CN115449491A - 一种具有高效抑菌功能的地衣芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一株具有高效抑制产气荚膜梭菌的地衣芽孢杆菌及其应用，所述地衣芽孢杆菌保藏号为ACCC61965。所述地衣芽孢杆菌采用LB培养基培养。本发明还提供一种应用上述地衣芽孢杆菌的生物饲料添加剂，所述生物饲料添加剂由地衣芽孢杆菌ACCC61965、植物乳杆菌ACCC 61967、酿酒酵母ACCC 21162发酵而成。本发明相对于现有技术，地衣芽孢杆菌及其配制的生物饲料添加剂可对产气荚膜梭菌进行有效防治。

Description

一种具有高效抑菌功能的地衣芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物领域，具体地说，涉及一种具有高效抑制产气荚膜梭菌的地衣芽孢杆菌及其应用。
背景技术
产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens,CP)又称为魏氏梭菌(Clostridiumwelchii)，属于芽孢杆菌科，梭状芽孢杆菌属。是一种广泛分布于水源、土壤等自然界以及动物肠道中的条件致病性细菌，产气荚膜梭菌耐受环境能力强，通过产生物活性蛋白或者毒素，导致人和多种家畜发生不同临床症状的疾病。CP是健康禽肠道的常在菌，当生长环境及日粮发生改变，会引起该菌大量增殖并附着于肠道黏膜产生大量毒素和蛋白酶导致肠道黏膜损伤，从而引起腹泻及肠炎等疾病，严重影响动物生产性能并造成巨大经济损失。目前防治产气荚膜梭菌的方法主要有：(1)疫苗预防法，疫苗预防效果较好，但是其免疫效果、质量、安全性等方面存在一定的缺陷，还有待提高。(2)抗菌药物治疗法，其治疗效果较佳，但是容易产生耐药性，与养殖行业“减抗禁抗”政策不符。(3)中草药治疗法，中草药可以直接或间接杀灭病菌。(4)噬菌体治疗，噬菌体可以裂解病菌，但是其制备的方法繁琐。(5)益生菌类，益生菌能替代药物，对疾病防治具有一定的效果，是一种绿色防治方法，但是具有较强抑菌效果菌株资源较少、菌株制备工艺、保存及发酵方面也存在不足，有待提高。本发明针对产气荚膜梭菌防治现状，筛选具有高效抑菌功能菌株，并研究其在病害防治上的应用，开发出对产气荚膜梭菌有较好防治效果的产品。
发明内容
本发明提供了提供一株具有高效抑制产气荚膜梭菌的地衣芽孢杆菌及其应用，以实现对产气荚膜梭菌的绿色防治。
本发明提供了一株具有高效抑制产气荚膜梭菌的地衣芽孢杆菌，所述地衣芽孢杆菌保藏号为ACCC61965。
进一步地，所述地衣芽孢杆菌采用LB培养基培养。
本发明还提供一种上述地衣芽孢杆菌制备的产品，所述产品为含量不低于1×107cfu/mL的地衣芽孢杆菌菌液或地衣芽孢杆菌菌粉。
本发明还提供一种应用上述地衣芽孢杆菌的生物饲料添加剂，所述生物饲料添加剂由地衣芽孢杆菌ACCC61965、植物乳杆菌ACCC 61967、酿酒酵母ACCC 21162发酵而成。
进一步地，所述生物饲料添加剂的制备方法如下：
将地衣芽孢杆菌ACCC61965的发酵液、植物乳杆菌ACCC 61967的发酵液、酿酒酵母ACCC 21162的发酵液按照体积比1:(0.5-1.5):(0.5-1.5)的比例混合均匀，将混合后的复合微生物按照固体料质量的0.2-1％加入至固体发酵培养基中进行固体发酵。
更进一步地，所述固体发酵培养基包括下列重量份原料：麸皮20-40份、小麦粉10-30份、豆粕粉10-20份、玉米粉5-10份，所述固体发酵培养基成份发酵培养基初始含水量30-50％。
更进一步地，所述地衣芽孢杆菌ACCC 61965的发酵液制备方法如下：
a.种子液制备，取纯化的地衣芽孢杆菌，斜面接种至灭菌LB液体培养基中置于摇床培养16h，培养条件37℃、200r/min；
b.液体发酵，向发酵罐中加入LB液体培养基，加入其重量0.05％的有机硅消泡剂，并灭菌；控制装液体积为发酵罐的60％-70％，将培养好的种子液按体积比1％的接种量接入发酵罐，在罐压0.05Mpa、通气量15L/min、转速225r/min、温度37℃的条件下培养24h，得到地衣芽孢杆菌ACCC 61965的发酵液。
更进一步地，所述植物乳杆菌ACCC 61967植物乳杆菌的发酵液制备方法如下：
a.种子液制备，取纯化的植物乳杆菌，斜面接种至灭菌MRS肉汤培养基中置于摇床培养16h，培养条件37℃、100r/min；
b.液体发酵，发酵罐中加入LB液体培养基，加入其重量0.05％的有机硅消泡剂，并灭菌；将培养好的种子液按体积比1％的接种量接入发酵罐，在罐压0.01Mpa、通气量0L/min、转速125r/min、温度37℃的条件下培养24h，得到植物乳杆菌ACCC 61967植物乳杆菌的发酵液。
更进一步地，所述酿酒酵母ACCC 21162的发酵液制备方法如下：
a.种子液制备，取纯化的酿酒酵母，斜面接种至灭菌YPD培养基中置于摇床培养36h，培养条件28℃、100r/min。
b.液体发酵，发酵罐中加入YPD液体培养基，加入其重量0.05％的有机硅消泡剂，并灭菌；将培养好的种子液按体积比1％的接种量接入发酵罐，在罐压0.05Mpa、通气量10L/min、转速150r/min、温度28℃的条件下培养48h，得到酿酒酵母ACCC 21162的发酵液。
本发明还公开一种饲料，所述饲料含有上述生物饲料添加剂。
进一步地，所述饲料中添加剂含量为2kg-5kg每吨。
本发明还公开一种饲料，所述饲料含有地衣芽孢杆菌产品，所述饲料中地衣芽孢杆菌含量不低于1×106cfu/g。
本发明相对于现有技术，地衣芽孢杆菌及其配制的生物饲料添加剂可对产气荚膜梭菌进行有效防治。本发明的地衣芽孢杆菌应用包含地衣芽孢杆菌发酵液、菌剂、生物饲料添加剂及衍生产品在畜禽养殖业中的应用。地衣芽孢杆菌生物饲料添加剂是将微生物经液体发酵后接种至固体发酵培养基发酵而成。
附图说明
图1为本发明实施例地衣芽孢杆菌菌落形态；
图2为本发明实施例地衣芽孢杆菌菌落革兰氏染色镜检图；
图3为发酵液对产气荚膜梭菌抑菌效果图；
图3中A：地衣芽孢杆菌发酵液对产气荚膜梭菌的抑制作用；B：地衣芽孢杆菌发酵液用无菌水稀释100倍对产气荚膜梭菌的抑制作用；C：地衣芽孢杆菌发酵液用无菌水稀释200倍对产气荚膜梭菌的抑制作用；D：75ppm金霉素对产气荚膜梭菌的抑制作用；
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。
本发明中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100mL溶液中含有溶质的克数。
为了实现本发明目的，本发明通过筛选获得一株地衣芽孢杆菌，其菌落形态图和镜检图见图1、图2所示。采用LB发酵液培养24小时后，发酵液对产气荚膜梭菌抑菌效果如图3所示。本发明菌株经16S rDNA测序获得基因序列，具体基因序列见序列表，通过在NCBI进行序列比对，本发明菌株与地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis strain E2-10-2-2相似性最高，相似度99.17％，结合其生理生化特性初步确定本发明菌株为地衣芽孢杆菌。筛选获得的地衣芽孢杆菌已经保藏至中国农用微生物保藏中心，并获得保藏编号为ACCC61965。
实施例1地衣芽孢杆菌发酵液及菌剂的生产
包括以下步骤：
1、斜面种子的制备
将地衣芽孢杆菌ACCC 61965在营养琼脂试管斜面上活化。
2、一级液体种子液的制备
将活化后的地衣芽孢杆菌挑2-3环菌种接种至LB培养基中(1000ml三角瓶，装液量为400ml，121℃高压灭菌15min)，于37℃，200r/min的条件下发酵16h，发酵过程中控制pH值7.0，即得一级液体种子液。
3、液体发酵
将一级液体种子液按10％(v/v)的接种量接种至灭菌LB培养基(加入0.05％有机硅消泡剂)中，发酵条件：罐压0.05Mpa、通气量15L/min、转速225r/min、温度37℃，发酵培养24h，得地衣芽孢杆菌发酵液。
4、地衣芽孢杆菌菌剂的制备
将发酵液经碟式离心机离心后收集离心后的浓缩液，经喷雾干燥处理即得地衣芽孢杆菌菌剂，喷雾干燥条件：进风口温度：160-180℃；出风口温度80℃。
实施例2生物饲料添加剂的制备
生物饲料添加剂是采用复合菌剂经固体发酵而得，所述微生物由地衣芽孢杆菌ACCC61965、植物乳杆菌ACCC61967、酿酒酵母ACCC 21162组成。包括以下步骤：
S1：微生物液体发酵
(1)地衣芽孢杆菌发酵：步骤同实施例1
(2)植物乳杆菌发酵：
a.种子液制备，取纯化的植物乳杆菌斜面接种至灭菌MRS肉汤培养基中置于摇床培养16h，培养条件37℃、100r/min；
b.液体发酵，发酵罐中加入LB液体培养基和0.05％有机硅消泡剂灭菌，将培养好的种子液按体积比1％的接种量接入发酵罐培养24h即可，发酵条件：罐压0.01Mpa、通气量0L/min、转速125r/min、温度37℃。
(3)酿酒酵母发酵：
a.种子液制备，取纯化的酿酒酵母斜面接种至灭菌YPD培养基中置于摇床培养36h，培养条件28℃、100r/min；
b.液体发酵，发酵罐中加入YPD液体培养基和0.05％有机硅消泡剂灭菌，将培养好的种子液按体积比1％的接种量接入发酵罐培养48h即可，发酵条件：罐压0.05Mpa、通气量10L/min、转速150r/min、温度28℃。
S2：生物饲料添加剂固体发酵
将S1中发酵液按照体积比1:1:1的比例在发酵储罐中混合均匀，将混合好的复合微生物按照液固体料质量0.5％的比例加入至固体发酵培养基中进行固体发酵。固体发酵培养基如下：麸皮40份、小麦粉30份、豆粕粉20份、玉米粉10份，发酵培养基初始含水量45％。
实验例3
1、实验设计
CK：对照组，基础日粮；
T1：基础日粮+实施例1发酵的地衣芽孢杆菌发酵液；
T2：基础日粮+2％实施例2方法生产的生物饲料添加剂；
T3：将实施例1生产的地衣芽孢杆菌菌粉与基础日粮混合均匀，地衣芽孢杆菌含量为1亿cfu/g。
T4：基础日粮+根据CN 109337841 A生产的枯草芽孢杆菌发酵液，添加量2％。
选择1日龄的健康817白羽肉杂鸡1500只，按照体重一致的原则随机分为30个组，每个处理设6个重复，每个重复50只鸡，实验日粮分为肉小鸡(1-21d)阶段和肉中大鸡(21-49d)两个阶段。实验采用玉米-豆粕型日粮，其营养配比和基础日粮饲喂量参照中华人民共和国农业行业标准肉鸡饲养标准《NY/T33-2004》执行。T1每天饲喂基础日粮重量0.1％的地衣芽孢杆菌发酵液(1×109cfu/mL)。
2、实验方法
试验开始前对鸡舍及所有饲养用具进行清洗、熏蒸消毒(福尔马林/高锰酸钾为1：15)，通风晾晒一周后进行使用。CK、T1、T2与T3、T4、T5分房间饲养。试验肉鸡采用三层立式笼养，自由采食和饮水，鸡舍育雏温度维持在35-38℃，育雏结束后每两天降1℃，直至维持在25-28℃，自然光照加人工补光，相对湿度50-60％，自然通风结合纵向负压通风。免疫程序正常进行，他消毒管理措施遵照鸡场正常程序进行。每天观察记录试验鸡采食、饮水及生长健康状况，及时记录试验鸡死淘情况及耗料量。49天结束实验，统计实验数据。
3、测定指标及方法
每周按重复统计肉鸡耗料量和死淘情况；每个阶段准确记录肉鸡体重初重、末重以及耗料量，计算平均日采食量ADFI(g/d)、平均日增重ADG(g/d)和料重比F/G(平均日采食量/平均日增重)。记录试验期间肉仔鸡死亡只数，计算存活率。记录养殖过程中鸡腹泻情况，计算腹泻率。
存活率＝1-肉鸡死亡数/实验鸡总数×100％
腹泻率＝(腹泻只数×腹泻天数)/(试验只数×试验天数)×100％
4、实验结果
表1 1-49d不同处理对肉鸡生长性能影响
Figure BDA0003438251510000051
从表1可知，本发明实施例的T1、T2、T3能有效提高肉鸡生长性能，使用本发明的产品后能显著提高肉鸡日增重，降低料重比，显著减少腹泻率。采用本发明产品饲喂肉鸡，肉鸡日增重达67g左右，较CK提高了4.07％，饲养49天后平均单只肉鸡增重较CK提高16.2％-17.82％，较T4处理4.39％-5.85％，提升效果较为明显。在防治腹泻率方面，采用本发明处理肉鸡腹泻率低，肉鸡腹泻率4.03％-4.52％，腹泻率较CK降低75.35-78.02％，较T4降低56.24-60.99％。此外，本发明实施例T2采用地衣芽孢杆菌菌液、植物乳杆菌菌液、酿酒酵母菌液混合及生物饲料添加剂固体发酵，相比T1、T3仅采用单一菌种的方案，在平均日采食量、平均日增重更高，且料重比低，在存活率、腹泻率方面也优于T1、T3。最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解，技术人员阅读本申请说明书后依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，但这些修改或变更均未脱离本发明申请待批权利要求保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 唐人神集团股份有限公司
<120> 一种具有高效抑菌功能的地衣芽孢杆菌及其应用
<130> 20211214
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1449
<212> DNA
<213> 唐人神集团股份有限公司
<400> 1
cggcggggga gctatacatg caagtcgagc ggaccgacgg gagcttgctc ccttaggtca 60
gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcctgta agactgggat aactccggga 120
aaccggggct aataccggat gcttgattga accgcatggt tcaatcataa aaggtggctc 180
ttagctacca cttgcagatg gacccgcggc gcattagcta gttggtgagg taacggctca 240
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ctgacgctga ggcgcgaaag cgtggggagc gaacaggatt agataccctg gtagtccacg 780
ccgtaaacga tgagtgctaa gtgttagagg gtttccgcgc tttagtgctg cagcaaacgc 840
attaagcact ccgcctgggg agtacggtcg caagactgaa actcatagga attgacgggc 900
gccggcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg 960
tcttgacatc ctctgacaac cctagagata gggcttcgcc ttcgggggca gagtgacagg 1020
tggtgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg 1080
caacccttga tcttagttgc cagcattcag ttgggcactc taaggtgact gccggtgaca 1140
aaccggagga aggtggggat gacgtcagat catcatgccc cttatgacct gggctacaca 1200
cgtgctacaa tgggcagaac aaagggcagc gaagccgcga ggctaagcca atcccacaaa 1260
tctgttctca gttcggatcg cagtctgcaa ctcgactgcg tgaagctgga atcgctagta 1320
atcgcggatc agcatgccgc ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac 1380
atcacgagag tttgtaacac ccgaagtcgg tgaggtaacc ttctggagcc agccgccgaa 1440
gtgactatc 1449

Claims (10)

1.一种具有高效抑菌功能的地衣芽孢杆菌，其特征在于，所述地衣芽孢杆菌保藏号为ACCC61965。
2.一种应用权利要求1所述地衣芽孢杆菌制备的产品，其特征在于，所述产品为含量不低于1×107cfu/mL的地衣芽孢杆菌菌液或地衣芽孢杆菌菌粉。
3.一种应用权利要求1所述地衣芽孢杆菌的生物饲料添加剂，其特征在于，所述生物饲料添加剂由地衣芽孢杆菌ACCC61965、植物乳杆菌ACCC 61967、酿酒酵母ACCC 21162发酵而成。
4.根据权利要求3所述生物饲料添加剂，其特征在于，所述生物饲料添加剂的制备方法如下：
将地衣芽孢杆菌ACCC61965的发酵液、植物乳杆菌ACCC 61967的发酵液、酿酒酵母ACCC21162的发酵液按照体积比1:(0.5-1.5):(0.5-1.5)的比例混合均匀，将混合后的复合微生物按照固体料质量的0.2-1％加入至固体发酵培养基中进行固体发酵。
5.根据权利要求4所述生物饲料添加剂，其特征在于，所述固体发酵培养基包括下列重量份原料：麸皮20-40份、小麦粉10-30份、豆粕粉10-20份、玉米粉5-10份，所述固体发酵培养基成份发酵培养基初始含水量30-50％。
6.根据权利要求4所述生物饲料添加剂，其特征在于，所述地衣芽孢杆菌ACCC61965的发酵液制备方法如下：
a.种子液制备，取纯化的地衣芽孢杆菌，斜面接种至灭菌LB液体培养基中置于摇床培养16h，培养条件37℃、200r/min；
b.液体发酵，向发酵罐中加入LB液体培养基，加入其重量0.05％的有机硅消泡剂，并灭菌；控制装液体积为发酵罐的60％-70％，将培养好的种子液按体积比1％的接种量接入发酵罐，在罐压0.05Mpa、通气量15L/min、转速225r/min、温度37℃的条件下培养24h，得到地衣芽孢杆菌ACCC61965的发酵液。
7.根据权利要求4所述生物饲料添加剂，其特征在于，所述植物乳杆菌ACCC 61967的发酵液制备方法如下：
a.种子液制备，取纯化的植物乳杆菌，斜面接种至灭菌MRS肉汤培养基中置于摇床培养16h，培养条件37℃、100r/min；
b.液体发酵，发酵罐中加入LB液体培养基，加入其重量0.05％的有机硅消泡剂，并灭菌；将培养好的种子液按体积比1％的接种量接入发酵罐，在罐压0.01Mpa、通气量0L/min、转速125r/min、温度37℃的条件下培养24h，得到植物乳杆菌ACCC 61967的发酵液。
8.根据权利要求4所述生物饲料添加剂，其特征在于，所述酿酒酵母ACCC 21162的发酵液制备方法如下：
a.种子液制备，取纯化的酿酒酵母，斜面接种至灭菌YPD培养基中置于摇床培养36h，培养条件28℃、100r/min。
b.液体发酵，发酵罐中加入YPD液体培养基，加入其重量0.05％的有机硅消泡剂，并灭菌；将培养好的种子液按体积比1％的接种量接入发酵罐，在罐压0.05Mpa、通气量10L/min、转速150r/min、温度28℃的条件下培养48h，得到酿酒酵母ACCC 21162的发酵液。
9.一种饲料，其特征在于，所述饲料含有权利要求3-8任一项所述生物饲料添加剂，所述饲料中添加剂含量为2kg-5kg每吨。
10.一种饲料，其特征在于，所述饲料含有权利要求2所述产品，所述饲料中地衣芽孢杆菌含量不低于1×106cfu/g。
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