CN103243041A - 一株地衣芽孢杆菌h2及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株耐酸、耐热、耐胆盐并对产气荚膜梭菌具有良好拮抗性的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)H₂及其在防治鸡坏死性肠炎中的应用。该菌株通过分离、筛选和鉴定而获得，保藏编号为：CCTCC NO：M2011133；该地衣芽孢杆菌H₂可制成微生物制剂，作为兽药和鸡饲料添加剂使用，能有效防治由产气荚膜梭菌引起的鸡坏死性肠炎，促进鸡肠道内正常生理性厌氧菌的生长，提高鸡肠道微生物多样性及免疫器官指数，改善鸡生长性能。本发明适用于饲料厂、兽药厂和规模化养鸡场。

Description

一株地衣芽孢杆菌H2及其应用

技术领域

本发明涉及一株经分离而获得的耐酸、耐热、耐胆盐且对产气荚膜梭菌具有良好拮抗性的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)H₂及其在防治鸡坏死性肠炎中的应用，属于预防兽医技术领域。 

背景技术

我国是一个养禽大国，由于规模化、集约化养殖业的迅猛发展，畜禽药物残留和病原菌污染引起的疾病层出不穷，不仅危害动物健康，而且对我国畜牧业造成巨大的经济损失。所以，预防和治疗畜禽的各种疾病成为养殖业的首要任务。 

近年来，全世界主要的养禽国家和地区都普遍存在由产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridium perfringens)引起的鸡坏死性肠炎，而该病原菌(产气荚膜梭菌)广泛存在于自然环境中。自2001年至今，我国在肉、蛋鸡养殖行业由产气荚膜梭菌增殖导致的鸡肠道坏死性肠炎疫区主要集中在长江以东(曹河源.2006.吉林畜牧兽医，27：42-42)。添加抗生素促生长剂(AGP)饲喂的鸡与不用药的鸡相比，大大减少了坏死性肠炎的发生率。但是长期使用抗生素造成畜禽抗药性增强，机体免疫力下降，最后造成抗生素残留超标，严重危害人类和动物健康。从2006年1月始，欧盟已全面禁止在动物饲料中添加抗生素(刘兴海.2007.现代畜牧兽医，5：35-36)。随着抗生素在我国的限用，甚至禁用，该病在我国养鸡业中将越来越严重。目前所知的鸡坏死性肠炎患病因素可能还远远不足，要考虑各种患病因素的影响，抑制产气荚膜梭菌的增殖，找到动物生长和产气荚膜梭菌污染的均衡点，这才可能找到最有效的防控措施(虞传峰.2010.上海畜牧兽医通讯， 6：41-43)。因此，抓紧建立规模化养鸡场鸡坏死性肠炎的防治措施，促进我国养鸡行业的健康发展，具有重要的现实意义。 

益生菌(又叫微生态制剂，或微生物制剂，或微生物饲料添加剂)是最先被提出的抗生素替代品，它的作用主要在于扶植正常微生物菌群，调节生态平衡(李长强.2010.江西饲料，2：21-24)。自上世纪八十年代以来，微生态制剂作为生物兽药和饲料添加剂已用于仔猪、犊牛、羔羊、家禽等动物的部分疾病的治疗和预防上。现已证明，有些芽孢杆菌是具有特殊功能的益生菌，其微生态制剂具有防治疾病、促进生长等功效，且无毒、无残留。迄今为止尚未见到有关地衣芽孢杆菌H₂的筛选及其在防治鸡坏死性肠炎中的应用的报道。 

发明内容

针对目前抗生素的滥用及禁用导致疾病很难治愈的情况以及禽类感染产气荚膜梭菌发生坏死性肠炎后难以治愈或无法治疗等问题，本发明的目的是提供一种具有耐酸、耐热、耐胆盐，抑菌效果好且对产气荚膜梭菌具有良好拮抗性的地衣芽孢杆菌H₂；同时也提供该地衣芽孢杆菌H₂在兽药或饲料中的应用，可用以治疗由产气荚膜梭菌引起的鸡坏死性肠炎，并提高鸡肠道微生物多样性。 

本发明参考益生菌可用于临床上预防和治疗动物疾病的思维，从健康鸡回肠内容物中筛选出耐酸、耐热、耐胆盐，抑菌效果好且对产气荚膜梭菌具有良好拮抗性的地衣芽孢杆菌H₂并制作成菌剂，然后将该菌剂应用到兽药或鸡饲料中，证明添加本发明菌剂H₂后，可以预防和治疗鸡坏死性肠炎；同时发现菌剂H₂的应用能显著提高鸡肠道微生物的多样性，调整鸡肠道微生态平衡，改善鸡生长性能。 

具体讲，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是： 

本发明获得具有耐酸、耐热、耐胆盐，抑菌效果好且对产气荚膜梭菌具有良好拮抗性的地衣芽孢杆菌H₂的方法是(见图1)：采集健康鸡回肠内容物样品，用 蒸馏水稀释后，用不同筛选培养基进行分离培养和鉴定，得到一株对鸡产气荚膜梭菌有显著抑制作用的菌株H₂，然后进行耐酸、耐胆盐试验，并将其菌液、菌体、代谢产物做拮抗试验和生物学性能试验。通过PCR扩增出菌株H₂的16S rDNA片段，经测序获得目的基因序列。用美国生物信息学中心(NCBI)的BLAST程序对所初步获得的菌株H₂的16S rDNA序列进行登录，获得登录号为FJ549021(GenBank(Http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)，与已收录的序列进行核苷酸同源性比较。经过微生物学分类鉴定，确定该分离的菌株H₂为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)H₂，该菌株已于2011年4月20日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为：CCTCC NO：M2011133。 

本发明地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)H₂(以下简称为“地衣芽孢杆菌CCTCC2011133”)按照常规甘油冷冻方法保藏。 

本发明也提供本发明“地衣芽孢杆菌CCTCC2011133”在兽药或饲料中的应用。采用农业微生物常规操作方法将本发明制备成含“地衣芽孢杆菌CCTCC2011133”活菌含量1×10⁹cfu/g至1×10¹⁰cfu/g范围的微生物制剂(以下简称“菌剂”)，以0.05％至0.4％比例添加在鸡饲料中，使其在鸡饲料中活菌含量为1×10⁵-4×10⁶cfu/g，或以每日每只鸡饲喂该菌剂20mg至50mg(连续使用5-7天)，可以防治由产气荚膜梭菌引起的鸡坏死性肠炎，促进其肠道内正常生理性厌氧菌的生长，调整肠道菌群失调，恢复肠道功能，提高鸡肠道微生物多样性的效果，增强机体免疫器官指数，改善鸡生长性能。本发明“地衣芽孢杆菌CCTCC2011133”菌剂还可参照无锡中顺生物有限公司公开的发明专利(公开号为CN101147529，发明名称：一种水产养殖的微生态制剂及其制备方法)所介绍的方法生产，应用后同样能获得相同效果。 

本发明具有以下效果： 

(1)本发明“地衣芽孢杆菌CCTCC2011133”具有耐酸、耐热、耐胆盐，抑菌效果好且对产气荚膜梭菌具有良好拮抗性，可用于治疗由产气荚膜梭菌引起的鸡坏死性肠炎并提高鸡肠道微生物多样性。 

(2)本发明“地衣芽孢杆菌CCTCC2011133”可直接在兽药或饲料中应用；也可制成微生物制剂，作为兽药和鸡饲料添加剂使用，比如添加于鸡饲料中使用，可有效预防和治疗由产气荚膜梭菌引起的坏死性肠炎，促进其肠道内正常生理性厌氧菌的生长，调整肠道菌群失调，恢复肠道功能，提高鸡肠道微生物多样性及免疫器官指数，改善鸡生长性能。这会给生物兽药业和饲料工业带来良好的经济效益。本发明适用于饲料厂、兽药厂和规模化养鸡场。 

附图说明

图1为本发明的技术流程图。 

图2为体外初筛拮抗产气荚膜梭菌的本发明“地衣芽孢杆菌CCTCC2011133”图。 

图3为本发明“地衣芽孢杆菌CCTCC2011133”的耐酸性试验结果图。 

图4为本发明“地衣芽孢杆菌CCTCC2011133”的耐胆盐试验结果图。 

图5为本发明“地衣芽孢杆菌CCTCC2011133”的菌液、菌体、代谢产物的拮抗试验结果图。 

图6为本发明“地衣芽孢杆菌CCTCC2011133”总DNA的0.8％琼脂糖凝胶电泳检测结果图。 

图7为从Genbank里搜索出芽孢杆菌属内12个不同种的16S rRNA序列建立芽孢杆菌属系统发育树图。 

图8-10为本发明“地衣芽孢杆菌CCTCC2011133”预防各组对14日龄鸡回肠菌群的DGGE图谱、聚类分析图和多样分析图。 

图11-13为本发明“地衣芽孢杆菌CCTCC2011133”预防各组对21日龄鸡回肠菌群的DGGE图谱、聚类分析图和多样分析图。 

图14-16为本发明“地衣芽孢杆菌CCTCC2011133”预防各组对28日龄鸡回肠菌群的DGGE图谱、聚类分析图和多样分析图。 

图17为本发明“地衣芽孢杆菌CCTCC2011133”治疗感染鸡回肠粪样细菌16S rRNA V3区PCR扩增结果图。该图中，Marker为D2000，PCR扩增得到200bp左右的16S rRNA V3区片段。 

图18-20为本发明“地衣芽孢杆菌CCTCC2011133”治疗各组对28日龄鸡回肠菌群的DGGE图谱、聚类分析图和多样分析图。 

具体实施方式

实施例1：本发明“地衣芽孢杆菌CCTCC2011133”的获取与鉴定，见图1 

1、本发明“地衣芽孢杆菌CCTCC2011133”的分离、获取 

1.1菌株的分离 

采集位于中国四川省雅安市内的四川农业大学动物房饲养健康鸡回肠内容物，立即送实验室检测。取新鲜回肠内容物0.5g，放入加有49.5ml生理盐水并带有玻璃珠的三角瓶中，摇床37℃震荡20min，然后60℃恒温水浴20min。取0.5ml稀释粪液做十倍递减稀释到10^-5。从10^-3～10^-5各稀释度取100μL涂布于普通营养琼脂培养基，37℃恒温培养12h(见图2)。 

镜检培养基上的单个菌落。挑取芽孢杆菌单菌落在普通营养琼脂平板上画线培养，每个单菌落重复平板画线2～3次，直到得到纯的芽孢杆菌。将得到的 芽孢杆菌接种于营养琼脂斜面，保存备用。 

1.2耐酸试验 

将筛选到的芽孢杆菌培养过夜，离心收集菌体(4000r/min，10min，4℃)；0.25％生理盐水漂洗一次后离心；悬浮于0.05M磷酸缓冲液-pH2.0中，37℃培养1～3h，检测培养期间活菌数的变化。试验结果显示，菌株在pH4.0时的活菌数较pH6.0下降，存活率在80％左右；pH2.0时存活率达到50％以上(见图3)。表明本发明菌株H₂具有较强的耐酸性。 

1.3耐胆盐试验 

将筛选到的芽孢杆菌培养过夜，离心收集菌体(4000r/min，10min，4℃)；0.25％生理盐水漂洗一次后离心；悬浮于与初培养基等体积的含1％胆盐的生理盐水中，37℃作用6h；检测活菌数的变化率。试验结果显示，菌株在胆盐浓度为0.6％时耐受性达到30％以上(见图4)。这表明本发明菌株H₂具有较强的胆盐耐受性。 

1.4抑菌试验 

1.4.1按照(徐春厚.2010.华南农业大学学报，2：117-120)方法制得芽孢杆菌菌体，上清液用0.22μm细菌滤器过滤，即得芽孢杆菌代谢产物(见图5)。 

1.4.2采用双层琼脂扩散法：将芽孢杆菌接于普通营养琼脂平板上，37℃培养24h。然后用0.7％软营养琼脂覆盖(加有10⁸/mL的指示菌)，倒置平板。37℃再培养24h。测量抑菌圈的直径。菌株H₂代谢产物的抑菌直径基本等于其菌液的抑菌直径(见表1)。 

表1芽孢杆菌菌液、菌体、代谢产物的抑菌直径(单位：mm) 

1.5药敏试验 

采用纸片扩散法(Kerby-Bauer)进行药敏检测，结果显示本发明地衣芽孢杆菌H₂对氨苄青霉素、先锋霉素V、头孢噻肟、新霉素、卡那霉素、强力霉素、诺氟沙星、甲砜霉素、氯霉素、万古霉素、青霉素、庆大霉素敏感。 

2、本发明菌株H₂的鉴定 

2.1该菌株H₂的菌学特征如下：菌体大小为(0.6-0.8)um×(1.5-2.0)um，普通培养基(LB琼脂糖平板)上形成的菌落呈乳白色、不透明、边缘不整齐、表面粗糙的大菌落。显微镜下呈革兰氏阳性杆菌，菌体两端平整，内生芽孢且呈椭圆形。最适生长温度为30℃，pH5.8-8均生长良好，最适生长pH为6.8-7.2。还原石蕊牛奶、硝酸盐，水解马尿酸盐、酪素、淀粉，接触酶阳性，在7％氯化钠中生长。 

2.2将分离得到的菌株H₂的基因组总DNA按照(Li M.2003.Journal of Microbiology Methods，54：13-20)采用

Stool Mini Kit提取。菌株H₂基因组总DNA的16S rDNA V₃按照(Walter J.2001.Applied and Environmental Microbiology，67：2578-2585)方法扩增，PCR产物用0.8％琼脂糖进行凝胶电泳检测，结果见图6(图6中，Marker为-Hind III，0为阴性对照，1为样品)。纯化后将菌株的16S rRNA的PCR反应产物用ABI3700基因测序仪测序，测序由上海生物技术有限公司完成，测得H₂16S rRNA大部分序列为1423个bp，见核苷酸序列表。将该菌株H₂的16S rRNA序列提交美国生物信息学中心(NCBI)网站，获得登录号为FJ549021。在Genbank里搜索出芽孢杆菌属内12个不同种的16S rRNA序列，应用ClustalX1.81软件进行多重序列比对，再用Tree View和Phylod Raw软件进行系统发育分析，构建无根进化树，见表 2和图7。 

表2芽孢杆菌H₂构建系统进化树所用序列 

从进化树图得出本发明菌株H₂与地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)在同一分支上，与它的亲缘关系最近，同源性高达99％。因此，本发明菌株H₂鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)H₂，并已于2011年4月20日在位于湖北省武汉市的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏编号为：CCTCC NO：M2011133。 

本发明“地衣芽孢杆菌CCTCC2011133”按照常规甘油冷冻方法保藏。 

实施例2：本发明“地衣芽孢杆菌CCTCC2011133”的应用 

1、动物预防试验 

(1)预防试验设计 

将本发明地衣芽孢杆菌H₂(即“地衣芽孢杆菌CCTCC2011133”)按农业微生物常规操作方法制备菌剂I，活菌数为1.0×10⁹cfu/g，饲喂健康一日龄铁脚麻鸡，见表3。 

表3预防试验设计 

(2)生长性能测定 

按照(陈鹏.2011.中国家禽，33(11)：11-14)方法对预防组感染鸡模型生长性能的影响进行测定，见表4。空白组和添加不同剂量的“地衣芽孢杆菌CCTCC2011133”预防感染鸡模型的末重、平均日增重均比感染组高，差异极显著(P＜0.01)；与空白组相比，试验组3、4、5的末期体重、平均日增重均比空白组高，差异极显著(P＜0.01)，其中试验组4的末期平均体重、平均日增重极显著(P＜0.01)高于试验组3、5。结果表明添加菌剂I能有效提高感染鸡模型的增重和有效降低感染鸡模型的料重，且日粮中添加0.1％的菌剂I效果极显著。 

表4芽孢杆菌预防组对感染鸡模型生长性能的影响 

注：表内同一指标，同一行数值肩注小写字母不同者表示差异显著(P＜0.05)，大写字母不同者表示差异极显著(P＜0.01)，未标注或字母相同表示差异不显著(P＞0.05)。下面的表格同。 

(3)免疫器官指数的测定 

分别于14、21和28日龄取接近平均体重的鸡3羽无菌屠宰，摘取胸腺、脾 脏、法氏囊，剔除脂肪后称鲜重，计算免疫器官与体重的相对重量得到胸腺指数、脾脏指数、法氏囊指数。计算公式：免疫器官指数＝免疫器官重(g)/体重(Kg)。 

A、“地衣芽孢杆菌CCTCC2011133”对14日龄鸡免疫器官指数的影响，见表5。结果显示：3、4、5组的脾脏指数和法氏囊指数与空白组差异不显著。4组的胸腺指数与空白组差异显著(P＜0.05)。 

表5芽孢杆菌对14日龄感染鸡模型免疫器官指数的影响 

B、“地衣芽孢杆菌CCTCC2011133”对21日龄感染鸡模型免疫器官指数的影响，见表6。结果显示：空白组、试验3、4、5组的胸腺指数与感染组差异极显著(P＜0.01)，空白组、3、4、5组的脾脏指数和法氏囊指数与感染组差异显著(P＜0.05)。其中，4组的胸腺指数与3、5组差异极显著(P＜0.01)，4组的脾脏指数和法氏囊指数与3组、5组差异显著(P＜0.05)。说明添加0.1％菌剂I在基础日粮中对提高肉鸡免疫器官指数有明显效果。 

表6芽孢杆菌对21日龄感染鸡模型免疫器官指数的影响 

C、“地衣芽孢杆菌CCTCC2011133”预防对28日龄感染鸡模型免疫器官指数的影响，见表7。结果显示：空白组、试验3、4、5组的胸腺指数、脾脏指数和法氏囊指数与感染组差异极显著(P＜0.01)。其中，3、4、5组的胸腺指数和法氏囊指数与空白组差异极显著(P＜0.01)，3、4、5组的脾脏指数与空白组差 异显著(P＜0.05)。4组的脾脏指数与3组、5组差异显著(P＜0.05)。 

表7芽孢杆菌预防组对28日龄感染鸡模型免疫器官指数的影响 

(4)回肠内容物微生物群的测定 

分别于14、21和28日龄每组取3羽接近平均体重的鸡屠宰。按照(Kaldhusdal M.2000.World Poultry.16：50-51)描述，用PCR-DGGE分子生物学法观察各处理组肠道(回肠)微生物群落结构和多样性的差异性。按照上述方法提取粪样总DNA和细菌16S rRNA V3区扩增，结果见表8。 

表8细菌总DNA编号 

(5)细菌基因组总DNA16S rRNA V3区扩增片段DGGE分析 

按照上文所述方法配制梯度胶及用Bio-Rad Dcode进行DGGE凝胶电泳和硝酸银染色，然后用Bio-Rad GS800Calibrated Densitometer扫描胶成像。试验数据用Excel进行预处理后用SPSS进行显著性分析。DGGE图谱使用NTSYSpc2.10s软件进行多样性聚类分析。 

A、“地衣芽孢杆菌CCTCC2011133”对预防组鸡回肠菌群影响 

a、“地衣芽孢杆菌CCTCC2011133”对14日龄鸡回肠菌群的影响，见表9。 产气荚膜梭菌、双歧杆菌、类杆菌、总厌氧菌数量差异不显著(P＞0.05)，而乳酸杆菌、大肠杆菌、肠球菌和总需氧菌各组菌数量差异显著(P＜0.05)。其中，3，4，5组乳酸杆菌数量显著升高(P＜0.05)，同时4，5组肠杆菌、肠球菌和总需.氧菌数量显著下降(P＜0.05)。结果表明，14日龄时实验组肠道的健康指数B/E值有所升高。 

表9芽孢杆菌对14日龄感染鸡模型回肠菌群的影响(lgCFU/g粪便，X±SE) 

b、“地衣芽孢杆菌CCTCC2011133”对21日龄感染鸡回肠菌群的影响，见表10。大肠杆菌、肠球菌、总需氧菌、乳酸杆菌、双歧杆菌、类杆菌各组菌数量差异显著(P＜0.05)，产气荚膜梭菌、总厌氧菌各组菌数量差异极显著(P＜0.1)。其中，试验3，4，5组乳酸杆菌、双歧杆菌、类杆菌和总厌氧菌数量显著升高(P＜0.05)，同时产气荚膜梭菌、大肠杆菌、肠球菌和总需氧菌数量显著下降(P＜0.05)。结果表明，添加不同剂量的菌剂I在基础日粮中，在抑制产气荚膜梭菌、大肠杆菌、肠球菌等病原菌的定植有一定的作用。 

表10芽孢杆菌对21日龄感染鸡模型回肠菌群的影响(lgCFU/g粪便，X±SE) 

c、“地衣芽孢杆菌CCTCC2011133”预防对28日龄感染鸡回肠菌群的影响，见表11。产气荚膜梭菌、大肠杆菌、肠球菌、总需氧菌、乳酸杆菌、双歧杆菌、类杆菌和总厌氧菌各组菌数量差异显著(P＜0.05)。其中，试验3，4，5组乳酸杆菌、双歧杆菌、类杆菌和总厌氧菌数量显著升高(P＜0.05)，同时产气荚膜梭菌、大肠杆菌、肠球菌和总需氧菌数量显著下降(P＜0.05)。结果表明，芽孢杆菌预防组肠道的回肠健康指数B/E值升高。 

表11芽孢杆菌预防对28日龄感染鸡模型回肠菌群的影响(lgCFU/g粪便，X±SE) 

B、各处理组回肠微生物群落结构和多样性的差异性 

鸡回肠菌群的DGGE图谱、聚类分析图和多样分析图(见表12)。DGGE图谱上的条带反映了鸡回肠中的优势菌群，条带的数量和位置的复杂性说明菌群的多样性。试验结果图说明饲喂本发明“地衣芽孢杆菌CCTCC2011133”能够保护肠道微生物群，稳定鸡肠道微生物的多态性，且添加0.1％菌剂I组预防效果最好，而且饲喂芽孢杆菌能够保护肠道微生物群，提高鸡肠道微生物的多态性，改善生长性能，且4组效果最好。 

表12鸡回肠菌群的DGGE图谱、聚类分析图和多样分析图 

2、动物治疗试验 

(1)治疗试验设计 

在预防试验基础上，15日龄每只鸡灌喂1.0×10⁷cfu/mL的球虫卵囊1mL，17-20日龄每天灌喂1.0×10⁸cfu/mL的产气荚膜梭菌1mL，建立感染模型。21日龄后将第3组均分成4组，分出6、7、8三组，在基础日粮中分别添加0.1％、0.2％、0.4％菌剂II(菌剂II的制作方法与上述菌剂I相同，地衣芽孢杆菌H₂活菌 数为1.0×10¹⁰cfu/g)。9组在基础日粮中添加0.1％盐霉素作为抗生素治疗对照组。饲喂4周，在0～1周龄时，以每个重复为单位采用纸箱散养；在2～4周龄时，以每个重复为单位采用笼养，早晚各喂料一次，自由采食(干粉料)，将前次未采完日粮收集称重，自由饮水，见表13。动物房相对湿度保持在50～70％，温度保持在23℃～28℃，同时保持周围环境安静。 

表13治疗试验设计 

(2)生长性能测定 

按照(陈鹏.2011.中国家禽，33(11)：11-14)方法对“地衣芽孢杆菌CCTCC2011133”治疗组对感染鸡模型生长性能的影响进行测定。由表14结果可见，与感染组相相比，试验6、7、8、9组的末期体重均比空白组高，差异极显著(P＜0.01)，结果表明添加菌剂II能显著提高感染鸡模型的增重，降低感染鸡模型的料重比，且日粮中添加0.4％的菌剂II效果极显著。 

表14芽孢杆菌治疗组对感染鸡模型生长性能的影响 

(3)免疫器官指数的测定 

分别于14、21和28日龄取接近平均体重的鸡3羽无菌屠宰，摘取胸腺、脾脏、法氏囊，剔除脂肪后称鲜重，计算免疫器官与体重的相对重量得到胸腺指数、脾脏指数、法氏囊指数。计算公式：免疫器官指数＝免疫器官重(g)/体重(Kg)。“地衣芽孢杆菌CCTCC2011133”治疗对28日龄感染鸡模型免疫器官指数的影响，见表15。结果显示：试验6、7、8组的胸腺指数、脾脏指数和法氏囊指数与感染组差异极显著(P＜0.01)。其中，6、7、8组的胸腺指数和脾脏指数与感染组差异极显著(P＜0.01)，6、7、8组的法氏囊指数与感染组差异显著(P＜0.05)。而抗生素组的胸腺指数、脾脏指数和法氏囊指数与感染组差异极显著(P＜0.01)。 

表15芽孢杆菌治疗对28日龄感染鸡模型免疫器官指数的影响 

(4)回肠内容物微生物群的测定 

按照上文所述方法提取粪样总DNA和对细菌16S rRNA V3区进行PCR扩增，见表16。 

表16细菌总DNA编号 

(5)细菌基因组总DNA16S rRNA V3区扩增片段DGGE分析 

按照上文所述方法配制梯度胶及用Bio-Rad Dcode进行DGGE凝胶电泳和硝酸银染色，然后用Bio-Rad GS800Calibrated Densitometer扫描胶成像。试验数据用Excel进行预处理后用SPSS进行显著性分析。DGGE图谱使用NTSYSpc2.10s软件进行多样性聚类分析。 

A、“地衣芽孢杆菌CCTCC2011133”治疗对28日龄感染鸡回肠菌群的影响，见表17。产气荚膜梭菌、大肠杆菌、肠球菌、总需氧菌、乳酸杆菌、双歧杆菌、类杆菌和总厌氧菌各组菌数量差异极显著(P＜0.1)。其中，试验6，7，8组乳酸杆菌、双歧杆菌、类杆菌和总厌氧菌数量显著升高(P＜0.05)，产气荚膜梭菌、大肠杆菌、肠球菌和总需氧菌数量极显著下降(P＜0.1)。而抗生素组与感染组的总需氧菌、双歧杆菌、总厌氧菌差异不显著(P＞0.05)。结果表明，先添加低剂量的芽孢杆菌在基础日粮中，再添加高剂量的芽孢杆菌治疗，可使肠道的回肠健康指数B/E值升高。 

表17芽孢杆菌治疗对28日龄感染鸡模型回肠菌群的影响(lgCFU/g粪便，X±SE) 

B、各处理组回肠微生物群落结构和多样性的差异性 

细菌16S rRNA V3区PCR扩增产物用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图17。鸡回肠菌群的DGGE图谱、聚类分析图和多样分析图(见表18)。DGGE图谱上的条带反映了鸡回肠中的优势菌群，条带的数量和位置的复杂性说明了菌群的多样性。试验结果图说明在饲喂芽孢杆菌预防的基础上，再添加高剂量的芽孢杆菌治疗能够保护肠道微生物群，提高鸡肠道微生物的多态性，且添加0.2％菌剂II治疗组效果最好。 

表18鸡回肠菌群的DGGE图谱、聚类分析图和多样分析图 

Claims (2)

1.一株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)H₂，其特征在于该菌株耐酸、耐热、耐胆盐，且对产气荚膜梭菌具有良好拮抗性，该菌株已于2011年4月20日由中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏号为CCTCC NO：M2011133。 

2.权利要求1所述的菌株或含有该菌株的微生物制剂在防治鸡坏死性肠炎中的应用。 

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