CN116574653A - 一种嗜盐四联球菌嗜盐亚种及其应用 - Google Patents

一种嗜盐四联球菌嗜盐亚种及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种嗜盐四联球菌嗜盐亚种及其应用，属于微生物及发酵技术领域；本发明在虾酱中分离到一株嗜盐四联球菌嗜盐亚种，并将其命名为Tetragenococcus halophilus subsp.halophilus M7‑1(以下记为嗜盐四联球菌嗜盐亚种M7‑1)；所述嗜盐四联球菌嗜盐亚种M7‑1在盐度为8％～20％，pH 5.5～8.5，20～40℃条件下生长，具有良好耐盐性；所述嗜盐四联球菌嗜盐亚种M7‑1无生物胺产生相关基因，可安全用于发酵虾酱等盐渍发酵水产品；所述嗜盐四联球菌嗜盐亚种M7‑1发酵所用时间短，发酵产品风味优良且生物胺含量低，具有很好的实用性。

Description

一种嗜盐四联球菌嗜盐亚种及其应用
技术领域
本发明属于微生物及发酵技术领域，具体涉及一种嗜盐四联球菌嗜盐亚种及其应用。
背景技术
虾酱是我国沿海地区传统食品，其是将低值虾经腌制、自然发酵而成的一种黏稠状、紫红色的盐渍发酵食品。目前国内主要通过传统自然发酵方法制作虾酱，即将低值虾原料与食盐混合后进行自然发酵，此类方法存在发酵周期长(3～12个月)、盐度高(20％～30％)、产品质量难以控制等问题。另外，虾酱发酵过程中由于微生物氨基酸脱羧酶的作用，会产生大量生物胺，严重威胁人类健康。人工接种微生物发酵虾酱可有效缩短发酵时间、抑制非必要微生物的生长，同时促进风味物质的形成，可有效解决这类问题。因此，寻找能够可低盐、快速、安全发酵虾酱的发酵剂微生物资源具有重要应用价值。
四联球菌属(Tetragenococcus)细菌是中度嗜盐菌，广泛存在于盐渍发酵水产品中，可有效促进发酵水产品中游离氨基酸以及挥发性风味物质的产生、改善发酵风味等作用。其中，嗜盐四联球菌(Tetragenococcus halophilus)因为其较好的发酵性能，常被用作发酵剂，改善盐发酵凤尾鱼酱的风味，以及在酱油生产中以提升酱油的风味。但是，目前还没有利用嗜盐四联球菌来用于虾酱发酵的相关研究。因此，需要提供一种可在满足快速、安全发酵虾酱等盐渍发酵水产品的四联球菌属菌株，这对于虾酱等盐渍发酵水产品的品质控制、工业化生产具有重要参考意义。
发明内容
针对现有技术中存在不足，本发明提供了一种嗜盐四联球菌嗜盐亚种及其应用；本发明在虾酱中分离到一株嗜盐四联球菌嗜盐亚种，并将其命名为Tetragenococcushalophilus subsp.halophilus M7-1(以下记为嗜盐四联球菌嗜盐亚种M7-1)；所述嗜盐四联球菌嗜盐亚种M7-1在盐度为0％～20％，pH 5.5～8.5，20～40℃条件下生长，具有良好耐盐性；所述嗜盐四联球菌嗜盐亚种M7-1无生物胺产生相关基因，可安全用于发酵虾酱等盐渍发酵水产品；所述嗜盐四联球菌嗜盐亚种M7-1发酵所用时间短，发酵产品风味优良且生物胺含量低，具有很好的实用性。
为了解决以上问题，本发明采用以下技术手段：
本发明首先提供了一种嗜盐四联球菌嗜盐亚种M7-1，所述嗜盐四联球菌嗜盐亚种的名称为Tetragenococcus halophilus subsp.halophilus M7-1，保藏在广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCC No：63323，保藏日期为2023年4月4日，保藏地址为中国广州。
优选地，所述嗜盐四联球菌嗜盐亚种M7-1的16S rRNA基因序列如SEQ ID No:3所示。
优选地，本发明所述嗜盐四联球菌嗜盐亚种M7-1为革兰氏阳性菌，其固体培养基上的菌落呈乳白色、圆形、边缘整齐不透明。
优选地，所述嗜盐四联球菌嗜盐亚种M7-1中无产生生物胺相关的基因。
优选地，所述基因包括编码鸟氨酸脱羧酶、亚精胺合酶、精胺合成酶、组胺脱羧酶、酪氨酸脱羧酶、色氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶和苯丙氨酸脱羧酶的基因。
本发明还提供了上述嗜盐四联球菌嗜盐亚种M7-1在制备发酵剂中的应用。
优选地，所述发酵剂为食品领域中的发酵剂。
优选地，所述嗜盐四联球菌嗜盐亚种M7-1发酵时不产生生物胺。
优选地，所述生物胺包括色胺、苯乙胺、腐胺、组胺。
优选地，所述食品包括盐渍发酵水产品。
优选地，所盐渍发酵水产品的盐度为8％～20％。
优选地，所述盐渍发酵水产品包括虾酱。
本发明还提供了一种盐渍发酵水产品的发酵方法，所述盐渍发酵水产品采用上述嗜盐四联球菌嗜盐亚种M7-1发酵水产品得到。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明从虾酱中分离到一株四联球菌属菌株，命名为Tetragenococcushalophilus subsp.halophilus M7-1，记为嗜盐四联球菌嗜盐亚种M7-1；该菌株可在盐度为8％～20％，pH 5.5～8.5，20～40℃条件下生长，具有良好耐盐性。本发明利用嗜盐四联球菌嗜盐亚种M7-1发酵虾酱等盐渍发酵水产品，可以得到发酵时间短、盐度低、风味优良的发酵产品。
本发明所述嗜盐四联球菌嗜盐亚种M7-1无生物胺产生相关基因，发酵虾酱时不产生生物胺，可用于发酵虾酱等盐渍发酵水产品。相比自然发酵，本发明所述嗜盐四联球菌嗜盐亚种M7-1发酵的虾酱不含色胺、苯乙胺、腐胺和组胺，在虾酱等盐渍发酵水产品的品质控制具有重要的参考意义。
相比其他嗜盐四联球菌，本发明所述嗜盐四联球菌嗜盐亚种M7-1发酵虾酱等盐渍发酵水产品时所用的时间更短，且发酵产品更加安全，更加适用于工业化生产。
附图说明
图1为Tetragenococcus halophilus subsp.halophilus M7-1系统发育树。
图2为虾酱成品感官评价图。
具体实施方式
下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。下述实施例中所用的试剂、生物材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中，涉及到的S-MRS固体培养基配方如下：
S-MRS固体培养基(g/L)：10g酪蛋白胨，10g牛肉膏，5g酵母提取物，5g葡萄糖，2g磷酸氢二钾，5g乙酸钠，2g柠檬酸三铵，1g吐温80，0.2g硫酸镁，0.05g硫酸锰，100g氯化钠，10g碳酸钙，15g琼脂，蒸馏水定容到1L，调节pH为6.8，121℃灭菌20min。
实施例1：嗜盐四联球菌嗜盐亚种M7-1的分离及形态、生物学鉴定
(1)分离：
取连云港农家现制虾酱，于4℃冰箱低温发酵4个月后，无菌环境下，取10g虾酱样品于盛有90mL无菌生理盐水(0.85％NaCl，w/v)的试管中，充分震荡混匀后梯度稀释至10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7备用。
在无菌条件下，用微量移液器吸取200μL虾酱稀释液(10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7)分别涂布于灭菌后的S-MRS平板上。涂布完成后将平板培养基置于恒温培养箱中35℃厌氧培养5d。挑取形态不一的单菌落在S-MRS固体培养基上划线纯化3次以上直至获得纯菌。通过上述操作，获得菌株M7-1和M7-2。
(2)形态、生物学鉴定：
将步骤(1)中得到的菌株M7-1和M7-2分别涂布于S-MRS固体培养基，在35℃厌氧培养3-5d长出单菌落后，先进行菌落形态观察，然后挑取单菌落进行革兰氏染色：涂片、固定、结晶紫初染、碘液媒染、无水乙醇脱色和番红复染后，进行干燥、镜检。
通过菌落形态观察和革兰氏染色发现，步骤(1)中得到的菌株M7-1和M7-2的生物学特征均为：在S-MRS固体培养基上M7-1菌落呈乳白色、圆形、边缘整齐不透明，革兰氏染色阳性。
对分离到的菌株M7-1和M7-2，进行基因组DNA的提取，利用PCR技术扩增菌株M7-1和M7-2的16S rDNA，均采用上游引物27F和下游引物1492R以基因组DNA为模板进行PCR扩增。
其中，上游引物27F的核苷酸序列为5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’(SEQ ID No:1)；
下游引物1492R的核苷酸序列为5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’(SEQ ID No:2)；
所述PCR扩增的体系(25μL)如下，DNA模板：2μL；ddH2O：8.5μL；正向引物：1μL；反向引物：1μL；Master Mix：12.5μL。PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。
将PCR扩增后的产物送至上海生工进行测序，经16S rRNA基因序列测定，得到菌株M7-1 16S rRNA基因序列长度为1431bp，其核苷酸序列如SEQ ID No:3所示；菌株M7-216SrRNA基因序列长度为1350bp，其核苷酸序列如SEQ ID No:4所示。测定结果在EzBioCloud数据库中进行同源性比对，菌株M7-1与已知的Tetragenococcus halophilussubsp.halophilus DSM 20339T的16SrRNA序列相似度为99.86％。
图1是基于16S rRNA序列的系统发育树图，由图1可见，菌株M7-1与Tetragenococcus halophilus subsp.halophilus DSM 20339T聚在一起。结合其形态学特征，确定其为Tetragenococcus halophilus subsp.halophilus，因此将菌株M7-1命名为Tetragenococcus halophilus subsp.halophilus M7-1，记为嗜盐四联球菌嗜盐亚种M7-1。菌株M7-2与Tetragenococcus halophilus subsp.flandriensis DSM 23766T聚在一起。结合其形态学特征，确定其为Tetragenococcus halophilus subsp.flandriensis，因此将菌株M7-2命名为Tetragenococcus halophilus subsp.flandriensis M7-2。
SEQ ID No:3
ATGCAGTCGAACGCTGCTTAAGAAGAAACTTCGGTTTTTTCTTAAGCGGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGGAACCTATCCATCAGCGGGGGATAACACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGCATATGGCTTTTTTTCACCTGAAAGAAAGCTCAAAGGCGCTTTACAGCGTCACTGATGGCTGGTCCCGCGGTGCATTAGCCAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAAGCAACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGCAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTCAGCAAAGAACAGGAGAAAGAGGAAATGCTTTTTCTATGACGGTAGCTGACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTGATTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCAGCTCAACTGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGATCACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCGTGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTTTGACCGCCCTAGAGATAGGGTTTCCCCTTCGGGGGCAAAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTATTGTTAGTTGCCAGCATTGAGTTGGGCACTCTAGCAAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGCGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGGAAGTACAACGAGCAAGCCAAGCCGCAAGGCCTAGCGAATCTCTGAAAGCTTCTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATCCGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCAAAGTCGGTGCGGCAACCCTTAGGGGAGCCAGCCGCCTAA
SEQ ID No:4
TTTTCTTAAGCGGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGGAACCTATCCATCAGCGGGGGATAACACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGCATACGGCTTTTTTTCACCTGAAAGAAAGCTCAAAGGCGCTTTACAGCGTCACTGATGGCTGGCCCCGCGGTGCATTAGCCAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAAGCAACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGCAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTCAGCAAAGAACAGGAGAAAGAGGAAATGCTTTTTCTATGACGGTAGCTGACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTGATTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCAGCTCAACTGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGATCACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCGTGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTTTGACCGCCCTAGAGATAGGGTTTCCCCTTCGGGGGCAAAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTATTGTTAGTTGCCAGCATTGCGTTGGGCACTCTAGCAAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGCGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGGAAGTACAACGAGCAAGCCAAGCCGCAAGGCCTAGCGAATCTCTGAAAGCTTCTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATCCGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAA。
将上述Tetragenococcus halophilus subsp.halophilus M7-1保藏在广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCC No：63323，保藏日期为2023年4月4日，保藏地址为中国广州；分类学名称为Tetragenococcus halophilus subsp.halophilus。
实施例2：嗜盐四联球菌嗜盐亚种M7-1的生长条件探究
本实施例对实施例1中分离的嗜盐四联球菌嗜盐亚种M7-1进行了生长条件探究，分别探究了嗜盐四联球菌嗜盐亚种M7-1可生长的盐度、pH和温度，具体步骤如下所示：
(1)可生长盐度实验：
配制盐浓度分别为0％，5％，10％，15％，20％，25％(w/v)的S-MRS液体培养基，按1％(v/v)接种量将活化好的菌株M7-1接入培养基中，35℃培养5天。将菌液混匀后，用移液枪移取2μL菌液，使用超微量分光光度计(NanoDropOne)测定菌体OD600。
经测定，该菌株可生长盐度范围为0％～20％，最适生长盐度为10％。
(2)可生长pH实验：
配制pH分别为5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0的S-MRS液体培养基，按1％(v/v)接种量将活化好的菌株M7-1接入培养基中，35℃培养5天。将菌液混匀后，用移液枪移取2μL菌液，使用超微量分光光度计(NanoDropOne)测定菌体OD600。
经测定，该菌株可生长pH范围为5.5～8.5，最适生长pH为7.5。
(3)可生长温度实验：
配制S-MRS液体培养基，按1％(v/v)接种量将活化好的菌株M7-1接入培养基中，分别放置于15℃，20℃，25℃，30℃，35℃，40℃，45℃的培养箱中，培养5天。将菌液混匀后，用移液枪移取2μL菌液，使用超微量分光光度计(NanoDropOne)测定菌体OD600。
经测定，该菌株可生长温度范围为20～40℃，且最适生长温度为35℃。
综上，实施例1中分离的嗜盐四联球菌嗜盐亚种M7-1可在盐度为0％～20％，pH5.5～8.5，20～40℃条件下生长，具有良好耐盐性。
实施例3：嗜盐四联球菌嗜盐亚种M7-1生物胺产生相关基因分析
使用PacBio平台单分子测序技术对嗜盐四联球菌嗜盐亚种M7-1进行基因组测序。对获得的下机数据进行质控、拼接。使用KEGG数据库对基因组进行注释，查找与生物胺产生相关的功能基因，包括：鸟氨酸脱羧酶(EC:4.1.1.17)、亚精胺合酶(EC：2.5.1.16)、精胺合成酶(2.5.1.22)、组胺脱羧酶(EC:4.1.1.22)、酪氨酸脱羧酶(EC:2.6.1.82)、色氨酸脱羧酶(EC:2.6.1.105)、赖氨酸脱羧酶(EC:4.1.1.18)以及苯丙氨酸脱羧酶(EC：4.1.1.53)。
经分析，嗜盐四联球菌嗜盐亚种M7-1基因组中不存上述与生物胺产生相关的基因。因此认为嗜盐四联球菌嗜盐亚种M7-1不产生生物胺，可安全用于虾酱等海产品发酵。
实施例4：嗜盐四联球菌嗜盐亚种M7-1发酵食品的应用
本实施例中以虾酱为例，举例说明嗜盐四联球菌嗜盐亚种M7-1作为发酵剂在发酵食品中的应用。其中，以自然发酵虾酱为对照组1，以同样分离自虾酱的Tetragenococcushalophilus subsp.flandriensis M7-2发酵虾酱为对照组2，本发明所述嗜盐四联球菌嗜盐亚种M7-1为试验组，进行两种发酵方式的成品品质以及安全指标测定，具体操作如下所示：
(1)对照组和试验组虾酱的发酵：
对照组1：取新鲜麻虾200g，去除杂物，冲洗干净后装罐，备用。
将罐装虾在65℃条件下杀菌30min，边加热边搅拌原料使其受热均匀；接着添加10％(w/v)的食盐，混合均匀后冷却至20-40℃，最后加入5％(v/v)无菌盐水(盐度为10％)置于20℃条件下发酵30天，得到自然发酵的虾酱。
对照组2：将Tetragenococcus halophilus subsp.flandriensis M7-2于S-MRS液体培养基富集培养，在OD600达到1.2，备用；取新鲜麻虾200g，去除杂物，冲洗干净后装罐备用。
将罐装虾在65℃条件下杀菌30min，边加热边搅拌原料使其受热均匀，待其受热均匀后添加12％(w/v)的食盐(Tetragenococcus halophilus subsp.flandriensis M7-2可生长的最佳盐浓度)，使其与灌装虾混合均匀；接着将灌装虾冷却至20～40℃，按5％(v/v)接种量向其中接种Tetragenococcus halophilus subsp.flandriensis M7-2，菌液终浓度为106-107CFU/mL，混合均匀后置于20℃条件下发酵30天，得到Tetragenococcushalophilus subsp.flandriensis M7-2发酵的虾酱。
试验组：将嗜盐四联球菌嗜盐亚种M7-1于S-MRS液体培养基富集培养，在OD600达到1.2，备用；取新鲜麻虾200g，去除杂物，冲洗干净后装罐备用。
将罐装虾在65℃条件下杀菌30min，边加热边搅拌原料使其受热均匀，待其受热均匀后添加10％(w/v)的食盐，使其与灌装虾混合均匀；接着将灌装虾冷却至20～40℃，按5％(v/v)接种量向其中接种嗜盐四联球菌嗜盐亚种M7-1，菌液终浓度为106-107CFU/mL，混合均匀后置于20℃条件下发酵30天，得到嗜盐四联球菌嗜盐亚种M7-1发酵的虾酱。
(2)对照组和试验组虾酱成品的品质以及安全指标测定：
(S1)挥发性盐基氮含量的测定：
按照GB 5009.228-2016记载的微量扩散法进行对照组自然发酵的虾酱和试验组嗜盐四联球菌嗜盐亚种M7-1发酵的虾酱的挥发性盐基氮含量测定。
经测定，对照组1自然发酵的虾酱TVB-N含量为213.244mg/100g，对照组2Tetragenococcus halophilus subsp.flandriensis M7-2发酵的虾酱TVB-N含量为124.582mg/100g，试验组嗜盐四联球菌嗜盐亚种M7-1发酵的虾酱TVB-N含量为110.261mg/100g。这说明，相较于自然发酵虾酱和Tetragenococcus halophilus subsp.flandriensisM7-2发酵的虾酱，嗜盐四联球菌嗜盐亚种M7-1发酵的虾酱被破坏的氨基酸含量更少，产品品质更高。
(S2)氨基酸态氮含量的测定：
按照GB 5009.235-2016记载的酸度计法进行对照组自然发酵的虾酱和试验组嗜盐四联球菌嗜盐亚种M7-1发酵的虾酱的氨基酸态氮含量测定。
经测定，对照组1自然发酵的虾酱AAN含量为1.032g/100g，对照组2Tetragenococcus halophilus subsp.flandriensis M7-2发酵的虾酱AAN含量为0.9625g/100g，试验组嗜盐四联球菌嗜盐亚种M7-1发酵的虾酱AAN含量为1.153g/100g。虾酱贸易行业标准中做出规定，虾酱产品中氨基酸态氮含量应≥1.1g/00g，发酵30天时，仅试验组嗜盐四联球菌嗜盐亚种M7-1发酵的虾酱AAN含量高于1.1g/00g，这说明，嗜盐四联球菌嗜盐亚种M7-1可以更加快速发酵虾酱。
(S3)对成品虾酱进行感官评价：
提前对10个评价人员进行风味培训，并对成品虾酱进行评分，分数从0～9，对虾酱的虾味、腥味、发酵味、氨味、鲜味、咸味、甜味和苦涩味进行评分，评分结果如图2所示。
图2为虾酱成品感官评价图，从图中可以看出，对照组1中自然发酵的虾酱主要以腥臭味以及难闻的氨气味为主，对照组2Tetragenococcus halophilussubsp.flandriensis M7-2发酵的虾酱以虾味、腥味为主，试验组中嗜盐四联球菌嗜盐亚种M7-1发酵的虾酱以鲜香味较突出。GC-MS结果表明，相对于对照组，实验组中醛类、酯类、醇类有所增加，且不含有三甲胺等挥发性含氮化合物，此类化合物具有腥臭味，推测是三甲胺等挥发性含氮化合物引起的对照组中的腥味。因此，嗜盐四联球菌嗜盐亚种M7-1发酵的虾酱具有更好的风味。
(S4)亚硝酸盐含量的测定：
按照GB 5009.33-2016记载的分光光度计法进行对照组自然发酵的虾酱和试验组嗜盐四联球菌嗜盐亚种M7-1发酵的虾酱的亚硝酸盐含量的测定。
经测定，对照组1自然发酵的虾酱亚硝酸盐含量为0.259mg/kg，对照组2Tetragenococcus halophilus subsp.flandriensis M7-2发酵的虾酱亚硝酸盐含量为0.012mg/kg，试验组嗜盐四联球菌嗜盐亚种M7-1发酵的虾酱亚硝酸盐含量为0.007mg/kg。这说明，嗜盐四联球菌嗜盐亚种M7-1可以安全发酵虾酱，使虾酱亚硝酸盐含量控制在非常低的含量。
(S5)生物胺的测定：
采用高效液相色谱法分别测定对照组自然发酵的虾酱和试验组嗜盐四联球菌嗜盐亚种M7-1发酵的虾酱中生物胺的含量，测定结果如表1所示。
表1对照组和试验组中生物胺的含量测定
生物胺(mg/kg) 色胺 苯乙胺 腐胺 尸胺 组胺 酪胺 精胺 总生物胺
对照组1 198.78 24.89 113.79 9.29 1.27 864.84 36.72 1249.57
对照组2 0 6.25 0 8.03 0 321.12 11.22 346.62
试验组 0 0 0 8.25 0 287.87 1.93 298.05
从表1中可以看出，对照组1自然发酵的虾酱中色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、精胺含量分别为198.78mg/kg、24.89mg/kg、113.79mg/kg、9.29mg/kg、1.27mg/kg、864.84mg/kg、36.72mg/kg；对照组2Tetragenococcus halophilus subsp.flandriensisM7-2发酵的虾酱中色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、精胺含量分别为0、6.25mg/kg、0、8.03mg/kg、0、321.12mg/kg、11.22mg/kg、346.62mg/kg；试验组嗜盐四联球菌嗜盐亚种M7-1发酵的虾酱中不含有对人体伤害最高的组胺，仅存在尸胺、酪胺和精胺，含量分别为8.25mg/kg、287.87mg/kg、1.93mg/kg，远低于自然发酵虾酱中生物胺含量。
此外，自然发酵虾酱中总生物胺含量为1249.57mg/kg，远远高出美国FDA对生物胺的标准1000mg/kg，Tetragenococcus halophilus subsp.flandriensis M7-2发酵的虾酱总生物胺含量为346.62mg/kg，而试验组嗜盐四联球菌嗜盐亚种M7-1发酵的虾酱总生物胺含量仅为298.05mg/kg。这说明，本发明所述嗜盐四联球菌嗜盐亚种M7-1可更加安全的发酵虾酱。
(S6)挥发性风味物质的测定：
采用顶空固相微萃取-气质联用分别测定对照组自然发酵的虾酱和试验组嗜盐四联球菌嗜盐亚种M7-1发酵的虾酱中的挥发性物质，测定结果如表2所示。
表2.试验组和对照组中虾酱的挥发性风味物质结果
从表2中可以看出，对照组1自然发酵的虾酱中挥发性风味物质75种，对照组2Tetragenococcus halophilus subsp.flandriensis M7-2发酵的虾酱中挥发性物质为63种，试验组嗜盐四联球菌嗜盐亚种M7-1发酵的虾酱中挥发性风味物质75种，并且，试验组嗜盐四联球菌嗜盐亚种M7-1发酵的虾酱增加了醛类、酯类、醇类等挥发性风味物质的种类或相对含量。这说明嗜盐四联球菌嗜盐亚种M7-1发酵虾酱使得虾酱具有更加多样的风味。
综上，本发明中所述嗜盐四联球菌嗜盐亚种M7-1可在低盐(10％)条件下发酵虾酱并加快发酵进程，同时维持低含量的挥发性盐基氮、亚硝酸盐和生物胺，为虾酱等盐渍发酵水产品的低盐、快速、安全发酵提供了微生物资源。
所述实施例为本发明的优选的实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种嗜盐四联球菌嗜盐亚种M7-1，其特征在于，所述嗜盐四联球菌嗜盐亚种的名称为Tetragenococcus halophilus subsp.halophilus M7-1，保藏在广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCC No：63323，保藏日期为2023年4月4日，保藏地址为中国广州。
2.根据权利要求1所述的嗜盐四联球菌嗜盐亚种M7-1，其特征在于，所述嗜盐四联球菌嗜盐亚种M7-1的16S rRNA基因序列如SEQ ID No:3所示。
3.根据权利要求1所述的嗜盐四联球菌嗜盐亚种M7-1，其特征在于，所述嗜盐四联球菌嗜盐亚种M7-1中无产生生物胺相关的基因。
4.根据权利要求3所述的嗜盐四联球菌嗜盐亚种M7-1，其特征在于，所述基因包括编码鸟氨酸脱羧酶、亚精胺合酶、精胺合成酶、组胺脱羧酶、酪氨酸脱羧酶、色氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶和苯丙氨酸脱羧酶的基因。
5.权利要求1-3任一项所述的嗜盐四联球菌嗜盐亚种M7-1在制备发酵剂中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述发酵剂为食品领域中的发酵剂。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述食品包括盐渍发酵水产品。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所盐渍发酵水产品的盐度为8％～20％。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述盐渍发酵水产品包括虾酱。
10.一种盐渍发酵水产品的发酵方法，其特征在于，所述盐渍发酵水产品采用权利要求1所述的嗜盐四联球菌嗜盐亚种M7-1发酵水产品得到。
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