PL233899B1 - Nowe szczepy bakterii probiotycznych do zwalczania Escherichia coli i Clostridium perfringens u ptaków hodowlanych, zwłaszcza u drobiu, kompozycje szczepów bakterii probiotycznych i ich zastosowania - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są nowe szczepy bakterii fermentacji mlekowej do ograniczania rozwoju chorobotwórczych szczepów bakterii Escherichia coli i Clostridium perfringens, występujących w organizmach ptaków hodowlanych, szczególnie kurcząt rzeźnych, indyków, kaczek, gęsi, perliczek, bażantów, strusiów i ptaków ozdobnych oraz w środowisku ich bytowania. Wynalazek obejmuje także probiotyk i kompozycje szczepów probiotycznych oraz ich zastosowania polegające na podawaniu ptakom opracowanych kompozycji bakterii probiotycznych w celu zabezpieczenia ich organizmu przed chorobotwórczymi bakteriami E. coli i C. perfringens oraz dezynfekcję powierzchni ich ciał, a także pomieszczeń hodowlanych środkami zawierającymi komórki i/lub metabolity drobnoustrojów nowych szczepów bakterii probiotyczych.

Pod pojęciem probiotyku rozumie się produkt zawierający aktywne formy bakterii probiotycznych, który wpływa korzystnie na zdrowie zwierząt. Pod terminem „korzystny wpływ” rozumie się ograniczenie biegunek i chorób przewodu pokarmowego wywołanych patogennymi mikroorganizmami z gatunków E. coli i C. perfringens, lepszą ogólną kondycję zwierząt i inne korzystne efekty spożywania probiotyku.

W ostatnich latach obserwuje się wyraźne zainteresowanie biologicznymi metodami zwiększania bezpieczeństwa żywności. Większość chorób bakteryjnych przenoszonych drogą pokarmową ma pochodzenie odzwierzęce. Jednymi z bardziej niebezpieczniejszych patogenów przenoszonych w ten sposób są enterotoksyczne bakterie Escherichia coli i Clostridium perfringens. Wymienione bakterie stanowią także bezpośrednie zagrożenie w hodowli zwierząt gospodarskich. Zagrożenie to jest szczególnie duże w fermach, w których skoncentrowany jest chów tysięcy zwierząt gospodarskich. Z tego powodu są poszukiwane nowe, skuteczne metody zwalczania patogennych bakterii zarówno na poziomie produkcji pierwotnej, jak i przetwórstwa produktów zwierzęcych.

Przez dziesiątki lat ochronę przed chorobotwórczymi bakteriami spełniały antybiotyki. Dodatkowo były one czynnikiem stymulującym wzrost zwierząt. Masowe stosownie antybiotyków spowodowało jednak pojawienie się antybiotykoopornych szczepów patogennych bakterii, co znacznie osłabiło antybiotykową ochronę zwierząt i ludzi. Doprowadziło to także do wydania zakazu stosowania antybiotyków w żywieniu zwierząt na terenie UE.

Alternatywą do stosowania antybiotyków paszowych stały się w ostatnich latach probiotyki. Pod tym pojęciem rozumie się produkty zawierające mikroorganizmy, które podane w odpowiedniej ilości, wywierają korzystny wpływ na dobrostan zwierząt, którym zostały podane. Pojęcie dobrostanu zwierząt obejmuje wiele zjawisk, jak brak zachorowań, szybszy wzrost zwierzęcia, lepsze wykorzystanie paszy i lepszą ogólną kondycję zwierząt.

W literaturze przedmiotu pojawiło się wiele rozwiązań oferujących preparaty probiotyczne zwierające mikroorganizmy antagonistyczne w stosunku do bakterii chorobotwórczych, w tym chorobotwórczych szczepów Escherichia coli i C. perfringens. Zdecydowana większość z tych preparatów ma w swoim składzie bakterie fermentacji mlekowej. Należy jednak mocno podkreślić, że nie wszystkie szczepy bakterii fermentacji mlekowej wykazują właściwości antagonistyczne w stosunku do bakterii chorobotwórczych. Cecha ma bowiem charakter szczepozależny. Oznacza to, że tylko nieliczne szczepy należące do danego gatunku wykazują takie właściwości. Aktywność antagonistyczną może być wykryta w wieloetapowej procedurze specjalistycznych badań skriningowych, a następnie musi być potwierdzona w testach żywieniowych na zwierzętach.

Bakterie fermentacji mlekowej występują naturalnie w przewodzie pokarmowym ludzi i zwierząt. Są one uważane za całkowicie bezpieczne i zaliczane do klasy GRAS (ang. generally recognized as safe). Spotkać je także można w paszach dla zwierząt, szczególnie w kiszonkach. Ponadto są one składnikami mikroflory skóry zwierząt oraz występują w środowisku hodowlanym.

Antagonistyczne działanie probiotycznych bakterii fermentacji mlekowej jest najczęściej następstwem konkurencji o substancje pokarmowe oraz hamowania wzrostu lub niszczenia komórek bakterii chorobotwórczych. Może być ono także rezultatem blokowania receptorów dla bakterii chorobotwórczych, a co za tym idzie ograniczania przez nie kolonizacji przewodu pokarmowego. Dodatkowo może być ono skutkiem aglomerowania komórek bakterii probiotycznych z komórkami bakterii patogennych i ich usuwania z przewodu pokarmowego wraz z kałem. Aktywność bakterii fermentacji mlekowej w stosunku do patogenów wynika z produkowania przez nie substancji hamujących lub zabijających bakterie chorobotwórcze, takich jak bakteriocyny, nadtlenek wodoru, aldehyd octowy, kwasy organiczne i inne metabolity. Aktywność antagonistyczną wykrywa się w testach laboratoryjnych, np. po

PL 233 899 B1 przez naniesienie punktowo bakterii potencjalnie probiotycznych na powierzchnię płytek z pożywką agarową pokrytą komórkami bakterii chorobotwórczych, pełniących rolę mikroorganizmu wskaźnikowego. Pojawienie się po inkubacji, stref przejaśnień wokół punktu naniesienia testowanych bakterii fermentacji mlekowej świadczy ich aktywności w stosunku do bakterii chorobotwórczych. Im większa jest średnica strefy przejaśnienia, tym silniejsza aktywność antybakteryjna badanego szczepu w stosunku do stosowanej wskaźnikowej bakterii chorobotwórczej.

W praktyce do zwalczania bakterii chorobotwórczych wykorzystywane są preparaty zawierające pojedyncze szczepy bakterii probiotycznych lub ich kompozycje. Stosowanie kompozycji wieloszczepowych lub wielogatunkowych wymaga jednak standaryzacji preparatów probiotycznych.

W ostatnich latach pojawiły się komercyjnie wytwarzane preparaty probiotyczne przeznaczone do ochrony drobiu przed szkodliwym działaniem E. coli i C. perfringens. W opisie patentowym CN102373172 do zwalczania chorobotwórczych szczepów bakterii E. coli u drobiu i świń użyto szczepu Enterococcus faecium CGMCC 5058. Mikroorganizm ten stosowano jako dodatek paszowy lub jako samodzielny produkt. Podanie probiotycznych bakterii powodowało ochronę przed patogenami i promocję wzrostu zwierząt. Inny szczep tego samego rodzaju, Enterococcus faecalis CCTCC M2014488, wykorzystywany do zwalczania patogennych bakterii Escherichia coli, Salmonella, Pasteurella multocida, Listeria monocytogenes i Staphylococcus aureus, opisano w CN104774782. Szczep ten wyizolowano z 20-tygodniowych kurcząt. Wykazano, że cechuje się on opornością na kwasy i sole żółciowe. Może być przy tym wykorzystany jako system ekspresyjny do produkcji heterologicznych białek.

W opisie RU2246537 do zwalczania patogennych bakterii E. coli, Enterobacteria, Staphylococcus, Citrobacter i Aeromonas zastosowano szczep bakterii Bacillus subtilis VKM B-2287. Szczep ten wyizolowano z gleby i wykorzystano do konstrukcji komercyjnego preparatu o nazwie „Subtilis +”. Preparat ten reguluje skład mikroflory jelitowej drobiu i ryb i może być stosowany zarówno w celach leczniczych, jak i w profilaktyce.

W znanym rozwiązaniu MX2014012098 do niszczenia chorobotwórczych bakterii E. coli i Clostridium perfringens u drobiu, przeżuwaczy, cieląt, świń, koni i ryb wykorzystano probiotyczne szczepy z rodzaju Bacillus, a mianowicie B. majovensis DSM 25839, B. amyloliquefaciens DSM 25840, DSM 27032 i B. subtilis DSM 25841, a także ich mutanty. Bakterie te wprowadzano do paszy lub premiksów i podawano zwierzętom.

Inny preparat o podobnym antagonistycznym działaniu wobec enteropatogennych i enterotoksygennych E. coli zawierający szczep Lactobacillus casei ATCC PTA-3945. opisano w CA2520178. Podano, że może być on stosowany w żywieniu kurcząt, indyków, bażantów, przepiórek i papug, a także dla ssaków i ryb.

W rozwiązaniu znanym z opisu MX2014005754 opisano z kolei preparat probiotyczny dla kurcząt, indyków i kur niosek, zawierający szczep Lactobacillus LA51. Preparat ten hamuje rozwój C. coli, Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni i Salmonella typhimurium o 30%. Podawanie go ptakom w ilości 103-10¹⁰ jtk/ptaka dziennie zwiększa przyrosty masy ciała.

Kompozycję szczepów Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium longum, Bacillus subtilis i B. licheniformis przedstawioną w opisie CN101368165 zastosowano natomiast do przyspiesze nia wzrostu, redukcji zawartości ołowiu w tuszach drobiowych i wołowych oraz polepszenia strawności pasz.

W opisie WO2015160960 (A1) przedstawiono następny probiotyk dla drobiu. Jako aktywnym składnikiem były endospory 17 szczepów Bacillus o numerach akcesyjnych z kolekcji NRRL. Probiotyk ten podawano łącznie z enzymami z klasy hydrolaz i z nośnikiem.

Inny probiotyk, znany z opisu CN103636923, zawierający Bacillus coagulans dodawano do paszy w ilości 0,15% w celu polepszenia efektów żywieniowych kur niosek. Biomasę komórkową będącą podstawą tego probiotyku pozyskiwano przez hodowlę w podłożu stałym, w skład którego wchodziły otręby ryżowe, mąka sojowa i ekstrakt słodowy.

Do polepszenia efektów żywieniowych zwierząt hodowlanych zaproponowano też kompozycję bakterii Lactobacillus murinus DPC6002, L. pentosus DPC6004, L. salivarius DPC6005 i Pediococcus pentosaceus DPC6006. Jak podaje US8603461 kompozycja ta wprowadzana do paszy i podawana zwierzętom w ilości 3 x 10⁹ jtk/dobę ma działanie profilaktyczno-lecznicze.

Kolejny bioaktywny szczep Lactobacillus salivarius L2 (CCTCC M2014614) odkryty przez chińskich badaczy, został zastosowany do ochrony drobiu przed patogennym szczepem Escherichia coli (CN104789497). Ten probiotyczny szczep został wyizolowany z treści jelitowej zdrowej kury. Cecho

PL 233 899 B1 wał się on opornością na ekspozycję 3% soli żółciowych. W opisie KR20090057154 przedstawiono natomiast nowy szczep Lactobacillus salivarius CPM-7 (KACC 91332P), wyizolowany z kału kurcząt, wykazujący właściwości antagonistyczne w stosunku do Escherichia coli.

W rozwiązaniu ujawnionym w opisie CN104363769 (A) przeciwko biegunkom u drobiu, bydła, trzody i owiec zastosowano probiotyczny szczep Faecalibacterium prausnitzii.

Opisy bakterii probiotycznych działających antagonistycznie wobec bakterii Escherichia coli można znaleźć także w zgłoszeniach i patentach opublikowanych przez Urząd Patentowy RP. W opisie PL 209987 przedstawiono charakterystykę probiotycznego szczepu Lactobacillus casei ŁOCK 0915, zdeponowanego w Kolekcji Czystych Kultur Przemysłowych ŁOCK pod numerem ŁOCK 0915 oraz w Zakładzie Mikrobiologii Molekularnej Narodowego Instytutu Leków pod numerem depozytu 08/01/2012. Szczep ten wykazuje zdolność zwalczania patogennych E. coli, S. aureus, P. aeruginosa, E. faecalis, S. Enteritidis, S. Typhimurium, L. monocytogenes i C. jejuni. Z kolei w opisie PL 209986 (B1) scharakteryzowano inny szczep L. casei ŁOCK 0908, który wykazuje aktywność wobec E. coli i innych bakterii chorobotwórczych.

W opisie PL 207930 przedstawiono kompozycję szczepów bakterii probiotycznych z rodzaju Lactobacillus, Bifidobacterium i Enterococcus stosowanych w celu poprawy zdrowia psów i kotów, których jedną z podstawowych cech był antagonizm wobec patogennych bakterii E. coli.

Przykłady zwalczania chorobotwórczych E. coli i C. perfringens przez probiotyczne bakterie opisano także w literaturze naukowej.

Wśród bakterii patogennych największe zagrożenie dla drobiu i zdrowia ludzkiego stanowią Salmonella, Campylobacter jejuni i Clostridium perfringens (Humphrey i in. 2007, Van Immersed i in. 2004). Probiotyki mogą być używane do kontroli rozwoju w/w patogenów i tym samym do normalizacji składu mikroflory jelitowej. Wyniki wielu badań dowiodły, że probiotyczne szczepy Lactobacillus redukują liczbę chorobotwórczych bakterii, takich jak: Salmonella enteritidis, C. jejuni, Listeria monocytogenes, enteropatogenne E. coli, Yersinia enterocolitica i C. perfringens. W konsekwencji tego zmniejszają śmiertelność kilkudniowych brojlerów z powodu martwicy jelit (Schneitz i in. 2003). Ważnym czynnikiem wpływającym na skuteczność działania preparatów probiotycznych u drobiu jest sposób i czas ich podania. Wykazano, że probiotyki podawane za pośrednictwem paszy, w porównaniu do aplikowanych wraz wodą, działają lepiej i powodują większe przyrosty masy ciała (Timmerman i in. 2006).

W obszernej pracy Dahiya i in. (2006) omówiono współczesne strategie stosowane w kontroli enteritis wywołanych u brojlerów przez C. perfringens. Wśród zalecanych środków wymieniono probiotyki, prebiotyki, kwasy organiczne, enzymy, ekstrakty roślinne przeciwciała z jaj kurzych i bakteriofagi. Pod względem skuteczności działania na czoło wysuwają się probiotyczne bakterie z rodzaju Lactobacillus, Streptococcus, Enterococcus, Bacillus i drożdże z rodzaju Saccharomyces. Pozytywną rolę probiotyków w żywieniu brojlerów podkreślają też Huyghebaert i in. (2011). Najważniejsze aspekty stosowania probiotyków w przemyśle drobiarskim omówił Kabir (2009). Autor ten przedstawił szeroki przegląd literaturowy na temat probiotyków, kryteriów ich selekcji, mechanizmów działania i wykorzystania w żywieniu drobiu, a także omówił korzystny wpływ podawania probiotyków złożonych z bakterii fermentacji mlekowej na redukcję chorobotwórczych bakterii E. coli i C. perfringens .

W skład żadnego z opisanych w literaturze preparatów probiotycznych nie wchodzą jednak szczepy będące podstawą niniejszego zgłoszenia. Żaden z opisanych w literaturze probiotyków dla drobiu, nie wykazuje też takiej samej aktywności przeciwdrobnoustrojowej i właściwości fizykochemicznych jak opracowana przez nas kompozycja. W związku z tym żaden z dostępnych dotąd probiotyków nie działa w taki sam sposób.

Probiotyczne szczepy są pozyskane na drodze izolacji i wielokierunkowego skriningu w stosunku do wybranych gatunków/szczepów bakterii chorobotwórczych, w tym przypadku wobec chorobotwórczych szczepów Escherichia coli i Clostridium perfringens. Mimo oferty tego typu probiotyków na rynku ich skuteczność jest dyskusyjna. Przyczyną tego jest duża naturalna zmienność genetyczna bakterii chorobotwórczych i bakterii probiotycznych. Efekt antagonizmu między mikroorganizmami jest zależny od oporności bakterii patogennych na toksyczne dla niego metabolity wytwarzane przez bakterie probiotyczne. Wrażliwość ta jest zmienna. Ponadto po dłuższym stosowaniu probiotyków na danym terenie pojawiają się szczepy odporne na biobójcze czynniki wytwarzane przez dany probiotyk. Istnie tu pełna analogia do uodparniania się bakterii chorobotwórczych na antybiotyki. Występuje swego rodzaju wyścig biologiczny między patogenami a probiotykami. Oznacza to, że dla ochrony

PL 233 899 B1 zwierząt konieczne jest nieustanne poszukiwanie nowych szczepów bakterii probiotycznych wykazujących antagonistyczną aktywność wobec patogenów występujących aktualnie na danym terenie.

Dla pozyskania skutecznych szczepów bakterii probiotycznych konieczne jest prowadzenie skriningu bakterii probiotycznych wobec patogenów występujących w danym momencie na obszarze, na którym ma być przeprowadzana ochrona zwierząt przed tymi patogenami. Idąc za tym tokiem rozumowania przeprowadzono skrining bakterii fermentacji mlekowej wyizolowanych z ferm drobiu w kierunku ich zdolności do zwalczania chorobotwórczych szczepów bakterii Escherichia coli i Clostridium perfringens występujących na teranie Polski i nieoczekiwanie odkryto nowe szczepy bakterii fermentacji mlekowej zdolne do hamowania wzrostu i niszczenia tych patogenów.

Nowy szczep bakterii fermentacji mlekowej Enterococcus faecium eub1D o właściwościach probiotycznych według wynalazku, zdeponowany pod numerem PKM B/00094, charakteryzuje się sekwencją nukleotydową regionu DNA kodującego gen 16S rRNA wskazaną pod pozycją 1 wykazu sekwencji.

Nowy szczep bakterii fermentacji mlekowej Weissella paramesenteroides eub2D o właściwościach probiotycznych według wynalazku, zdeponowany pod numerem PKM B/00100, charakteryzuje się sekwencją nukleotydową regionu DNA kodującego gen 16S rRNA wskazaną pod pozycją 2 wykazu sekwencji nukleotydowych.

Nowy szczep bakterii fermentacji mlekowej Pediococcus acidilactici eub3D o właściwościach probiotycznych, zdeponowany pod numerem PKM B/00095, charakteryzuje się sekwencją nukleotydową regionu DNA kodującego gen 16S rRNA wskazaną pod pozycją 3 załączonego wykazu sekwencji.

Wymienione szczepy zostały zdeponowane w depozycie patentowym Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów we Wrocławiu.

Korzystnie izolacja bakterii polegała na pobraniu wymazów z dziobów kurcząt oraz próbek kału i ściółki, a następnie namnożeniu zawartych w nich bakterii w pożywce MRS, selektywnie wspomagającej wzrost bakterii fermentacji 30 mlekowej. Z otrzymanych hodowli izolowano następnie pojedyncze komórki, które dały początek kolekcji monokultur izolatów. Następnie przeprowadzono procedurę skriningową mającą na celu wyłonienie spośród pozyskanych izolatów tych, które wykazują zdolność niszczenia chorobotwórczych szczepów bakterii Escherichia coli i Clostridium perfringens.

Korzystnie szczepy chorobotwórczych E. coli i Clostridium perfringens wyizolowano z kału drobiu hodowanego na terenie Polski.

Procedura skriningu polegała na wysianiu chorobotwórczych szczepów bakterii E. coli i C. perfringens na odpowiednie dla nich pożywki umieszczone na płytkach Petriego, nałożeniu na nie komórek badanego izolatu bakteryjnego, wspólnej inkubacji a następnie pomiarze średnicy stref zahamowania wzrostu wokół punktu, na który nałożono komórki izolatu. Strefa przejaśnienia oznacza, że komórki badanego izolatu bakterii mlekowych wykazują działanie antagonistyczne wobec patogenu. Izolaty te traktowano jako bakterie potencjalnie probiotyczne, czyli takie, które mogą być zastosowane w ochronie zwierząt przed patogenami, wpływając korzystnie na dobrostan zwierząt. Kolejnym krokiem w badaniach była identyfikacja szczepów, które wykazały silne właściwości antagonistyczne wobec patogennych E. coli i C. perfringens. Korzystnie identyfikację przynależności gatunkowej izolatów oparto głównie na sekwencjonowaniu genu kodującego 16S rRNA izolatów.

Prebiotyk do zwalczania patogennych szczepów bakterii Escherichia coli u ptaków hodowlanych, zwłaszcza drobiu według wynalazku zawiera nowy szczep bakterii Weissella paramesenteroides eub2D. Jego postać aplikacyjna zawiera w jednym gramie co najmniej 106 jtk, korzystnie 109-10¹¹ jtk.

Kompozycja probiotyczna do zwalczania patogennych szczepów bakterii Clostridium perfringens u ptaków hodowlanych, zwłaszcza drobiu według wynalazku zawiera nowy szczep bakterii Enterococcus faeciumeub1D i/lub nowy szczep bakterii Weissella paramesenteroides eub2D i/lub nowy szczep bakterii Pediococcus acidilactici eub3D. Postać aplikacyjna kompozycji zawiera w jednym gramie co najmniej 10⁶ jtk, korzystnie 10⁹-10¹¹ jtk.

Kompozycja probiotyczna do zwalczania patogennych szczepów bakterii Escherichia coli i Clostridium perfringens u ptaków hodowlanych, zwłaszcza drobiu według wynalazku zawiera szczepy bakterii Weissella paramesenteroides eub2D i Enterococcus faecium eub1D i/lub Pediococcus acidilactici eub3D. Szczepy wchodzące w jej skład mogą być stosowne jako szczepy alternatywne, wymienialne w danej kompozycji w razie ataku wirusowego. Postać aplikacyjna kompozycji zawiera w jednym gramie co najmniej 10⁶ jtk, korzystnie 10⁹-10¹¹ jtk.

Zastosowanie kompozycji probiotycznej według wynalazku polega na produkcji preparatu probiotycznego, zawierającego nowe szczepy Weissella paramesenteroides eub2D i/lub Enterococcus

PL 233 899 B1 faecium eubID i/lub Pediococcus acidilactici eub3D i podawaniu go ptakom w celu ograniczania rozwoju chorobotwórczych szczepów bakterii Escherichia coli i Clostridium perfringens u ptaków hodowlanych, zwłaszcza drobiu. Kompozycja probiotyczna jest podawana ptakom doustnie lub doodbytniczo w ilości co najmniej 108-109 jtk/kg masy ciała zwierzęcia dziennie, korzystnie 108 jtk/kg masy ciała zwierzęcia dziennie. Korzystnie, kompozycja probiotyczna jest podawana ptakom doustnie razem z paszą i/lub z prefiksami i/lub z dodatkami paszowymi lub w formie specjalnych preparatów bakteryjnych.

Zastosowanie kompozycji do produkcji preparatu do dezynfekcji ciał ptaków i miejsca ich przebywania według wynalazku polega na dezynfekcji ciał ptaków i miejsca ich przebywania środkami zawierającymi w swoim składzie kompozycje i/lub ich metabolity. Metabolitami bakterii probiotycznych stosowanymi w celach dezynfekcji są bakteriocyny i/lub kwasy organiczne i/lub nadtlenek wodoru i/lub aldehyd octowy i/lub D-aminokwasy i/lub kwasy tłuszczowe i/lub cały płyn pohodowlany bakterii probiotycznych. Korzystnie, kompozycje i/lub metabolity są stosowane w formie zawiesiny komórkowej lub w formie utrwalonej.

Wśród korzystnych cech bakterii probiotycznych wymienia się:

a) oporność na niskie pH, gwarantująca przejście bakterii przez żołądek do dalszych odcinków przewodu pokarmowego,

b) oporność na sole żółciowe, gwarantująca przeżycie bakterii w obecności soków trzustkowych,

c) zdolność adhezji do ścian jelit, zwiększająca czas przebywania bakterii probiotycznych w przewodzie pokarmowych zwierząt.

Aby wykazać oporność na niskie pH zbadano ich przeżywalność w środowisku o pH 2,0. Wykazano, że 2 h inkubację w tych warunkach przeżyły szczepy Enterococcus faecium eub1D, Weissella paramesenteroides eub2D i Pediococcus acidilactici eub3D.

Następnie przeprowadzono test oporności na sole żółciowe, polegający na 4 h inkubacji pozyskanych szczepów w pożywce zawierającej 3% dodatek soli żółciowych. Korzystnie wykazano, że test ten pozytywnie przeszły szczepy Enterococcus faecium eub1D, Weissella paramesenteroides eub2D i Pediococcus acidilactici eub3D.

Zgodnie z wynalazkiem szczepy bakterii probiotycznych, wchodzące w skład kompozycji, mogą być namnażane w pożywkach ciekłych lub półstałych o składzie dostosowanym do wymogów pokarmowych kultur bakterii fermentacji mlekowej. Korzystnie w skład podłoża hodowlanego powinien wejść jeden z mono- lub disacharydów, organiczne źródło azotu zawierające aminokwasy i krótkie peptydy, witaminy i potrzebne sole mineralne. Przykładowo, odpowiednim podłożem do hodowli probiotycznych bakterii fermentacji mlekowej jest handlowa pożywka MRS (bulion DeMan-Rogosa-Sharpe), serwatka podpuszczkowa lub kwasowa, podłoże melasowe. W trakcie hodowli bakterii korzystne jest stabilizowanie pH pożywki do poziomu powyżej 5,0. Hodowlę bakterii wchodzących w skład kompozycji prowadzi się w warunkach beztlenowych lub względnie beztlenowych w temperaturze 30-37°C, korzystnie 35-37°C. Po zakończeniu hodowli korzystnie jest wydzielić komórki z ciekłego podłoża przez wirowanie lub mikrofiltrację i uzyskać w ten sposób koncentrat komórkowy, który następnie może być utrwalany przez zamrożenie lub wysuszenie. W przypadku hodowli bakterii w podłożu półstałym bakterie suszy się lub zamraża z całym podłożem.

Zgodnie z wynalazkiem, na podstawie wyników testów opracowano kompozycje probiotycznych szczepów bakterii fermentacji mlekowej, dobierając grupy drobnoustrojów pod kątem ich pochodzenia. Przykładowo, szczepy wyizolowane z odchodów kurcząt rzeźnych mogą stanowić środek do ochrony drobiu przed patogennymi szczepami E. coli i/lub C. perfringens. Korzystnie ochrona tych ptaków odnosi się szczególnie do patogennych szczepów E. coli i/lub C. perfringens występujących na terenie Polski.

Pozyskane szczepy bakterii probiotycznych mogą być wykorzystane jako samodzielne preparaty lub dodatki do pasz stosowanych w żywieniu kurcząt rzeźnych, indyków, bażantów, perliczek, strusi oraz innych ptaków hodowlanych, w tym ozdobnych, a także do dezynfekcji ich ciał i środowiska bytowania.

Przykłady zastosowania wynalazku

P r z y k ł a d 1. Izolacja i skrining na aktywność antagonistyczną

Z dziobów i skóry zdrowych kurcząt-brojlerów pobrano wymazy, natomiast ze ściółki próbki ich kału. Pobrany materiał zhomogenizowano, a następnie rozcieńczono metodą rozcieńczeń dziesiętnych i posiano na płytki Petriego, które zalano pożywką MRS-agar o składzie (g/l): agar 20,0 ekstrakt drożdżowy - 5,0, ekstrakt mięsny - 10,0, pepton K - 10,0, glukoza - 20,0 cytrynian amonu - 2,0, fosforan dwupotasowy - 2,0, octan sodu - 5,0, siarczan magnezu 0,1, siarczan manganu - 0,05. Płytki

PL 233 899 Β1 inkubowano w warunkach względnie beztlenowych w temperaturze 35-37°C przez co najmniej 48 godzin. Po inkubacji sterylną ezą pobrano pojedyncze kolonie i wprowadzono do ciekłej pożywki MRS umieszczonej w probówkach szczelnie zamykanych korkiem. Hodowle izolatów prowadzono w temperaturze 35-37°C przez 24h, a następnie wykonano z nich preparaty barwione metodą Grama. Monokultury oznaczono numerami pozwalającymi identyfikować je pod względem pochodzenia i zabezpieczano w ciekłym azocie. Utworzono w ten sposób bank izolatów bakterii fermentacji mlekowej naturalnie bytujących w przewodzie pokarmowym brojlerów.

Izolaty badano dalej w kierunku zdolności oddziaływania na patogenne szczepy bakterii E. coli i C. perfringens, które wyizolowano samodzielnie z ferm drobiu.

W testach stosowano pięć szczepów E. coli wyizolowanych z różnych regionów Polski. Na płytkach Petriego umieszczono podłoże - bulion wzbogacony z dodatkiem 2% glukozy i 1% agaru uprzednio zaszczepione chorobotwórczymi szczepami E. coli. Po jego zestaleniu wprowadzano na nie kolejno po 20pl zawiesiny badanych izolatów bakteryjnych. Aktywność każdego izolatu testowano wobec pięciu różnych szczepów E. coli.

Po 24 godzinach inkubacji w temperaturze 35-37°C dokonywano pomiaru średnicy stref przejaśnień wokół miejsc naniesienia zawiesiny izolatów. Na tej podstawie sporządzono ranking izolatów o antagonistycznej aktywności wobec testowanych szczepów. Aktywność w stosunku do wszystkim badanych szczepów Escherichia coli wykazał izolat Weissella paramesenteroides eub2D. Izolat ten wykorzystano do konstrukcji preparatu probiotycznego.

W analogiczny sposób wykonano test na antagonistyczną aktywność wyizolowanych szczepów wobec patogennych Clostridium perfringens. Do testu użyto siedmiu szczepów C. perfrinegns, pozyskanych z różnych regionów Polski. Każdy z izolatów bakterii fermentacji mlekowej testowano wobec wszystkich chorobotwórczych szczepów C. perfringens. Bakterie C. perfringens hodowano na płytkach Petriego w pożywce RCM-agar (Reinforced Clostridial Medium). W wyniku testu wykazano, że najsilniejszą aktywnością antagonistyczną w stosunku do wszystkich testowanych szczepów C. perfringens charakteryzowały się izolaty Enterococcus faecium eub1D, Weissella paramesenteroides eub2D i Pediococcus acidilactici eub3D.

Przykład 2. Identyfikacja izolatów

W wyniku hodowli wgłębnej izolatów wybranych w przykładzie 1, pozyskano biomasę komórkową, z której izolowano bakteryjne DNA. Następnie przeprowadzano sekwencjonowanie regionu DNA kodującego gen 16S rRNA. Otrzymaną sekwencję nukleotydową genu 16S rRNA porównano za pomocą programu BLASTN 2.2.27+ z sekwencjami dostępnymi w bazie National Center of Biotechnology Information (NCB1). Na podstawie analizy porównawczej sekwencji genów 16S rRNA izolatu określono przynależność gatunkową poszczególnych izolatów. Wyniki badań zamieszczono w tabeli 1

Tabela 1. Bakterie probiotyczne wykazujące aktywność przeciw 5 chorobotwórczym szczepom Escherichia coli i Clostridium perfringens

Numer izolatu	Pochodzenie izolatu	Przynależność gatunkowa na podstawie sekwencjonowania 16S rRNA	Homologia do wzorca gatunku, %	Numer akcesyjny w depozycie Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów we Wrocławiu
eublD	kał	Enterococcus faecium	99	B/00094
eub2D	kał	Weissella paramesenteroides	99	B/00100
eub3D	kał	Pediococcus acidilactici	98	B/00095

Sekwencja 16S rDNA szczepu Enterococcus faecium eub1D wskazana pod pozycją 1 wykazu sekwencji

Sekwencja 16S rDNA szczepu Weissella paramesenteroides eub2D wskazana pod pozycją 2 wykazu sekwencji

Sekwencja 16S rDNA szczepu Pediococcus acidilactici eub3D wskazana pod pozycją 3 wykazu sekwencji

PL 233 899 Β1

Przykład 3. Hodowla bakterii

Izolaty bakterii mlekowych wymienione w przykładzie 2 hodowano w ciekłej pożywce o składzie (g/l): ekstrakt drożdżowy - 5,0, ekstrakt mięsny - 8,0, pepton K - 5,0, glukoza - 10,0, cytrynian amonu - 2,0, fosforan dwupotasowy - 2,0, octan sodu - 5,0, siarczan magnezu 0,1, siarczan manganu - 0,05. Hodowle prowadzono metodą okresową w bioreaktorze laboratoryjnym o poj. 30 L. Pożywkę sterylizowano metodą mikrofiltracji membranowej, a następnie zaszczepiano 2% v/v inoculum o stężeniu komórek ok. 10⁹ jtk/ml. Hodowlę prowadzono w warunkach względnie beztlenowych w temperaturze 37°C, przy pH 6,0, z mieszaniem 100 obr/min. Po upływie 18 godzin hodowlę przerywano i oznaczano liczebność żywych komórek metodą klasycznych posiewów ilościowych. W opisanych warunkach uzyskiwano stężenie komórek powyżej 2 x 10⁹ jtk/ml.

Przykład 4. Oporność na niskie pH 5

Hodowle szczepów otrzymane w przykładzie 3 odwirowywano, przemywano dwu-krotnie solą fizjologiczną, a następnie zawieszano w 0,01 M buforze fosforanowym o pH 2,0. Stężenie wyjściowe komórek w zawiesinie doprowadzano do poziomu ok. 10⁷ jtk/ml. Tak przygotowaną zawiesinę inkubowano przez 2 godziny w temp. 37°C. Po inkubacji oznaczano liczebność żywych komórek w zawiesinie. Oznaczenia te wykonywano metodą posiewów ilościowych. Ustalono, że ekspozycję na niskie pH przeżywały wszystkie badane szczepy, na co wskazują wyniki badań zamieszczone w tabeli 2.

Tabela 2. Przeżywalność bakterii probiotycznych w środowisku o niskim pH

Badany szczep	Początkowa liczebność komórek w zawiesinie jtk/ml	Końcowa liczebność komórek w zawiesinie jtk/ml
Enterococcus faecium eublD	l,32xl07	1,02x1ο5
Weissella paramesenteroides eub2D	l,13xlO7	8,67xl04
Pediococcus acidilactici eub3D	1,08x107	Ι,ΙΟχΙΟ5

Przykład 5. Odporność na sole żółciowe

Zawiesiny komórek bakteryjnych otrzymanych w przykładzie 3 umieszczano w podłożu zawierającym 3% soli żółci i inkubowano przez 4 godziny. Jako kryterium oceny wytrzymałości na działanie soli żółciowych przyjęto wyniki oznaczenia liczebności komórek po ekspozycji. Wyniki te przedstawiono w tabeli 3.

Tabela 3. Przeżywalność bakterii probiotycznych w obecności soli żółciowych

Badany szczep	Początkowa liczebność komórek w zawiesinie jtk/ml	Końcowa liczebność komórek w zawiesinie jtk/ml
Enterococcus faecium eublD	2,51xl07	1,99x107
Weissella paramesenteroides cub2D	3,71xl07	2,00xl07
Pediococcus acidilactici eub3D	2,52x107	1,05x106

Przykład 6. Probiotyk o aktywności przeciw E. coli oraz eksperymenty na zwierzętach potwierdzające jego działanie profilaktyczne

Szczep Weissella paramesenteroides eub2D wykazujący aktywność przeciw patogennym E. coli hodowano w bioreaktorze w pożywce MRS, pozbawionej ekstraktu mięsnego. Hodowle prowadzono przez 22 godziny. Następnie płyn pohodowlany odwirowano w wirówce przy 5000 g przez 5 min. Uzyskaną gęstwę komórkową wymieszano z 5% dodatkiem odtłuszczonego mleka w proszku i 8% dodatkiem trehalozy, a następnie wysuszono w suszami rozpyłowej. W suszu określono liczebność komórek metodą płytkową. Niewielką próbkę wytworzonego preparatu przeznaczono na testy mające potwierdzić jego aktywność antagonistyczną wobec patogennych E. coli. W tym celu susz bakteryjny wprowadzono do pożywki MRS na 20 godzin celem ożywienia zawartych w nim komórek,

PL 233 899 B1 a następnie zaszczepiono nim pożywkę MRS w kolbach o poj. 300 ml. Hodowle prowadzono przez 18 godzin w temp. 37°C. Uzyskaną kulturę wykorzystano do przeprowadzenia testu na aktywność antagonistyczną wobec E. coli, który przeprowadzono jedną ze znanych metod dyfuzyjnych. Testy dyfuzyjne potwierdziły zdolność badanego szczepu do antagonistycznego działania na patogenne E. coli.

Pozostały przygotowany preparat wymieszano z paszą w ilości 100 g/tonę. Paszą tą skarmiano 3 grupy kurcząt rzeźnych rasy Ross 500, każda po 80 ptaków. Doświadczenie prowadzono przez okres 42 dni. Dzienna dawka bakterii probiotycznych podana kurczętom wynosiła 10⁹ jtk/kg paszy. Próbę kontrolną stanowiła grupa kurcząt, której podawano paszę bez dodatku probiotyków. Zwierzęta były hodowane w pomieszczeniach o niskich standardach higienicznych. Wykazano, że kurczęta należące do grupy skarmianej paszą z dodatkiem kompozycji probiotycznych nie miały biegunek, podczas gdy biegunki były obserwowane w grupie kontrolnej. Ponadto grupa kontrolna miała luźniejszy kał od grupy chronionej probiotykiem, a także obserwowano odparzenia łap u niektórych osobników .

Analogiczny test przeprowadzono z grupami indyków, strusi i gęsi, uzyskując podobne obserwacje, jak u kurcząt.

P r z y k ł a d 7. Kompozycje aktywne wobec Clostridium perfringens oraz eksperymenty na zwierzętach potwierdzające ich działanie profilaktyczne

Wykonano eksperymenty potwierdzające aktywność antybakteryjną kompozycji i ich działanie antagonistyczne wobec patogennych szczepów Clostridium perfringens. Eksperymenty zostały przeprowadzone w identyczny sposób jak w przykładzie 6. W badaniach stosowano następujące kompozycje probiotyków:

Kompozycja A: Enterococcus faecium eub1D + Weissella paramesenteroides eub2D (1:1) Kompozycja B: Weissella paramesenteroides eub2D + Pediococcus acidilactici eub3D (3:1) Kompozycja C: Enterococcus faecium eub1D + Weissella paramesenteroides eub2D + Pediococcus acidilactici eub3D (1:2:2)

Wyniki badań potwierdziły aktywność antagonistyczną kompozycji w stosunku do Clostridium perfringens, niezależnie od składu tych kompozycji, oraz ich aktywność ochronną w badanych grupach kurcząt.

Analogiczne eksperymenty przeprowadzono na grupach bażantów i perliczek hodowlanych, uzyskując potwierdzenie aktywności przeciwbakteryjnej kompozycji u tych grup ptaków.

P r z y k ł a d 8. Testy oceniające aktywność antagonistyczną i profilaktyczną kompozycji przeznaczonych do zwalczania patogennych E. coli i C. perfringens jednocześnie

Badania wykonano identycznie jak w przykładzie 6, stosując następujące kompozycje probiotyczne:

Kompozycja A: Enterococcus faecium eub1D + Weissella paramesenteroides 10 eub2D (1:2) Kompozycja B: Pediococcus acidilactici eub3D + Weissella paramesenteroides eub2D (1:5) Kompozycja C: Enterococcus faecium eub1D + Weissella paramesenteroides eub2D + Pediococcus acidilactici eub3D (1:5:2)

Wyniki badań potwierdziły aktywności antagonistyczną wszystkich kompozycji względem E. coli i C. perfringens oraz ich działanie ochronne w testach ze zwierzętami.

P r z y k ł a d 9. Dezynfekcja

Przeprowadzono hodowle bakterii probiotycznych Weissella paramesenteroides eub2D i Pediococcus acidilactici eub3D w oddzielnych bioreaktorach. Jako medium hodowlane stosowano pożywkę MRS zawierającą zwiększoną zawartość glukozy do 25 g/l. Hodowle prowadzono w warunkach beztlenowych w temperaturze 30°C przez 20 godzin. Po tym czasie płyn pohodowlany odwirowano w celu usunięcia komórek i zatężano metodą ultrafiltracji membranowej, a następnie przeniesiono go do zbiornika aplikatora aparatu do dezynfekcji i spryskano nim powierzchnie posadzki w kurniku. Preparat stosowano w ilości 20 ml/m² i pozostawiano na dezynfekowanych powierzchniach przez 5 minut. Dla porównania część posadzki nie dezynfekowano. Następnie pobrano wymazy z powierzchni dezynfekowanych i kontrolnych i oznaczono na nich pozostałych liczbę żywych komórek Escherichia oraz Clostridium, postępując zgodnie z normą PN-EN 13697. Stwierdzono, że w stosunku do powierzchni niedezynfekowanej liczebności żywych komórek bakterii Escherichia zmniejszyła się o co najmniej 105, a Clostridium o ponad 106.

PL 233 899 B1

Literatura

Humphrey T., O’Brien S., Madsen M.: Campylobacters as zoonotic pathogens: a food production perspective. Int. J. Food Microbiol. 2007, 117, 237-257.

Van Immerseel F., De Buck J., Pasmans F., Huyghebaert G., Haesebrouck F., Ducatelle R.: Clostridium perfringens in poultry: an emerging threat for animal and public health. Avian Pathol. 2004, 33, 537-549.

Schneitz C.: Competitive exclusion in poultry - 30 years of research. Food Control. 2005, 16, 657-667. Timmerman H.M., Veldman A., van den Elsen E., Rombouts F.M., Beynen A.C.: Mortality and growth performance of broilers given drinking water supplemented with chicken-specific probiotics. Poultry Sci. 2006, 85, 1383-1388.

Dahiya JP, Wilkie DC, van Kessel AG, Drew MD.: Potential strategies for controlling necrotic enteritis in broiler chicken in post-antibiotic era. Animal Feed Sci. Technol. 129, 60-88, 2006.

Huyghebaert G., Ducatelle R., van Immerseel F.: An update on alternatives to antimicrobial growth promotors for broilers. The Veterinary J., 187, 182-188, 2011.

Kabir SML: The role of probiotics in the poultry industry. Int. J. Mol. Sci. 10, 3531-3546, 2009.

PL 233 899 Β1

Wykaz sekwencji nukleotydowych <110> Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu

Przyrodniczy, Uniwersytet <120> Nowe szczepy bakterii probiotycznych do zwalczania Escherichia coli i Clostridium perfringens u ptaków hodowlanych, zwłaszcza u drobiu, kompozycje szczepów bakterii probiotycznych i ich zastosowania.

<130> P.416205 <160> 3 <170> Patentln yersion 3.5 <210> 1 <211> 1414 <212> DNA <213> Enterococcus faecium <220>

<221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <220>

<221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> n is a, c, g, or t

PL 233 899 Β1 <220>

<221> misc_feature <222> (37)..(37) <223> n is a, c, g, or t <220 <221> misc_feature <222> (42)..(42) <223> n is a, c, g, or t <220>

<221> misc_fcaturc <222> (60)..(60) <223> n is a, c, g, or t <220>

<221> misc_feature <222> (67)..(67) <223> n is a, c, g, or t <220>

<221> misc_feature <222> (70)..(70) <223> n is a, c, g, or t <220>

<221> misc_feature <222> (72)..(72) <223> n is a, c, g, or t

PL 233 899 Β1 <220>

<221 > misc_feature <222> (74)..(74) <223> n is a, c, g, or t <220>

<221> misc_fcaturc <222> (77)..(77) <223> n is a, c, g, or t <220>

<221> misc_fcaturc <222> (96)..(96) <223> n is a, c, g, or l <220>

<221> misc_feature <222> (100)..(100) <223> n is a, c, g, or t <220>

<221> misc_feature <222> (114)..(114) <223> n is a, c, g, or t <220>

<221> misc_feature <222> (122)..(122) <223> n is a, c, g, or t <220>

PL 233 899 Β1 <221> misc_feature <222> (124)..(124) <223> n is a, c, g, or t <220>

<221> misę.fcaiurc <222> (134)..(134) <223> n is a, c, g, or t <220>

<221> misc_fcaturc <222> (138)..(138) <223> n is a, c, g, or t <220>

<221> misc_feature <222> (143)..(143) <223> n is a, c, g, or t <220>

<221> misc_feature <222> (145)..(145) <223> n is a, c, g, or t <220>

<221> misc_feature <222> (152)..(152) <223> n is a, c, g, or t <220>

<221> misc_feature

PL 233 899 Β1 <222> (154)..(154) <223> n is a, c, g, or t <220>

<221> misc_feature <222> (165)..(165) <223> n is a, c, g, or t <220>

<221> misc_feature <222> (172)..(172) <223> n is a, c, g, or t <220>

<221> misc_feature <222> (174)..(174) <223> n is a, c, g, or t <220>

<221> misc_feature <222> (177)..(177) <223> n is a, c, g, or t <220>

<221> misc_fcaturc <222> (184)..(184) <223> n is a, c, g, or t <220>

<221> misc_feature <222> (191)..(191)

PL 233 899 Β1 <223> n is a, c, g, or t <220>

<221> miscfeature <222> (196)..(196) <223> n is a, c, g, or t <220>

<221> misc feature <222> (201)..(201) <223> n is a, c, g, or t <220>

<221> misC-fealure <222> (209)..(209) <223> n is a, c, g, or i <220>

<221> misc_fcaturc <222> (211)..(211) <223> n is a, c, g, or ( <220>

<221> misc_feature <222> (220)..(220) <223> n is a, c, g, or t <220>

<221> misc feature <222> (1287)..(1287) <223> n is a, c, g, or t

PL 233 899 Β1 <400> sekwencja 1 taggcggctg gctccaaagg ntacctcacc ganttcnggt gntacaaact ctcgtggtgn 60 gacgggnggn gngnacnagg gccgggaacg tattcnccgn ggcgtggtga tccncgatta 120 cnancgattc cggnttcntg gangngaatt gnancctgga atccnaactg ananaanctt 180 taanaaatta ncttancctc ncgacttcnc nactcgttgn acttcccatt ggagcacgtg 240 ggtagcccag gtcataaggg gatgatgatt tgacgtcatc cccaccttcc tccggttgtc 300 accggcagtc ttgctagagt gccaactgaa tgatggcaac taaaataagg gttgcgctcg 360 ttgcgggact taacccaaca tctcacgaca cgagctgacg acaaccatgc accacctgtc 420 actttgcccc cgaaggggaa gctctatctc tagagtggtc aaaggatgtc aagacctggt 480 aaggttcttc gcgttgcttc gaattaaacc acatgctcca ccgcttgtgc gggcccccgt 540 caattccttt gagtttcaac cttgcggtcg tactccccca ggcggagtgc ttaatgcgtt 600 agctgcagca ctgaagggcg gaaaccctcc aacacttagc actcatcgtt tacggcgtgg 660 actaccaggg tatctaatcc tgtttgctcc ccacgctttc gagcctcagc gtcagttaca 720 gaccagagag ccgccttcgc cactggtgtt cctccatata tctacgcatt tcaccgctac 780 acatggaaat tccactctcc tcttctgcac tcaagtctcc cagtttccaa tgaccctccc 840 cggttgagcc gggggctttc acatcagact taagaaaccg cctgcgctcg ctttacgccc 900

PL 233 899 Β1 aataaatccg gacaacgctt gccacctacg tattaccgcg gctgctggca cgtagttagc 960 cgtggctttc tggttagata ccgtcaaggg atgaacagtt actctcatcc ttgttcttct 1020 ctaacaacag agttttacga tccgaaaacc ttcttcactc acgcggcgtt gctcggtcag 1080 actttcgtcc attgccgaag attccctact gctgcctccc gtaggagttt gggccgtgtc 1140 tcagtcccaa tgtggccgat caccctctca ggtcggctat gcatcgtggc cttggtgagc 1200 cgttacctca ccaactagct aatgcaccgc gggtccatcc atcagcgaca cccgaaagcg 1260 cctttcaaat caaaaccatg cggtttngat tgttatacgg tattagcacc tgtttccaag 1320 tgttatcccc ttctgatggg caggttaccc acgtgttact cacccgttcg ccactcctct 1380 ttttccggtg gagcaagctc cggtggaaaa agaa 1414 <210> 2 <211> 1438 <212> DNA <213> Wcissella paramcscnteroidcs <220>

<221> misc_feature <222> (50)..(50) <223> n is a, c, g, or t

PL 233 899 Β1 <400> sekwencja 2 tgcagtcgaa cgctttagtc tttaattgat ctgacgagct tgctctgatn tgattttatc 60 tgacaaagag tggcgaacgg gtgagtaaca cgtgggtaac ctacctctta gcaggggata 120 acatttggaa acaagtgcta ataccgtata ataccaacaa ccgcatggtt gttggttgaa 180 agatggttct gctatcacta agagatggac ccgcggtgca ttagctagtt ggtaaggtaa 240 cggcttacca aggcaatgat gcatagccga gttgagagac tgatcggcca caatgggact 300 gagacacggc ccatactcct acgggaggca gcagtaggga atcttccaca atgggcgcaa 360 gcctgatgga gcaacgccgc gtgtgtgatg aagggtttcg gctcgtaaaa cactgttata 420 agagaagaac ggcactgaga gtaactgttc agtgtgtgac ggtatcttac cagaaaggaa 480 cggctaaata cgtgccagca gccgcggtaa tacgtatgtt ccaagcgtta tccggattta 540 ttgggcgtaa agcgagcgca gacggttatt taagtctgaa gtgaaagccc tcagctcaac 600 tgaggaatgg ctltggaaac tggatgactt gagtgcagla gaggaaagtg gaactccatg 660 tgtagcggtg aaatgcgtag atatatggaa gaacaccagt ggcgaaggcg gctttctgga 720 ctgtaactga cgttgaggct cgaaagtgtg ggtagcaaac aggattagat accctggtag 780 tecacaccgt aaacgatgag tgctagatgt tcgagggttt ccgcccttga gtgtcgcagc 840 taacgcatta agcactccgc ctggggagta cgaccgcaag gttgaaactc aaaggaattg 900

PL 233 899 Β1 acggggaccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt 960 accaggtctt gacatccctt gctaatccta gaaataggac gttcccttcg gggacaaggt 1020 gacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa 1080 cgagcgcaac ccttattatt agttgccagc attcagttgg gcactctagt gagactgccg 1140 gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc atgcccclta tgacctgggc 1200 tacacacgtg ctacaatggc atatacaacg agtcgccaac ccgcgagggl gcgctaatct 1260 cttaaagtat gtctcagttc ggattgtagg ctgcaactcg cctacatgaa gtcggaatcg 1320 ctagtaatcg cggatcagca cgccgcggtg aatacgttcc cgggtcttgt acacaccgcc 1380 cgtcacacca tgagagtttg taacacccaa agccggtggg gtaaccttgt aggagcca 1438 <210> 3 <211> 1446 <212> DNA <213> Pcdiococcus acidilactici <220>

<221> misc_feature <222> (212)..(212) <223> n is a, c, g, or t <220>

PL 233 899 Β1 <221> misc_feature <222> (1413)..(1413) <223> n is a, c, g, or t <220>

<221> misc_feature <222> (1416)..(1416) <223> n is a, c, g, or t <220>

<221> misc_fcaturc <222> (1418)..(1418) <223> n is a, c, g, or t <400> sekwencja 3 tagacggcta gctcctaaag gttaccccac cggctttggg tgttacaaac tctcatggtg 60 tgacgggcgg Lgtgtacaag gcccgggaac gtattcaccg cggcatgctg atccgcgalt 120 actagcgatt ccgacttcgt gtaggcgagt tgcagcctac agtccgaact gagaatggtt 180 ttaagagatt agctaaacct cgcggtttcg cnactcgttg taccatccat tgtagcacgt 240 gtgtagccca ggtcataagg ggcatgatga tttgacgtcg tccccacctt cctccggttt 300 gtcaccggca gtctcactag agtgcccaac tgaatgctgg caactagtaa taagggttgc 360 gctcgttgcg ggacttaacc caacatctca cgacacgagc tgacgacaac catgcaccac 420 ctgtcattct gtccccgaag ggaacgccta atctcttagg ttggcagaag atgtcaagac 480

PL 233 899 Β1 ctggtaaggt tcltcgcgta gcttcgaatt aaaccacatg ctccaccgct tgtgcgggcc 540 cccgtcaatt cttttgagtt tcaaccttgc ggtcgtactc ccccaggcgg attacttaat 600 gcgttagctg cagcactgaa gggcggaaac cctccaacac ttagtaatca tcgtttacgg 660 catggactac cagggtatct aatcctgttc gctacccatg ctttcgagcc tcagcgtcag 720 ttacagacca gacagccgcc ttcgccactg gtgttcttcc atatatctac gcatttcacc 780 gctacacatg gagttccact gtcctcttct gcactcaagt ctcccagttt ccaatgcact 840 tcttcggttg agccgaaggc tttcacatta gacttaaaag accgcctgcg ctcgctttac 900 gcccaataaa tccggataac gcttgccacc tacgtattac cgcggctgct ggcacgtagt 960 tagccgtggc tttctggtta aataccgtca ctgggtgaac agttactctc acccacgttc 1020 ttctttaaca acagagcttt acgagccgaa acccttcttc actcacgcgg cgttgctcca 1080 tcagacttgc gtccattgtg gaagattccc tactgctgcc tcccgtagga gtctgggccg 1140 tgtctcagtc ccaatgtggc cgattaccct ctcaggtcgg ctacgcatca tcgccttggt 1200 gagccgttac ctcaccaact agctaatgcg ccgcgggtcc atccagaagt gatagcagag 1260 ccatctttta aaagaaaacc aggcggtttt ctctgttata cggtattagc atctgtttcc 1320 aggtgttatc ccctgcttct gggcaggtta cccacgtgtt actcacccgt ccgccactca 1380 cttcgtgtla aaatctcatl cagtgcaagc acnlcntnat caaltaacgg aagttcgtcg 1440 actgca 1446

Claims (15)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Nowy szczep bakterii fermentacji mlekowej Enterococcus faecium eubID o właściwościach probiotycznych, zdeponowany pod numerem PKM B/00094, o sekwencji nukleotydowej regionu DNA kodującego gen 16S rRNA wskazanej pod pozycją 1 wykazu sekwencji.
2. 2. Nowy szczep bakterii fermentacji mlekowej o właściwościach probiotycznych Weissella paramesenteroides eub2D, zdeponowany pod numerem PKM B/00100, o sekwencji nukleotydowej regionu DNA kodującego gen 16S rRNA wskazanej pod pozycją 2 wykazu sekwencji.
3. 3. Nowy szczep bakterii fermentacji mlekowej o właściwościach probiotycznych Pediococcus acidilactici eub3D, zdeponowany pod numerem PKM B/00095, o sekwencji nukleotydowej regionu DNA kodującego gen 16S rRNA wskazanej pod pozycją 3 wykazu sekwencji.
4. 4. Prebiotyk do zwalczania patogennych szczepów bakterii Escherichia coli u ptaków hodowlanych, zwłaszcza drobiu, znamienny tym, że w jego skład wchodzi nowy szczep bakterii Weissella paramesenteroides eub2D jak określono w zastrz. 2.
5. 5. Prebiotyk według zastrz. 4, znamienny tym, że jego postać aplikacyjna zawiera w jednym gramie co najmniej 106 jtk, korzystnie 109-10¹¹ jtk.
6. 6. Kompozycja probiotyczna do zwalczania patogennych szczepów bakterii Clostridium perfringens u ptaków hodowlanych, zwłaszcza drobiu, znamienna tym, że zawiera nowy szczep bakterii Enterococcus faecium eub1D jak określono w zastrz. 1 i/lub nowy szczep bakterii Weissella paramesenteroides eub2D jak określono w zastrz. 2 i/lub nowy szczep bakterii Pediococcus acidilactici eub3 D jak określono w zastrz. 3.
7. 7. Kompozycja probiotyczna do zwalczania patogennych szczepów bakterii Escherichia coli i Clostridium perfringens u ptaków hodowlanych, zwłaszcza drobiu, znamienna tym, że zawiera szczepy bakterii Weissella paramesenteroides eub2D jak określono w zastrz. 2 i Enterococcus faecium eub1D jak określono w zastrz. 1 i/lub Pediococcus acidilactici eub3D jak określono w zastrz. 3.
8. 8. Kompozycja według zastrz. 7, znamienna tym, że szczepy wchodzące w jej skład mogą być stosowne jako szczepy alternatywne, wymienialne w danej kompozycji w razie ataku wirusowego.
9. 9. Kompozycja według zastrz. 7 albo 8, znamienna tym, że jej postać aplikacyjna zawiera w jednym gramie co najmniej 106 jtk, korzystnie 109-10¹¹ jtk.
10. 10. Zastosowanie kompozycji jak określono w zastrz. 6 albo 7 albo 8 albo 9 do produkcji preparatu probiotycznego w celu ograniczania rozwoju chorobotwórczych szczepów bakterii Escherichia coli i Clostridium perfringens u ptaków hodowlanych, zwłaszcza drobiu.
11. 11. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że kompozycja probiotyczna według zastrz. 6 albo 7 albo 8 albo 9 jest podawana ptakom doustnie lub doodbytniczo w ilości co najmniej 108-109 jtk/kg masy ciała zwierzęcia dziennie, korzystnie 108 jtk/kg masy ciała zwierzęcia dziennie.
12. 12. Zastosowanie według zastrz. 11, znamienne tym, że kompozycja probiotyczna według zastrz. 7 albo 8 albo 9 jest podawana ptakom doustnie razem z paszą i/lub z prefiksami i/lub z dodatkami paszowymi lub w formie specjalnych preparatów bakteryjnych.
13. 13. Zastosowanie kompozycji jak określono w zastrz. 7 albo 8 albo 9 do produkcji preparatu do dezynfekcji ciał ptaków i miejsca ich przebywania, znamienne tym, że ciała ptaków i miejsca ich przebywania dezynfekuje się środkami zawierającymi w swoim składzie kompozycje według zastrz. 6 albo 7 albo 8 albo 9 i/lub ich metabolity.
14. 14. Zastosowanie według zastrz. 13, znamienne tym, że metabolitami bakterii probiotycznych stosowanymi w celach dezynfekcji są bakteriocyny i/lub kwasy organiczne i/lub nadtlenek wodoru i/lub aldehyd octowy i/lub D-aminokwasy i/lub kwasy tłuszczowe i/lub cały płyn pohodowlany bakterii probiotycznych.
15. 15. Zastosowanie według zastrz. 13, znamienne tym, że kompozycje i/lub metabolity są stosowane w formie zawiesiny komórkowej lub w formie utrwalonej.