PL88977B1

PL88977B1 -

Info

Publication number: PL88977B1
Application number: PL1972153634A
Authority: PL
Priority date: 1971-02-25
Filing date: 1972-02-23
Publication date: 1976-10-30
Also published as: HU165526B; IL38693A; DK137863B; JPS5610032B1; ZA72622B; MY7700262A; AR193848A1; SE379053B; HK28077A; NL175196B; CA986047A; SU417925A3; AU3865672A; PH9416A; YU35621B; KE2716A; DE2209018A1; CH567572A5; JPS5592660A; JPS5749181B2

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowego antybiotyku, oznaczonego symbolem A-4696 oraz dopuszczalnych farmaceutycznie soli addycyjnych tego antybiotyku.Psucie sie zebów i choroby dziasel stanowia po¬ wazne problemy zdrowotne. Obserwacje wykazu¬ ja, ze kamien nazebny pochodzenia bakteryjnego jest przyczyna próchnicy zebów i ubytków okolo- zebowych lub tez obu tych zjawisk równoczesnie.Istnieje zapotrzebowanie na profilaktyczne przeciw¬ dzialanie osadzaniu sie kamienia -tego rodzaju, badz tez utrzymywania osadów ponizej poziomu, przy którym wystepuja reakcje toksyczne. Udoskonalo¬ no antybiotyki, inhibitujace wzrost mikroorganiz¬ mów osadotwórczych, lecz nadal istnieje zapotrze¬ bowanie na efektywniejsze srodki zapobiegajace i leczace choroby zebów i dziasel.Podstawowym zadaniem hodowli jest wydajniej¬ sza produkcja bialka zwierzecego dla celów spo¬ zywczych. Szereg dodatków paszowych, wsród nich liczne antybiotyki, efektywnie wplywa na przy¬ rost wagi kurczat i swin. Istnieje stale zapotrze¬ bowanie na ulepszone, bezpieczne i ekonomiczne dodatki paszowe, zwiekszajace przyrost wagi zwie¬ rzat i efektywnosc zywienia. Odkrycie nowych czynników, spelniajacych ten cel, stanowi rzeczy¬ wisty postep w dziedzinie hodowli zwierzat rzez¬ nych.Sposób wytwarzania nowego antybiotyku A-4696 oraz jego dopuszczalnych farmaceutycznie soli ad- dycyjnych polega na hodowaniu mikroorganizmu Actinoiplanes sp. szczep ATCC 23 342 w plynnej pozywce, zawierajacej zródla przyswajalnego wegla, azotu i soli nieorganicznych w warunkach tleno¬ wej fermentacji podpowierzchniowej, do czasu, az istotna czesc aktywnosci antybiotycznej przeniesie sie z hodowanego mikroorganizmu do pozywki, izolacji otrzymanego antybiotyku i ewentualnym przeksztalceniu go w dopuszczalna farmaceutycznie sól.Antybiotyk A-4696 izoluje sie z pozywki przez przesaczenie i oddzielenie na drodze adisorbcji na aktywowanym adsorbencie i elucji kwasnym roz¬ puszczalnikiem, a nastepnie w razie potrzeby prze¬ ksztalca sie w dopuszczalna farmaceutycznie sól.Szczególnie korzystne jest przeprowadzenie otrzy¬ manego antybiotyku A-4696 w chlorowodorek lub siarczan, w roztworze wodno-metanolowym i wy¬ tracenie dodatkiem acetonu krystalicznej soli, któ¬ ra odsacza sie.Antybiotyk A-4696 wykazuje czynnosc przeciw- bakteryjna i pobudzajaca wzrost.Nowy antybiotyk, otrzymany sposobem wedlug wynalazku, jest zwiazkiem zasadowym, tworzacym sole z odpowiednimi kwasami. Przedstawione po¬ nizej dane dotycza antybiotyku A-4696 w postaci chlorowodorku. Wyodrebnianie * i charakteryzowa¬ nie antybiotyku A-4696 w postaci chlorowodorku jest dogodne, aczkolwiek w znany sposób mozna 88 97788 977 3 wytwarzac równiez inne farmaceutycznie doplist- czalne sole tego antybiotyku.Chlorowodorek antybiotyku A-4696 jest bialym cialem krystalicznym o temperaturze topnienia po¬ wyzej 220°C. Jest rozpuszczalny w wodzie, a nie- rozpmswaalny w takich rozpuszczalnikach, jak me¬ tanol, aceton, eter, chloroform, pirydyna, benzen, weglowodory alifatyczne i podobne. Jest bardzo stabilny w roztworach o .wartosci pH w zakresie 1,0^10,0, w temperaturze do 27°C.Krzywa potencjometrycznego miareczkowania chlorowodorku antybiotyku A-46&6 w wodzie lufo mieszaninie dwumetyloformamidu z woda w sto¬ sunku 2:0. ma w zakresie wartosci pH^Gfi—13,0 ksztalt zblizony do prostej o nachyleniu okolo 0,14.Sklad elementarny chlorowodorku antybiotyku A-4696, obliczony jako przecietna wyników kilku mikroamaliz jest nastepujacy: C—51,33%, H—5,79%, N—5,46%, 0—30,96%, Cl—6,72%. Pozorny ciezar czasteczkowy, oznaczony metoda pomiaru cisnienia osmotycznego, wynosi 1158. Skrecalnosc wlasciwa chlorowodorku antybiotyku A-4696 [a]D25=—42,3 /c=l, H^O/. Widmo afbsorcji chlorowodorku anty¬ biotyku A-4696 w nadfiolecie wykazuje w roztwo¬ rach kwasnych i obojetnych pojedyncze maksi¬ mum przy 276mn i wspólczynnik ekstynkcji 1% E« =45. W roztworach zasadowych maksimum 1 cm absorcji przesuwa sie do 300 m\i, a wspólczynnik 1% ekstynkcji wynosi E1€m~61 Przedstawione na fig. 1 widmo w podczerwieni chlorowodorku anty¬ biotyku A-4696 w oleju mineralnym wykazuje w zakresie 2—15 maksima przy 3,0, 5,8, 5,9, 6,03, 6,15, «,28, 6,63, 6,85, 7,27, 7,75, S,l 8^5, 8,9, 9,4, 9,9 i ,1|ju Wartosci Rf chlorowodorku antybiotyku A-4696 w chromatografii na biibule Whattnana nr 1 zestawiono w tablicy 1. Chromatogramy wywoly¬ wano biologksiie stosujac jako szczep testowy BaciUus sufotUis.Tablica 1 Chromatografia bibulowa chlorowodorku antybio¬ tyku A-4696 1 Uklad chromatograficzny 1 2 3 4 6 7 8 \ 9 11 Wartosci Rf*/ 0,88 0,72 0,80 0,59 0,35 0,77 0,80 0,74 0,37 0,59 0,77 ] 40 45 50 55 60 V Stosunek drogi antybiotyku, liczonej od punktu naniesienia do odlegosci czola ukladu od tego punktu.Sklad chemiczny ukladów chromatograficznych: 1. Woda wysycona butanolem+1V* kwasu p-to- luenosulfonowego 2. Woda wysycona ketonem metytoteobutylo- wym+!l% kwasu p-toluenosulfonowego 3. Woda wysycona ketonem metyloizobutylo- wym+1% kwasu p-toluenosulfonowego+ l°/o pipe- rydyny 4. Woda: metanol: aceton /12:3*V, Roitwór do- prowadfcainy za pomoca NH4OH do wartosci pH=10,5, a nastepnie za ipomoca H^PO* do wartosci pH=7,5.. Metanol: 0,1 n HC1 /3:I/ 6. Roztwór ketonu metyioizobutylowego /l°/o/ i NH4OH /0,5°/o/ w wodzie 7. Roztwór chlorku sodowego fltht i 2,5% roz¬ twór ketonu metyloizobutylowego w wodzie. 8. 10% roztwór propanolu w wodzie 9. Butanol: etanol: woda /l50:15:18,5/ . Propanol: pirydyna: kwas octowy: woda /15:10:3:12/ 11. Woda: etanol: kwas octowy 770:24:6/ Nadajacymi sie do stosowania w farmacji solami addycyjnymi antybiotyku A-4696 sa sole z kwasami nieorganicznymi takimi , jak chlorowodorowy, bro- mowodorowy, siarkowy, fosforowy itp. oraz z kwa¬ sami organicznymi takimi, jak cytrynowy, winowy, maleinowy, p-toluenosulfonowy, salicylowy, fuma¬ rowy, octowy, propdonowy itp. Sole antybiotyku z kwasami mozna wytwarzac przykladowo przez za¬ kwaszenie odpowiednim kwasem antybiotyku w formie wolnej zasady i zadanie roztworu dziesie¬ ciokrotna objetoscia acetonu. W pewnych przy¬ padkach mozna wytwarzac sole w drodze wymiany jonów na kolumnie z odpowiednia zywica lub in¬ nymi sposobami, stosowanymi do wytwarzania soli antybiotyków.Nowy antybiotyk wytwarzany jest zgodnie ze sposobem wedlug wynalazku przez nowo odkryty szczep Actinoplaines, hodowany w odpowiedniej pozywce w warunkach tlenowych. Antybiotyk moina wyodrebniac i oczyszczac róznymi znanymi i stosowanymi sposobami. Stopien oczyszczenia antybiotyku moze byc nizszy w przypadku stoso¬ wania jako dodatku paszowego niz w przypadku stosowania do celów leczniczych.Miikrooirganazm, stosowany w procesie wedlug wynalazku do wytwarzania antybiotyku A-4696, zidentyfikowano jako szczep gatunku Actinoplanes rodziny Actinoplanaceae. Actinoplanaceae sa nowa rodzina mikroorganizmów, nalezaca do rzedu Actl- nomycetales, która po raz pierwszy opisal Dr John N. Oouch, Jour. Elisha Mitchell Sci. Coc, 65, 315—318 m&1 i 6«, 87—92 tt95Ó/, Trans. New York Acad. Sci., 1«, 3il5—MS /1954/, Jour, Elisha Mitchell Sci. Soc., 71, 148—155 i. 269 /1955/, Bergey*s Manual of Determinative Bacterioiogy, wydanie 7, 825—829 fl957/ oraz Jour. Elisha Mitchell Sci, Soc., 79, »-T0 /1983/.Szczep Actinopianes sp., stosowany do wytwarza¬ nia antybiotyku A-4698, zostal zlozony w Ameri¬ can Type Culture CoUection w Maryland i zare¬ jestrowany jako ATCC 23 342, i jest osiagalny bez ograniczen. Szczep ten zostal wyodrebniony z gleby88 977 w rejonie gór Cascade w stanie Waszyngton. W zbiorze dr Johna N. Coucha z Uniwersytetu Pól¬ nocnej Karoliny jest oznaczony numerem 581.Ponizej podano wlasnosci fizyczne i wlasnosci hodowlane. Actinoplanes sp. szczep ATCC 23 942: Nazwy barw podano wedlug systemu Ridgeway Color Standards and Nomenclature /1012/.Morfologia mikroskopowa i ogólna charakterysty¬ ka hodowlana Actinoplanes sp. ATCC 23 342.Mwrfoiogia makroskopowa. Skapa grzyfania na py*tu styrakowca Liquidaf»ber7 w wcdaie. Strzep¬ ki rozgalezione z przegrodami o sredmicy M—1,3 ja.Wypelniaja ziarna pylku, rozprzestrzeniajace sie w wodzie na odleglosc mniej wiecej rówoa srednicy ziarna. Sporangfofory rozprzestrzeniaja sie ponad powierzchnia wody. Trzonki sporangialne zwykle pojedyncze, czasami rozgalezione; na jednej spo- rangioforze dwa, rzadziej wieksza liczba zarodni.Trzonki o grubosci 1,0—1,5^ z przegrodami. Zawod¬ nie niewielkie srednicy 4—ililp* prawie kuliste, cza¬ sami kuliste, zwykle z nieregularna sciana. Doj¬ rzale zarodmiki ulozone na zarodni w jednym luib wiekszej liczbie niewyraznych zwojów. Pekniecie zarodni jest wywolane specznieniem substancji miedzyzarodnikowej, powodujacej powiekszenie za¬ rodni i przyjecie przez nia prawie gladkiego, ku¬ listego ksztaltu. Zarodniki ruchliwe srednicy 1,0— —1^, kuliste lub prawie kuliste.Charakterystyka hodowlana na agarze Czapeka /S. A. Waksmaa, The Actinamycetes, 1950/. Wzrost dobry, w ciagu g tygodni srednicy okolo 2 cm wo¬ kól punktowego posiewu. Czesc centralna wybrzu¬ szona, rozmaz splaszczony z nieznacznymi nierów¬ nosciami Grzybnia barwy oranzu cynkowego, agar bladoplowy do wyraznie zóltawego. Zarodnie rzad* ko formowane.Charakterystyka hodowlana na agarze Czapek'a z peptonem /5 g peptonu w miejsce 2 g NaNO*A Wzrost podobny do obserwowanego na agarze Czapek^, z wyrazniejszymi bruzdami grzbietami i raerównoeciami. Zarodnie nie formuja sie.Jak pocffzeonio wspomniano, antybiotyk A-4696 otrzymuje sie z hodowli Actinoplanes sp., szczep ATCC 23 342. Do hodowli stosuje sie rozne pozyw* ki, jednakze z-uwagi na koszt, wydajnosc i latwosc wyodrebniania antybiotyku stosowanie pewnych pozywek jest szczególnie korzystne. Takwiec, {przy¬ kladowo, jednym z korzystnych zródel weglowoda¬ nów jest skrobia, a korzystnym zródlem azotu majka sojowa. Odpowiednim zródlem weglowoda¬ nów jest równiez melasa, glukoza, dekstryna, gli¬ ceryna itp. Do odpowiednich zródel azotu naleza mieszaniny aminokwasów, peptony itp.Jako odzywcze sole nieorganiczne mozna stoso¬ wac sole handlowe, w sklad których wchodza jony sodowe, potasowe, amonowe, wapniowe, fosforano¬ we, chlorkowe, siarczanowe, octanowe, weglanowe itp.Dodatni wplyw na wyitwarzanie antybiotyku A- -489lft ma dodatek do pozywki zródel czynników wzrostu takich, jak rozpuszczalne odjpady gorzel¬ niane i wyciajg z drozdzy. Niezbednym'! skladnika¬ mi sa pierwiastki sladowe. Sa one zwykle zawarte w innych sklabMfcach ipozywek.Szczep, produkujacy antybiotyk A-4696, rozwija sie w stosunkowo szerokim zakresie wartosci pH, korzystne jest jednak doprowadzenie pozywka przed posiewem do wartosci pH^S—7A Podobnie, jak w przypadku hodowli innych Actinomycetes, war- tosc pH pozywki ulega stopniowej zmianie, docho¬ dzac pod koniec okresu fermentacji do 7,0—7,8.Warunkami korzystnymi dla wytwarzania anty¬ biotyku A-49W sa warunki podpowierzcbniowej hodowli taenowej. Male ilosci antybiotyku mozna wytwarzac w kolbach na trzajsarce; w celu wy¬ tworzenia doiych ilosci korzystne jest prowadzenie podpowerwnniowej hodowli w sterylnych tankach.Po-iywka w sterylnych tankach moze byc zaszcze¬ piona zawiesina zarodników luh grzybni, jednak % uwagi na dluzszy cza* rozwoju hodowli w przy¬ padku zawiesiny zarodników, korzystne, bo umoz¬ liwiajace efektywniejsze wykorzystanie urzadzen, jest zaszczepienia pozywki wegetatywna postacia kultury.Korzystne jest otrzymywanie posiewu wegetatyw¬ nego przez zaszczepienie malej ilosci pozywki za¬ rodnikami luib grzybnia mikroorganizmu i nasten- nie przeniesienie mlodego, aktywnego posiewu do duzego tanku. Do przygotowania posiewu mozna stosowac ta same pozywki,, co do fermentacji na duza skala. Mozliwe jest równiez stosowanie innych pozywek.Wytwarzajacy antybiotyk A~460f szczep Actino¬ planes *P.ATCC 2&S42 rozwija sie w temperaturze —40°C Na&nfcensywTueJste wytwarzanie antybio¬ tyku obserwuje sie w temperaturze okolo 34°C.W warunkach podpowierasbniowej hodowH tle¬ nowej przez pozywke przedmuchuje sie sterytoe powietrze, w ilosci 0,1—1,0 objetosci na jednostke. objetosciowa pozywki w ciagu minuty. Najwyzsza wydajnosc antybiotyku osiaga sie przy przedmu¬ chiwaniu w ciaga minuty 0,5 objetosci powietrza na jednostke objetosci pozywki.Narastanie stezenia antybiotyku A-4G96 w POZJTW- 40 ce mozna sledzic, okreslajac aktywnosc antybio- tyczna pobieranych próbek w stosunku do orga¬ nizmów testowych. Odpowiednim organizmem te¬ stowym jest Baeillus subtilis. Oznaczenia biolo- 45 giczne wyboouje sie standardowym sposobem tur-- bidymetryczn^m, metoda cylinderkowo-plytkowa lub metoda krazków bibuly na plytach z agarem.Zwykle maksymalne stezenie antybiotyku, zarów¬ no w kolbach na trzesarce, jak i w tankach wy- ^ stepuje po 4—6 dniach prowadzenia hodowli.Antybiotyk A-4696 mozna wyodrebniac z hodowli przez adsorpcje luib ekstrakcje. Korzystniejsze, bo pozwalajace uniknac operowania duzymi ttosciami rozpuszczalników, sa sposoby adsorpcyjne. 55 Po fermentacji aktywnosc sjotybiotyczna wykazu¬ je zarówno brzeczka* jak i grzybnia. Grzybnie, od¬ sacza sie, placek filtracyjny przemywa sie, woda, a nastepnie rozbija w wodzie o wartosci pH, do- - prowadzonej za pomoca NaOH do 10,5, intensyw- 60 nie miesza w ciagu 30 minut a ponownie odsacza.Polaczone przesacze i wode pluczaca przesacza sie przez zloze adsorbenta takiego, jak wegiel aktyw¬ ny,aktywowany kwasem tlenek glinu, zywica po¬ liamidowa, celuloza, zel krzemionkowy itp. lub do- 65 daje jednego z powyzszych adsorbentów do roz- 357 88 977 8 tworu, starannie miesza w ciagu 20-430 minut, a nastepnie odsacza. Surowy antybiotyk A-4696 od¬ zyskuje sie z adsorbenta na drodze elucji.Surowy antybiotyk A-4696 oczyszcza sie, prze¬ prowadzajac go w sól addycyjna z kwasem pikry- nowym, a te z kolei w chlorowodorek, lutb tez w drodze adsorpcji i elucji na odpowiednim adsor¬ bencie lub zywicy jonitowej. Odpowiednim do tego celu adsorbentem jest zywica poliamidowa IM.Woelm, Eschwege, RFN, kwasny tlenek glinu, obojetny tlenek glinu, zasadowy tlenek glinie zel krzemionkowy, Amberldte XAD-2 /Rohm and HAAS, Filadelfia/, Amberlite XAD-4 /Rohm and Haas, Filadelfia/, Dowex 50 /H+/ /Dow Chemical, Midland, (Michigan.Nowy antybiotyk, otrzymany sposobem wedlug Wynalazku, inhibituje wzrost wielu mikroorganiz¬ mów chorobotwórczych w stosunku do ludzi, zwie¬ rzat a roslin. W tablicy 2 zestawiono rm^nimalne stezenia chlorowodorku antybiotyku A-4696, inhi- bitujace wzrost przykladowych mikroorganizmów.Minimalne stezenia inhibitujace /MIC/ oznaczono sposobem rozcienczen na agarze /skrót ad/ lulb w bulionie /skrót bd/ i wyrazono w mlkrogramach na mililitr /^ig/ml/.W metodzie rozcienczen na agarze organizm te¬ stowy posiewa sie na plytkach z agarem, zawie¬ rajacym chlorowodorek antybiotyku A-4696 w róz¬ nych stezeniach. Plytki inkubuje sie w (temperatu¬ rze 37°C, w ciagu 48 godzin. Za MIC przyjmuje sie najnizsze stezenie antybiotyku, powodujaice za¬ hamowanie wzrostu szczepu testowego.W metodzie rozcienczen w bulionie organizmem testowym .posiewa sie serie probówek z bulionem, zawierajacym chlorowodorek, antybiotyku A-4696 w róznych stezeniach, a inkubacje prowadzi sie w temperaturze 37°C, w ciagu 24 godzin. Za MIC przyjmuje sie najnizsze stezenie antybiotyku, przy którym nie obserwuje sie wzrostu organizmu w probówce.Proteus sp.Pseudomonas sp.Salmonella sp.Vabrio metschnikovii Saccharomyces pastorianus Candida albicans d.c. tablicy 2 100 ad 1 100 ad XD0 ad 100 ad 100 ad 100 ad Tablica Organizm testowy 1 Staphylococcus aureus 3055 Bacillus subtilis Mycobacterium avium Streptococcus faecalis Trichophyton mentagrophytes Vibrio coli Mycoplasma gallisepticum Staphylococcus auTeus /odporny na penicyline/ Staphylococcus aureus /odporny na metycyline/ Diplococcus pneumoniae Clostridium perfringens Clostridaum -tetani Corynebacterium gravis Lactobacillus casei Leuconostoc citrovorum | Escherichia coli 2 Minimalne steze¬ nie inhibitujace 7[*g./ml/ it,5 ad 6,25 bd 0,78 ad 0,4 ad 3,12 ad 0,2 ad 12,5 bd 50,0 bd ,0 bd ,0 bd 3,12 bd 1,25 bd 2,5 bd 1,25 bd 100 ad 100 ad 100 ad 40 45 50 55 60 05 Chlorowodorek antybiotyku A-4696, wprowadao- ny podskórnie myszy, wykazuje aktywnosc in vivo w stosunku do szeregu organizmów chorobotwór¬ czych. Przykladowo ED50 /dawka dajaca 50% o- chrone zwierzat testowych/ przy dwukrotnej iniek¬ cji wynosi: w stosunku do Staphylococcus aureus 9,2 mg/kg, w stosunku do Streptococcus pyógenes 0,68 mg/kg i w stosunku do Diplococcus pneumo- nies 0,76 mg/kg.CNowy antybiotyk, otrzymany sposobem wedlug wynalazku, irówndez efektywnie inhibituje wzrost mikroorganizmów, przyczyniajacych sie do rozwoju chorób okolozebowych i psucia sie zebów. Na przy¬ klad roztwór chlorowodorku antybiotyku A-4696 wykazuje aktywnosc w stosunku do organizmów kamientiotwórczych w próbie, przeprowadzonej w nastepujacy Sposób: probówki z bulionem odzyw¬ czym, zawierajacym 5% sacharozy, zaszczepia sie mikroorganizmami próchnicotwórczymi. Do probó¬ wek wprowadza sie szklane paleczki i prowadzi sie inkubacje w temperaturze 37°C w ciagu nocy. Na powierzchni paleczek tworzy sde osad, skladajacy sie z komórek bakteryjnych i dekstranu. Paleczki przenosi sie do roztworów chlorowodorku antybio¬ tyku A-4696 o róznym stezeniu d pozostawia w nich w ciagu 5, 10 i 15 minut. Po uplywie zalozo¬ nego czasu paleczki przemywa sie sterylna, odmi- nert&izowana woda ii zanurza w niezaszczepionej pozywce zawierajacej sacharoze. Inkubacje prowa¬ dzi sie w temperaturze 37°C w ciagu nocy, a na¬ stepnie do kazdej pozywki dodaje blekitu bromo- tymolowego. Wzrost mikroorigatózmil obserwuje sie jako zmiane batrwy z nielbieakiej na zólta, wy¬ wolana zakwaszeniem pozywki przez rozwijajacy sie mikroorganizm. - Roztwór chlorowodorku antybiotyku A-4696 o stezeniu 0,01*/o okazal sie aktywny w stosunku do niezidentyfikowanego próchnicotwórczego szczepu Streptococcus sp., przy kontaktowaniu z nim po¬ krytej osadem paleczki w ciagu 10 minut. W przy¬ padku kontaktu, trwajacego 5 minut, wzrost mi¬ kroorganizmu byl inhibitowany przez roztwór 0,1%.Ponadto, roztwór chlorowodorku antybiotyku A-4696 inhibituje wzrost kamieniotwórczego mikroorga- nizmu Odontomyces viscosus, przy stezeniu 0,25 g/mlj oznaczonym sposobem rozcienczen w bulio¬ nie.Domieszka antybiotyku A-4696 lub jego soli ad-' dycyjnej do odpowiedniej pasty do zejbów, proszku, zelu itp., do odpowiedniego plynu do plukania lub innego srodka do dezynfekcji jamy ustnej moze byc skutecznym sposobem inhibitowania rozwoju próch¬ nicy zebów i choroby okolozebowej. Alternatyw¬ nie, roztwór antybiotyku A-4696 lub jego soli ad-88 977 9 dycyjnej mozna nanosic na powierzchnie dziasel i zebów za pomoca odpowiedniego tamponu.Antybiotyk A-4696 jest równiez efektywnym sffodM-em, pobudzajacym wzrósl; zwierzat. Chloro¬ wodorek antybiotyku A-4696, dodawany do podsta¬ wowej racji pokarmowej w ilosci 45,4 g/t, .powoduje zwiekszony przyrost wagi kurczat i zwiekszenie efektywnosci zywienia. W tablicy 3 przedstawiono dane, otrzymane w czterech odrebnych doswiad¬ czeniach, przeprowadzonych w celu okreslenia wplywu chlorowodorku antybiotyku A-4696 na wage kurczat. Próby przeprowadzono w hodowli, prowadzonej przy temperaturze okolo 25°C. Daw¬ kowanie antybiotyku rozpoczynano w poszczegól¬ nych próbach od pierwszego do piatego dnia zycia zwierzat. Czas dawkowania wyniósl 10—17 dni.Próby przeprowadzano przy calodobowym oswietle¬ niu i nieograniczonym zywieniu.Zbadano równiez wplyw dodatku chlorowodorku antybiotyku A-46916 do karmy odstawionych od matki prosiat. Przed rozpoczeciem doswiadczenia 4 do 5 tygodniowe prosieta utrzymywano w ciagu okolo tygodnia na diecie bez dodatku antybioty¬ ków. Prosieta wazono i dzielono na igrupy doswiad¬ czalne w zaleznosci od wagi i miotu. Trzymano je w zamknietych pomieszczeniach, odpowiednio o- grzewanych i wietrzonych dostarczajac im w ciagu calego doswiadczenia pozywienia i wody w nieo¬ graniczonych ilosciach. W kazdej próbie prosieta dzielono na dwie grupy, z których jedna otrzymy¬ wala podstawowa racje bez dodatku antybiotyków, a druga te sama podstawowa racje z dodatkiem chlorowodorku antybiotyku A-4696. W tablicy 4 przedstawiono sredni przyrost wagi i sprawnosc zywienia prosiat, karmionych karma z dodatkiem chlorowodorku antybiotyku A-4696 i zwierzat po¬ równawczych.Tablica 3 Przyrost wagi i sprawnosc zywienia przy karmieniu mlodych kurczat pasza z dodatkiem chlorowodorku antybiotyku A-4696 Racja zywieniowa 1 Racja podstawowa Racja podstawowa+chlorowodorek anty¬ biotyku A-4696 , tlacja podstawowa Racja podstawowa+chlorowodorek anty¬ biotyku A-4696 Eacja podstawowa Racja podstawowa+chlorowodorek anty- luptyku A-4696 Racja podstawowa Racja podstawowa+chlorowodorek anty- | biotyku A-4696 i Ilacja podstawowa Racja podstawowa+chlorowodorek anty- 1 biotyku A-4696 Chlorowo¬ dorek anty¬ biotyku A-4696 g/t paszy 0 45,4 0 45,4 0 45,4 0 45,4 0 45,4 Liczba dni zywienia 17 17 17 17 17 17 Liczba zywionych zwierzat 40 40 80 80 80 80 80 80 sredni przyrost wagi g/zwierze 147 146 146 153 295 320 300 318 287 307 Sprawnosc przemiany paszy waga paszy przyrost wagi zwierzecia 1,53 1,47 •' 1,50 1,45 1,56 1,46 1,51 1,43 1,58 1,47 1 Tablica 4 Przyrost wagi i sprawnosc zywienia przy karmieniu odstawionych od matki prosiat pasza z dodatkiem chlorowodorku antybiotyku A-4696 i Racja zywieniowa 1 Racja podstawowa Racja podstawowa+chlorowodorek anty¬ biotyku A-4696 Racja podstawowa Racja po dstawowaH-chlorowodorek anty- | biotyku A-4696 Chlorowo¬ dorek anty¬ biotyku A-4696 g/t 0 0 50 Liczba prosiat w doswiad¬ czeniu 11 11 11 11 Liczba dni doswiad¬ czenia 28 28 34 34 Sredni dzienny przyrost wagi/kg 0,31 0,43 0,50 0,55 Sprawnosc przemiany paszy waga paszy/ przyrost wagi zwierzecia 1,91 1,77 2,41 | 2,1788 977 il Toksycznosc chlorowodorku antybiotyku A-4096, oznaczona ha myszach przy wprowadzaniu do¬ otrzewnowym, wyrazona Jako IAo, wynosi 8400 mg/kg.Sposób wedlug wynalazku ilustruja ponizsze przy¬ klady: (Przyklad I. Grzybnia Actinoiplanes sp. ATCC 23342 szczepi sie skos agarowy o skladzie: gotowana maka owsiana 60 g drozdze 2£ g KtHP04 1,0 g suszone rozpuszczalne odpady gorzelniane 5,0 g roztwór soli mineralnych wedlug Czapek'a*/ 5,0 ml agar 25 g Zestaw soli mineralnych wedlug Czapek'a: KO 100g MgS04.7H/D 100 g FeS04. TH.& /rozpuszczony w 2 ml stezonegoHCl/ 2 % odmineralizowana woda 1 litr . Inkubacja prowadzi sie w temperaturze 30QC, w ciagu 6 dni. W pozywce o powyzszym skladzie hodowla zwykle nie zarodnikuje; w celu zwieksze¬ nia Beztoy potencjalnych centrów wzrostu konlieczne jest wiec znoaceorowanie grzybni splaszczona i za¬ ostrzona igla posiewowa. ZmaceroWiana grzyibnie zalewa sie destylowana woda i za pomoca sterylnej paileczki sporzadza z niej zawiesine.Otrzytrnana w opisany sposób zawiesine szczepi siie 100 ml sterylnej pozywki wegetatywnej o skla¬ dzie: glukoza 5,0 g dekstryna 20,0 g makasojowa 15,0 g wyciag z drozdzy 2,5 g weglanwapnia 1,0 g woda wodociagowa I litr Zaszczepiona pozywke Jnkubuje sie w tempera¬ turze S0°C, w ciagu 48 godzin na wstrzasarce obro¬ towe), obracanej z szybkoscia 250 obrotów na mi¬ nute.; Dziesiecioma mHilitrami inkubowanej .pozywki wegetatywnej szczepi sie 100 ml sterylnej pozywki o takim samym skladzie. Zaszczepiona pozywke inkubuje sie w temJperaturze 30°C, w ciagu 24 go¬ dzin na wstrzasarce obrotowej, obracanej z szyb- koscia 250 obrotów na minute. 0,4 ml tej ipozywki szczepd sie 100 ml pozywki produkcyjnej w kolbie Erlenmayera o pojemnosci 500 ml, sterylizowanej w temperaturze 120°C w ciagu 30 minut.Sklad pozywki produkcyjnej dekstroza 1,0% dekstryna 3,0% pepton 1,5% makasojowa 0,5% Mg$04.7H80 1,5% : melas z buraka cukrowego 1,5% wyciag z namoku kukurydzianego 0,5% betaina 0,1% K*HP04 0,05% odmineralizowana woda 25 ml Przed sterylizacja wartosc pH pozywki dopra¬ li wadza sie za pomoca 5n NaOH do 7,5. Po steryli¬ zacji wartosc pH wynosi okolo $,*.Fermentacje produkcyjna prowadza sie na trze- sarksch obrotowych, obracanych z szybkoscia 250 s obrotów na minute. Pod koniec cyklu fermenta¬ cyjnego -wartosc pH pozywki wynosi okolo 7,2. 25 litrów pozywki produkcyjnej o wyzej podanym skladzie, z dodatkiem srodka przeciwpiennego Dow Corning w ilosci 0,02% sterylizuje sie w autokla- wie w temperaturze 120°C, w ciagu 30 minut i wprowadza do tanku fermentacyjnego o pojemnosci 40 litrów. Fermentacje prowadzi sie w tempera* turze 30°C, w ciagu 4 dni. W czasie fermentacji przez pozywke przepuszcza sie steryine powietrze w ilosci okolo pól objetosci pozywki na minute.Wymieszanie powietrza z pozywka osiaga sie za pomoca mieszadla wirnikowego o odpowiedniej wielkosci, obracanego z odpowiednia szybkoscia.W trakcie fermentacji pH pozywki wzrasta z po- czatkowej wartosci okolo 6,9 do okolo 7,2.Calosc brzeczki z fermentacji antybiotyku A-4696, opisanej powyzej, przesacza sie z dodatkiem han¬ dlowego, pomocniczego materialu filtracyjnego. Pla¬ cek grzybni przemywa sie 32 litrami wody, a na- stepnie zawiesza w nastepnej porcji 32 litrów wo¬ dy i za pomoca 5n NaOH podnosi sie wartosc pH zawiesiny do 10,5. Zawiesine miesza' sie w ciagu -4$ minut i przesacza. Przesacz i popluczki laczy sie i za pomoca HaS04 doprowadza do wartosci pH=4, a nastepnie przepuszcza sie przez kolumne, wypelniona 1 kg aktywowanego wegla /Pittaburg, 12X40/. Kolumne przemywa sie woda do uzyska¬ nia bezbarwnego wycieku. Zaadsor.bowany na ko¬ lumnie antybiotyk A-4696 eluuje sie dwoma litra¬ mi 1% roztworu H2S04 w mieszaninie 1:1 acetonu z woda. Jony siarczanowe usuwa sie, zadajac eluat nasyconym roztworem Ba/OH/2 i odsaczajac wy¬ tracony BaS04. Przesacz, zawierajacy antybiotyk A-4696, odparowuje sie pod zmniejszonym cisnie¬ niem, otrzymujac okolo 80 g suche] pozostalosci.Okolo 80 g surowego antybiotyku A-4696 roz¬ puszcza sie w 5 litrach wody i zadaje 500 g akty¬ wowanego wegla /Darco G^6Q JUlas Chernipal, 45 Wilmington, Deli. Zawiesine miesza sie w ciagu godziny i przesacza. Przesacz odrzuca sie, a placek filtracyjny wegla z zaadsorbowaaiym antybiotykiem A-4696 przemywa kolejno 1 litrem wody i 1 litrem fr,0Sn wodnego roztworu HCl, odrzucajac przesacz. w Przemyty placek eluuje sie, mieszajac go w ciagu minut a 500 ml wo&no-acetonowego roztworu HCl /0.05n roztwór HCl: acetonu=7:4/. Mieszanine przesacza sie, zachowujac przesacz. W identyczny sposób powtarza sie elucje jeszcze czterokrotnie, w zachowujac przesacze. Piec porcji przesaczu, zawie¬ rajacych antybiotyk A-46&6, laczy sie ze soba, a nastepnie odparowuje sie do objetosci okolo 100 ml pod zmniejszonym cisnieniem i zadaje kolejno 200 ml metanolu i 2 litrami acetonu. Wytraca sie 60 surowy chlorowodorek antybiotyku A-469G, który po odsaczeniu i wysuszeniu wazy 60,9 g. g surowego chlorowodorku antybiotyku A-4G96 rozpuszcza sie w 20 ml wody. Roztwór przepusz¬ cza sie przez uprzednio przemyte woda zloze zy- ^ wicy poliamidowej /M. Woelm, Eschwege, NR/ w 4013 48 977 14 szklanej kolumnie o wymiarach okolo 7X60 cm.Kolumne przemywa sie woda z szybkoscia okolo dB—10 ml na minute, frakcje, wykazujace okreslona zwyklym sposobem aktywnosc aitybiotyozna, la¬ czy sie i odparowuje pod zmniejszonym cisnieniem.Pozostalosc rozpuszcza sie w mieszaninie 25 ml wody i 50 ml metanolu. Wodno-metanolowy roz¬ twór chlorowodorku antybiotyku A-4696 zakwasza sie 5n HO do wartosci pH=2,0, a nastepnie do¬ daje do niego okolo 1,5 litra acetonu. Wytracony chlorowodorek antybiotyku A-4696 odsacza sie.Pozostalosc na saczku rozpuszcza sie w jak naj¬ mniejszej ilosci wody. Do roztworu dodaje sie etanolu w objetosci dwukrotnie wiekszej od obje¬ tosci wody i calosc ogrzewa sie do temperatury okolo 60°C, a nastepnie ochladza, powodujac kry¬ stalizacje chlorowodorku antybiotyku A-4696. Kry¬ sztaly odsacza sie i suszy, otrzymujac okolo 9 g produktu.Przyklad II, 2,3 g surowego antybiotyku A-4696, otrzymanego w sposób, opisany w przy¬ kladzie I, rozpuszcza sie w 20 ml 50°/t roztworu wodnego metanolu i przepuszcza przez kolumne o wymiarach 2X4 cm, wypelniona plukanym kwa¬ sem tlenkiem glinu /Alcoa/, po czym kolumne prze¬ mywa sie natychmiast metanolem. Antybiotyk eluuje sie z kolumny 50*/t metanolem, zbierajac frakcje, wykazujace aktywnosc biologiczna. Pola¬ czone frakcje zateza sie do objetosci okolo 100 ml i dodatkiem acetonu wytraca sie z nich antybiotyk A-4696. Osad odsacza sie i suszy pod zmniejszonym cisnieniem, otrzymujac okolo 930 g czystego, kry¬ stalicznego antybiotyku A-4696.Plukany kwasem tlenek glinu przygotowuje sie w nastepujacy sposób: aktywowany tlenek glinu Alcoa F—20 mieszai sie w ciagu 6 godzin w wodzie, zakwaszonej H4SO4 do wartosci pH=3, utrzymujac wartosc pH na tym poziomie. Nastepnie tlenek gli¬ nu odsacza sie, przemywa 50°/t wodnym roztworem metanolu i suszy w temperaturze 100°C.Przyklad III. 500 mg surowego antybioty¬ ku A-4696, otrzymanego w sposób, opisany w przy¬ kladzie I, rozpuszcza sie w 25 ml wody. Do roz¬ tworu dodaje sie, mieszajac 25 ml nasyconego roz¬ tworu wodnego kwasu pikrynowego. Calosc utrzy¬ muje sie w ciagu nocy w temperaturze 5°C, a na¬ stepnie wytracony osad odwirowuje eae i suszy.Tak otrzymany osad rozpuszcza sie w 25 ml me¬ tanolu, dodatkiem HC1 doprowadza sie wartosc pH roztworu do 1,5 i dodaje 500 ml eteru dwuetylo- wego, wytracajac chlorowodorek antybiotyku A-4696. Wytracony chlorowodorek odwirowuje sie, przemywa eterem dwuetylowym i suszy pod zmniej¬ szonym cisnieniem, otrzymujac okolo 306 mg bia¬ lego, krystalicznego produktu.Przyklad IV. 2g krystalicznego cHorowo- • dorku antybiotyku A-4696, otrzymanego w sposób, opisany w przykladzie I, rozpuszcza sie w 300 ml wody, za pomoca 5 NaOH doprowadza sie pH roz¬ tworu do wartosci 7,5 i dodaje sie 30 g wegla Darco G—60. Calosc miesza sie w ciagu 30 minut, przesacza z dodatkiem handlowego pomocniczego materialu filtracyjnego, a placek filtracyjny prze¬ mywa kolejno 300 ml wody i 30© ml 0,06 n HjSO* Antybiotyk wyplukuje sie z placka filtracyjnego, dodajac 500 ml mieszaniny o skladzie 70*/t 0,05 n H4SO4 i 3 30 minut i odsaczajac wegiel. Przesacz odparowuje sie do objetosci okolo 10 ml, dodaje okolo 20 ml metanolu i calosc wlewa do 600 ml Acetonu, co powoduje wytracenie siarczanu antybiotyku A-4696.Osad odsacza sie, przemywa acetonem i suszy pod zmniejszonym cisnieniem, otrzymujac 661 mg kry¬ stalicznego produktu barwy bialej. PL

Claims

Zastrzelenia patentowe 30 1. Sposób wytwarzania nowego antybiotyku 1. A-4696 oraz jego dopuszczalnych 'farmaceutycznie soli addycyjnych, znamienny tym, fe mikroorga¬ nizm Actinoplanes sp. szczep ATOC MM2 Hoduje sie w plynnej pozywce, zawierajacej zródla przy- 35 swajalnego wegla, azotu i soli nieorganicznych W warunkach tlenowej fermentacji podpowierzchnio- wej, do czasu, az istotna czesc aktywnosci antytoio- tycznej przeniesie sie z hodowanego mikroorganiz¬ mu do pozywki, izoluje sie otrzymany antybiotyk 40 i ewentualnie przeksztalca sie w dopuszczalna far¬ maceutycznie sól.
2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ie otrzymany antybiotyk izoluje sie z pozywki przez naniesienie i adsorbcje na adsorbencie, z którego *s antybiotyk eluuje sie roztworem kwasnym, adsor- buje sie go ponownie na zakwaszonym adsorben¬ cie chromatograficznym, a nastepnie eluuje sie go z tego adsorbenta.88 977 A-4696, 4000 3000 2500 2000 lOOF ' ' r _I L_ 1500 HOOBOO 1200 1100 1000950 S30 660 i i 1 r j L \ L 7^0 7ZjQ 650 10 II 13 14 15 FIG. I Bltk 825/77 r. 105 egz. A4 Cena 10 zl PL