JP2015517809A - 大腸菌(E.coli)及びクロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridiumperfringens)に対する抗菌効果を有し、且つ高い胞子形成能を有する抗生物質感受性バチルス株 - Google Patents
大腸菌(E.coli)及びクロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridiumperfringens)に対する抗菌効果を有し、且つ高い胞子形成能を有する抗生物質感受性バチルス株 Download PDFInfo
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Abstract
Description
2006年の欧州連合における抗生物質成長促進因子の段階的廃止は、高い効力を伴う費用効果的な飼料添加剤の増加した必要性をもたらし、そしてそれによる新規のプロバイオティックの必要性をもたらした。バチルスに基づくプロバイオティック飼料添加剤は、ブタ及び家禽における健康及び生産へのそれらの好ましい効果について公知である。胞子は熱安定性であり、且つ90〜95℃までの温度でのペレット化工程で生存し得るので、これらの製品は、飼料産業に適している。
一晩成長の試験される株の懸濁物を、105cfu/mL(コロニー形成単位/mL)の適切な濃度で、試験される抗生物質を倍数連続希釈(総溶液100μL/ウェル)において、マイクロタイタープレート中のISO-SENSITEST培養液(Oxoid CM0473)に接種し、そして20〜24時間、37℃で好気的に培養する。抗生物質アンピシリン、バンコマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、エリスロマイシン、クリンダマイシン、テトラサイクリン、及びクロラムフェニコールを含んで成る前加工パネルVetMIC Lact-1 & Lact-2が使用され得る。結果は、目に見える成長を阻害する抗生物質の最も低い濃度として、24時間後に記録される。
9mLの子ウシのインフュージョン培養液(VIB)を、試験されるバチルス培養物に接種し、そして37℃及び175rpmで一晩培養する。同時に9mLのブレインハートインフュージョン(BHI)培養液に、大腸菌(E.coli)O149(O149:k91、k88a)、大腸菌(E.coli)O147(O147:K89 F4)、及び大腸菌(E.coli)O101(O101、F5)から選定される大腸菌(E.coli)株を接種し、そして37℃で一晩培養する。
9mLのVIBに、試験されるバチルス培養物を接種し、そして37℃及び175rpmで一晩培養する。同時に9mLのBHI培養液に、クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)A型、DSM 756を接種し、そして嫌気的な瓶の中で、37℃で一晩培養する。
50μLの体積にある試験されるバチルス株を、ディープウェル(DW)プレート中の700μLのVIBに添加し、そして37℃及び175rpmで、一晩培養する。50μLの体積にあるバチルス一晩培養物を、DWプレート中に95重量%の水;1.5重量%の窒素源(すなわち、イースト);3重量%のショ糖;0.06重量%の微量ミネラル;リン酸水素二カリウム 0.1重量%を含んで成る700μLの胞子形成培地に移す。プレートを37℃及び175rpmで、3日間培養する。胞子形成は、微視的に観察され、そして胞子パーセンテージ(バチルス細胞の総数と比較した胞子の数)は、培養の1日(24時間)、2日(48時間)及び3日(72時間)後の視覚評価により決定される。
(a)受入番号DSM 25839のバチルス・モヤヴェンシス(Bacillus mojavensis)株;
(b)受入番号DSM 25840、受入番号 DSM 27032または受入番号DSM 27033のバチルス・アミロリクエファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)株
;或いは
(c)受入番号DSM 25841の枯草菌(Bacillus subtilis)株;の突然変異株を得るための方法に関し;
方法は、任意に株を突然変異化処理にかけ、そして以下
(i)アンピシリン、バンコマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、エリスロマイシン、クリンダマイシン、テトラサイクリン及びクロラムフェニコールへの感受性:
(ii)大腸菌(E.coli)及びクロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)に対する抗菌活性、並びに
(iii)2日目に測定した場合、少なくとも80の胞子形成パーセンテージの特性を有する突然変異株を選定することを含んで成る。
バチルス・モヤヴェンシス(Bacillus mojavensis)株CHCC 15510は、2012年4月3日の寄託日で、Chr.Hansen A/S、デンマークにより、DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstrasse 7B、D−38124 Braunschweig)にて、受入番号DSM 25839の下で寄託されている。寄託は、特許手続の目的のための微生物の寄託の国際的承認におけるブダペスト条約の条件下で成された。
それぞれの指定国のそれぞれの特許庁に関して、本出願人は、上記の寄託微生物のサンプルが、特許が付与される日、或いは本出願人が拒絶され、もしくは取り下げ、または取り下げたと見なされる日までに、請求人により指名された専門家に入手可能にさせることだけを請求する。
子ウシのインフュージョン培養液(VIB)(Difco、234420)
子ウシのインフュージョン培養液(VIB)寒天(VIB+1.5%寒天 細菌学的(寒天、no.1)、Oxoid LP0011)
T3寒天プレート(リットルあたり:3gのトリプトン、2gのトリプトース、1.5 gのイースト抽出物、0.05Mのリン酸二水素ナトリウム、及び0.005gのMnCl2 [pH 6.8]、及び15gの寒天)
Laura−Bertani(Lb)培養液(g/L:Bacto トリプトン 10(Difco 0123)、イースト抽出物5(Oxoid L21)、NaCl 10(Merck nr.106404))
ブレインハートインフュージョン(BHI)培養液(Oxoid CM225)
ブレインハートインフュージョン(BHI)寒天(Oxoid CM375)
胆汁塩(胆汁抽出物、ブタ;Sigma B8631)
バイオアッセイ皿(Nunc 240845)
ペトリ皿(Procudan 140096、リブを伴うペトリ皿)
胞子形成培地:%(w/w)95%の水;1.5%の窒素源(すなわちイースト);3%のサッカリド;0.06%の微量ミネラル;リン酸水素二カリウム0.1%。
ペプトンを有する生理食塩水(0.9%の塩化ナトリウム、1%のペプトン)FKP
VetMIC Lact−1 & Lact−2(SVA、Uppsala、スウェーデン)
ISO−SENSITEST培養液(Oxoid CM0473)
バチルス株は、排泄物、土壌、食物起源から単離し、そして株バンクコレクションから収集し、そしてVIB中で、20%のグリセロールと共に、MTPマスタープレートにおいて−80℃で維持した。
アンピシリン(Sigma、A9518−5G)
バンコマイシン(Sigma、V1764−250MG)
ゲンタマイシン(Sigma、G1264−50MG)
カナマイシン(Sigma、K1377−1G)
ストレプトマイシン(Sigma、S6501−5G)
エリスロマイシン(SigmaE−5389)
クリンダマイシン(Sigma、C2569−10MG)
テトラサイクリン(Sigma T−7660)
クロラムフェニコール(Sigma、C0378−5G)
大腸菌(E.coli)O101 F5(State Serum Institute、コペンハーゲン、デンマーク)
大腸菌(E.coli)O147:K89 F4(State Serum Institute、コペンハーゲン、デンマーク)
大腸菌(E.coli)O149:k91、k88a(NCTC 10650) National Collection of Type Cultures
大腸菌(E.coli)株を、LB中で、20%のグリセロールと共に、MTPマスタープレートにおいて−80℃で維持した。
クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)A型、DSM 756を、BHI中で、20%のグリセロールと共に−80℃で維持した。
土壌及び排泄物及び食物起源から由来する261個の分離株を、抗生物質感受性、病原菌阻害、胆汁耐性及び低pHへの感受性について前スクリーニングにかけた。
50μLの体積にあるバチルス株を、MTPマスタープレートから、DWプレート中の700μLのVIB中に添加し、そして37℃及び175rpmで、一晩培養した。表1に挙げた抗生物質を、2つの濃度で補充したISO試験サンプル、及び抗生物質を含まないISOコントロールを、180μLの体積にあるMTPプレート中に添加した。一晩のバチルス培養物を100倍に希釈し、そして20μLの分割量でISO試験サンプル及びコントロールに移した。MTPプレートを、37℃で培養した。620nmでの光学密度(OD)を、接種材料中で、及びMTP試験プレート中で、培養の24時間及び48時間の後に測定した。細菌の抗生物質感受性を、ISOコントロール中のODに対する、ISO試験サンプル中のODのパーセンテージとして見積もった。
50μLの体積にあるバチルス株を、MTPマスタープレートから、DWプレート中の700μLのVIB中に添加し、そして37℃及び175rpmで、一晩培養した。検定前に、大腸菌(E.coli)株を、LB中で、一晩、30℃で成長させた。C.パーフリンジェンス(C.perfringens)CHCC14372を、BHI中で、一晩、嫌気性の瓶において、37℃で成長させた。
2mLの大腸菌(E.coli)の一晩培養物を、200mLの液体VIB寒天と、50℃で混合し、そしてそれぞれのバイオアッセイ皿に注いだ。消毒した作業台中で、皿を乾燥させた。一晩のバチルス培養物、それぞれ2μLを、大腸菌(E.coli)と混合したVIB寒天の表面上にスポットし、そして37℃で、2日間培養した。スポットを取り囲む明確にされた阻害域の半径を測定し、そして2mmを上回る半径を「高」、0.5〜2mmの半径を「中」、及び0.5mm未満の半径を「低」と記録した。
VIB寒天を、バイオアッセイ皿中に注ぎ(1皿につき200mL)、そして消毒した作業台中で完全に乾燥させた。一晩のバチルス培養物、それぞれ2μLを、VIB寒天皿の表面上にスポットし、そして37℃で、一晩培養した。2mLの体積にあるC.パーフリンジェンス(C.perfringens)A型CHCC14372を、200mLの液体BHI寒天に添加し、混合し、そしてバチルススポットを有するバイオアッセイ皿中にそっと置いた。皿を、嫌気性的に、27℃で、1日培養した。スポットを取り囲む明確にされた阻害域の半径を測定し、そして2mm超を「高」、1〜2mmを「中」、及び1mm未満を「低」と記録した。
2mLのC.パーフリンジェンス(C.perfringens)CHCC14372の一晩培養物を、200mLの液体BHI寒天と混合し、そしてそれぞれのバイオアッセイ皿に注いだ。固化後に、消毒した穴開け機により、BHI寒天中に10mmのウェルを作り、そして80μLの一晩のバチルス培養物を、それぞれのウェル中に移した。皿を、嫌気的に、37℃で、1日培養した。ウェルを取り囲む明確にされた阻害域の半径を測定し、そして2mm超を「高」、0.5〜2mmを「中」、及び0.5mm未満を「低」と記録した。
50μLの体積にあるバチルス株を、MTPマスタープレートから、DWプレート中の700μLのVIB中に添加し、そして37℃及び175rpmで、一晩培養した。50μLの体積にあるバチルスの一晩培養物を、DWプレート中の0.3%の胆汁塩を補充した800μLのVIB(試験サンプル)、及び胆汁を含まないVIB(コントロール)に移した。プレートを、37℃及び175rpmで培養した。620nmでの光学密度(OD620)を、胆汁を有するVIBにおいて、0、6及び24時間で測定し、そしてVIBコントロールにおける対応するOD620値から差し引いた。培養物を、OD620値の差異に従い、群A(OD<0.1)、B(OD=0.1〜0.4)及びC(OD>0.4)に階層化した。群A中の株は、胆汁塩に最も耐性であると見なされた。選択株は、群AまたはBにあるべきである。選択株の結果を表2に示す。
800μLのVIB分割量を、1.0Mの塩酸によりpH4に調整し、そしてVIBコントロール(pH7)を、DWプレート中に分配した。50μLの体積にあるバチルス株を、MTPマスタープレートからDWプレート中に添加し、そして37℃及び175rpmで、24時間培養した。光学密度(OD620)を、200μLの細胞懸濁物中で、培養の0及び24時間後の時点で測定した。培養前のOD620値を、培養後の対応値から引くことにより、pH4での細菌の成長を定義した。0.1超のOD620の増加を示す培養物は、pH4に耐性と見なされ(表2においてRで示される)、その一方で、0.1未満のOD620値を有する培養物(成長なし、または否定的な値)は、pH4に感受性であると見なされた(表2においてSで示される)。
前スクリーング試験に基づき、32株を2次スクリーニングのために選択した。選択株は、発表される抗生物質に感受性であるべきであり、また大腸菌(E.coli)及びクロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)の両方に対して抗菌効果を示すべきであり、また他の実施される試験において合理的に実施されるべきである。
1次スクリーニングの結果に基づき、40個の選択分離株及び参照株を、寒天スポット試験の反復により、病原菌の阻害について、及び胞子形成について試験した。さらに32個の株を、MIC試験により、抗生物質感受性について試験した。
検定前に、9mLのVIBにバチルス培養物を接種し、そして37℃及び175rpmで、一晩培養した。同時に9mLのBHI培養液に、大腸菌(E.coli)株を接種し、そして一晩、37℃で培養した。クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)を、同一の条件で、嫌気性の瓶の中で成長させた。
それぞれ2mLの体積にある病原菌の一晩の培養物を、200mLの液体VIB寒天中に、50℃で添加し、そしてそれぞれのバイオアッセイ皿中に注いだ。消毒した作業台中で、皿を乾燥させた。一晩のバチルス株培養物を、病原菌と混合したVIB寒天の表面上にスポットし、そして37℃で、2日間培養した。スポットを取り囲む阻害域の半径、及びスポット直径を記録した。
バチルス培養物を、ペトリ皿中のVIB寒天の表面上にスポットし、そして37℃で、一晩培養した。2mLの体積にあるC.パーフリンジェンス(C.perfringens)の一晩培養物を、200mLの液体BHI寒天と混合し、そして成長したバチルススポットを有するVIB寒天中に注いだ。皿を、嫌気的に、37℃で、1日培養した。スポットを取り囲む明確にされた阻害域の半径を測定した。
50μLの体積にあるバチルス株を、MTPマスタープレートから、DWプレート中の700μLのVIB、または胞子形成培地中に添加し、そして37℃及び175rpmで、24時間培養した。バチルス成長を、200μLの懸濁物において、620nm(OD620)での光学密度により決定した。胞子形成培地の高い濁度、及びそのウェル間での変動のために、培養前のOD620値を、培養後の対応するウェルにおけるOD620値から差し引いた。0.4超のOD620を示す培養物を群A(高成長)、及び0.4未満のOD620を群B(低成長)に階層化した。
50μLの体積にあるバチルス株を、MTPマスタープレートから、DWプレート中の700μLのVIB中に添加し、そして37℃及び175rpmで、一晩培養した。50μLの体積にあるバチルスの一晩培養物を、DWプレート中の700μLの胞子形成培地(SM)に移した。プレートを、37℃及び175rpmで、3日間培養した。胞子形成を微視的に観察し、そして胞子パーセンテージ(総細胞と比較した胞子の数)を、培養の1日(24時間)、2日(48時間)及び3日(72時間)後の視覚評価により決定した。
多くの抗生物質に関し、株の最小阻害濃度(MIC)を測定することにより、抗生物質感受性について分析した。使用した方法は、CLSI標準(臨床・検査標準協会M07−A8及び M45−A2)により概説されるような培養液微量希釈法であった。
32個の選択株の結果は、バチルス・アミロリクエファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)が、抗生物質感受性、抗菌効果及び胞子形成の最も良い組み合わせ特性を有したことを示した(表2を参照)。Chr.Hansen所有株(32個の株中の22個)に関するデータのみが含まれる。
選択されたバチルス株に関する基本データ
起源、gyrBによる種、VIB及び胞子形成培地における成長、並びに胞子形成パーセンテージ。
株A=15510;株B=15516;株C15541;株H=15536;株I 15539
選択バチルス株による大腸菌(E.coli)及びクロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)の阻害 (mm)、並びに胆汁及び酸に対する耐性
株A=CHCC15510;株B=15516;株C=15541;株H=15536;株I=15539
O149、O147及びO101は、病原菌で述べた3つの大腸菌(E. coli)ブタ病原菌である。
3.1 熱安定性試験に関する方法
バチルス株を、一晩、VIB中で、37℃及び220rpmで成長させた。一晩培養物を、T3寒天プレート上に広げ(100μLの105〜106希釈物)、そして胞子形成が完了するまで、37℃で、1〜2日間培養した。胞子をプレートからスクラップし、FKP溶液中に懸濁し、そして増殖性細胞を不活性化するために80℃で15分間培養した。胞子懸濁物を、加熱後すぐに氷上に置いた。胞子調製品をFKP中で2回洗浄し、20%のグリセロールを有するFKP中で再懸濁し、そして使用前に80℃で保った。細菌胞子の熱耐性は、FKP中に500μLの胞子懸濁物を(1mLにつき、約1×106CFUの濃度で)有するエッペンドルフ管を、99.5℃で、2、5及び10分間保持することにより可能になった。CFU計算は、37℃で、一晩培養した後に、VIB寒天上に固定した加熱懸濁物の希釈において決定した。
熱安定性データを表4に示す。
表4 選択バチルス株の99.5℃での熱安定性;0時間に対する2、5及び10分後の減少としてcfuにおいて測定した(log/log)
株B=15516;株C=15541、株H=15536
4.1 セルラーゼ検定法
バチルス株を、カルボキシメチルセルロース(CMC)培地(Abou-Taleb等、2009)(1つあたり:10.0gのカルボキシメチルセルロース(C9481)、2.0gのBacto トリプトン(cat.211705、Becton Dickinson A/S、デンンマーク)、4gのKH2PO4、4.0gのNa2HPO4、0.2gのMgSO4・7H2O、0.001gのCaCl2・2H2O、0.004gのFeSO4・7H2O、pH 7)中で、37℃で、及び24時間の激しい磁気撹拌において成長させた。セルラーゼ生産は、製造者の指示書に従い、EnzChek Cellulase Substratキット(cat. E33953、Life Technologies)を用いて決定した。簡潔には、培養物の上澄みを遠心分離により収集し、そしてMTP(ウェルごとに200μL)中に連続希釈で分配した。2U/mLから出発して、黒色アスペルギルス(C1184)からのセルラーゼを用いて標準曲線を構築した。EnzChek基質溶液を、Nunc96ウェルBlack FluoroNuncプレート(cat.237105、Thermo Fisher Scientific、NUNC Inc.)中の培養物の上澄みに添加した。培養の30分後に、蛍光を、励起360nm/発光420nmで記録した(Enspire 2300 Multilabel Reader、Perkin Elmer Inc.)。セルラーゼ活性は、2つの独立した実験における標準曲線から算出し、そして手段(U/mL)として表した。
バチルス培養物を、ブナ材キシラン(Cordeiro等、2002)を含む培地(1つあたり:5.0gのキシラン(X4252)、2.0gのイースト抽出物(cat.288620、Becton Dickinson A/S、デンマーク)、5.0gのBactoペプトン(cat.211677、 Becton Dickinson A/S、デンマーク)、0.5gのNaCl、0.5gのMgSO4・7H2O、0.15gのCaCl2・2H2O、pH7.5)中で、37℃で、及び24時間の激しい磁気撹拌において成長させた。キシラナーゼ検定は、製造者の指示書に従い、EnzChek Ultraキシラナーゼ検定キット(cat.E33650、Life Technologies)を用いて実施した。簡潔には、培養物の上澄みを遠心分離により収集し、MTP(ウェルごとに200μL)中に連続希釈で分配し、そしてキシラナーゼ基質ワーキング溶液を添加した。培養の30分後に、培養物の上澄み中の蛍光を、励起360nm/発光420nmで測定した(Enspire 2300 Multilabel Reader、Perkin Elmer Inc.)。好熱性子嚢菌(Thermomyces lanuginosis)(X2753)を標準酵素として使用し、そして25mU/mLから出発する連続希釈でMTPに充填した。バチルス株のキシラナーゼ活性は、標準曲線から算出し、そして2つの独立した検定の手段(mU/mL)として表した。
バチルスの一晩株(37℃で、VIBにおいて成長させた)を、基質としてフルオレセインイソチオシアネート-カゼイン(FITC-C)(Sigma C3777)を有する反応混合物に移し、そして37℃で、3時間培養した。沈殿後に適量のペプチドを、励起497nm/発光515nmでの蛍光により測定した。本検定は、広範囲のプロテアーゼ(セリン、アスパラギン酸、システイン及びメタロプロテアーゼ)を検出する。
バチルス株を、VIB(約107のCFU/mL)中に添加し、ポリプロピレン(PP)MTP(96ウェルConical Btm PP Plt Natural; NUNC Inc.,デンマーク)中に分配し、そして振らずに、37℃で、24時間培養した。620nmでの光学密度(OD)の測定により、成長を制御した。既に発表されているクリスタルバイオレット染色(Auger等.2009)により、バイオフィルム形成を評価した。簡潔には、蒸留水でウェルを洗浄した後に、0.1(w/v)%のクリスタルバイオレット溶液を、PP-MTPに添加し、そしてプレートを30分間培養した。その後に洗浄手順を繰り返し、そして96(v/v)%のエタノールをプレートに添加した。培養から15分後に、570nmでの吸収を測定した(Wallac Victor2 分光光度計、Perkin Elmer Inc.)。バチルス種株を、高(Abs570nm >2.0)、中(Abs570nm =1.0〜2.0)、または低(Abs570nm <1.0)のいずれかのバイオフィルム生産物として分類した。検定は、2回繰り返して実施した。
表5 酵素生産及びバイオフィルム
(RFU=相対蛍光単位)
株A=15510;株B=15516;株C=15541;株H=15536:株I=15539
2つの選択されたバチルス株(株BまたはC)を、幼獣用の食餌に補充し、成長成績へのそれらの効果、及び離乳後の子ブタの死亡率を評価した。大腸菌(E.coli)は、生産パラメーター及び死亡率に大きな衝撃を伴う幼獣期における主な病原菌の1つであり、これらの試験は、動物における大腸菌(E.coli)阻害の影響についての情報を与え得る。試験は、2つの異なる場所で実施し;場所1は研究飼育場、及び場所2は大学であった。試験設定は、両方の場所で同様であった。
表6
子ブタでの試験において使用された場所の概説
離乳日に実験飼育場の2つの連続した離乳バッチ(それぞれ288匹の子ブタ)から来た、576匹の子ブタ(28日齢)を、実験において使用した。子ブタは、交配種(ACMC×ピエトレン)であった。選択された子ブタは、良好な一般的な状態を伴う健康体であり、また幼獣期に任意のワクチン接種を受けていなかった。実験飼育場は、豚繁殖・呼吸障害症候群(PRRS)に陽性であったが、制御下にあり、また離乳期後におけるいくつかの大腸菌症の問題を有していた。体重により子ブタを分類し、そしてその後に、両方の処置において、それぞれの囲いの区画が、類似する体重の6匹の子ブタ、全部で3匹の雄及び3匹の雌を含むように、両方とも離乳バッチにある48個の囲いに割り振った(合計で96個の囲い)。処置は、それぞれの処置が6匹の子ブタの24個の囲いに適用されるように(1つの処置及び部屋につき6個の囲い;1つの処置及び離乳バッチにつき12個の囲い)、区画により、軽い子ブタと重い子ブタの囲いに割り振った。バチルス製品を、400g/トンの飼料、または1.28*10 7 CFUg/飼料で飼料に添加した。
表7
場所1での生産パラメーター
コントロールと比較したP値(A:P=<0.1;a=<0.05)
株B=15516;株C=15541
SE=標準誤差
幼獣用の食餌に補充される両方のバチルス株プロバイオティック製品は、陰性コントロール群と比較して、それらの間での差異を示さずに、生産性能を数値的に改良。ADG及びFUの両方への有意な効果は、プレスターター相(28〜42日齢)において観察できた。死亡率パーセンテージは、両バチルス群において減少した(死亡率%:コントロール(3.47)、株B(1.39%)、株C(2.08)) 。
離乳直後に、全ての選択された子ブタを、24個の囲いの離乳部屋に、囲いごとに30匹の動物で住まわせた。部屋は、セントラルヒーティングを備え、また冷却システムを有する換気が施こされ、また完全に床張りであった。それぞれの囲いは、業務用の両面湿乾給餌器を備え、同時に3匹の動物へ給餌することを可能にする不断給餌、及び自由な飲水を保証した。給餌は、全実験段階を通して、不断に成された。
表8
場所2の生産パラメーター
最小二乗平均、コントロールと比較したP値(A:P=<0.1)
株B=15516;株C=15541
幼獣用の食餌に補充された両方のバチルス株は、陰性コントロール群と比較して、それらの間の差を示さずに生産性能を数値的に改善させた。ADG及びFUの両方への有意な効果は、試験の間に観察できた。
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Claims (15)
- (i)アンピシリン、バンコマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、エリスロマイシン、クリンダマイシン、テトラサイクリン及びクロラムフェニコールへの感受性;
(ii)大腸菌(E.coli)及びクロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)に対する抗菌活性;並びに
(iii)培養の2日後に測定した場合、少なくとも80の胞子形成パーセンテージ、
を特徴とするバチルス属の株。 - バチルス・アミロリクエファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)/アトロファエウス(atrophaeus)/メチロトロフィカス(methylotrophicus)/シアメンシス(siamensis)/バリスモルティス(vallismortis)種から成る群、またはバチルス・モヤヴェンシス(Bacillus mojavensis)/枯草菌(subtilis)/テクィレンシス(tequilensis)種から成る群から選択される、請求項1に記載されたバチルス株。
- B.モヤヴェンシス(B.mojavensis)である、請求項1または2に記載されたバチルス株。
- B.アミロリクエファシエンス(B.amyloliquefaciens)である、請求項1または2に記載されたバチルス株。
- 枯草菌(B.subtilis)である、請求項1または2に記載されたバチルス株。
- 株が、
(a)受入番号DSM25839の、バチルス・モヤヴェンシス(Bacillus mojavensis)株CHCC15510;
(b)バチルス・アミロリクエファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)株の、受入番号DSM25840のCHCC15516、受入番号DSM27032のCHCC15536、及び受入番号DSM27033のCHCC15539;及び
(c)受入番号DSM25841の、枯草菌(B.subtilis)株CHCC15541;
並びに(a)、(b)または(c)の突然変異株から成る群から選択される、請求項1〜5のいずれか1項に記載されたバチルス株。 - (i)アンピシリン、バンコマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、エリスロマイシン、クリンダマイシン、テトラサイクリン及びクロラムフェニコールへの感受性;
(ii)大腸菌(E.coli)及びクロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)に対する抗菌活性;並びに
(iii)培養の2日後に測定した場合、少なくとも80の胞子形成パーセンテージ、
を有するバチルス株を選択するための方法であって、
以下の:
(i)バチルス株のプールから、アンピシリン、バンコマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、エリスロマイシン、クリンダマイシン、テトラサイクリン及びクロラムフェニコールに感受性であるバチルス株を選択及び単離するステップ、
(ii)バチルス株のプールから、大腸菌(E.coli)及びクロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)に対する抗菌活性を有するバチルス株を選択及び単離するステップ、
(iii)バチルス株のプールから、培養の2日後に測定した場合、少なくとも80の胞子形成パーセンテージを有するバチルス株を選択及び単離するステップ、
(iv)pH4での増殖性細胞の感受性について、バチルス株のプールを検定するステップ、及び
(v)胆汁耐性について、バチルス株のプールを検定するステップ、
を含んで成る方法。 - (a)受入番号DSM25839の、バチルス・モヤヴェンシス(Bacillus mojavensis)株CHCC15510;
(b)バチルス・アミロリクエファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)株の、受入番号DSM25840のCHCC15516、受入番号DSM27032のCHCC15536、または受入番号DSM27033のCHCC15539;或いは
(c)受入番号DSM25841の、枯草菌(B.subtilis)株CHCC15541の突然変異株を得るための方法であって、
任意に前記株を突然変異化処理にかけ、そして
以下の特性
(i)アンピシリン、バンコマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、エリスロマイシン、クリンダマイシン、テトラサイクリン及びクロラムフェニコールへの感受性;
(ii)大腸菌(E.coli)及びクロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)に対する抗菌活性、並びに
(iii)培養の2日後に測定した場合、少なくとも80の胞子形成パーセンテージ、
を有する突然変異株を選択することを含んで成る方法。 - 請求項1〜5のいずれか1項に記載された少なくとも1つのバチルス株の細胞を含んで成る、バチルス組成物。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載された少なくとも2つの株の細胞を含んで成る、請求項9に記載されたバチルス組成物。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載された少なくとも3つの株の細胞を含んで成る、請求項9または10に記載されたバチルス組成物。
- 前記バチルス株の前記細胞、または株が胞子である、請求項9〜11のいずれか1項に記載されたバチルス組成物。
- 請求項10〜12のいずれか1項に記載されたバチルス組成物を、動物飼料に添加することを含んで成る、動物飼料またはプリミックスを生産するための方法。
- 請求項9〜12のいずれか1項に記載されたバチルス組成物、または請求項13に記載された方法に従い生産された動物飼料もしくはプリミックスを、動物に投与することを含んで成る、動物に給餌するための方法。
- 前記動物が、家禽、反すう動物、子ウシ、ブタ、ウサギ、ウマ、魚及び愛玩動物から成る群から選択される動物である、請求項14に記載された動物に給餌するための方法。
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