JPH01190633A - 動物用成長促進剤 - Google Patents

動物用成長促進剤

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JPH01190633A
JPH01190633A JP63015341A JP1534188A JPH01190633A JP H01190633 A JPH01190633 A JP H01190633A JP 63015341 A JP63015341 A JP 63015341A JP 1534188 A JP1534188 A JP 1534188A JP H01190633 A JPH01190633 A JP H01190633A
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Koji Hayashi
林 幸之
Takao Konishi
小西 喬郎
Koichi Matsumoto
浩一 松本
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Shionogi and Co Ltd
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、式; で示される化合物およびその塩からなる群力)ら選択さ
れる1種以上の化合物を有効成分とする動物用成長促進
剤に関する。
従SOυL術 グリコペプチド系抗生物質としては、従来より、パンツ
マイシンおよびその誘導体など数多くの化合物が知られ
ており、これらを動物に投与することによりその成長を
促進することができることも良く知られている(例えば
、特開昭57−129693、特開昭59−21339
4、特開昭59−213395、特表昭61−5023
35、特開昭61−122300、特開昭62−126
970、特開昭60−199397、特開昭60−23
7099、特開昭60−231698、特開昭61−2
51699、米国特許4558036、米国特許453
7770、欧州公開特許119575など)。
本発明に関わる化合物のうち、式中Rがである化合物P
A−42867−Aは特開昭62−174099に開示
されており、また、式中RがH または水素である化合物は、特願昭61−188865
に、テスー(4−エビパンツサミニル)PA−4286
7−A、および、デス−(4−エピハンコサミニルー〇
−グルコシル) PA−42867−Aとして記載きれ
ている。
現在、動物用成長促進剤としてチオペプチンなどが市販
されている。
発明が解決しようとする課題 上記のように、バンコマイシン系抗生物質が動物に対し
て成長促進作用を有することが知られていたが、本発明
に関わる化合物が成長促進作用を有することは全く知ら
れていなかった。
・題を 決するための手段 本発明者らは、上記3化合物が動物成長促進作用の指標
となる、クロストリジウム属に属する菌゛株に対する強
い抗菌活性を有することを見出し、がっ、これら化合物
を動物飼料に添加して動物を飼育すると、その体重が顕
著に増加することを見出し本発明を完成した。
本発明の成長促進剤を動物に投与する場合には、直接投
与する場合には、本発明に関わるグリコペプチド類を直
接経口投与してもよいが、一般的には通常使用されてい
る担体(例えば、脱脂米糠、脱脂大豆粉、ふすま、カオ
リン、タルク、炭酸カルシウム、乳糖、水など)と混合
したものを投与するか、あるいはこのように混合したも
のもしくはグリコペプチド類単独を動物飼料もしくは水
と混合して投与する方法が好ましい。ここで使用するグ
リコペプチド類は、必ずしも純品である必要はなく、例
えば本発明に関わるグリコペプチド生産菌を培地に培養
して得られた培養物を部分的に精製したものであっても
よい。さらに、グリコペプチドの製薬上許容きれる塩を
使用してもよく、カリウム、ナトリウムなどのアルカリ
金属、アルミニウム、マグネシウムなどのアルカリ土類
金属、塩酸、硫酸、硝酸などの無機酸および酢酸、フマ
ル酸などの有機酸との塩があげられる。
本発明に関わるグリコペプチド類の1または2以上を含
有する動物の飼料は、動物の飼料として一般に使用され
る飼料であればいずれでもよい。
その例を挙げると次の通りである。すなわち、とうもろ
こし、ふすま、米、麦、綿実粕、マイロ、大豆粕、魚粉
、脱脂米ぬか、油脂、アルファルファ、炭酸力ルンウム
、リン酸カルシウム、塩化ナトリウム、塩化コリン、ビ
タミンA、ビタミンD、ビタミンE1 ビタミンB 1
%  ビタミンB!、ビタミンB1、ビタミンB lf
f1、パントテン酸カルシウム、ニコチン酸アミド、葉
酸などのビタミン剤、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸
鋼、硫酸亜鉛、ヨウ化カリウム、硫酸コバルトなどの無
機塩、なとの一部または全部を混合し使用される。
この他に、他の抗生物質や殺菌剤、抗コクシジウム剤、
駆虫剤などを添加してもよい。
また、本発明に係るグリコペプチド類1種または2種以
上の飼料中の含有量は、それらをそれぞれ単独に使用す
る場合、それらの任意の混合物を使用する場合、それら
を含有する菌体、それらを含む抽出粗製物を使用する場
合のいずれの場合でも、使用するグリコペプチド類とし
て、0.5〜100p91+1の*囲が適当である。
この発明の成長促進剤は動物一般に使用でき、その例と
して、にわとり、七面鳥、あひる、うずら、牛、馬、豚
、羊、山羊、ミンク、うさぎなど家禽および家畜が挙げ
られる。
また動物の飼育法は、一般に行なわれている方法をその
まま用いればよい。
本発明の成長促進剤は、動物の成長を促進するのみなら
ず、動物の飼料要求率を改ηする。また、細菌性疾患な
どにも有効である。きらに、動物に対して低毒性であり
、動物体内には全く残留しない特徴を有しているので、
極めて優れている。以下に、本発明に係る化合物の雄マ
ウス静注におけるLDi値を示す。
LD、、 (m /K ) PA−42867−A        1955fスー
(4−エビバンコ7ミニル)PA−42867−A  
     >3000fスー(4−エビパンコサミニル
ー〇−グルコシル)PA−42867−A     2
05本発明に係る化合物の製造法は、特開昭62−17
4099および特願昭61−188865に詳述されて
いるが、下記の通りに製造することかでさる。
(a)発酵工程: 可溶性澱粉0.5%、グルコース0.5%、ポリペプト
ン0.5%、牛肉エキス0.5%、酵母エキス0.25
%、食塩0625%、脱イオン水(pH7,0、殺菌前
)よりなる培地800m1を含む22容三角フラスコに
ノカルデイア・エスピーPA−42867(微工研条寄
第1230号)の種培養スラントを接種し、毎分180
回転で、28°C148時間振盪培養を行なう、この培
養液800m1を、上記と等しい成分からなる培地20
1を含む30j!容ジャーファーメンタ−に植菌し、通
気量20!/分、内圧0 、5kg/cm”G、攪拌回
転数20 Orpmで、28℃、24時間培養する。
次いでこの培養液10りを、トマトペースト2゜4%、
デキストリン2.4%、乾燥酵母(ビースト、居城製薬
製)1.2%、塩化コバルト・6水和物0.0006%
、消泡剤P−2000(大日本インキ製>0 、08%
、水道水(pH7,0、殺菌前)よりなる培地140f
fiを含む2501発酵タンクに植菌し、通気量tso
N/分、内圧5psi、攪拌回転数325 rpmで、
28℃、64時間培養する。
(b)分離工程: 上記工程で得られた培養液は10%水酸化ナトリウムに
てPH10,5に調整し、遠心分離によって上清液14
51を得る。この上/1j液をpH4,0に調整後、1
3りのダウエックス50X2(Na″′型)(ダウケミ
カル社製)のカラムに流し、水?CBで洗浄後、1%ト
リエチルアミンを含む30%アセトン水40!で溶出す
る。枯草菌を用いたパルプディスク拡散法で活性を示す
フラクション22!を集め、pH5に調整する。これを
減圧濃縮しアセトンを留去する0次いで、HP−20(
三菱化成社製)2eのカラムに流す、水201で洗浄後
、50%アセトン水で溶出する。活性フラクション6!
を集める。これを減圧濃縮し、凍結乾燥するとPA−4
2867の粗粉末35.6gを得る。
(c)精製工程: PA−42867−Aおよび−B上
記粗粉末12gを用いて0.01.N塩酸150ml溶
液とし、MCI GEL CHP−20P(三菱化成社
製)100mlでクロマトする。 HPLCで含有程度
をチエツクしながら0.0IN塩酸で溶出し、PA−4
2867−A、 Bを含む分画をpH7,0とし、再度
C0P−20Pでクロマトする。 PA−42867−
A、 B含有液をアプライした後、15%メタノール水
で充分洗浄し、15%メタノール−0,005N塩酸で
溶出し、PA−42867−A含有分画およびPA−4
2867−B含有分画に分ける。 PA−42867−
B含有分画をpH7,0に調整後濃縮凍結乾燥し、残渣
683mgを得た。 PA−42867−A含有分画は
pH7,0に調整後濃縮し、脱色目的でCHP−20P
 10 mlでクロマトし、希塩酸(pH5,0)水溶
液で溶出し、PA−42867−Aを含む分画を集め、
濃縮後凍結乾燥して、残渣571@(純度70%)を得
る。この571mgを水に溶解した後希塩酸を加えpH
5,0に調整し、CHP−20P10m10カラムに付
し、水で溶出し、PA−42867−^含有分画を集め
pH7,0に調整し、濃縮後再度脱塩目的でCHP−2
0P 10 ml(0、05Mリン酸塩緩衝液(pH7
,0>で安定化)のカラムに付し、0.05Mリン酸塩
緩衝液(pH7,0)で洗浄、水洗後50%メタノール
水で溶出、PA−42867−A含有分画を集め、濃縮
後凍結乾燥しPA−42867−A 256mg(純度
95%)を得る。 FA−42867−B含有残渣68
3mgは水に溶解後金塩酸を加えpH4,0に調整し脱
色目的でCHP−20P 5 mlのカラムに付し、希
塩酸水溶液(pH4,0)で溶出し、FA−42867
−B含有分画を集めpH7,0に814整し濃縮した後
、パンクドカラムRQ−2(富士ゲル販売株式会社)に
付す、 HPLCで純度をチエツクしながら7%アセト
ニトリル−0,05Mリン酸塩緩衝液(pH4゜9)、
次いで8%アセトニトリル−0,05Mリン酸塩緩衝液
(pH4,9)で溶出、95%純度以上の分画を集めp
H7,0に調整し、濃縮後脱塩のためCHP−20P1
0 ml(0、05Mリン酸塩緩衝液(pH7,0)で
安定化)のカラムに付す、水洗後、50%メタノール−
水で溶出しPA−42867−B含有分画を集め、濃縮
、凍結乾燥し、PA−42867−8102mg(純度
98%)を得る。
(d)精製工程;デス−(4−エビバンコサミニル) 
FA−42867−Aおよびデス−(4−エピパンコサ
ミニルー〇−グルフシル) FA−42867−At記
工程(b)で得た粗生成物(PA−42867−A 5
3%とPA−42867−89%を含有) 2.00 
gを、20%塩酸(和光紬薬工業、精密分析用)200
mlに溶解し、窒素雰囲気下水冷(0〜1℃)して16
時間攪拌する0反応液に6N水酸化ナトリウムC約20
4m1)を加、tてp)19.2L:w4tす6.MC
IGEL C0P−20P(200〜400メツシユ、
100量1)に付し、水(600ml)、0.01N塩
酸(450ml)・、水(450ml)、25%メタノ
ール水(450ml)、50%メタノール水(400m
l)、メタノール(400sal)、50%メタノール
−0,005N塩酸(400ml)で順次溶出する。
HPLC[ヌクレオシル(Nucleosil) 30
0−7C18,4,6φX250mm、10%アセトニ
トリル−0゜05M  PBS(pH3,5)流速1 
m17分、220nn+UV検出]による分画チエツク
により、分画A(0,01Nm#、水溶出部)と分画B
(50%メタノール、メタノール、50%メタノール−
0,005N塩酸溶出部)を得る。
分画Bを濃縮後、pH3,5に調整し、MCI GEL
 CHP−20P(200〜400メツシユ、10m1
)に付し、水(pH4,0に塩酸水で調整、約10−’
N塩酸)300ml、15%メタノール−水(pH4゜
0)100ml、30%メタノール−水(pH4゜0)
100ml、50%メタノール−水(pH4゜0)10
0ml、メタノール50m1.50%メタノール−0,
005N塩酸50m1で順次溶出し、分画C[水(pt
14.o)溶出8IS]と分画D〔50%メタノール−
水(pH4,0)溶出部]を得る。
分画A%Cを合わせて濃縮し、pH7,0に調整した後
、MCI GEL C1(P−20P(200〜400
メツシユ、10m1)を用いて脱塩する。水(100m
1)、25%メタノール水(100ml)、50%メタ
ノール水(100ml)、メタノール(100ml)、
50%メタノール−0,005N塩酸(50ml)で溶
出し、分画E(未脱塩部)と分画F(脱塩部)を得る0
分画E(未脱塩部)を同−条件で再脱塩し、分画G(脱
塩部)を得る。
得られた分画FSGの沈殿部(各分画を濃縮後、メタノ
ールを加え沈殿を生成きせる)800mgを水(39m
l)に力a熱溶解後、メタノール(39ml)を加え再
結晶し、結晶557mg(五塩化溝の存在下、30°C
で1.5時間減圧乾燥)を得る。[デス−(4−エビパ
ンツサミニル) FA−42867−A、 HPLC9
3%、収率46.0%]別に、結晶母液、沈殿生成母液
から凍結乾燥体350mg[デス−(4−エビパンツサ
ミニル)PA−421367−A、 HPLC91%、
収率2B、3%コを得る。
分画りを同様に脱塩することにより、凍結乾燥体30m
g[デス−(4−エピパン=+ サミニル−〇−グルコ
シル)PA−42867−A、 HPLC93%、収率
2.8%]を得る。
上記工程(c)と同様にして得た純度90%のPA−4
2867−A  100 mgを20%塩酸10m1に
溶解し、窒素雰囲気下池浴温度40〜45°Cで加温し
ながら10分間攪拌する0反応液を6N水酸化ナトリウ
AでpH9,2に調整し、MCI GEL CHP−2
0P(200〜400メツシュ、10m1)に付し、水
(100ml>、0.01N塩酸(50ml)、水(5
0ml)、25%メタノール(50ml)、50%メタ
ノール(50ml)、メタノール(50ml)、50%
メタノール−0,005N塩#(50ml)で順次溶出
する。
aPLc (ヌクL−才’/ ル300−7C18,1
0%アセトニトリル−0,05M  PBS  (pH
3,5)、220nrdJV検出)による分画のチエツ
クにより分画I  (0゜01N塩酸、水溶出部)と分
画n(50%メタノール、メタノール、50%メタノー
ル−o、oosN塩酸溶出部)を得る。
分画■を濃縮後、pH3,5に調整し、MCI GEL
 CHP−2QP (200〜400メツシユ、10m
1)に付し、水(pH4,0> 50ml、15%メタ
ノール−水(pH4,0)、30%メタノール−水(p
H4,0>、50%メタノール−水(pH4,0)、メ
タノール50m1.50%メタ/−ルー0.005N塩
#50 mlで溶出し、分画■C水(pH4,0)溶出
部]と分画■[50%メタノール−水(pH4,0)、
50%メタノール−0,005N塩酸溶出部]を得る。
分画I、■を合わせて濃縮し、pH7,0に調整した後
、MCI GEL CHP−20P (200〜400
メッンユ、5m1)ヲ用いて脱塩し、デス−(4−エビ
パンツサミニル) PA−42867−A 31 、5
 mg (収率386%)を得る。
分画■も同様に脱塩し、デス−(4−エピパンrサミ=
ルー0−グルーr シJL、 ) PA−42867−
A 36 。
3mg(50,1%)を得る。
なお、PA−42867−Aを産生ずるノカルデイア・
エスピー PA−42867は、昭和61年1月8日よ
りNocardia orientalis PA−4
2867、徽工研菌寄第8601(FERM  P−8
601)として茨城系つくば南東1−1−3の微生物工
業技術研究所に寄託されており、昭和61年12月4日
に微工研条寄第1230(FERM  BP−1230
)としてブダペスト条約に基づく寄託に移管された。
奎」LΔ PA−42867−A、デス−(4−エビパンツサミニ
ル) PA−42867−A、デス−(4−エビパンフ
サミニルー〇−グルフシル) PA−42867−Aの
クロストリジウムeペルフリン〉エンス(Clostr
idium perfringens )に対するin
 vitro試験とブロイラー雛に対する成長促進効果
試験を実施した。
1 、 C1,perfringensに対するtn 
vitro試験試験菌のC1,perfringens
は牛および鶏由来の合計11株を用いた。感受性測定方
法は、測定用培地としてCAM寒天培地(日永)を用い
て、寒天平板希釈法による嫌気培養(ガスバック法)を
行なった6判定は、37”Cで24時間培養した後、肉
眼で明らかに発育が阻止された最低a度(MIC)をも
ってその薬剤のMIC値とした。
生長促進を目的とした抗生物質のin vitroスク
リーニングでは、ダラム陽性菌に対する活性、特にC1
,perfringensに対する活性が1つの目安と
されている(Poultry 5cience 62.
1633=1638.1983; Poultry 5
cience 63.2036−2042.19134
)。
表I  C1,perfringensに対するin 
vitro成績NCTC−10239牛    0.3
9   1.!>6   0.78FC2208/75
   牛    0.39   1.56   0.7
85−79       牛    0.39   0
.78   0.39CM−1970牛    0.3
9   1.56   0.786B−10牛    
0.2    1.56   0.78NCTC−82
39牛    0.39   1.56   0.78
NCfC−8798牛    0.39   1.56
   0.785PO7鶏    0.39   1.
56   0.789C−02鶏    0.2   
 1.56   0.783C−01@     0.
39   1.56   0.7802441    
   鶏    0.39   1.56   0.7
8化合物1 、 PA−42867〜A 化合物2 : fスー(4−エビバンコサミニル)PA
−42867−A化合物3.fスー(4−エビバンコi
ミニルー0−グルコシル)PA−42867−A2、雛
に対する成長効果試験 FA−42867−Aのプロイラ1ift (8日令、
アバ−ニーカ一種)に対する成長促進効果を、既知抗生
物質チオベプテンを対照薬剤として用いて検討した。
添加濃度は、それぞれ抗菌剤無添加飼料マツシュ(粗蛋
白濃度(CP)’18%)に20ppmの添加濃度で1
0日間与えバタリー飼育方式で検討した。実験方法は、
初生雛を8日令時までCPfi度23Xの飼料で平飼い
飼育した後、1群25〜26羽(雌雄者12〜13羽)
ずつ各群の体重が均一になるように合計3群の実験群に
区分した。各実験群は、PA−42867−A群20p
pmXlO日間、チオペプテン20ppmxlO日間、
無添加対照群CP18%飼料10日間である。これらの
各実験群は、6〜7羽ずつケージ(435x600x4
10mm)に収容し′ た後、10日間(188日令環
境温度26±2℃の条件下で飼育した。有効性の評価法
は、試験期間中(10日間)の増体重と飼料要求率から
評価した。
試験成績は表2に示す通りである。
(以下余白) PA−42867−A添加群は、対照薬のチオベグチン
添加群と無添加対照群に比べて有意(P<0.01)に
体重が重いものであった。また、飼料要求率においCも
、PA−42867−A添加群とチオペグチン添加群が
無添加群に比べて優れた成績を示した。
次いで、 fスー(4−エビバンコサミニル)PA−4
2867−Aとfスー(4−エビ/(アコサミニル−0
−グルコシル)PA−42867−Aのプロ イ ラ雛
に対す°る成長促進効果について、対照薬剤にチオペブ
チンを用いて20ppmの添加濃度で13日間(8〜2
1日令)雛に与えて検討した。
試験方法は、PA−42867−Aの場合とほぼ同様に
、初生雛を8日令まで抗菌剤無添加飼料マツシュ(粗蛋
白濃度(CP) 23%)で平飼い飼育した後、1群2
4羽づつ(雄雌各12羽)合計4群の実験群を設定した
。これらの実験群はfスー(4−圧パンコシミニル)P
A−42867−A、  fスー(4−エピバンコ号ミ
ニルーO−グルコシル)PA−42867−A1チオベ
ブチン、無添加対照群である。各実験群は、ケージに各
々6〜7羽(雌雄別々にして)づつ収容した後、8〜2
1日令までの13日間、CP 18%の飼料に各薬剤を
20ppmfi度に添加して与えた。
有効性は、試験期間中の増体重(10日自重13日口重
と飼料要求率から評価した。試験成績は表3に示す通り
である。
飼料添加群では、無添加対照群に比べて成長促進が認め
られた。
及鳳! 以下に、飼料への各化合物の添加例を示す。
(1)  とうもろこし       46.45%マ
イロ          15.00 %大豆粕   
       5.00%魚粉           
 3.00%脱脂米ぬか        25.00X
アルフアルフア        3.0O%炭酸カルシ
ウム      1.00 %リン酸カルシウム   
   0.70%塩化ナトリウム      0.40
’Xビ’) ミンA、 D、 E混合物   o、os
x“無機塩混合物       0.1x10ビタミン
B群混合物    0.1  %PA−42867−A
         10 pp+m上記をよく混合する
“無機塩混合物:硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸鋼、硫
酸コバルト、ヨウ化カリウム 1ビタミンB群混合物:ビタミンB1%  ビタミンn
、ビタミンBs、ビタミンB1m%  ビオチン、葉酸
、パントテン酸カルシウム (り とうもろこし       41.00 %マイ
ロ         25.00X大豆粕      
    L9.10%魚粉            8
.00%油脂            4.00χ炭酸
カルシウム      1.40Xリン酸カルシウム 
     0.85χ0ビタミン無機塩混合物   0
.26χメチオニン        0.10%塩化ナ
トリウム       0.29XPA−45052−
A         20 ppm上記をよく混合する
0ビタミン無機塩混合物:ビタミンA、ビタミンD。
、ビタミンE1  ビタミンB11  ビタミン81%
  ビタミンB8、ビタミンB11、パントテン酸カル
シウム、ニコチン酸アミド、ビタミンに4、塩化コリン
、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸銅、硫酸亜鉛、硫酸
コバルト、ヨウ化カリウム (3)  とうもろこし       78  %大豆
油粕         9x 魚粉           10  %脂肪     
      3.9x 粗繊g           2.4%粗灰分    
      5.1x カルシウム         1.07%リン酸   
        0.73%アルファルファミール、食
塩、 次酸カルシウムの混合物  3x PA−42867−A         20 pp1
11上記をよく混合する。
(4)  デス−(4−エビバンクサミニル) PA−
42867−Aまたはデス−(4−エビパンコサミニル
ー〇−グルコシル’) PA−42867−Aを上記(
1)、(褐0)と同様に混合して、薬剤添加飼料とする

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. (1)式; ▲数式、化学式、表等があります▼ (式中Rは▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式
    、化学式、表等があります▼ またはHを表わす。) で示される化合物およびその塩からなる群から選択され
    る1種以上の化合物を有効成分とする動物用成長促進剤
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