CN115948291B

CN115948291B - 一种利用枯草芽孢杆菌改善快速发酵鱼露品质的方法

Info

Publication number: CN115948291B
Application number: CN202211602867.5A
Authority: CN
Inventors: 李春生; 李琰; 李来好; 杨贤庆; 陈胜军; 王悦齐; 吴燕燕; 郝淑贤; 戚勃; 杨少玲; 王迪
Original assignee: South China Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy Fishery Sciences
Current assignee: South China Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy Fishery Sciences
Priority date: 2022-12-13
Filing date: 2022-12-13
Publication date: 2023-06-27
Anticipated expiration: 2042-12-13
Also published as: CN115948291A

Abstract

本发明公开了一种利用枯草芽孢杆菌改善快速发酵鱼露品质的方法，属于微生物发酵技术领域。该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.23784，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏时间为2021年11月11日；本发明利用枯草芽孢杆菌所生产的快速发酵鱼露，具有传统发酵鱼露特有的香气，而且能够显著改善快速发酵鱼露品质，与未加菌的自然发酵鱼露相比，腐败微生物比例显著下降，氨基酸态氮含量明显提升，组胺、酪胺、腐胺和尸胺的含量显著降低，具有广阔的市场应用前景。

Description

一种利用枯草芽孢杆菌改善快速发酵鱼露品质的方法

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，特别是涉及一种利用枯草芽孢杆菌改善快速发酵鱼露品质的方法。

背景技术

鱼露是一种以低值海捕鱼类为主要原料，经过长时间自然发酵制得的水产调味品。鱼露风味独特，营养丰富，是东南亚地区和我国南方沿海一带最受欢迎的调味品之一。为抑制腐败微生物的生长和代谢，传统的鱼露发酵工艺通常采用高盐盐渍(加盐量为25-30％)的发酵方式。在传统发酵鱼露发酵过程中，耐盐微生物(主要是耐盐细菌)通过其复杂的生化代谢途径产生各种代谢产物，进而产生鱼露独特的风味。然而，由于高盐对微生物代谢的抑制作用，依靠自然发酵过程促使鱼露形成独特风味所需要的时间过长，通常需要1-3年，而且品质易受发酵环境影响而不稳定，极大地限制了鱼露产业的发展。因此，如何缩短鱼露发酵周期是整个鱼露行业亟待解决的重要难题。

低盐发酵是目前快速发酵鱼露常用的方式。但是由于加盐量较低，无法有效抑制腐败微生物生长，鱼露容易腐败变质，因此需要添加合适的微生物发酵剂。目前鱼露微生物发酵剂多选用高产蛋白酶活性的菌株，但是多数菌株产酶能力低，特别是在高盐环境下易失活等问题，限制了其在鱼露发酵产业中的应用。因此，筛选出一种能够在高盐条件下产蛋白酶的微生物菌株，并应用于低盐快速发酵鱼露中，是目前亟待解决的问题。

本发明从传统高盐发酵鱼露中筛选到一株能够在高盐条件下产蛋白酶的微生物菌株，并应用于低盐快速发酵鱼露中，用以解决低盐快速发酵鱼露腐败微生物及生物胺含量过高等问题，显著提升快速发酵鱼露品质。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用枯草芽孢杆菌改善快速发酵鱼露品质的方法，以解决现有技术中存在的问题。该方法有利于提升快速发酵鱼露氨基酸态氮含量、降低腐败微生物比例和关键生物胺含量，改善快速发酵鱼露品质。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YL9-2，其已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23784，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏时间为2021年11月11日。

本发明还提供一种利用所述的枯草芽孢杆菌YL9-2改善快速发酵鱼露品质的方法，包括采用所述枯草芽孢杆菌YL9-2对鱼露原料进行加菌发酵的步骤。

进一步地，所述快速发酵鱼露为低盐鱼露，加盐量为鱼露原料的10-20wt％。

进一步地，所述加菌发酵的发酵温度为25-35℃，发酵时间为5-45d。

进一步地，在加菌发酵前，还包括发酵剂制备的步骤；所述发酵剂制备包括：将枯草芽孢杆菌YL9-2在15-37℃下恒温培养1-3d，于4℃，12000g离心10min，重悬。

进一步地，所述发酵剂按照10⁵-10⁷CFU/g的终浓度加入到鱼露原料中。

进一步地，所述鱼露原料包括绞碎的新鲜小型低值海鱼；所述小型低值海鱼包括鳀鱼、蓝圆鲹、青鳞鱼、小黄花鱼、沙丁鱼中的一种或多种。

本发明还提供一种所述的枯草芽孢杆菌YL9-2的用途，用于改善快速发酵鱼露品质。

本发明公开了以下技术效果：

本发明利用筛选培养基从传统鱼露发酵液中筛选枯草芽孢杆菌，通过加菌发酵的方式，提升鱼露发酵速率，改善快速发酵鱼露品质，为我国鱼露行业转型升级提供重要理论基础和技术支撑；本发明利用枯草芽孢杆菌所生产的快速发酵鱼露，具有传统鱼露特有的香气，而且能够显著改善快速发酵鱼露品质，与未加菌的自然发酵鱼露相比，腐败微生物比例显著下降，氨基酸态氮含量明显提升，组胺、酪胺、腐胺和尸胺的含量显著降低，具有广阔的市场应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为利用枯草芽孢杆菌YL9-2的16S rRNA基因序列构建的分子进化树；

图2为枯草芽孢杆菌YL9-2在含不同浓度NaCl的LB培养基中的生长情况。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1

该枯草芽孢杆菌系从广东省汕头市汕头鱼露厂有限公司的传统鱼露发酵样品中筛选分离得到，筛选方法为：在筛选培养基(10g/L蛋白胨、5g/L酵母浸粉、20g/L琼脂、30g/L脱脂奶粉和100g/L氯化钠)上涂布不同梯度稀释倍数(10-10⁴)的鱼露发酵液，37℃培养3d，挑选能产生明显透明圈的单菌落，在LB平板上连续划线纯化培养三次，获得目标菌株YL9-2，并进行后续分子生物学鉴定。利用细菌通用引物对菌株的16SrRNA基因进行测序，并构建分子进化树如图1所示，鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

经16S rRNA基因序列鉴定，测序拼接结果如下(SEQ ID No.1)：

TGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGA。

菌株YL9-2在含有不同浓度NaCl的LB培养基中培养48h(37℃、180r/min)，其生长情况如图2所示，该菌具有很强的耐盐性，在0-20％盐浓度下均能良好生长，在30％盐浓度条件下仍能进行生长。

菌株YL9-2命名为枯草芽孢杆菌YL9-2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23784，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏时间为2021年11月11日。

实施例2

(1)原料的处理：将新鲜鳀鱼用绞肉机绞碎，按照10％(w/w)的比例加入食用盐，混匀后备用。

(2)发酵剂的制备与添加：将枯草芽孢杆菌在LB培养基(10g/L蛋白胨、5g/L酵母浸粉、10g/LNaCl)中在15℃下恒温培养3d，于4℃、12000g离心10min，无菌生理盐水重悬，将菌体按10⁵CFU/g的终浓度加入到预处理过的原料中，搅拌均匀。向原料中只加相同体积的生理盐水作为对照组，用于鱼露的自然发酵。

(3)发酵鱼露：将加菌发酵组和对照组的原料在25℃下保温发酵30d，获得鱼露发酵液。

(4)过滤与灭菌：鱼露发酵液用纱布过滤，去除未分解的鱼肉、鱼骨等固形物残留，得到的鱼露发酵液进行灌装杀菌，获得鱼露发酵产品。

采用16S rRNA基因高通量测序分析鱼露微生物菌群多样性，结果如表1所示。与自然发酵鱼露相比，加菌发酵鱼露的微生物菌群的Sobs指数、Chao指数、ACE指数和Shannon指数均显著降低，而Simpson指数显著增加，表明枯草芽孢杆菌加菌发酵后微生物菌群丰富度和均匀度均显著下降；同时，加菌发酵后芽孢杆菌属(Bacillus)的比例达到83.51％，腐败微生物比例显著降低。鱼露发酵产品的理化指标结果如表2所示。枯草芽孢杆菌加菌发酵鱼露的品质显著提升，其中氨基酸态氮含量可达到1.059g/100mL，与自然发酵鱼露相比提升了45.07％。同时加菌发酵鱼露的质量安全显著提升，组胺含量为121.06mg/L，显著低于欧盟标准400mg/L；与自然发酵鱼露相比，加菌发酵鱼露的组胺、酪胺、腐胺和尸胺含量分别下降了11.99％、12.41％、28.38％和54.05％。

实施例3

(1)原料的处理：将新鲜蓝圆鲹用绞肉机绞碎，按照20％(w/w)的比例加入食用盐，混匀后备用。

(2)发酵剂的制备与添加：将枯草芽孢杆菌在LB培养基中在25℃下恒温培养2d，于4℃、12000g离心10min，无菌生理盐水重悬，将菌体按10⁷CFU/g的终浓度加入到预处理过的原料中，搅拌均匀。向原料中只加相同体积的生理盐水作为对照组，用于鱼露的自然发酵。

(3)发酵鱼露：将加菌发酵组和对照组的原料在30℃下保温发酵5d，获得鱼露发酵液。

采用16S rRNA基因高通量测序分析鱼露微生物菌群多样性，结果如表1所示。与自然发酵鱼露相比，加菌发酵鱼露的微生物菌群的Sobs指数、Chao指数、ACE指数和Shannon指数均显著降低，而Simpson指数显著增加，表明枯草芽孢杆菌加菌发酵后微生物菌群丰富度和均匀度均显著下降；同时，加菌发酵后芽孢杆菌属(Bacillus)的比例达到93.64％，腐败微生物比例显著降低。鱼露理化指标结果如表2所示。枯草芽孢杆菌加菌发酵鱼露的品质显著提升，其中氨基酸态氮含量可达到0.792g/100mL，与自然发酵鱼露相比提升了22.79％。同时加菌发酵鱼露的质量安全显著提升，组胺含量为57.84mg/L，显著低于欧盟标准400mg/L；与自然发酵鱼露相比，加菌发酵鱼露的组胺、酪胺、腐胺和尸胺含量分别下降了13.75％、16.00％、9.38％和24.74％。

实施例4

(1)原料的处理：将新鲜蓝圆鲹用绞肉机绞碎，按照18％(w/w)的比例加入食用盐，混匀后备用。

(2)发酵剂的制备与添加：将枯草芽孢杆菌在LB培养基中在37℃下恒温培养1d，于4℃、12000g离心10min，无菌生理盐水重悬，将菌体按10⁶CFU/g的终浓度加入到预处理过的原料中，搅拌均匀。向原料中只加相同体积的生理盐水作为对照组，用于鱼露的自然发酵。

(3)发酵鱼露：将加菌发酵组和对照组的原料在温度35℃下保温发酵45d，获得鱼露发酵液。

采用16S rRNA基因高通量测序分析鱼露微生物菌群多样性，结果如表1所示。与自然发酵鱼露相比，加菌发酵鱼露的微生物菌群的Sobs指数、Chao指数、ACE指数和Shannon指数均显著降低，而Simpson指数显著增加，表明枯草芽孢杆菌加菌发酵后微生物菌群丰富度和均匀度均显著下降；同时，加菌发酵后芽孢杆菌属(Bacillus)的比例达到93.63％，腐败微生物比例显著降低。鱼露理化指标结果如表2所示。枯草芽孢杆菌加菌发酵鱼露的品质显著提升，其中氨基酸态氮含量可达到1.385g/100mL，与自然发酵鱼露相比提升了34.99％。同时加菌发酵鱼露的质量安全显著提升，组胺含量为175.27mg/L，显著低于欧盟标准400mg/L；与自然发酵鱼露相比，加菌发酵鱼露的组胺、酪胺、腐胺和尸胺含量分别下降了37.40％、10.12％、45.93％和31.32％。

表1

表2

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YL9-2，其特征在于，其已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23784，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏时间为2021年11月11日。

2.一种利用如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌YL9-2改善快速发酵鱼露品质的方法，其特征在于，包括采用所述枯草芽孢杆菌YL9-2对鱼露原料进行加菌发酵的步骤。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述快速发酵鱼露为低盐鱼露，加盐量为鱼露原料的10-20wt％。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述加菌发酵的发酵温度为25-35℃，发酵时间为5-45d。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在加菌发酵前，还包括发酵剂制备的步骤；所述发酵剂制备包括：将枯草芽孢杆菌YL9-2在15-37℃下恒温培养1-3d，于4℃，12000g离心10min，重悬。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述发酵剂按照10⁵-10⁷CFU/g的终浓度加入到鱼露原料中。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述鱼露原料包括绞碎的新鲜小型低值海鱼；所述小型低值海鱼包括鳀鱼、蓝圆鲹、青鳞鱼、小黄花鱼、沙丁鱼中的一种或多种。

8.一种如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌YL9-2的用途，其特征在于，用于改善快速发酵鱼露品质。