CN114317368B - 一种利用盐渍四生球菌改善快速发酵鱼露风味的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用盐渍四生球菌改善快速发酵鱼露风味的方法,属于微生物发酵技术领域。该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.23785,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏时间为2021年11月11日;本发明利用盐渍四生球菌所生产的鱼露,具有传统发酵鱼露特有的香气,而且能够明显改善快速发酵鱼露的风味,与未加菌快速发酵鱼露相比,腐败微生物比例显著下降,特征性挥发性风味物质的种类和含量显著增加,具有广阔的市场应用前景。

Description

一种利用盐渍四生球菌改善快速发酵鱼露风味的方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域,特别是涉及一种利用盐渍四生球菌改善快速发酵鱼露风味的方法。
背景技术
鱼露也称鱼酱油,通常以低值鱼类或水产品加工副产物为原料,经过长时间自然发酵制得。鱼露味道鲜美,营养丰富,是一种备受欢迎的调味品。为抑制腐败微生物的不良影响,传统的鱼露发酵工艺通常采用高盐发酵方式,加盐量一般在30%左右。耐盐微生物,在其复杂生化代谢途径的作用下,产生各种初级和次级代谢产物,进而产生鱼露独特的风味。这些耐盐微生物在原料鱼体内和发酵环境中并不是优势微生物,在高盐作用下逐渐富集为优势菌群,然而由于高盐对微生物代谢的抑制作用,依靠自然发酵过程促使鱼露形成独特风味所需要的时间较长,通常需要1~3年,极大地限制了鱼露产业的发展。
低盐发酵技术是目前快速发酵鱼露常用的方式。但是由于加盐量较低,鱼露容易腐败变质,因此需要添加合适的微生物发酵剂。目前,由于微生物发酵剂筛选的盲目性和随机性,大多选用的菌株不是在传统发酵鱼露风味和品质形成起关键作用的菌株,因此虽然鱼露发酵速度有所提高,但失去了传统鱼露的特征风味,因此很难进行工业化应用。四生球菌属(Tetragenococcus)已被鉴定为传统发酵鱼露中的核心微生物菌群,在传统鱼露风味形成过程中起着关键作用。但是,至今尚未出现关于鱼露中盐渍四生球菌的筛选以及应用于改善快速发酵鱼露风味的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用盐渍四生球菌改善快速发酵鱼露风味的方法,以解决上述现有技术存在的问题,该方法有利于抑制快速发酵鱼露中腐败微生物生长,提高特征性挥发性风味物质含量,改善快速发酵鱼露风味。
为实现上述目的,本发明提供了如下方案:
本发明提供一种盐渍四生球菌(Tetragenococcus muriaticus)YL9-5,其已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.23785,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏时间为2021年11月11日。
本发明还提供一种利用上述的盐渍四生球菌YL9-5改善快速发酵鱼露风味的方法,包括采用所述盐渍四生球菌YL9-5对鱼露原料进行加菌发酵的步骤。
进一步地,所述快速发酵鱼露为低盐鱼露,加盐量为鱼露原料的10-18%(w/w)。
进一步地,所述加菌发酵的发酵温度为25-35℃,发酵时间为10-45d。
进一步地,在加菌发酵前,还包括发酵剂制备的步骤;所述发酵剂制备包括:将盐渍四生球菌YL9-5厌氧培养1-3d,于4℃、12000g离心10min,重悬。
进一步地,所述厌氧培养包括:将所述盐渍四生球菌YL9-5接种到新鲜的LB改良培养基中,15-37℃下恒温厌氧培养1-3d。
进一步地,所述LB改良培养基包括以下质量百分比的组分:蛋白胨0.1-3%、酵母浸粉0.1-3%、氯化钠5-30%,用0-20%鱼露发酵稀释液溶解。
进一步地,所述发酵剂按照105-107CFU/g的终浓度加入到鱼露原料中。
进一步地,所述鱼露原料包括绞碎的新鲜小型低值鱼;所述小型低值鱼包括鳀鱼、蓝圆鲹、沙丁鱼、虾虎鱼、黄花鱼、青鳞鱼、凤尾鱼和鲭鱼中的一种或多种。
具体地,以上方法包括以下步骤:
(1)原料的处理:将新鲜小型低值鱼用绞肉机绞碎,按照10-18%(w/w)的比例加入食用盐,混匀后备用;
(2)发酵剂的制备与添加:将盐渍四生球菌厌氧培养1-3d,于4℃、12000g离心10min,无菌生理盐水重悬,将菌体按105-107CFU/g的终浓度加入到鱼露原料中,搅拌均匀;
(3)发酵鱼露:将加菌的原料在温度25-35℃下保温发酵10-45d,获得鱼露发酵液;
(4)过滤与灭菌:将鱼露发酵液用纱布过滤,去除未分解的鱼肉、鱼骨等固形物残留,得到的鱼露发酵液进行灌装杀菌,获得鱼露发酵产品。
本发明还提供一种上述的盐渍四生球菌YL9-5的用途,其特征在于,用于改善快速发酵鱼露风味。
本发明公开了以下技术效果:
本发明利用筛选培养基从鱼露发酵液中定向筛选盐渍四生球菌,通过加菌发酵的方式,提升传统鱼露发酵速率,抑制快速发酵鱼露中腐败微生物生长,提高特征性挥发性风味物质含量,改善快速发酵鱼露风味,为我国传统鱼露发酵产业转型升级提供重要理论基础和技术支撑;本发明利用盐渍四生球菌所生产的鱼露,具有传统发酵鱼露特有的香气,与未加菌快速发酵鱼露相比,腐败微生物比例显著下降,特征性挥发性风味物质的种类和含量显著增加,具有广阔的市场应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为利用盐渍四生球菌YL9-5的16S rRNA基因序列构建的系统进化树;
图2为盐渍四生球菌YL9-5的革兰氏染色结果;
图3为盐渍四生球菌YL9-5在含不同浓度盐培养基中的生长情况。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式,该详细说明不应认为是对本发明的限制,而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式,并非用于限制本发明。另外,对于本发明中的数值范围,应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明,否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料,但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入,用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时,以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下,可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化,这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等,均为开放性的用语,即意指包含但不限于。
实施例1
该盐渍四生球菌系从广东省汕头市汕头鱼露厂有限公司的传统鱼露发酵样品中筛选分离得到,筛选方法为:在改良的LB平板(蛋白胨1%、酵母浸粉0.5%、氯化钠10%、琼脂2%,用10%鱼露发酵稀释液溶解)上涂布不同梯度稀释倍数(10-106)的鱼露发酵液,35℃厌氧培养3d,挑选生长良好的单菌落,在改良的LB平板上连续划线纯化培养三次,获得疑似菌株,然后分别接种至改良的LB液体培养基(蛋白胨1%、酵母浸粉0.5%、氯化钠10%,用10%鱼露发酵稀释液溶解)中,进行后续形态观察及鉴定。
对纯化出来的菌株进行形态学以及生长特性分析,筛选出特性明显的四生球菌(四联或成对存在),该菌是一株可以改善鱼露风味的新菌株,经系统分类鉴定及形态鉴定,系统进化树如图1所示,革兰氏染色后显微镜下形态如图2所示,鉴定为盐渍四生球菌(Tetragenococcus muriaticus)。盐渍四生球菌在含有不同盐浓度培养基的生长情况如图3所示,该菌具有很强的耐盐性,最适生长盐浓度为15%,在30%盐浓度条件下仍生长良好。
该盐渍四生球菌命名为盐渍四生球菌(Tetragenococcus muriaticus)YL9-5,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.23785,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏时间为2021年11月11日。
经16S rRNA基因序列鉴定,测序拼接结果如下(SEQ ID No.1):
TGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAACGCTGCCCCTGTTCCCCTTCGGGGGAAGAGGTGGCAGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGGAACCTACCCAGCAGCGGGGGATAACACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGCATAAGCCTTTTTTTCACCTGGAAGAAAGGGAAAAGGCGCTTTAAGCGTCACTGCTGGAGGGGCCCGCGGTGCATTAGCCAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAAGCAACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGCAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTCAGCCAAGAACAGGAAGAAGAGGGAATGCTTTTTCTATGACGGTAGCTGACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGGGAGCGCAGGCGGTTCGTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCTCGGCTCAACCGAGGAGGGGCATTGGAAACTGGCGAACTTGAGTACAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTGACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCGTGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGCTGAGTGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTTTGACCGCCCTAGAGATAGGGTTTCCCCTTCGGGGGCAAAGAGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTATGGCTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAGTCAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGGGAGTACAACGAGCGCGCGAAGCCGCAAGGCCCAGCGAATCTCTGAAAGCTTCTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATCCGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTCGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCGCAAGGAGCCTACCGCCGAAGTGGGACGAACGATTGGGGT。
实施例2
(1)原料的处理:将新鲜鳀鱼用绞肉机绞碎,按照10%(w/w)的比例加入食用盐,混匀后备用。
(2)发酵剂的制备与添加:将盐渍四生球菌在LB改良培养基(蛋白胨2%、酵母浸粉0.5%、氯化钠20%,用15%鱼露发酵稀释液溶解)中厌氧培养3d,于4℃、12000g离心10min,无菌生理盐水重悬,将菌体按107CFU/g的终浓度加入到预处理过的原料中,搅拌均匀。向原料中只加相同体积的生理盐水作为对照组,用于鱼露的自然发酵。
(3)发酵鱼露:将加菌发酵组和对照组的原料在温度25℃下保温发酵20d,获得鱼露发酵液。
(4)过滤与灭菌:鱼露发酵液用纱布过滤,去除未分解的鱼肉、鱼骨等固形物残留,得到的鱼露发酵液进行灌装杀菌,获得鱼露发酵产品。
采用16S rRNA基因高通量测序分析鱼露微生物菌群多样性,结果如表1所示。与自然发酵鱼露相比,加入该盐渍四生球菌发酵鱼露的微生物菌群的Sobs指数、Chao指数、ACE指数和Shannon指数均显著降低,而Simpson指数显著增加,表明盐渍四生球菌能够显著降低快速发酵鱼露的微生物菌群多样性,降低腐败微生物比例。采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术解析鱼露发酵液中挥发性风味物质的含量,结果如表2所示。与自然发酵鱼露相比,加入该盐渍四生球菌发酵鱼露的特征性挥发性醛类、酯类、醇类、呋喃类、酮类、酸类等化合物的种类和数量显著增加,表明盐渍四生球菌能够显著改善快速发酵鱼露的风味。
实施例3
(1)原料的处理:将新鲜蓝圆鲹用绞肉机绞碎,按照18%(w/w)的比例加入食用盐,混匀后备用。
(2)发酵剂的制备与添加:将盐渍四生球菌在LB改良培养基(蛋白胨2%、酵母浸粉0.5%、氯化钠10%,用10%鱼露发酵稀释液溶解)中厌氧培养2d,于4℃、12000g离心10min,无菌生理盐水重悬,将菌体按106CFU/g的终浓度加入到预处理过的原料中,搅拌均匀。向原料中只加相同体积的生理盐水作为对照组,用于鱼露的自然发酵。
(3)发酵鱼露:将加菌发酵组和对照组的原料在温度35℃下保温发酵10d,获得鱼露发酵液。
(4)过滤与灭菌:鱼露发酵液用纱布过滤,去除未分解的鱼肉、鱼骨等固形物残留,得到的鱼露发酵液进行灌装杀菌,获得鱼露发酵产品。
采用16S rRNA基因高通量测序分析鱼露微生物菌群多样性,结果如表1所示。与自然发酵鱼露相比,加入该盐渍四生球菌发酵鱼露的微生物菌群的Sobs指数、Chao指数、ACE指数和Shannon指数均显著降低,而Simpson指数显著增加,表明盐渍四生球菌加菌发酵后微生物菌群多样性显著下降,腐败微生物比例显著降低。采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术解析鱼露发酵液中挥发性风味物质的含量,结果如表2所示。与自然发酵鱼露相比,加入该盐渍四生球菌发酵鱼露的特征性挥发性醛类、酯类、醇类、呋喃类、酮类、酸类等化合物的种类和数量显著增加,表明盐渍四生球菌能够显著改善快速发酵鱼露的风味。
实施例4
(1)原料的处理:将新鲜蓝圆鲹用绞肉机绞碎,按照18%(w/w)的比例加入食用盐,混匀后备用。
(2)发酵剂的制备与添加:将盐渍四生球菌在LB改良培养基(蛋白胨2%、酵母浸粉0.5%、氯化钠10%,用10%鱼露发酵稀释液溶解)中厌氧培养1d,于4℃、12000g离心10min,无菌生理盐水重悬,将菌体按105CFU/g的终浓度加入到预处理过的原料中,搅拌均匀。向原料中只加相同体积的生理盐水作为对照组,用于鱼露的自然发酵。
(3)发酵鱼露:将加菌发酵组和对照组的原料在温度35℃下保温发酵45d,获得鱼露发酵液。
(4)过滤与灭菌:鱼露发酵液用纱布过滤,去除未分解的鱼肉、鱼骨等固形物残留,得到的鱼露发酵液进行灌装杀菌,获得鱼露发酵产品。
采用16S rRNA基因高通量测序分析鱼露微生物菌群多样性,结果如表1所示。与自然发酵鱼露相比,加入该盐渍四生球菌发酵鱼露的微生物菌群的Sobs指数、Chao指数、ACE指数和Shannon指数均显著降低,而Simpson指数显著增加,表明盐渍四生球菌加菌发酵后微生物菌群多样性显著下降,腐败微生物比例显著降低。采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术解析鱼露发酵液中挥发性风味物质的含量,结果如表2所示。与自然发酵鱼露相比,加入该盐渍四生球菌发酵鱼露的特征性挥发性醛类、酯类、醇类、呋喃类、酮类、酸类等化合物的种类和数量显著增加,表明盐渍四生球菌能够显著改善快速发酵鱼露的风味。
表1
Figure BDA0003456080750000101
表2
Figure BDA0003456080750000102
Figure BDA0003456080750000111
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述,并非对本发明的范围进行限定,在不脱离本发明设计精神的前提下,本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进,均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 中国水产科学研究院南海水产研究所
<120> 一种利用盐渍四生球菌改善快速发酵鱼露风味的方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1483
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tggctcagga cgaacgctgg cggcgtgcct aatacatgca agtcgaacgc tgcccctgtt 60
ccccttcggg ggaagaggtg gcagagtggc ggacgggtga gtaacacgtg gggaacctac 120
ccagcagcgg gggataacac ttggaaacag gtgctaatac cgcataagcc tttttttcac 180
ctggaagaaa gggaaaaggc gctttaagcg tcactgctgg aggggcccgc ggtgcattag 240
ccagttggtg aggtaacggc tcaccaaagc aacgatgcat agccgacctg agagggtgat 300
cggccacact gggactgaga cacggcccag actcctacgg gaggcagcag tagggaatct 360
tcggcaatgg acgcaagtct gaccgagcaa cgccgcgtga gtgaagaagg ttttcggatc 420
gtaaagctct gttgtcagcc aagaacagga agaagaggga atgctttttc tatgacggta 480
gctgaccaga aagccacggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa 540
gcgttgtccg gatttattgg gcgtaaaggg agcgcaggcg gttcgttaag tctgatgtga 600
aagccctcgg ctcaaccgag gaggggcatt ggaaactggc gaacttgagt acagaagagg 660
agagtggaat tccatgtgta gcggtgaaat gcgtagatat atggaggaac accggtggcg 720
aaggcgactc tctggtctgt gactgacgct gaggctcgaa agcgtgggta gcaaacagga 780
ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac gctgagtgct aagtgttgga gggtttccgc 840
ccttcagtgc tgcagttaac gcattaagca ctccgcctgg ggagtacgac cgcaaggttg 900
aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag 960
caacgcgaag aaccttacca ggtcttgaca tcctttgacc gccctagaga tagggtttcc 1020
ccttcggggg caaagagaca ggtggtgcat ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt 1080
gggttaagtc ccgtaacgag cgcaaccctt atggctagtt gccagcattc agttgggcac 1140
tctagtcaga ctgccggtga caaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa atcatcatgc 1200
cccttatgac ctgggctaca cacgtgctac aatggggagt acaacgagcg cgcgaagccg 1260
caaggcccag cgaatctctg aaagcttctc tcagttcgga ttgcaggctg caactcgcct 1320
gcatgaagcc ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcatgc cgcggtgaat ccgttcccgg 1380
gccttgtaca caccgcccgt cacaccacga gagttcgtaa cacccgaagt cggtgaggta 1440
accgcaagga gcctaccgcc gaagtgggac gaacgattgg ggt 1483

Claims (8)

1.一种盐渍四生球菌(Tetragenococcus muriaticus)YL9-5,其已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.23785,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏时间为2021年11月11日。
2.一种利用如权利要求1所述的盐渍四生球菌YL9-5改善快速发酵鱼露风味的方法,其特征在于,包括采用所述盐渍四生球菌YL9-5对鱼露原料进行加菌发酵的步骤。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述快速发酵鱼露为低盐鱼露,加盐量为鱼露原料的10-18%w/w。
4.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述加菌发酵的发酵温度为25-35℃,发酵时间为10-45d。
5.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,在加菌发酵前,还包括发酵剂制备的步骤;所述发酵剂制备包括:将盐渍四生球菌YL9-5厌氧培养1-3d,于4℃、12000g离心10min,重悬。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述发酵剂按照105-107CFU/g的终浓度加入到鱼露原料中。
7.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述鱼露原料包括绞碎的新鲜小型低值鱼;所述小型低值鱼包括鳀鱼、蓝圆鲹、沙丁鱼、虾虎鱼、黄花鱼、青鳞鱼、凤尾鱼和鲭鱼中的一种或多种。
8.一种如权利要求1所述的盐渍四生球菌YL9-5的用途,其特征在于,用于改善快速发酵鱼露风味。
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