶：谷氨酰胺转氨酶=1:1.5，温度55℃、时间0.5h、pH7.0、酶用量为上一步中全部物料重量的2.5%-5%；
步骤五、辗拌：将物料转移至斩拌机充分辗拌；
步骤六、一次接菌：接入米曲霉3.042，接种温度25-32℃，接菌量为上一步中全部物料重量的1%-2%；
步骤七、制酱醅：将接菌后的酱料挤压置于发酵池中；
步骤八：前发酵，发酵温度25-32℃，发酵时间保持48-72h；
步骤九、辗拌、一次注盐水：盐水浓度18%-20%,加水量为干豆体积的一倍；
步骤十、二次接菌：接入纳豆芽孢杆菌诱变株BNM1，枯草芽孢杆菌，贝莱斯芽孢杆菌，四联耐盐球菌，凝结芽孢杆菌；菌种比例为纳豆芽孢杆菌诱变株BNM1：枯草芽孢杆菌：贝莱斯芽孢杆菌：四联耐盐球菌：凝结芽孢杆菌=5:2：1:1：1，接种温度35-40℃，接菌量为上一步中全部物料重量的2-3%；
所述纳豆芽孢杆菌诱变株BNM1，Bacillus subtilis natto BNM1在中国典型培养物保藏中心的保藏号为：CCTCC No.M2019882；
步骤十一、稀盐半固态发酵；35-40℃，发酵30-45天；
步骤十二、二次注水：稀释至含盐量10%-13%；
步骤十三、三次接菌；注水后接入耐盐酵母，接种温度26-32℃，接菌量为上一步中全部物料重量的0.5%-1%；
步骤十四：后发酵，温度为26-32℃，发酵30-40天；
步骤十五、罐装；封口；灭菌；成品。
2.根据权利要求1所述的一种基于纳豆芽胞杆菌诱变株为优势菌系的大豆酱，其特征在于：步骤八所述的前发酵，温度25℃、时间48h；步骤十四所述的后发酵，温度26℃、时间30天。
3.根据权利要求2所述的一种基于纳豆芽胞杆菌诱变株为优势菌系的大豆酱，其特征在于：步骤十一所述的稀盐半固态发酵，温度35℃，发酵时间30天。
4.根据权利要求3所述的一种基于纳豆芽胞杆菌诱变株为优势菌系的大豆酱，其特征在于：所述的一次接菌的接菌量为1%，所述的二次接菌的接菌量为2%，所述的三次接菌的接菌量为0.5%。
5.根据权利要求4所述一种基于纳豆芽胞杆菌诱变株为优势菌系的大豆酱，其特征在于：在步骤十五中，发酵好后的大豆酱采用自动包装机进行灌装、封口；灌装后采用水浴杀菌，杀菌温度80℃，时间30分钟，然后冷却至15℃；将冷却后的包装袋装箱，即为成品。
6.一种基于纳豆芽胞杆菌诱变株为优势菌系的大豆酱的制作方法，其特征在于，包括下列步骤：
步骤一、精选大豆：选取大豆绥农29，蛋白含量41.92%，脂肪含量21.28%，经过机械分级精选；
步骤二、气蒸祛腥：120℃下气蒸3-5min；
步骤三、糖液煮制熟化：加入β-葡聚糖溶液进行高温熟化，加入0.5%-1%β-葡聚糖溶液，溶液添加量为干豆体积的1.5-2.5倍，进行高温熟化，熟化参数为100℃，35-40min，熟化后冷却备用；
步骤四、酶解: 加入中性蛋白酶和谷氨酰胺转氨酶对大豆蛋白进行复合改性，混合比例：中性蛋白酶：谷氨酰胺转氨酶=1:1.5，温度55℃、时间0.5h、pH7.0、酶用量为上一步中全部物料重量的2.5%-5%；
步骤五、辗拌：将物料转移至斩拌机充分辗拌；
步骤六、一次接菌：接入米曲霉3.042，接种温度25-32℃，接菌量为上一步中全部物料重量的1%-2%；
步骤七、制酱醅：将接菌后的酱料挤压置于发酵池中；
步骤八：前发酵；发酵温度25-32℃，发酵时间保持48-72h；
步骤九、辗拌、一次注盐水：盐水浓度18%-20%,加水量为干豆体积的一倍；
步骤十、二次接菌：接入纳豆芽孢杆菌诱变株BNM1，枯草芽孢杆菌，贝莱斯芽孢杆菌，四联耐盐球菌，凝结芽孢杆菌；菌种比例为纳豆芽孢杆菌诱变株BNM1：枯草芽孢杆菌：贝莱斯芽孢杆菌：四联耐盐球菌：凝结芽孢杆菌=5:2：1:1：1，接种温度35-40℃，接菌量为上一步中全部物料重量的2-3%；
所述纳豆芽孢杆菌诱变株BNM1，Bacillus subtilis natto BNM1在中国典型培养物保藏中心的保藏号为：CCTCC No.M2019882；
步骤十一、稀盐半固态发酵；35-40℃，发酵30-45天；
步骤十二、二次注水：稀释至含盐量10%-13%；
步骤十三、三次接菌；注水后接入耐盐酵母，接种温度26-32℃，接菌量为上一步中全部物料重量的0.5%-1%；
步骤十四：后发酵，温度为26-32℃，发酵30-40天；
步骤十五，发酵好后的大豆酱采用自动包装机进行灌装、封口；灌装后采用水浴杀菌，杀菌温度80℃，时间30分钟，然后冷却至15℃；将冷却后的包装袋装箱，即为成品。
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