DK172545B1 - Antibiotiske glycopeptider og fremgangsmåde til deres fremstilling - Google Patents
Antibiotiske glycopeptider og fremgangsmåde til deres fremstilling Download PDFInfo
- Publication number
- DK172545B1 DK172545B1 DK198700395A DK39587A DK172545B1 DK 172545 B1 DK172545 B1 DK 172545B1 DK 198700395 A DK198700395 A DK 198700395A DK 39587 A DK39587 A DK 39587A DK 172545 B1 DK172545 B1 DK 172545B1
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- water
- liters
- nocardia
- antibiotic
- nutrient medium
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K9/00—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K9/006—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof the peptide sequence being part of a ring structure
- C07K9/008—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof the peptide sequence being part of a ring structure directly attached to a hetero atom of the saccharide radical, e.g. actaplanin, avoparcin, ristomycin, vancomycin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/365—Nocardia
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
DK PR 172545 B1 i
Den foreliggende opfindelse angår antibiotiske glycopeptider med følgende formel (I)
R
5 CH °
t o © jlJL
io CCC0
VyV s. V
Jii OH I CHj
HO OH
15 hvori R er
CH3 OH
IByl/Η,ΟΗ 20 hvor X er NH2> og Y er CH^, eller X er OH, og Y er H og farmaceutisk acceptable salte deraf. Opfindelsen angår endvidere en fremgangsmåde til fremstilling af disse peptider.
25 Da en mængde antibiotika har fundet generel anvendelse, er frem komsten af mikroorganismer, der er resistente over for mange antibiotikumtyper, specielt methicillin-resistente mikroorganismer, med tiden blevet til et alvorligt problem. Den methicillin-resistente mikroorganisme er resistent, ikke blot over for methlcilUn, men også over for 30 næsten alle antibiotika, såsom amlnoglycosider, tetracycliner, cephalo-sporiner, cephamyciner, penemer, carbapenemer og macrolider.
Det har vist sig, at glycopeptider, især vancomyciner, viser kraftig aktivitet over for disse methicillin-resistente mikroorganismer (Antimicrobial Agents and Chemotherapy 28, 660-662 (1985). Vancomycin er et 35 velkendt antibiotikum (japansk patentskrift nr. 33-8450) og nye analoge deraf er opdaget (Antimicrobial Agents and Chemotherapy 28, 660-662 (1985), The Journal of Antibiotics 37, 446-453 (1984), 38, 1-8 (1985),
38, 51-57 (1085), japansk offentliggørelsesskrift nr. 60-39623, 60-199397, 60-231698, 60-237099 etc.) Antibiotika PA-42867-A og PA-42867-B
DK PR 172545 B1 2 ifølge den foreliggende opfindelse er hidtil ukendte vancomydnantibiotika med strukturer, der er forskellige fra de ovennævnte forbindelsers strukturer.
Det i dag tilgængelige vancomycin, som har lav renhed, er anvendt 5 som oralt administrerbart præparat og er vanskeligt at anvende som i nj i -cerbart præparat. Det har følgelig været et ønske at tilvejebringe et antibiotikum med kraftigere aktivitet over for methicillin-resistente mikroorganismer end konventionelle vancomyciner.
Den antibiotiske forbindelse med formel (I), hvor R er 10
CH3 OH
Η^λ, ΗΟ^ΧΧΗ,ΟΗ ίλν 15 hvori X er NHg, og Y er CH^, betegnes PA-42867-A. Den antibiotiske forbindelse med formel (I), hvori R er
CH3 OH
20 hvori X er OH og Y er H, betegnes PA-42867-B.
25 PA-42867-A og PA-42867-B fremstilles ved at fermentere en PA-42867- producerende organisme, der hører til slægten Nocardia, i et dyrkningsmedium og opsamle PA-42867-A og/eller PA-42867-B fra det fermenterede dyrkningsmedium. Disse forbindelser har hidtil ukendt struktur og udviser fortrinlig antibakterlel aktivitet over for grampositive mikroorga-30 nismer, især methicillin-resistent Staphylococcus aureus in vitro og in vivo.
Fig. 1, 2, 3 og 4 viser henholdsvis IR-spektrum, massespektrum, *Η- NMR-spektrum og ^3C-NMR-spektrum af PA-42867-A. Fig - 5, 6, 7 og 8 viser 1 13 henholdsvis IR-spektrum, massespektrum, H-NMR-spektrum og C-NMR-35 spektrum af PA-42867-B.
Det har overraskende vist sig, at en stamme af slægten Nocardia frembringer forbindelserne med formel (II) DK PR 172545 B1 3 CH3 OH CH3 ί* h2n^-^ I o h i o H i < H Λ 0 H k 0 otl HOOC1 Π æ T ^»3 f'VV ^ hcA^S)h0H i ch3 15 hvori X er NH^, og Y er CH3, eller X er OH, og Y er H, hvilke forbindelser udviser kraftig aktivitet over for methicilUn-resistente mikroorganismer. Forbindelsen med formel (II), hvori X er NH^, og Y er CH^, be-20 tegnedes PA-42867-A, og forbindelsen med formel (II), hvori X er OH, og Y er H, betegnedes PA-42867-B. Den foreliggende opfindelse omfatter ikke blot de to ovennævnte forbindelser, men også farmaceutisk acceptable salte deraf.
De fyslsk-kemiske egenskaber af forbindelserne PA-42867-A og PA-25 42867-B ifølge opfindelsen er vist nedenfor.
Fysisk-kemi ske egenskaber 30
1) PA-42867-A
UV-spektrum χ0,01Ν HClnm(El*);281,8 (41,15) max lem 35 λ0,01Ν NaOH,aqn|J){El% j. 302>6 (43>14) max lem
Specifik drejning DK PR 172545 B1 4 [α£Ζ-88,8±3,Γ (c=0,41 vand) IR-spektrum (se fig. 1) IR (KBr): 3396, 1654, 1588(skulder), 1505, 1420, 1396, 1223, 1131, 1064, lOlO(skulder) cm’*.
5 Massespektrum (se f1 g. 2) MS m/z: 1557 (M+H)+
Analyse for CjjHggOggNjgClO 1/2H20:
Beregnet (%): C 54,08; H 5,97; N 8,64; Cl 2,19 Fundet (%): C 54,03; H 6,14; N 8,60; Cl 2,19 10 NMR-spektrum *H-NMR: 400MHz i dg0MS0+l dråbe D20, intern standard TMS 100*C (se fig. 3) & ppm: 0,888 (d, 6,5, 3H); 0,917 (d, 6,0, 3H); 1,093 (d, 6,0, 3H); 1,156 (s, 3H); 1,167 (d, 6,2, 3H); 1,202 (s, 3H); ca. 1,425 (m, IH); ca.
15 1,525 (m, IH); 1,630 (dd, 13,6, 4,3, IH); 1,640 (dd, 13,6, 4,3, IH); 1,766 (m, IH); 1,866 (d lignende, 13,6, IH); 1,915 (d lignende, 13,6, IH); 2,175 (dd, 16,0, 7,5, IH), 2,315 (s, 3H); 2,560 (dd, 16,0, 5,0, IH); 2,892 (d, 9,5, IH); 2,947 (d, 9,6, IH); ca. 3,03 (skærmet af vand i opløsningsmiddel, IH), ca. 3,31 (m, 2H); 3,428 (t lignende, ca, 8,7, 20 IH); 3,540 (dd, 11,6, 4,8, IH), 3,609 (qd, 6,2, 9,5, IH); 3,688 (dd, 7.2, 8,7, IH); 3,730 (dd, 11,6, 2,1,IH); 4,141 (qd, 6,0, 9,6, IH); 4,233 (bred s-lignende, IH), 4,328 (dd, 5,0, 7,5, IH); 4,485 (s-lignende, IH); 4,516 (s, IH); 4,674 (d-l1gnende, ca. 4,3, IH); 4,699 (d, 4,0, IH); 5,152 (d-lignende, ca. 4,0, IH), 5,188 (bred s-Ugnende, IH); 5,190 (s 25 lignende, IH), 5,305 (d lignende, ca. 4,3, IH), 5,603 (d, 7,2, IH), 5,638 (bred s-lignende, IH), 5,762 (bred s lignende, IH), 6,375 (d, 2,3, IH), 6,388 (d, 2,3, IH), IH), 6,712 (d, 8,3, IH), 6,793 (dd, 8,3, 2,2, IH), 7,087 (dd, 8,5, 2,2, IH), 7,120 (dd, 8,3, 2,2, IH), 7,148 (d, 2,2, IH), 7,215 (d,8,4, IH), 7,286 (bred dd-lignende, ca. 8,3, ca. 2,0, IH); 30 7,327 (dd, 8,4, 2,0 IH), 7,586 (bred dd-lignende, ca. 8,5, ca. 2, IH), 7,863 (d, 2,0, IH).
13C-NMR: 50MHz, i 0,0, ekstern standard CH~CN, 1,7 ppm 60*C (se f«. 4).
8 ppm: 178,9, 177,8, 174,8, 172,1, 171,9, 171,7, 170,3, 167,8, 35 158,0, 156,3, 155,9, 155,85, 155,85, 153,85, 151, 138,8, 137, 136,85, 136,7, 134,9 133,9, 131, 130, 128,8, 128,4, 127,8, 127,1, 126,2, 124,6, 124.2, 123,9, 122,8, 119,4, 118,6, 107,4, 107,3, 104,9, 104, 102,3, 99.2, 94, 80,7, 77,5, 77,5, 76,9, 76,8, 75,2, 72,5, 70,4, 67,4, 67,2, 63,4, 63,4 61,7, 60,5, 59,9, 56,1, 55,5, 55,5, 54,9, 52,7, 42, 41,4, DK PR 172545 B1 5 39,85, 37,6, 34,9, 25,2, 23,3, 22,5, 20,6, 19,9, 18,4, 18,1.
Tyndtlagschromatografi:
Præcoated TLC-silicagelplade "Merck 60F254"
Udviklingsmiddel: chloroform: methanol: kone. ammoniakvand: 5 sec-butanol: vand (5:10:5:5:2)
Rf ** 0,28 HPLC ("Shimazu LC-6A")
Kolonne: "Chemco Pak Nucleosil 5C18", 0 4,6 x 150 mm (Chemco Scientific Co., Ltd.) 10 Detektion: UV 220 nm
Flowhastighed: 1 ml/min.
Mobil fase: 8% acetonitril - 0,05M phosphatpuffer (pH3,5)
Retentionstid: 8,8 min.
Mobil fase: 9% acetonitril - 0,05M phosphatpuffer (pH3,5) 15 Retentionstid: 5,6 min.
Farvereaktion: Ninhydrin positiv
Opløselighed: Opløseligt i vand og dimethyl sul foxid. Tungt opløseligt i alkohol. Uopløseligt i ether, benzen, chloroform og ethyl acetat 20 Udseende: amfotert, hvidt amorft pulver (2) PA-42867-B UV-spektrum λ0,01Ν HClnm(El% j.281>6 (44,22) 25 max lem X0,01N Na0H,aqn|n(El% 3Q1 (45>94) max lem
Specifik drejning 30 [aj2-97,313,3" (c-0,41, vand) IR-spektrum (se fig. 5) IR (KBr): 3360, 1656, 1587(skulder), 1505, 1421, 1393, 1230, 1129, 1062, 1013(skulder) cm'1.
Massespektrum (se fig. 6) 35 MS m/z: 1544 (M+H)+
Analyse for C72H86027NgCl· 1 1/2^0:
Beregnet (%): C 55,01; H 5,71; N 8,02; Cl 2,26 Fundet {%): C 54,83; H 5,81; N 8,46; Cl 2,13 NMR-spektrum DK PR 172545 B1 6 ^H-NMR: 400MHz i dg-DMSO+1 dråbe DgO, intern standard TMS, 100’C (se fig. 7).
δ ppm: 0,891 (d, 6,6, 3H); 0,919 (d, 6,5, 3H); 1,080 (d, 6,2, 3H), 1,159 (s, 3H), 1,173 (d, 6,0, 3H), ca. 1,428 (m, IH), 1,469 (m, IH), ca.
5 1,525 (m, IH), 1,647 (dd, 13,7, 4,4, IH), 1,767 (m, IH), 1,920 (d- lig nende, 13,7, IH), 2,042 (dd-lignende, ca. 13,0, ca. 5,3, IH), 2,182 (dd, 16,0, 7,5, IH), 2,314 (s, 3H), 2,565 (dd, 16,0, 4,8, IH), 2,817 (t-lig-nende, ca. 9,1, IH), 2,895 (d, 9,7, IH), ca. 3,03 (skærmet af vand i opløsningsmidlet, IH), ca. 3,33 (m, 2H), 3,497 (t lignende, ca. 8,5, IH), 10 3,547 (dd, 11,6, 4,9, IH), 3,636 (qd, 6,0, 9,7 IH), 3,668 (dd, 7,2, 8,5, IH), ca. 3,685 (m, IH), 3,733 (dd, 11,6, 2,3, IH), 4,092 (qd, 6,2, 9,3, IH), 4,234 (bred, d, ca. 1,5, IH), 4,330 (dd, 4,8, 7,5, IH), 4,489 is- lignende, IH), 4,516 (s, IH), 4,686 (d lignende, ca. 4,4, IH), 4,692 (d, 3,9, IH), 5,156 (d-lignende, ca. 3,9, IH), 5,192 (bred s-lignende, IH), 15 5,200 (s-lignende, IH), 5,334 (d-lignende, ca. 3,5, IH), 5,604 (d, 7,2, IH), 5,641 (bred s-lignende, IH), 5,771 (bred s lignende, IH), 6,388 (s-1ignende, 2H), 6,719 (d, 8,5, IH), 6,800 (dd, 8,5, 2,3, IH), 7,107 (dd, 8.4, 2,4, IH), 7,147 (d, 2,3, IH), 7,170 (dd, 8,4, 2,4, IH), 7,237 (d, 8.4, IH), 7,296 (bred dd, ca. 8,4, ca. 2,0, IH), 7,331 (dd, 8,4, 2,0, 20 IH), 7,590 (bred dd, 8,4, ca. 2,2, IH), 7,857 (d, 2,0, IH) 13C-NMR: 50 MHz i DgO, ekstern standard CH^CN 1,7 ppm, 60*C (se fig. 8) 6 ppm: 177,9, 177,8, 174,8, 172,2, 172,1, 171,7, 170,3, 167,8, 157,6, 156,1, 156, 155,8, 155,5, 153,9, 151,2, 139, 137, 136,7, 136,7, 25 135, 134,2, 131,4, 130,9, 128,8, 128,4, 127,9, 127,1, 126,4, 124,5, 124.3, 124,1, 122,6, 119,3, 118,6, 109,3, 107,2, 104,6, 104, 102,9, 99.3, 93,7, 79,4, 78,1, 77,9, 76,7, 76,1, 75,2, 72,5, 70,2, 69,6, 68,7, 67.3, 63,1, 63,1, 61,7, 60,4, 59,9, 57,1, 55,5, 55,5, 53, 41,5, 40,2, 39.3, 37,7, 34,1, 25,1 23,3, 22,5, 19,3, 18,3, 17,8.
30 Tyndtlagschromatografi:
Prscoated TLC-silicagelplade "Merck 60F254"
Udviklingsmiddel: chloroform: methanol: kone. ammoniakvand: sec-butanol: vand (5:10:5:5:2)
Rf - 0,22 35 HPLC ("Shimazu LC-6A")
Kolonne: "Nucleosil 5C18" 0 4,6 x 150 mm Detektion: UV 220 nm Flowhastighed: 1 ml/min.
Mobil fase: 9% acetonitril - 0,05M phosphatpuffer (pH 3,5) DK PR 172545 B1 7
Retentionstid: 9,4 min.
Mobil fase: 10% acetonitril - 0,05M phosphatpuffer (pH 3,5)
Retentionstid: 6,9 min.
Farvereaktion: Ninhydrin positiv 5 Opløselighed: Opløselig i vand og dimethyl sul foxid. Tungt opløselig i alkohol. Uopløselig i ether, benzen, chloroform og ethyl acetat Udseende: Amfotert, hvidt, amorft pulver
Af de ovenfor angivne fysiske-kemiske egenskaber udledes, at ΡΑΙΟ 42867-A og PA-42867-B har følgende konfiguration
OH
i CH, VA «*
^+·γ .M'S
s .
2° 5
""""naS) /V o o____^ o H
hooc^-u f η j j HH, CH* 011 25 hvori X er NH^ og Y er CH^, eller X er OH og Y er H.
PA-42867-A og PA-42867-B besidder de ovennævnte egenskaber, der er forskellige fra de konventionelle antiobiotiske glycopeptider, og betragtes derfor som hidtil ukendte antibiotika.
30 Stammen PA-42867, som er isoleret fra en bestemt jordprøve, er eksempel på en mikroorganisme, der frembringer PA-42867-A og PA-42867-B.
Taksologiske undersøgelser viser, at den må anses for at tilhøre Nocardia oriental is, og den deponeredes som Nocardia oriental i s PA-42867 (FERM BP-1230) ved Fermentation Research Institute Agency of the 35 Industrial Science & Technology i henhold til Budapest traktaten.
Stammen har følgende taksonomiske karakteristika.
(1) Morforlogiske karakteristika.
På g*r-maltagar, Tyrosinagar og Bennett's agarmedium dannes der rigeligt med luftmycelium og sporer af denne stamme. Der iagttages ingen DK PR 172545 B1 8 hvirvel dannelse. Luftmyceliet udvikler sig godt, og sporekæderne er lige eller bølgeformede. Sporeformen er lang cylindrisk og 0,3-0,5 x 1,2-1,7 pm i størrelse, og sporens overfladestruktur er glat under elektron-mi kroskopiobservation. Hverken sporehuse, flagellatsporer eller 5 sclerotium iagttages.
DK PR 172545 B1 9 (2) Dyrkninqskarakteristika (inkuberet ved 28*C i 14 dage)
Luft- Substrat- Opløseligt
Medium Vækst mycelium mycelium pigment ______Dannelse Farve_
Sakkarose- god god hvid bleggulligt bleggult nitratagar brun - bleg _gult_
Glucose- god ingen - bleggult bleggult asparaqinagar_-gul_._
Glycerol- god god hvid gult gult asparagin- -bleg- aqar -_gul_
Uorganisk god god hvid bleggulligt intet salt-sti- brun velsesaqar__
Tyrosinagar god god bleg- bleggult intet -gul -bleggulligt _brun_ Nærings- god ingen - bleggulligt intet mediumagar brunt Gærekstr.- god god hvid bleggult gult »
Maltekstr.- -bleggulligt agar brunt
Havremels- god god hvid bleggulligt intet agar brunt'
Bennetts god god hvid bleggult gult agar -bleggulligt brunt
Farverne er bestemt ud fra GUIDE TO COLOUR STANDARD (Jap. Farveinstitut) DK PR 172545 B1 10 Væksttemperatur (Inkuberet ved hver temperatur 1 14 dage på Bennetts agar) 10*C: Ganske god vakst, men Ingen dannelse af luftmycelium 28*C: God vækst og dannelse af luftmycelium og sporer.
5 37*C: Ingen vækst 45*C: Ingen vækst (3) Fysiologisk karakteristika (inkuberet ved 28*C i 14 dage)
Melaninproduktion negativ 10 Tyroslnasereaktion negativ
Koagulering af mælk negativ
Peptonisering af mælk positiv
Gelatineforflydigelse positiv
Stivelsehydrolyse negativ 15 (4) Udnyttelse af kulhydrater L-arabinose - +: god vækst D-xylose + ingen vækst 20 D-glucose + D-fructose +
Sakkarose
Inositol + L-rhamnose 25 Rafflnose D-mannitol +
Kontrol (uden sukker) (5) Cellevægssammensætning 30
Diam1nop1mersyren fra denne stamme er på meso-forra. Ud fra ovenstående karakteristika blev det bestemt, at stammen tilhører slægten Nocardia.
De med denne stamme nærmest beslægtede arter blev søgt i følgende 35 1itteraturreferencer: 1. Waxman S. A.: The Actinomyxcetes, bind 2 (1961) ii. Elwood B. Shirling and David Gottlieb: International Journal of Systematic Bacteriology, bind 18 (1968), bind 19 (1969) og bind 22 (1972) DK PR 172545 B1 11 iii. Bergy's Manual of Determinative Bacteriology, 8. udgave (1974) og iv. Anden litteratur der omhandler nye arter af Actino-mycetes.
5 Som resultat bestemtes det, at stammen tilhører Nocardia ori ental i s (der benævnes Streptomycetes ori ental i s i følgende litteratur:
International Journal of Systematic Bacteriology, bind 18, 154-157 (1968) og The Actlnomycetes, bind 2, 254-244 (1961). Stammen PA-42867 har hovedtræk, der er identiske med Nocardia oriental is bortset fra ud-10 nytteisen af arabinose og rhamnose. Følgelig identificeredes PA-42867-stammen som Nocardia oriental i s og benævntes Nocardia oriental is PA-42867.
PA-42876-A og/eller -B fremstilles ved at inkubere Nocardia oriental is PA-42867 1 et næringsmedium under aerobe betingelser og Iso-15 lere og opsamle PA-42867-A og/eller -B fra det inkuberede nærlngsmedium efter inkubationen. En generel fremgangsmåde til fremstilling af PA-42867-A og/eller-B er beskrevet nedenfor.
Den ved fremstilling af antibiotika generelt anvendte næringsmediumsammensætning og tilstand kan anvendes ved fremgansgmåden ifølge 20 opfindelsen. Som en generel regel indeholder næringsmediet carbonkilder, nitrogenkilder og uorganiske salte. Efter behov kan vitaminer, præ-kursorer etc. sættes til næringsmediet. Carbonkilden, såsom glucose, stivelse, dextrin, glycerol, melasse, organiske syrer og lignende kan anvendes alene eller som en blanding. Nitrogenkilden, såsom soyabønne-25 mel, majsstøbevæske, kødekstrakt, gærekstrakt, bomuldsfrøpulver, pepton, hvedekim, ammonlumsulfat, ammonlumnitrat og lignende kan anvendes alene eller som en blanding. Uorganisk salte såsom calclumcarbonat, natriumklorid, kallumchiorid, magnesiumsulfat, kobbersulfat, manganchlorid, zinksulfat, koboltchlorid, phosphater og lignende kan sættes til næ-30 ringssmediet efter behov.
Fermentation kan udføres 1 overensstemmelse med almene fremgangsmåder til fremstilling af antibiotika. I overensstemmelse med den foreliggende opfindelse foretrækkes en flydende kultur, specielt en submers luftet kultur ved masseproduktion. I det tilfælde, hvor næringsmediets 35 pH-værdi veksler, tilsættes næringsmediet et puffermiddel, såsom cal-ciumcarbonat. Den foretrukne fermentationstemperatur er ca. 20-40’C, specielt 28-32*C. Fermentationstiden afhænger i høj grad af fermentationsmålestokken, og det tager ca. 60-100 timer at udføre massefermentation. Hvor der fremkommer en masse skum under fermentationen, kan et I i i , DK PR 172545 B1 12 skumdæmpningsmiddel såsom en vegetabilsk olie eller polypropylenglycol passende tilsættes før eller under fermentationen.
Isolering og opsamling af PA-42867-A og/eller -8 fra det fermenterede næringsmedium kan udføres i overensstemmelse med almene fremgangs-5 måder til isolering og opsamling af konventionelle fermentationsprodukter, f.eks. filtrering, centrifugering, adsorption og desorption eller chromatografi ved hjælp af forskellige slags lonbytterharpikser eller andre aktive adsorberingsmidler, ekstraktion med forskellige slags organiske opløsningsmidler og kombinationer deraf.
10 Forbindelserne med formel (1) kan anvendes direkte ved behandling af mennesker og dyr, men fremstilles fortrinsvis på saltform for at kunne absorberes i legemet. Eksempler på baser, der er i stand til at danne et salt med forbindelserne ifølge opfindelsen, omfatter alkalimetaller, såsom kalium og natrium, jordal kalimetal ler såsom aluminium og mag-15 nesium, og eksempler på syrer omfatter uorganiske syrer, såsom saltsyre, svovlsyre og salpetersyre, og organiske syrer såsom eddikesyre og fumar-syre.
Forbindelserne og salte deraf ifølge opfindelsen kan administreres til mennesker eller dyr enten oralt eller parenteralt som aktive be-20 standdele af antibakterielle midler. De kan administreres ad oral vej i form af tabletter, kapsler eller pulvere ved anvendelse af almindeligt anvendte vehikler, stabiliseringsmidler, præserveringsmidler, befugt-ningsmidler, overfladeaktive midler eller lignende, eller ad parenteral vej 1 form af injektioner, salver eller suppositorier. Dosen varierer 25 med behandlingsformålet og patientens alder og tilstand, men 1 tilfælde af intravenøs injektion til en voksen patient v11 en daglig dosis generelt være ca. 0,1 til 10 g.
Forbindelserne ifølge den foreliggende opfindelse viser kraftig an-timikrobiel aktivitet over for gram-positive bakterier, specielt methi-30 cillin-resistente bakterier. Dde er således værdifulde som human og veterinær medicin. Og de er egnede til injicerbare præparater såvel som orale præparater, eftersom de kan fremstilles med stor renhed.
Opfindelsen belyses nærmere 1 de følgende eksempler uden dog at blive begrænset dertil.
35 DK PR 172545 B1 13
Eksempel (a) Fermenterinostrin
Et skråsubstrat podet med Nocardia sp. PA-42867 (FERM BP-1230) ino-5 kuleres i en Erlenmeyerkolbe (2 liter) fyldt med 800 ml næringsmedium bestående af 0,5% opløselig stivelse, 0,5% glucose, 0,5% polypepton, 0,5% kødekstrakt, 0,25% gsrekstrakt, 0,25% natriumchlorid og delonlseret vand (pH 7,0 før sterilisation) og fermenteres under omrystning ved 180 o.p.m. ved 28*C i 48 timer. Det fermenterede nsringsmedium 800 ml) over-10 føres til en fermenteringsbeholder (30 liter) fyldt med 20 liter af det ovenfor nævnte næringsmedium og fermenteres ved 28*C i 24 timer under omrøring ved 200 o.p.m. (luftningshastighed 20 liter/min. og Indre tryk 0,5 kg/cm G). Derpå overføres 10 liter af det resulterende næringsmedium til en fermentetionstank (250 liter) fyldt med 140 liter næringsmedium 15 bestående af 2,4% tomatpasta, 2,4% dekstrin, 1,2% tørret gær (Iwaki Seiyaku Co., Ltd.), 0,0006% koboltchloridhexahydrat, 0,08% skumdsmp-ningsmiddel nP-2000" (Dai Nippon Ink & Chemicals Inc.) og vand (pH 7,0 før sterilisation) og fermenteres ved 28*C i 64 timer under omrøring ved 325 o.p.m. (luftningshastighed 150 liter/min. og Indre tryk 34,5 kPa.
20 (b) Isolerinostrin
Det ved ovennævnte trin fremstillede fermenterede nærlngsmedium, som er Indstillet til en pH-værdi på 10,5 med 10% natriumhydroxid, centrifugeres, hvilket giver 146 liter af supernatanten. Indstillet til en 9 25 pH-værdi på 4,0 overføres supernatanten til en kolonne, der er fyldt med 13 liter "Dowex 50x2” (Na+-type) (The Dow Chemical Company), vaskes med 70 liter vand og elueres med 40 liter 30% acetone-vand indeholdende 1% tri ethylamin. De fraktioner, der viser aktivitet ved "pulp dise"-dispersionsmetoden under anvendelse af Bacillus subtilis opsamles (22 liter), 30 indstilles til pH 5,0 og koncentreres ved afdampning af acetone under reduceret tryk. Det resulterende produkt overføres til en kolonne af 2 liter "HP-20" (Mitsubishi Chemical Industries Co., Ltd.), vaskes med 20 liter vand og elueres med 50% acetone-vand. De aktive fraktioner opsamles (6 liter), koncentreres under reduceret tryk og lyofiliseres, hvil -35 ket giver 35,6 g af det rå PA-42867 i form af et pulver.
(c) Reasningstrin
Ovennævnte rå pulver (12 g) opløses i 150 ml 0,01N saltsyre og overføres til en kolonne af 100 ml "MCI GEL CHP-20P" (Mitsubishi Chemi- DK PR 172545 B1 14 cal Industries Co.), efterfulgt af eluering med 0,01N saltsyre, idet PA-42867-holdige fraktioner registreres ved HPLC. Fraktionerne Indeholdende PA-42867-A og -B indstilles til pH 7,0 og chromatograferes igen med "CHP-20P": Fraktionerne indeholdende PA-42867-A og -B overføres til ko-5 lonnen, vaskes godt med 15% methanol-vand og elueres med 15% methanol -0,005N saltsyre til opnåelse af fraktionen Indeholdende PA-42867-A og fraktionen indeholdende PA-42867-B.
Fraktionen indeholdende PA-42867-A indstilles til pH 7,0 og koncentreres. Hed henblik pi affarvning overføres det resulterende produkt 10 til en kolonne af 10 ml "CHP-20P" og elueres med fortyndet saltsyre (pH
5.0) til opnåelse af fraktionen indeholdende PA-42867-A, som koncentreres og lyofiliseres, hvilket giver 571 mg remanens (70%) renhed. Efter opløsning af denne remanens (575 mg) i vand og indstilling af pH til 5,0 ved tilsætning af fortyndet saltsyre, overføres opløsningen til en ko- 15 lonne af 10 ml "CHP-20P" og elueres med vand til opnåelse af fraktionen PA-42867-A, som indstilles til pH 7,0 og koncentreres. Det resulterende produkt overføres igen til en kolonne af 10 ml "CHP-20P" (stabiliseret med 0,05M phosphatpufferindstillet saltvand (pH 7,0) med henblik på af-saltning, vaskes med 0,05M phosphatpufferindstillet saltvand (pH 7,0) og 20 si med vand og elueres med 50% methanol-vand til opnåelse af fraktionen PA-42867-A, som koncentreres og lyofiliseres, hvilket giver 256 mg PA-42867-A (95% renhed).
Den ovennævnte fraktion, der Indeholder PA-42867-B indstilles til pH 7,0, koncentreres og lyofiliseres, hvilket giver 683 mg remanens. PA-25 42867-B-remanensen (683 mg) opløst 1 vand indstilles til pH 4,0 ved tilsætning af fortyndet saltsyre, overføres til en kolonne af 5 ml "CHP-20P" med henblik på affarvning og elueres med fortyndet saltsyre (pH
4.0) til opnåelse af fraktionen indeholdende PA-42867-B, som indstilles til pH 7,0 og koncentreres. Det resulterende produkt over-føres til en
30 "Packed Column RQ-2”-kolonne (Fujigeru Hanbal K.K.) og elueres med 7% acetonitril-0,05M phosphatpufferindstillet saltvand (pH 4,9) og derefter 8% aceton1tri1-0,05H phosphatpufferindstillet saltvand (pH 4,9), idet renheden af PA-42867-B undersøges med HPLC. Fraktioner, der viser mere end 95% renhed, opsamles, pH-værdien indstilles til 7,0, og fraktionerne 35 koncentreres. Det resulterende produkt overføres til en kolonne af 10 ml "CHP-20P" (stabiliseret med 0,05 phosphatpufferind-stillet saltvand (pH
7.0) ) til afsaltning, vaskes med vand og elueres med 50% methanol-vand, til opnåelse af fraktioner indeholdende PA-42867-B, som koncentreres og lyofiliseres, hvilket giver 102 mg PA-42867-B (98% renhed).
DK PR 172545 B1 15
In vitro og in vivo antibakteriel le aktiviteter af forbindelserne ifølge opfindelsen bedømtes i følgende forsøgseksempler.
Forsøaseksemoel 1 5 In vitro antibakteriel aktivitet bestemtes ved agarfortyndingsmeto- den som beskrevet nedenfor.
(1) Fremstilling af bakteriel suspension.
En fyldt præparatnålsløkke af hver testbakterie på skråsubstrat 10 Inokuleredes i 1 ml nsringsmedium ("Trypto Soy Broth”, Eiken Chemical Co.) og inkuberedes ved 37*C i 18-20 timer. Til dyrkning af Streptococci anvendtes Nueller-Hintonnsringsmedium (Difco) suppleret med 3% (vol/vol) hesteserum. En 110 gange fortynding af kulturen anvendtes som Inokulum-suspenslon af bakterien.
15 (2) Prøveooløsnino
Prøven (9-10 mg) blev vejet og opløstes i destilleret vand i en koncentration på 2 mg/ml.
20 (3) Aoarplade
En prøveopløsning underkastedes dobbelt seriefortynding med sterilt vand (2000-0,25 pg/ml). I sterile plastikpetriskåle (9 cm 1 diameter) udhsldtes en 0,5 ml-allquot af prøveopløsningerne, som blandedes med 9,5 ml af et agarmedium ("Sensitivity Test Agar", "Nissul"). Til Strepto- 9 25 cocci suppleredes med 0,5% (vol/vol) hesteserum.
(4) Måling af MIC-værdi
En fyldt prcparatnålløkke (1,0 pi) af inokulumsuspensIonen anbragtes på overfladen af agarpladerne, der var fremstillet som angivet oven-30 for. Bakterievæksten undersøgtes visuelt efter inkubation natten over (18-20 timer) ved 37'C. MIC (minimal 1nhibitorisk koncentration) bestemtes som den laveste koncentration, ved hvilken bakterievæksten Inhibere-des fuldstændigt.
Resultaterne er vist i tabel 1.
35 DK PR 172545 B1 16
TabeLJ
Antibakteriel aktivitet over for gram-positive organismer 5
Testorganisme MIC (j/g/ml)
10 Forb. A Forb B
Staphylococcus aureus FDA
209P JC-1 0,39 1,56
15 Staphylococcus aureus ATTC
25923 0,78 3,13
Staphylococcus aureus SMITH 0,78 3,13
Staphylococcus aureus SR14** 0,78 1,56
Staphylococcus aureus 3131* 0,78 1,56 20 Staphylococcus aureus SR1626* 0,78 1,56
Staphylococcus aureus SR3626* 0,78 1,56
Streptococcus pyogenes C-203 0,39 0,78
Streptococcus pneumoniae
Type I 0,39 0,78 25 Streptococcus agalactia SR1247 0,39 0,78
Streptococcus faecal is SR1004 1,56 3,13
Micrococcus luteus ATCC 9341 0,39 1,56
Forbindelse A: PA-42867-A 30 Forbindelse B: PA-42867-B
*: methicillin-resistent **: penicillin-resistent DK PR 172545 B1 17
Forsøgseksempel 2
In vivo antibakterlel aktivitet af PA-42867-A Metode ICR-mus af hunkøn (8 mus/gruppe) udsættes for intraperitonealt an-5 greb roed testbakterien, hvorefter de behandles subkutant med PA-42867-A (dobbelt seriefortynding) 1 og 5 timer efter infektion.
Resultat EDjjq (50% effektiv dosis) beregnes ud fra overlevelsesgraden for 10 nus p& dag 7 efter infektionen.
Resultaterne er vist i tabel 2.
Tabel 2 15
Antibakteriel aktivitet ved beskyttelsesforsøg i mus Testorganisme EO^q (mg/kg/dosis)
20 Forb. A
Staphylococcus aureus SMITH 0,62
Staphylococcus aureus SR2030* 2,31 25 Streptococcus pyogenes C-203 0,64
Streptococcus pneumoniae type 1 0,90
Forbindelse A: PA-42867-A
30 *: Methicillin-resistent organisme
Claims (5)
1. Antibiotisk glycopeptid med formel (I):
5 R o 10 η2]^^ ih| o η T o . x H00CjL X J ™ UcR3 Λ/γ nh2 y 15 0H 1 013 HO OH hvori R er CH3 OH H(xjv. ho^JLxh.oh 2° X-jT I T T hvori X er NHg, og Y er CH^, eller X er OH, og Y er H eller et 25 farmaceutisk acceptabelt salt deraf.
2. Antibiotisk glycopeptid betegnet PA-42867-A ifølge krav 1, kendetegnet ved, at R er CH3 oh 30 35 hvori X er NHg, og Y er CHj.
3. Antibiotisk glycopeptid betegnet PA-42867-B ifølge krav 1, kendetegnet ved, at R er DK PR 172545 B1 19 ch3 oh HO^AxH.OH hvor X er OH og Y er H.
4. Fremgangsmåde til fremstilling af PA-42867-A og/eller PA-42867-B, kendetegnet ved, at man fermenterer en PA-42867-producerende mikroorganisme Nocardia orientis PA-42867 1 et nsringsmedium og Isolerer PA-42867-A og/eller PA-42867-B fra det fermenterede nsringsmedium.
5. PA-42867-A og/eller PA-42867-B-producerende mikroorganisme, kendetegnet ved, at den er Nocardia orlentalis PA-42867. i
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP1438986 | 1986-01-24 | ||
JP61014389A JPS62174099A (ja) | 1986-01-24 | 1986-01-24 | 新規グリコペプチド系抗生物質pa−42867−aおよびpa−42867−bとその製造方法 |
JP18886586 | 1986-08-11 | ||
JP61188865A JPH0641480B2 (ja) | 1986-08-11 | 1986-08-11 | 新規なグリコペプチド系抗生物質 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DK39587D0 DK39587D0 (da) | 1987-01-23 |
DK39587A DK39587A (da) | 1987-07-25 |
DK172545B1 true DK172545B1 (da) | 1998-12-14 |
Family
ID=26350325
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DK198700395A DK172545B1 (da) | 1986-01-24 | 1987-01-23 | Antibiotiske glycopeptider og fremgangsmåde til deres fremstilling |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4946941A (da) |
EP (1) | EP0231111B1 (da) |
KR (1) | KR940000759B1 (da) |
AU (1) | AU602327B2 (da) |
CA (1) | CA1339348C (da) |
DE (1) | DE3771882D1 (da) |
DK (1) | DK172545B1 (da) |
ES (1) | ES2039230T3 (da) |
Families Citing this family (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EG18377A (en) * | 1986-09-19 | 1993-04-30 | Lilly Co Eli | Process for preparing glycopeptide antibiotics |
US5071749A (en) * | 1987-04-16 | 1991-12-10 | Shionogi & Co., Ltd. | Glycopetide antibiotic pa-45052-b |
JPH01190633A (ja) * | 1988-01-26 | 1989-07-31 | Shionogi & Co Ltd | 動物用成長促進剤 |
US5534420A (en) * | 1988-07-28 | 1996-07-09 | Eli Lilly And Company | Biotransformation of glycopeptide antibiotics |
IN167068B (da) * | 1988-08-27 | 1990-08-25 | Hoechst India | |
CA1339808C (en) * | 1988-10-19 | 1998-04-07 | Manuel Debono | Glycopeptide antibiotics |
JP2577133B2 (ja) * | 1989-11-27 | 1997-01-29 | スティフティング フォール ド テフニスヘ ウェッテンスハッペン | 船舶のプロペラ |
NZ236393A (en) * | 1989-12-13 | 1992-05-26 | Lilly Co Eli | N-alkylated glycopeptide derivatives prepared from antibiotics a82846 series and pa-42867-a; pharmaceutical compositions |
US5451570A (en) * | 1990-07-27 | 1995-09-19 | Hoechst Aktiengesellschaft | Antibiotic, balhimycin, a process for its production and its use as pharmaceutical |
US5256548A (en) * | 1990-11-21 | 1993-10-26 | Bristol-Myers Squibb Company | Antiviral antibiotic BU-4344V |
US5140101A (en) * | 1990-11-21 | 1992-08-18 | Bristol-Myers Squibb Company | Antiviral antibiotic BU-4344V |
US5235037A (en) * | 1991-08-15 | 1993-08-10 | American Cyanamid Company | Vancomycin precipitation process |
TW457248B (en) * | 1994-01-28 | 2001-10-01 | Lilly Co Eli | Glycopeptide antibiotic derivatives |
US5840684A (en) * | 1994-01-28 | 1998-11-24 | Eli Lilly And Company | Glycopeptide antibiotic derivatives |
AU701463B2 (en) * | 1995-07-05 | 1999-01-28 | Sanofi Aventis S.P.A. | Purification of dalbaheptide antibiotics by isoelectric focusing |
US6734165B2 (en) | 2001-08-23 | 2004-05-11 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Method for re-sensitizing vancomycin resistant bacteria which selectively cleave a cell wall depsipeptide |
JP5777034B2 (ja) * | 2013-01-30 | 2015-09-09 | Smc株式会社 | 揺動形アクチュエータ |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4495179A (en) * | 1982-12-20 | 1985-01-22 | Eli Lilly And Company | A51568 Antibiotic and process for producing thereof |
US4717714A (en) * | 1983-12-13 | 1988-01-05 | Eli Lilly And Company | A-51568B antibiotic |
US4552701A (en) * | 1984-04-16 | 1985-11-12 | Eli Lilly And Company | Glycopeptide antibiotics and process of preparation |
DE3572178D1 (en) * | 1984-04-16 | 1989-09-14 | Lilly Co Eli | Improvements in and relating to antibiotics m43a, m43b, m43c and m43d |
US4547488A (en) * | 1984-04-16 | 1985-10-15 | Eli Lilly And Company | Antibiotic M43D, pharmaceutical compositions and method of use |
GB8618445D0 (en) * | 1986-07-29 | 1986-09-03 | Lepetit Spa | Antibiotic a 42867 |
EG18377A (en) * | 1986-09-19 | 1993-04-30 | Lilly Co Eli | Process for preparing glycopeptide antibiotics |
-
1987
- 1987-01-14 US US07/003,252 patent/US4946941A/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-01-23 CA CA000528094A patent/CA1339348C/en not_active Expired - Fee Related
- 1987-01-23 DK DK198700395A patent/DK172545B1/da not_active IP Right Cessation
- 1987-01-23 AU AU67963/87A patent/AU602327B2/en not_active Ceased
- 1987-01-23 ES ES198787300614T patent/ES2039230T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1987-01-23 KR KR1019870000553A patent/KR940000759B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1987-01-23 DE DE8787300614T patent/DE3771882D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1987-01-23 EP EP87300614A patent/EP0231111B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US4946941A (en) | 1990-08-07 |
KR940000759B1 (ko) | 1994-01-29 |
AU6796387A (en) | 1987-07-30 |
EP0231111A3 (en) | 1987-12-09 |
DE3771882D1 (de) | 1991-09-12 |
KR870007202A (ko) | 1987-08-17 |
DK39587A (da) | 1987-07-25 |
EP0231111B1 (en) | 1991-08-07 |
DK39587D0 (da) | 1987-01-23 |
CA1339348C (en) | 1997-08-26 |
EP0231111A2 (en) | 1987-08-05 |
ES2039230T3 (es) | 1993-09-16 |
AU602327B2 (en) | 1990-10-11 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DK172545B1 (da) | Antibiotiske glycopeptider og fremgangsmåde til deres fremstilling | |
EP0182315B1 (en) | Novel antibiotic nk84-0218 pharmaceutical compositions containing it and process for the production of the same | |
US3338786A (en) | Antibiotic av290 and production thereof | |
CA1270782A (en) | Cl-1577d and 1577e antibiotic/antitumor compounds, their production and use | |
EP0287110B1 (en) | Glycopeptide antibiotics pa-45052 | |
US4536398A (en) | Antiviral agents | |
US3592925A (en) | Antibiotics ah272alpha2 and ah272beta2 and process for producing same | |
US4293546A (en) | Anthracycline antibiotics produced by Streptosporangium fragilis Shearer sp. nov. ATCC 31519 | |
EP0110155A1 (en) | Novel anthracycline derivatives, a process for preparing the same by a microorganism strain, the novel strain streptomyces cyaneus, and use of the anthracycline derivatives as medicaments | |
EP0727420B1 (en) | Novel antibiotic and process for producing the same | |
GB2136424A (en) | Macrolide derivatives | |
US4565861A (en) | Serirubicum | |
US4003902A (en) | Naphthyridinomycin antibiotics | |
US4628046A (en) | Antibiotic LL-C23201δ | |
US3495003A (en) | Antibiotic ab-664 and production thereof | |
JPS60172985A (ja) | 抗生物質a39079因子s−1およびその製造方法 | |
US5171740A (en) | Coumamidine compounds | |
Imai et al. | Izenamicins: macrolide antibiotics | |
US6693085B2 (en) | Macrolide compound JK | |
KR830001443B1 (ko) | 항생물질 a/16686의 제법 | |
US3344025A (en) | Antibiotic ap-191-gamma and a process for producing same by culturing streptomyces candidus | |
AU2002365433A1 (en) | Antibiotics GE 81112 factors A, B, B1, pharmaceutically acceptable salts and compositions, and use thereof. | |
KR820002138B1 (ko) | A-40104 항생물질의 제조방법 | |
EP0423247B1 (en) | Coumamidine compounds | |
WO1990009435A1 (en) | Altromycin compounds |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
B1 | Patent granted (law 1993) | ||
PBP | Patent lapsed |
Country of ref document: DK |