CN113736694B - 具有降解黄油能力的乳酸乳球菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株具有降解黄油能力的乳酸乳球菌及其应用。所述的乳酸乳球菌为grx602，保藏编号为CGMCC No.22692，其能够降解黄油脂肪产生游离脂肪酸，改善黄油的品质和风味。乳酸乳球菌grx602对人工胃液、胆盐均有较好的耐受性，能够耐受人体的胃液，可作为性能优良的益生菌，在肠胃中存活并发挥作用；且对于胆固醇也有一定的降解作用，可作为食品添加剂应用于多种食品制备及加工处理中。

Description

具有降解黄油能力的乳酸乳球菌及其应用
技术领域
本发明属于乳酸菌技术领域，涉及一株具有降解黄油能力的乳酸乳球菌及其应用。
背景技术
黄油是从新鲜牛奶中提炼出来的油脂，在常温下为浅黄色固体，具有独特的乳香味，其主要由乳脂、乳蛋白和水组成，还含有磷脂、固醇、少量维生素、胡萝卜素、矿物质和风味组分等，其营养是乳制品之首。乳脂肪是黄油中主要成分，也是香气的主要来源。黄油中乳脂肪的含量是原料牛奶的20～25倍。但黄油中的乳脂大多是以长链脂肪为主，这类脂肪不溶于水，且无明显气味和滋味特色。因此，在产品加工中往往需要通过增大黄油添加量才能达到产品要求，导致黄油摄入量过多，而过多的油脂摄入会促进肥胖、冠心病、糖尿病和肿瘤等慢性疾病的发生。
发酵增香技术是利用微生物发酵产生乳品特征香气成分，或发酵产物分解乳脂肪和乳蛋白，得到的产物香味更加自然、柔和、逼真，香气强度可提高100～300倍。乳酸菌是公认安全的一类微生物，其生长产生的脂肪酶可分解乳脂。脂肪水解生成游离脂肪酸，比如己酸、辛酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、十七烷酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸等，可以直接成为风味成分，也可作为进一步分解代谢的前体物质，最终获得具有强烈风味的终产品。由于脂肪分解的产物对黄油的品质改善具有重要的作用，因此选择使用具有降解黄油能力的菌株，对于发酵黄油具有很好的研究和应用前景。
乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)凭借其水解蛋白和脂肪产生挥发性风味物质的能力，在改善发酵乳制品质地和风味方面发挥巨大作用，而广泛应用于干酪、酸奶和酸奶油等乳制品生产。乳酸乳球菌能够赋予发酵乳制品良好的质地和风味，具有极高的工业和经济价值。
发明内容
本发明提供一株具有降解黄油能力的适用于食品制备或者直接食用的乳酸乳球菌。
发明人以黄油为唯一碳源，通过菌体富集及初筛、复筛培养等，从生牛乳样品中筛选出一株具有降解黄油能力的菌株，经分子生物学鉴定为乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)，命名为乳酸乳球菌grx602。该菌株已于2021年6月11日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.22692。
本发明还提供上述乳酸乳球菌grx602的培养方法，具体为：将乳酸乳球菌grx602接种到含黄油的培养基中，培养pH为7.0，培养温度为37℃，发酵培养。
乳酸乳球菌是可用于保健食品中的一种益生菌。具有降解黄油能力的乳酸乳球菌因其分泌脂肪酶分解脂肪，产生游离脂肪酸赋予食品特殊的风味等功能，可用于多种食品加工处理中，如生产奶油、奶酪、香肠、各种含油糕点等。
进一步地，本发明还提供上述乳酸乳球菌grx602在降解黄油中的应用。
上述应用中，具体的应用方法为：将乳酸乳球菌grx602接种到含有黄油的物质中，进行黄油的降解。
更进一步地，本发明提供降解黄油的食品或食品添加剂，所述的食品或食品添加剂中含有乳酸乳球菌grx602。
所述的食品或食品添加剂可以为本领域中乳酸乳球菌作为益生菌常规使用的食品或食品添加剂，例如奶油、奶酪、香肠、含油糕点及菌粉等。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明的乳酸乳球菌grx602为具有降解黄油能力的可食用菌株。乳酸乳球菌grx602降解黄油脂肪产生游离脂肪酸，随着发酵的进行，饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸、多不饱和脂肪酸含量不断增加。特别是发酵后生成了原样中没有的肉豆蔻油酸和亚麻酸两种不饱和脂肪酸，其为人体必需脂肪酸，可以调节血脂、清理血栓、提高人体的免疫力，对人体有重要的意义。乳酸乳球菌grx602发酵黄油产生37种挥发性物质，包括11种烃类化合物、9种醛类化合物、6种酸类化合物、4种醇类化合物、2种酯类化合物、1种酚类化合物和4种其他化合物。乳酸乳球菌grx602的发酵产物能测到明显的脂肪酶活性，胞内酶活在发酵周期24h时达到最大值，为9.33U/mL；而胞外酶活在发酵周期48h时才达到最大值，为12.43U/mL。该菌株所产脂肪酶对长链底物表现出最大酶活，最适反应pH及最适反应温度分别为7.0和40℃，且该酶具有一定的耐盐能力。乳酸乳球菌grx602对人工胃液、胆盐均有较好的耐受性，能够耐受人体的胃液，可作为性能优良的益生菌，在肠胃中存活并发挥作用。且该菌株对于胆固醇也有一定的降解作用。
附图表说明
图1为本发明菌株筛选实验结果图。
图2为本发明菌株镜检图。
图3为本发明菌株PCR扩增16S rDNA的琼脂糖凝胶电泳图。
图4为本发明菌株不同时间活菌数及其酶活结果图。
图5为本发明菌株脂肪酶酶学特性结果图。
图6为本发明菌株滴定酸度实验结果图。
图7为本发明菌株酸价实验结果图。
表1为脂肪酶酶活标准曲线的绘制。
表2为本发明菌株初筛培养结果。
表3为本发明菌株复筛培养结果。
表4为本发明菌株发酵黄油游离脂肪酸组成与含量。
表5为本发明菌株发酵黄油挥发性物质组成与含量。
表6为本发明菌株益生特性测定结果。
具体实施方式
下面结合实施例、附图和表对本发明作进一步详述。
本发明先从生牛乳样品中按形态分离筛选乳酸菌，通过以黄油为唯一碳源的筛选培养基筛选出具有降解黄油能力的菌株，进而通过16S rDNA对菌株进行鉴定。最终确定菌株的酶学特性、降解黄油特性及益生特性。
下述实施例中的相关培养基及试剂配方以及测试方法如下。
1.实验用油脂
安佳黄油，油脂含量为82.9wt％，规格为无盐，生产厂家为新西兰恒天然集团。
2.实验用培养基
(1)MRS培养基：葡萄糖20.0g、蛋白胨10.0g、无水乙酸钠5.0g、柠檬酸铵2.0g、磷酸氢二钾2.0g、七水硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、吐温-80 1.0ml、牛肉膏10.0g、酵母提取物5.0g、水1.0L、琼脂15.0g，pH为7.0。
(2)初筛培养基：牛肉膏10.0g，蛋白胨10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸三铵2.0g，吐温-80 1.0mL，无水乙酸钠5.0g，磷酸氢二钾2.0g，七水硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，黄油聚乙烯醇乳化剂20.0g，溴甲酚紫3mL，水1L，琼脂15.0g，pH为7.0。
(3)复筛培养基(以黄油为唯一碳源)：柠檬酸三铵2.0g，吐温-80 1.0mL，无水乙酸钠5.0g，磷酸氢二钾2.0g，七水硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，黄油聚乙烯醇乳化剂20.0g，水1L，溴甲酚紫3mL，琼脂15.0g，pH为7.0。
(4)验证培养基：柠檬酸三铵2.0g，吐温-80 1.0mL，无水乙酸钠5.0g，磷酸氢二钾2.0g，七水硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，溴甲酚紫3mL，水1L，琼脂15.0g，pH为7.0。
(5)添加黄油的产酶基础培养基：蛋白胨10.0g，葡萄糖5.0g，黄油聚乙烯醇乳化液20.0g，柠檬酸三铵2.0g，无水乙酸钠5.0g，磷酸氢二钾2.0g，七水硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，蒸馏水1L，pH为7.0。
(6)不添加黄油的产酶基础培养基：蛋白胨10.0g，葡萄糖5.0g，柠檬酸三铵2.0g，无水乙酸钠5.0g，磷酸氢二钾2.0g，七水硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，蒸馏水1L，pH为7.0。
3.主要测定方法
(1)脂肪酶酶活力测定
酶活力即酶的反应速度，可用产物增加量进行表示，并在反应过程中根据反应物或产物吸光值变化，利用分光光度计定量(OD405nm)。
1)标准曲线的绘制：配制5mmol/L对硝基苯酚溶液100mL，底物缓冲液为Tris-HCl(50mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)，按照下表1添加。
表1脂肪酶酶活标准曲线的绘制
Figure BDA0003221742300000041
各溶液于试管混合后，在405nm处测定吸光度值，根据测定结果绘制标准曲线。并计算相关线性方程：
Y＝109.88x-6.0033，R2＝0.9993，Y为对硝基苯酚浓度(μmol/L)，x为吸光值。
2)样品酶活力的测定
A液：25mmol/L的4-棕榈酸硝基苯酯，B液：50mmol/L的Tris-HCl(pH 8.0)的缓冲溶液，C液：A液与B液以体积比1：9均匀混合，加入0.1％的阿拉伯树胶粉，现用现配。
样品酶活测定：取两个试管，分别为对照管与样品管，总反应体系为1.2mL，两试管中各加入350μL的C液(37℃恒温保温15min)，样品管中加入酶液50μL，立即混匀计时，37℃恒温水浴反应15min，向反应体系中加入400μL、0.5mol/L的三氯乙酸溶液混匀终止反应，再加入400μL、0.5mol/L的碳酸钠溶液显色，混匀后于12000rpm离心1min。对照组测定方法同上，只是在加C液前先加400μL、0.5mol/L三氯乙酸，使酶失活，再加C液，之后于405nm处测定吸光度值。
酶活单位定义：每分钟脂肪酶分解对对硝基棕榈酸硝基苯酯(P-NPP，C16)释放出1μmol对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位U。
酶活计算公式：A＝([A1-A0]*K+C)*Vl*n/(V2*t)，
A：样品酶活力(U/mL)；A1：样品酶液的吸光度OD值，A0：对应酶液的空白吸光度值；K：斜率；C：截距；n：稀释倍数；V1：反应液的体积(mL)；V2：酶液的体积(mL)；t：反应时间(min)。
(2)生长曲线和产酶曲线的测定
将菌液接种于产酶基础培养基中，37℃，培养72h，每隔24h取样，测定脂肪酶酶活力及活菌数，绘制菌株的产酶曲线和生长曲线。
菌株胞外粗酶液的制备：菌株经产酶基础培养基培养后，收集菌液于4℃条件下8000r/min离心10min，取上清液即胞外粗酶液。
菌株胞内粗酶液的制备：菌株经产酶基础培养基培养后，收集菌液于4℃条件下10000r/min离心10min去上清，用Tris-HCl缓冲液(50mmol/mL，pH 8.0)洗涤2次后将菌体重新溶于缓冲液中，按0.6％(v/v)加入溶解酶(50mg/mL)，37℃水浴孵育2h，低温条件下高压破壁5次(35kpsi，4℃)，离心(条件同上)，所得上清液即为胞内粗酶液。
生长曲线的测定：取发酵液在8000r/min条件下离心10min后，弃去上清液，用生理盐水离心(同上条件)洗涤，然后在MRS固体培养基上稀释涂布，记录活菌数。
(3)酶学性质的测定
1)底物特异性
以异丙醇为溶剂，分别配制终浓度为25mmoI/L的对硝基苯酚乙酸酯(P-NPA，C2)、对硝基苯酚丁酸脂(P-NPB，C4)、对硝基苯酚辛酸酯(P-NPC，C8)、对硝基苯酚月桂酸酯(P-NPL，C12)、对硝基苯酚棕榈酸酯(P-NPP，C16)，测定菌株脂肪酶对不同底物的酶活力，定义最高酶活力为100％，计算其余相对酶活，判断其最适反应底物。
2)最适反应pH
配制50mmol/L pH分别为5.0、6.0、7.0、8.0和9.0的缓冲体系，同步替换酶促反应体系中的缓冲溶液，37℃、反应15min后测定其酶活力，定义最高酶活力为100％，计算其余相对酶活，判断其最适反应pH。
3)最适反应温度
将酶促反应体系的温度分别设定为20℃、30℃、40℃、50℃和60℃，同步替换酶促反应体系中的温度，反应15min后测定各温度下的酶活力，定义最高酶活力为100％，其他的换算成相对酶活，判断其最适反应温度。
4)耐盐能力
在反应体系中分别加入1％、3％、5％、7％和9％的NaCl溶液(w/v)，37℃、反应l5min后测定酶活力，其中定义最高酶活力为100％，计算其余相对酶活，判断其脂肪酶的耐盐能力。
(4)发酵理化指标的测定
1)生长曲线的测定
将菌株分别接种于不添加黄油和添加黄油的产酶基础培养基中，37℃，培养48h，每隔12h取样。取发酵液在8000r/min条件下离心10min后，弃去上清液，用生理盐水离心(同上条件)洗涤，然后在MRS固体培养基上稀释涂布，记录活菌数，绘制生长曲线。
2)滴定酸度的测定
根据GB 5009.239—2016，《食品安全国家标准食品酸度的测定》来测定样品的滴定酸度。
3)酸价测定
根据GB 5009.229—2016，《食品安全国家标准食品中酸价的测定》来测定样品的酸价。通过对脂肪酸价的测定来衡量脂肪水解的程度。
4)游离脂肪酸含量测定
样品的甲酯化：称取5.0g发酵液样品置于25mL具塞试管中，加入5.0mL、2mol/L的KOH-甲醇溶液，漩涡混匀后置于50℃水浴中进行衍生化反应，每隔10min取出摇匀1次，30min后取出置于室温下放置2h，其间每隔0.5h摇匀1次。加入5mL异辛烷，漩涡提取30s，静置分层后取上层异辛烷相装入GC-MS样品瓶中，样品在进样前用0.22μm孔径的尼龙膜过滤。
气相色谱条件：进样量为1μL，不分流，进样口温度为250℃，正模式下离子源(EI源)温度为250℃，质量分析器为四级杆质量分析器，质谱裂解电压为70eV，质量扫描范围m/z为45-450。柱温箱升温条件为：130℃保持5min，然后以2℃/min的速度升到220℃，保持5min，然后以2℃/min的速度升至240℃，保持10min。载气(氦气)流速为0.8mL/min。
(5)挥发性风味物质的测定
1)挥发性风味物质的萃取
取5g发酵样品于气密瓶中，在温度为50℃的条件下进行45min萃取，最后在温度为250℃的条件下解析5min。样品萃取结束后萃取头在温度为250℃的条件下老化15min，以防止样品之间的交叉污染。
2)GC-MS的条件分析
样品分离利用DB-WAX色谱柱(30m x 0.25mm x 0.25um)。载气为流速1.0mL/min的氦气，进样口温度为250℃。升温程序：开始的温度为60℃，保持3min；以6℃/min，升温至150℃；以4℃/min，升温至230℃，保持5min。
(6)耐酸耐胆盐实验
1)基础培养液的配置：
人工胃液：分别取0.5g NaCl和0.3g胃蛋白酶溶解于去离子水中，用1mol/L的盐酸调pH至3.0，加去离子水至100mL，0.22μm滤器过滤除菌，4℃冰箱冷藏备用。
胆盐培养基：称取一定量的胆盐于MRS液体培养基中，使其胆盐浓度(w/v)为0.05％、0.1％和0.3％，调pH至6.5±0.2，121℃灭菌15min，冷却备用。
2)耐酸耐胆盐能力测定
取菌株活化2代后的液体培养液6mL于10mL的离心管中，10000r/min离心10min去除上清取沉淀，加入等体积0.85％的生理盐水溶液，相同条件离心，去上清取沉淀，继续加入等体积的0.85％的生理盐水溶液，制备菌悬液。取1mL菌悬液加入9mL的人工胃液和9mL的胆盐浓度为0.05％、0.1％和0.3％(w/v)的MRS培养基中，37℃培养，依次在0、3h时进行取样，计算菌株存活率。
(7)降胆固醇实验
1)基础培养液的配置
胆固醇培养基：将胆固醇0.1g、吐温-80 1.0mL、蔗糖酯0.1g、冰乙酸5.0mL，混合后超声制备成胆固醇胶束溶液并迅速加入到MRS液体培养基中，使培养基中的胆固醇终浓度为0.1mg/mL，添加0.2％(w/v)的牛胆盐和0.2％(w/v)的巯基乙酸钠，调pH至6.5±0.1。
10％氯化铁溶液：称取10g六水合氯化铁(分析纯)溶解于87％浓磷酸中，定容至100mL。
磷硫铁试剂：吸取1.5mL的10％氯化铁溶液，用浓硫酸定容至100mL。
2)降胆固醇的测定
胆固醇含量标准曲线的建立：准确称取胆固醇标准品0.1g，用乙醇定容至100mL，配制成0.1％的胆固醇溶液(w/v)。吸取0.1％的胆固醇溶液10mL用无水乙醇定容至100mL，充分混匀后即为胆固醇标准液。在7个比色管中分别添加0mL、0.05mL、0.1mL、0.15mL、0.2mL、0.25mL、0.3mL的胆固醇标准液，加入无水乙醇使总体积至2mL。吸取2mL磷硫铁试剂沿管壁缓缓加入，使两液间保持明显间隔。加入后充分混匀，以促进成色。待冷却至室温后于560nm测定吸光值，吸光值计算公式为：Y＝2.2635x+0.0038，R2＝0.9992，Y为胆固醇含量(μg/mL)，x为吸光值。
胆固醇降解率的测定：将活化好的菌株按3％的接种量接种到胆固醇培养基中，37℃培养48h后离心(10000r/min)。取200μL离心所得发酵液于离心管中，加入800μL无水乙醇充分混匀后分两次加入4mL无水乙醇，快速混匀后离心(10000r/min，15min)。移取2mL上清液于比色管中，沿管壁缓缓加入2mL磷硫铁试剂，加入后充分混匀显色，待冷却至室温后，于560nm处测定吸光值。以MRS液体培养基为空白组校零。胆固醇降解率计算公式如下：
Figure BDA0003221742300000081
实施例1
1.菌株筛选
(1)菌株的驯化
无菌条件下，取适量生牛乳样品按1x、10x、102、103下稀释，共计4个平行样分别涂布接种于MRS固体培养基，37℃培养，进行菌株驯化。
生牛乳样品中的菌株经过MRS固体培养基48h的驯化培养后，从培养皿中挑选66个菌落从外观上较为符合乳酸菌的特质(以1至66的顺序进行编号)，进一步进行初筛培养。
(2)菌株的初筛
菌株初筛，将驯化得到的菌株涂布接种于初筛培养基上，37℃培养，进行初筛，并观察菌株生长情况。初筛结果如表2所示，有1、3、9、12、13、15、18、21、22、23、25、32、33、39、42、45、46、47、51、52、54、55、61、65这24株菌在初筛培养基中生存，其他菌株无法生存，不能利用黄油生长，不具有降解黄油的能力。对初筛的菌株进行革兰氏染色，观察染色结果，初筛得到的菌株皆为革兰氏阳性菌。
表2菌株初筛培养结果
Figure BDA0003221742300000091
Figure BDA0003221742300000101
Figure BDA0003221742300000111
(3)菌株的复筛
经过之前的驯化、初筛操作后，为了进一步筛选具有降解黄油能力的菌株，将初筛所得24株菌株涂布接种于复筛培养基，放置于37℃恒温条件下培养。复筛结果如表3所示，仅有1、3、9、21、22、23、25、32、33、39这10株菌在复筛培养基中生存，其他菌株无法生存，不能利用黄油生长，不具有降解黄油的能力。为了排除除油脂外其他物质供菌株生存，再次证明菌株能降解黄油，将在复筛培养基中生长情况较好的23号菌株涂布接种于验证培养基，放置于37℃恒温条件下培养，观察菌株生长情况。由图1可知，23号菌株在复筛培养基中可以生存形成菌落，而在验证培养基中无法生存。经验证培养基的验证，23号菌株能在以油脂为唯一碳源的培养基中生存，由此可判定其能够降解利用黄油。
表3菌株复筛培养结果
Figure BDA0003221742300000112
Figure BDA0003221742300000121
2.乳酸菌菌株鉴定
(1)生理生化鉴定
将23号菌进行染色电镜观察，其结果为图2所示，该菌株经革兰氏染色为阳性，并呈现均匀球状分布。
(2)16SrDNA扩增、克隆及测序
采用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取菌株的DNA，进行PCR扩增，在1500bp处条带清晰(图3)。PCR扩增后将产物切胶、纯化、回收后，送至生工生物工程(上海)有限公司进行测序，核苷酸序列见序列表SEQ NO.1所示。
测序结果在NCBI上用BLAST进行同源性比较：结果得出菌株23与乳酸乳球菌4590(GenBank登录号为MT545091.1)、4364(GenBank登录号为MT544902.1)等菌株相似度为98.8％，证明菌株23为乳酸乳球菌，具有较高的同源性，但尚有部分序列存在一定差异，属新菌株，命名为乳酸乳球菌grx602。
3.脂肪酶酶活能力
(1)生长曲线和产酶曲线
为了更好地了解菌株生长和脂肪酶表达的规律，测定并绘制菌株产酶曲线和生长曲线。
结果如图4，随着发酵时间的延长，胞内和胞外的脂肪酶酶活均呈现先升高后降低。当发酵周期为24h时，胞内酶活达到最高，为9.33U/mL，且此时胞内酶活高于胞外酶活。而随着时间的继续延长，胞内酶活开始下降，胞外酶活持续升高且逐渐高于胞内酶活，在发酵时间为48h时胞外酶活达到最高，为12.43U/mL。故选择最佳的发酵周期为48h。
(2)底物特异性
以不同链长的对硝基苯酚酯为底物，加入粗酶液催化水解，测定不同底物下酶活力的大小，判断对其底物的分解特性。
由图5a可知，菌株grx602所产脂肪酶对不同碳链长度的底物均有催化活性，且对长链的苯酚酯的催化活性显著高于中链及短链的催化活性(P<0.05)，其中对C16即对硝基苯酚棕榈酸酯的催化活性最高，因此，以对硝基苯酚棕榈酸酯为反应底物进行后续酶学性质的分析测定。
(3)最适反应pH
pH影响底物与酶或辅酶与底物的解离状态，从而会影响酶对底物分子的结合催化能力。
由图5b可知，菌株所产脂肪酶反应pH在5.0～9.0范围内，酶活呈现先上升后下降的趋势，pH为7.0时相对酶活力达到峰值，pH对菌株所产脂肪酶的影响较大，同时pH在6.0～8.0的范围时相对酶活力较高，当pH小于6.0或高于8.0时相对酶活力低于40％，可见菌株grx602所产脂肪酶为中性脂肪酶。
(4)最适反应温度
温度不仅对蛋白的稳定程度有影响，同时还可通过影响酶与底物、抑制剂、激活剂、辅酶的结合来影响酶的反应速率。
由图5c可以看到，反应温度对酶促反应影响比较大。随着酶促反应温度的升高，脂肪酶的酶活逐渐升高。当反应温度为40℃时，脂肪酶活力最大。随着温度的继续升高，脂肪酶活力急剧下降。此菌株所产脂肪酶的最适温度为40℃，该脂肪酶为温和型脂肪酶。
(5)耐盐能力
在食品精细加工的发酵和后熟阶段，脂肪酶扮演着重要而且不可或缺的角色，而上述过程大多都是需要添加盐。测定菌株脂肪酶在添加不同浓度NaCl溶液的反应底物中酶活的大小，从而判断其脂肪酶的耐盐能力。
由图5d可知，菌株所产脂肪酶酶活随着反应底物盐浓度的增加而降低。在盐浓度在1～5％的范围内，脂肪酶相对酶活力仍保持在50％以上，但随着盐浓度的不断增加，酶活力急速下降。故此可见菌株grx602所产脂肪酶有一定的耐盐能力。
4.发酵理化性质测定
(1)滴定酸度
取不同发酵时间的样品，测定其滴定酸度的变化。由图6可知，在发酵时间为12h时，乳酸乳球菌grx602在不添加黄油和添加黄油的产酶基础培养基中均处于对数期，生长速度快，活菌数分别为11.74lg cfu/mL和11.84lg cfu/mL；随着发酵的继续，乳酸乳球菌grx602在两种培养基中的活菌数均出现下降趋势，且在不添加黄油产酶培养基中的活菌数下降速度远高于在添加黄油的产酶培养基。当发酵达到48h，不添加黄油和添加黄油产酶培养基中的乳酸乳球菌grx602活菌数分别下降到8.28lg cfu/mL和9.86lg cfu/mL。发酵过程中酸度不断升高，且在添加黄油组的酸度上升幅度高于不加黄油组。酸度是评价发酵黄油的重要指标，发酵48h时添加黄油组酸度达到74°T，符合美国农业部对发酵黄油的酸度要求，大于56°T。
(2)酸价
酸价表示脂肪中游离脂肪酸含量的多少。取不同发酵时间的样品，测定其酸价的变化。结果如图7所示，随着发酵时间的延长，酸价会不断升高，且在菌株对数期时酸价增加速率最快。出现这个现象的原因是乳酸乳球菌grx602可分泌脂肪酶，降解黄油产生游离脂肪酸，游离脂肪酸积累从而引起酸价的升高。
5.发酵黄油产生的游离脂肪酸的组成与含量的测定
利用GC-MS测定乳酸乳球菌grx602发酵黄油产生的游离脂肪酸的组成与含量的情况见表4所示。脂肪酸含量的变化可以用来表示脂肪的水解程度，黄油中脂肪酸组成差异与营养价值密切相关。脂肪酸一般分为饱和脂肪酸，单不饱和脂肪酸，多不饱和脂肪酸。饱和脂肪酸主要为人体提供能量，它可以增加人体内胆固醇和中性脂肪。不饱和脂肪酸为人体必需的脂肪酸，可以调节血脂、清理血栓、提高人体的免疫力，对人体有重要的意义。而且不饱和脂肪酸易氧化生成醛类和酮类物质，这些物质最终影响产品的风味。
表4乳酸乳球菌grx602发酵黄油产生的游离脂肪酸的组成和含量(％)
Figure BDA0003221742300000151
由表4所示，一共分离检测出12种脂肪酸，它们分别为饱和脂肪酸(癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、棕榈酸、十七烷酸、硬脂酸)、单不饱和脂肪酸(肉豆蔻油酸、棕榈油酸、油酸)和多不饱和脂肪酸(亚油酸、亚麻酸)。经过乳酸乳球菌grx602发酵后，黄油中游离脂肪酸含量均增加。癸酸和月桂酸均具有较强的挥发性，可赋予黄油独特的脂香，发酵后黄油中癸酸和月桂酸含量的增加可以让黄油香气更浓郁。肉豆蔻油酸和亚麻酸在黄油发酵前未经检出，经发酵后两种不饱和脂肪酸含量增加。由先前对乳酸乳球菌grx602脂肪酶酶学性质研究可知，该酶对长链底物有最大酶活，其会优先水解1、3位置上有长链脂肪酸的脂肪，所以发酵后黄油中肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸等长链脂肪酸的含量增加较快。
6.挥发性物质的分析
风味是食品的重要品质特征，发酵能改变原样中挥发性风味物质的组成和含量，增强一些对原样有益的风物化合物，降解某些异味物质，最终改变样品的风味特征。经过乳酸乳球菌grx602发酵黄油的挥发性风味物质经SPME-GC-MS检测鉴定，其成分鉴定结果见表5。
表5乳酸乳球菌grx602发酵黄油挥发性风味成分分析及相对含量
Figure BDA0003221742300000161
Figure BDA0003221742300000171
由表5可知，经过乳酸乳球菌grx602发酵黄油中挥发性物质通过SPME-GC-MS分析，并用质谱图库检索进行物质鉴定，获得发酵后黄油中主要的挥发性化合物37种。37种挥发性物质中包括11种烃类化合物、9种醛类化合物、6种酸类化合物、4种醇类化合物、2种酯类化合物、1种酚类化合物和4种其他化合物。烃类物质种类很多，可由烷基自由基脂质氧化产生，但阈值高、香气无特色，对风味贡献较小。醛类物质主要来源于原料中脂肪酸的氧化，阈值较低，对风味的贡献较大。壬醛、辛醛和癸醛是油酸的氧化产物，己醛是亚油酸的氧化产物，具有油脂味、青草味，是不良风味的重要来源。出现该原因可能是经过发酵后黄油中游离脂肪酸增多，进而脂肪酸氧化生成醛类物质。酸类物质主要来源于乳酸乳球菌发酵，适量的酸味可赋予食品舒适、柔和的口味，与酯类、醇类物质含量配比恰当，有助于样品的呈香。醇类物质可赋予产品花香和水果香，对风味具有重要作用。其中异戊醇含量最高，具有水果香、酒香，可对风味带来积极的作用。酯类物质是醇与羧酸和氨基酸发生酯化反应的产物，大多数酯类具有令人愉悦的花果香，发酵后酯类物质相对含量较高，对风味的贡献较大。酚类物质的相对含量较少，但对产品具有一定的抗氧化功效。其它类风味物质含酮类1种、杂环类3种。甲基酮类化合物可以赋予黄油特殊的风味，其中2-壬酮具有清新脂肪味，一般来源于脂肪酸氧化降解，通过乳酸乳球菌grx602发酵促进了黄油中乳脂肪的水解，增加了脂肪酸的浓度，从而促进了甲基酮的合成。
7.菌株益生特性分析
作为性能优良的益生菌，进入人体肠道才能发挥其作用，因此就要求其能够耐受强酸性胃液以及高浓度胆盐的胁迫。人体的胃液pH值通常为3.0左右，正常人体的小肠胆盐浓度在0.03％-0.30％之间；食物通过胃、肠道的时间一般为2h左右。本实验选取了pH 3.0的模拟胃液，0.05％、0.1％和0.3％三个胆盐浓度对乳酸乳球菌grx602的耐受性进行测定，并测定了菌株的降胆固醇能力，结果如表6。
表6乳酸乳球菌grx602益生特性测定结果
Figure BDA0003221742300000181
由表3可知，乳酸乳球菌grx602对人工胃液、胆盐有较好的耐受性，存活率随胆盐浓度提高而降低。且乳酸乳球菌grx602对于胆固醇也有一定的降解作用。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 具有降解黄油能力的乳酸乳球菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1148
<212> DNA
<213> 乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)
<400> 1
ggggaggggc gctatctgca gttgagcgct gaggttggta cttgtaccga ctggatgagc 60
agcgaacggg tgagtaacgc gtggggaatc tgcctttgag cgggggacaa catttggaaa 120
cgaatgctaa taccgcataa aaactttaaa cacaagtttt aagtttgaaa gatgcaattg 180
catcactcaa agatgatccc gcgttgtatt agctagttgg tgaggtaaag gctcaccaag 240
gcgatgatac atagccgacc tgagagggtg atcggccaca ttgggactga gacacggccc 300
aaactcctac gggaggcagc agtagggaat cttcggcaat ggacgaaagt ctgaccgagc 360
aacgccgcgt gagtgaagaa ggttttcgga tcgtaaaact ctgttggtag agaagaacgt 420
tggtgagagt ggaaagctca tcaagtgacg gtaactaccc agaaagggac ggctaactac 480
gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggtcc cgagcgttgt ccggatttat tgggcgtaaa 540
gcgagcgcag gtggtttatt aagtctggtg taaaaggcag tggctcaacc attgtatgca 600
ttggaaactg gtagacttga gtgcaggaga ggagagtgga attccatgtg tagcggtgaa 660
atgcgtagat atatggagga acaccggtgg cgaaagcggc tctctggcct gtaactgaca 720
ctgaggctcg aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa 780
acgatgagtg ctagatgtag ggagctataa gttctctgta tcgcagctaa cgcaataagc 840
actccgcctg ggggagtacg accgcaaggt tgaaactcaa aggaattgac ggggggcccg 900
cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta ccaggtcttg 960
acatactcgt gctattccta gagataggaa gttccttcgg gacacgggat acaggtggtg 1020
catgggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggttt aagtccccgc aaacgagcgc 1080
accccctatt ggttagctgc atcatcagtg ggcactctaa cgagactgcc gggtgaataa 1140
accgggag 1148

Claims (6)

1. 乳酸乳球菌(Lactococcus lactis）grx602，保藏编号为CGMCC No.22692。
2.根据权利要求1所述的乳酸乳球菌grx602的培养方法，其特征在于，具体步骤为：将乳酸乳球菌grx602接种到含黄油的培养基中，培养pH为7.0，培养温度为37℃，发酵培养。
3.根据权利要求1所述的乳酸乳球菌grx602在降解黄油中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，具体的应用方法为：将乳酸乳球菌grx602接种到含有黄油的物质中，进行黄油的降解。
5.降解黄油的食品或食品添加剂，其特征在于，所述的食品或食品添加剂中含有权利要求1所述的乳酸乳球菌grx602。
6.根据权利要求5所述的食品或食品添加剂，其特征在于，所述的食品或食品添加剂为奶油、奶酪、香肠、含油糕点或菌粉。
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