DE68906172T2

DE68906172T2 - Verwendung eines Mittels zum Fördern des Tierwachstums.

Info

Publication number: DE68906172T2
Application number: DE89300764T
Authority: DE
Inventors: Yoshiyuki Hayashi; Takao Konishi; Koichi Matsumoto
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1988-01-26
Filing date: 1989-01-26
Publication date: 1993-11-11
Anticipated expiration: 2009-01-27
Also published as: EP0327259A2; KR890011901A; ATE88614T1; JPH0462300B2; KR950013454B1; AU2874989A; CA1328188C; DE68906172D1; ES2040993T3; AU611251B2; US4906612A; JPH01190633A; EP0327259A3; EP0327259B1

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung eines Mittels zum Fördern des Tierwachstums, umfassend, als einen wesentlichen Bestandteil, eine Verbindung der Formel I:
in der R
oder ein Wasserstoffatom bedeutet, oder ein Salz davon. Die Erfindung ermöglicht ein Verfahren zum Fördern des Tierwachstums, das die Verabreichung einer wirksamen Menge einer Verbindung der vorstehenden Formel I oder ein Salz davon in einer Beimischung mit herkömmlichen Trägern und/oder Tierfutterbestandteilen umfaßt.
In einem anderen Gesichtspunkt stellt die Erfindung die Verwendung einer erfindungsgemäßen Verbindung der Formel I oder ein Salz davon für die Herstellung einer tierwachstumsfördernden Zubereitung bereit.
Das Mittel zur erfindungsgemäßen Verwendung kann mit einem Verfahren hergestellt werden, das die Zubereitung einer erfindungsgemäßen Verbindung der Formel I oder ein Salz davon, gegebenenfalls als Vorgemisch zum Vermischen mit Tierfutter oder in Form einer Tierfutterration, zur tierärztlichen Verwendung umfaßt.
Die Erfindung ermöglicht die Aufzucht eines Tieres, das ein erhöhtes Wachstum zeigt, nachdem es einer Behandlung unter Verwendung des hier beschriebenen tierwachstumsfördernden Mittels unterzogen wurde.
Bis jetzt gab es viele bekannte Glycopeptidantibiotika, einschließlich Vancomycin, und ihre Derivate. Es ist auch allgemein bekannt, daß die Verabreichung solcher Antibiotika an Tiere das Tierwachstum fördern kann. Siehe zum Beispiel die japanischen Patentveröffentlichungen Nr. 129693/1982, 213394/1984, 213395/1984, 502335/1986, 122300/1986, 126970/1987, 199397/1985, 237099/1985, 231698/1985 und 251699/1986; die U.S.-Patente Nr. 4558036 und 4537770; und die europäische Patentveröffentlichung Nr. 119575. EP-A-231 111 offenbart auch Glycopeptide, wie Antibiotika, aber es erwähnt keine wachstumsfördernde Wirksamkeit.
Von den gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten Verbindungen ist eine Verbindung der vorstehenden Formel I, in der R
darstellt, bekannt und als PA-42867-A in der japanischen Patentveröffentlichung Nr. 174099/1987 offenbart. Eine Verbindung der vorstehenden Formel I, in der R
oder ein Wasserstoffatom darstellt, ist ebenfalls bekannt und als Des-(4-epi-vancosaminyl)PA-42867-A oder Des-(4-epi- vancosaminyl-O-glucosyl)PA-42867-A in der japanischen Patentveröffentlichung Nr. 1088865/1989 offenbart.
Gegenwärtig sind mehrere tierwachstumsfördernde Verbindungen, einschließlich Thiopeptin, im Handel erhältlich.
Wie vorstehend angegeben, ist von einigen Vancomycinantibiotika ebenfalls bekannt, daß sie eine wachstumsfördernde Wirkung gegenüber Tieren besitzen. Jedoch ist nichts über die wachstumsfördernde Wirkung der gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten Verbindungen bekannt.
Die Erfinder haben festgestellt, daß die vorstehend erwähnten Verbindungen eine starke antibakterielle Wirksamkeit gegenüber den zur Gattung Clostridium gehörenden Stämmen besitzen, wobei die Wirksamkeit nützlich für die Beurteilung der wachstumfördernden Wirkung der Verbindungen ist, und haben auch festgestellt, daß die Anwendung der Verbindungen bei Tieren zu einer bemerkenswerten Erhöhung an Körpergewicht führt.
Obwohl ein oder mehrere der an sich erfindungsgemäß verwendeten Glycopeptidverbindungen direkt bei Tieren zum Beispiel durch orale Verabreichung angewandt werden können, werden sie häufig in Form eines Vorgemisches angewandt, das durch Mischen (des) der Glycopeptide(s) mit üblichen Trägern, wie entfettete Reiskleie, entfettetes Sojamehl, Kleie, Kaolin, Talkum, Calciumcarbonat, Lactose, Wasser etc., hergestellt wird.
Stärker bevorzugt kann ein solches Vorgemisch oder die Glycopeptidverbindungen an sich bei Tieren nach Mischen mit herkömmlichen Tierfutter angewandt werden. So besteht eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäß verwendeten Mittels in einer Tierfutterration zur Wachstumsförderung, und daher ist die nachfolgende Erklärung bevorzugt Tierfutter gewidmet, die die vorstehend erwähnten Glycopeptid verbindungen enthalten.
Von den hier verwendeten Glycopeptidverbindungen ist nicht zwingend erforderlich, daß sie reine Substanzen sind; zum Beispiel kann ein Kulturmedium, in dem ein Glycopeptid herstellender Mikroorganismus gezüchtet wurde, als Ganzes nach einer teilweisen Reinigung verwendet werden. Tiermedizinisch verträgliche Salze der Glycopeptide können auch verwendet werden und schließen zum Beispiel Salze mit Alkalimetallen, wie Kalium und Natrium; Salze mit Erdalkalimetallen, wie Magnesium und Aluminium; Salze mit anorganischen Säuren, wie Salzsäure, Schwefelsäure und Salpetersäure; und Salze mit organischen Säuren, wie Essigsäure und Fumarsäure, ein.
Für die Zubereitung eines Tierfutters, das ein oder mehrere erfindungsgemäß verwendete Glycopeptide enthält, kann jede Substanz, die üblicherweise als Tierfutterbestandteil verwendet wird, verwendet werden. Beispiele solcher Substanzen sind Mais, Kleie, Reis, Weizen oder Gerste, Baumwollsaatmehl, Milo, Sojabohnenmehl, Fischmehl, entfettete Reiskleie, Öl und Fett, Luzerne, Calciumcarbonat, Calciumphosphat, Natriumchlorid, Cholinchlorid, Vitamine, wie Vitamin A, Vitamin D, Vitamin E, Vitamin B&sub1;, Vitamin B&sub2;, Vitamin B&sub6;, Vitamin B&sub1;&sub2;, Calciumpantothenat, Nicotinamid und Folsäure, anorganische Salze, wie Magnesiumsulfat, Eisensulfat, Kupfersulfat, Zinksulfat, Kaliumjodid und Kobaltsulfat. Alle oder Teile dieser Substanzen können mit einem oder mehreren Glycopeptiden gemischt werden. Außerdem können andere Antibiotika, Bakterizide, Mittel gegen Kokzidien, Wurmmittel und ähnliches ebenfalls zugegeben werden.
Das erfindungsgemäß verwendete wachstumsfördernde Mittel kann für verschiedene Tiere verwendet werden. Beispiele solcher Tiere sind Geflügel und Haustiere, einschließlich Küken, Truthahn, Ente, Wachtel, Kuh, Pferd, Schwein, Schaf, Ziege, Nerz, Kaninchen und ähnliche. Diese Tiere können in üblicher Weise gezüchtet werden.
Die tägliche Dosis eines oder mehrerer erfindungsgemäß verwendeter Glycopeptide beträgt 0.01 bis 3.0 mg/kg Körpergewicht des Tieres, unabhängig davon, ob das (die) Glycopeptid(e) an sich verwendet wird (werden), oder ob eine Mikroorganismenkultur, die die Glycopeptide enthält, oder eine extrahierte Rohsubstanz, die die Glycopeptide enthält, verwendet wird. Eine Dosis von 0.3 bis 3.0 mg/kg/Tag wird für Geflügel bevorzugt, während eine Dosis von 0.01 bis 1.0 mg/kg/Tag für Rinder und Schweine bevorzugt wird. Der Gehalt an erfindungsgemäß verwendeten Glycopeptid(en) im Tierfutter beträgt im allgemeinen 0.5 bis 100 ppm.
Das erfindungsgemäß verwendete wachstumsfördernde Mittel fördert nicht nur das Tierwachstum, sondern es verbessert auch die Futterverwertung. Das Mittel ist auch bei Behandlung bakterieller Erkrankungen wirksam. Außerdem ist seine Giftigkeit in Tieren gering und es verbleibt nicht in den Tierkörpern. Das erfindungsgemäß verwendete Mittel besitzt vorteilhafte Eigenschaften. Die LD&sub5;&sub0;-Werte der erfindungsgemäß verwendeten Mittel bei intravenöser Injektion in männliche Mäuse sind nachstehend aufgeführt: Verbindungen LD&sub5;&sub0; (mg/kg) Des-(4-epi-vancosaminyl) PA-42867-A Des-(4-epi-vancosaminyl-o-glucosyl) PA-42867-A
Das Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen ist in der japanischen Patentveröffentlichung (nicht geprüft) Nr. 174099/1987 und der japanischen Patentanmeldung Nr. 188865/1986 im einzelnen beschrieben und kann wie folgt beschrieben werden:

(a) Fermentationsschritt:

Eine Stammkultur auf Schrägagar der Nocardia sp. PA- 42867 (FERM BP-1230) wurde in einen Erlenmeyerkolben (2 l) eingebracht, in dem sich 800 ml Nährlösung, umfassend 0.5 % lösliche Stärke, 0.5 % Glucose, 0.5 % Polypepton, 0.5 % Fleischextrakt, 0.25 % Hefeextrakt, 0.25 % Natriumchlorid und entionisiertes Wasser (pH-Wert 7.0 vor Sterilisation) befanden, und unter Rühren bei 180 Upm 48 Stunden lang bei 28ºC fermentiert. Diese fermentierte Kulturlösung (800 ml) wird in ein Fermentergefäß (30 l) überführt, das mit 20 l der gleichen Kulturlösung, wie vorstehend angegeben, beschickt war, und unter Rühren mit 200 Upm 24 Stunden lang bei 28ºC fermentiert (Belüftungsgeschwindigkeit 20 l/min und innerer Druck 0.5 kg/cm²G). Dann wurden 10 l der entstandenen Kulturlösung in einen Bioreaktor (250 l) überführt, der mit 140 l Kulturlösung, umfassend 2.4 % Tomatenpaste, 2.4 % Dextrin, 1.2 % getrocknete Hefe (Beast, Iwaki Seiyaku Co., Ltd.), 0.0006 % Cobaltchlorid-Hexahydrat, 0.08 % Schaumverhütermittel P-2000 (Dai Nippon Ink & Chemicals Inc.) und Leitungswasser (pH-Wert 7.0 vor Sterilisation) beschickt war, und unter Rühren mit 325 Upm 64 Stunden lang bei 28ºC fermentiert (Belüftungsgeschwindigkeit 150 l/min und innerer Druck 5 psi).

(b) Isolationsschritt:

Die im vorstehenden Schritt hergestellte Kulturlösung, die mit 10%igem Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 10.0 eingestellt wird, wird zentrifugiert, wobei 145 l Überstand erhalten werden. Eingestellt auf einen pH-Wert von 4.0, wird der Überstand auf eine mit 13 l Dowex 50 x 2 (Na&spplus; Typ) (Dow Chemical Co.) beschickte Säule aufgetragen, mit 70 l Wasser gewaschen und mit 40 l 30%igem Aceton/Wasser, das 1 % Triethylamin enthält, eluiert. Die Fraktionen, die mit dem Massekuchen-Dispersionsverfahren unter Verwendung von Bacillus subtilis Aktivität zeigen, werden vereinigt (22 l), auf einen pH-Wert von 5.0 eingestellt und dann durch Eindampfen des Acetons unter reduziertem Druck kondensiert. Der Rückstand wird auf eine Säule mit 2 l HP-20 (Mitsubishi Chemical Industries Co., Ltd) aufgetragen, mit 20 l Wasser gewaschen und mit 50%igem Aceton/Wasser eluiert. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt (6 l), unter reduziertem Druck kondensiert und gefriergetrocknet, wobei 35.6 g des rohen PA-42867 als Pulver erhalten werden.

(c) Reinigungsschritt: PA-42867-A und -B

Das vorstehende Rohpulver (12 g) wird in 150 ml 0.01 n Salzsäure gelöst und auf eine Säule mit 100 ml MCI GEL CHP- 20P (Mitsubishi Chemical Industries Co.) aufgetragen. Die Säule wird unter Nachweis des Gehalts an PA-42867 durch HPLC mit 0.01 n Salzsäure eluiert. Die Fraktionen, die PA-42867-A und -B enthalten, werden auf einen pH-Wert von 7.0 eingestellt und wieder mit einer CHP-20P-Säule chromatografiert. Die Fraktionen, die PA-42867-A und -B enthalten, werden auf die Säule aufgetragen, gründlich mit 15%igem Methanol/Wasser gewaschen und mit 15%igem Methanol-0.005 n Salzsäure eluiert, wobei eine Fraktion, die PA-42867-A enthält, und eine Fraktion, die PA-42867-B enthält, erhalten wird.
Die Fraktion, die PA-42867-A enthält, wird auf pH-Wert 7.0 eingestellt und kondensiert. Zum Entfärben wird der Rückstand auf eine Säule mit 10 ml CHP-20P aufgetragen und dann mit verdünnter Salzsäure (pH 5.0) eluiert, wobei eine Fraktion, die PA-42867-A enthält, erhalten wird, die kondensiert und gefriergetrocknet wird, wobei 571 mg Rückstand erhalten werden (70 % Reinheit). Nach Lösen der 571 mg dieses Rückstands in Wasser und Einstellen auf einen pH-Wert von 5.0 durch Zugabe von verdünnter Salzsäure, wird die Lösung auf eine Säule mit 10 ml CHP-20P aufgetragen und mit Wasser eluiert, wobei eine Fraktion von PA-42867-A erhalten wird, die auf einen pH-Wert von 7.0 eingestellt und kondensiert wird. Der Rückstand wird wieder auf eine Säule mit 10 ml CHP-20P (stabilisiert mit 0.05 m phosphatgepufferter Salzlösung (pH 7.0.)) zum Entsalzen aufgetragen, mit 0.05 m phosphatgepufferter Salzlösung (pH 7.0) und dann mit Wasser gewaschen, und mit 50%igem Methanol/Wasser eluiert, wobei eine Fraktion von PA-42867-A erhalten wird, die kondensiert und gefriergetrocknet wird, wobei 256 mg PA-42867-A (95 % Reinheit) erhalten werden.
Die Fraktion, die wie vorstehend angegeben PA-42867-B enthält, wird auf pH-Wert 7.0 eingestellt, kondensiert und gefriergetrocknet, wobei 683 mg Rückstand erhalten werden. Der Rückstand (683 mg) des PA-42867-B wird in Wasser aufgelöst, auf einen pH-Wert von 4.0 durch Zugabe verdünnter Salzsäure eingestellt, auf eine Säule mit 5 ml CHP-20P zum Entfärben aufgetragen und mit verdünnter Salzsäure (PH-Wert 4.0) eluiert, wobei eine Fraktion von PA-42867-B erhalten wird, die auf einen pH-Wert von 7.0 eingestellt und kondensiert wird. Der Rückstand wird auf eine Füllkörpersäule RQ-2 (Fujigeru Hanbai K.K.) aufgetragen und mit 7%igem Acetonitril-0.05 m phosphatgepufferter Salzlösung (pH-Wert 4.9) und dann mit 8%igem Acetonitril-0.os m phosphatgepufferter Salzlösung (pH-Wert 4.9) eluiert, während die Reinheit des PA-42867-B durch HPLC nachgewiesen wird. Die Fraktionen mit mehr als 95 % Reinheit werden vereinigt, auf pH-Wert 7.0 eingestellt und kondensiert. Der Rückstand wird auf eine Säule mit 10 ml CHP-20P (stabilisiert mit 0.05 m phosphatgepufferter Salzlösung (pH-Wert 7.0)) zum Entsalzen aufgetragen, mit Wasser gewaschen und mit 50%igem Methanol/Wasser eluiert, wobei Fraktionen, die PA-42867-B enthalten, erhalten werden, die kondensiert und gefriergetrocknet werden, wobei 102 mg PA-42867-B (98 % Reinheit) erhalten werden.

(d) Reinigungsschritt: Des-(4-epi-vancosaminyl)-PA- 42867-A und Des-4-epi-vancosaminyl-O-glucosyl)-PA-42867-A

Genau 2.00 g des im vorstehenden Schritt (b) erhaltenen Rohprodukts (enthält 53 % PA-42867-A und 9 % PA-42867-B) werden in 200 ml 20%iger Salzsäure (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., für Feinanalyse) gelöst, und die Lösung wird 16 Stunden lang unter Eiskühlen (0 bis 1ºC) unter einer Stickstoffatmosphäre gerührt. Zur Reaktionslösung wird 6 n Natriumhydroxid (etwa 204 ml) gegeben, um den pH-Wert auf 9.2 einzustellen. Die Lösung wird auf MCI GEL CHP-20P (200 bis 400 mesh, 100 ml) aufgetragen und hintereinander mit Wasser (600 ml), 0.01 n Salzsäure (450 ml), Wasser (450 ml), 25%igem Methanol/Wasser (450 ml), 50%igem Methanol/Wasser (400 ml), Methanol (400 ml) und 50%igem Methanol-0.005 n Salzsäure (400 ml) eluiert.
Durch die Fraktionsüberprüfung mit HPLC (Nucleosil 300- 7C18), 4.6 ∅ x 250 mm, 10%igem Acetonitril-0.05 m PPS (pH- Wert 3.5), Fließgeschwindigkeit 1 ml/min., 220 nm UV- Nachweis) werden Fraktion A (0.01 n Salzsäure- und Wasserelutionsteile) und Fraktion B (50 % Methanol-, Methanol- und 50 % Methanol-0.005 n Salzsäureelutionsteile) erhalten.
Die Fraktion B wird konzentriert, auf pH-Wert 3.5 eingestellt, auf MCI GEL CHP-20P (200 bis 400 mesh, 10 ml) aufgetragen und hintereinander mit 300 ml Wasser (auf pH-Wert 4.0 mit Salzsäure/Wasser eingestellt, etwa 10&supmin;&sup4; n Salzsäure), 10 ml 15%iges Methanol/Wasser (pH-Wert 4.0), 100 ml 30%iges Methanol/Wasser (pH-Wert 4.0), 100 ml 50%iges Methanol/Wasser (pH-Wert 4.0), 50 ml Methanol und 50 ml 50%iges Methanol-0.005 n Salzsäure eluiert, wobei die Fraktion C (Wasser (pH-Wert 4.0)-Elutionsteil) und Fraktion D (50%iges Methanol-Wasser (pH-Wert 4.0)-Elutionsteil) erhalten werden.
Die Fraktionen A und C werden vereinigt, konzentriert, auf pH-Wert 7.0 eingestellt und unter Verwendung von MCI GEL CHP-20P (200 bis 400 mesh, 10 ml) entsalzt, hintereinander mit Wasser (100 ml), 25%igem Methanol/Wasser (100 ml), 50%igem Methanol/Wasser (100 ml), Methanol (100 ml) und 50%igem Methanol-0.005 n Salzsäure (50 ml) eluiert, wobei die Fraktion E (nicht entsalzter Teil) und Fraktion F (entsalzter Teil) erhalten werden. Die Fraktion E (nicht entsalzter Teil) wird wieder unter den gleichen Bedingungen entsalzt, wobei die Fraktion G (entsalzter Teil) erhalten wird.
In Wasser (39 ml) werden 800 mg der Niederschläge der erhaltenen Fraktionen F und G (nach Konzentrieren jeder Fraktion, Methanol wird zugegeben um einen Niederschlag zu bilden) unter Erhitzen gelöst, und Methanol (39 ml) wird zur Umkristallisation zugegeben, wobei 557 mg Des-(4-epi-vancosaminyl)PA-42867-A als Kristalle erhalten werden (1.5 Stunden Trocknen unter reduziertem Druck bei 30ºC in Gegenwart von Phosphorpentoxid) (HPLC 93% Reinheit, Ausbeute 46.0 %).
Getrennt werden aus der Kristallmutterlauge und der niederschlagsbildenden Mutterlauge 350 mg gefriergetrocknetes Produkt erhalten [Des-(4-epi-vancosaminyl)PA-42867-A, HPLC 91% Reinheit, Ausbeute 28.3 %].
Durch ähnliches Entsalzen der Fraktion D werden 30 mg gefriergetrocknetes Produkt erhalten [Des-(4-epi-vancosaminyl-O-glucosyl)PA-42867-A, HPLC 93 % Reinheit, Ausbeute 2.8 %].
Genau 100 mg des genauso wie im vorstehenden Schritt (c) erhaltenen PA-42867-A mit 90 % Reinheit werden in 10 ml 20%iger Salzsäure gelöst und 10 Minuten unter Erhitzen in einem Ölbad auf etwa 40 bis 45ºC unter Stickstoffatmosphäre gerührt. Die Reaktionslösung wird mit 6 n Natriumhydroxidlösung auf pH-Wert 9.2 eingestellt, auf MCI GEL CHP-20P (200 bis 400 mesh, 10 ml) aufgetragen und hintereinander mit Wasser (100 ml), 0.01 n Salzsäure (50 ml), Wasser (50 ml), 25%igem Methanol (50 ml), 50%igem Methanol (50 ml), Methanol (50 ml) und 50%igem Methanol-0.005 n Salzsäure (50 ml) eluiert.
Durch die Fraktionsüberprüfung mit HPLC (Nucleosil 300- 7C18, 10%iges Acetonitril-0.05 m PPS (pH-Wert 3.5), 220 nm UV-Nachweis) werden Fraktion I (0.01 n Salzsäure- und Wasserelutionsteile) und Fraktion II (50 % Methanol-, Methanol- und 50 % Methanol-0.005 n Salzsäureelutionsteile) erhalten.
Die Fraktion II wird konzentriert, auf pH-Wert 3.5 eingestellt, auf MCI GEL CHP-20P (200 bis 400 mesh, 10 ml) aufgetragen und hintereinander mit 50 ml Wasser (pH-Wert 4.0), 15%igem Methanol/Wasser (pH-Wert 4.0), 30%igem Methanol/Wasser (pH-Wert 4.0), 50%igem Methanol/Wasser (pH-Wert 4.0), 50 ml Methanol und 50 ml 50%igem Methanol-0.005 n Salzsäure eluiert, wobei die Fraktion III [Wasser (pH-Wert 4.0)- Elutionsteil] und Fraktion IV [50%iges Methanol-Wasser (pH- Wert 4.0)- und 50%iges Methanol-0.05 n Salzsäure-Elutionsteile] erhalten werden.
Die Fraktionen I und III werden vereinigt, konzentriert, auf pH-Wert 7.0 eingestellt und unter Verwendung von MCI GEL CHP-20P (200 bis 400 mesh, 5 ml) entsalzt, wobei 31.5 mg Des-(4-epi-vancosaminyl)PA-42867-A (Ausbeute 38.6 %) erhalten werden.
Die Fraktion IV wird gleich entsalzt, wobei 36.3 mg (Ausbeute 50.1 %) Des-(4-epi-vancosaminyl-O-glucosyl)PA- 42867-A erhalten werden.
Die Nocardia Sp. PA-42867, die PA-42867-A produziert, wurde als Nocardia orientalis PA-42867 bei dem Fermentation Research Institute, Agency of the Industrial Science & Technology, Higashi 1-1-3, Tsukuba City, Ibaragi Prefecture, am 8. Januar 1986 unter der Hinterlegungsnr. Bikoken Kinki 8601 (FERM P-8601) hinterlegt und gemäß dem Budapester Vertrag am 4. Dezember 1986 in eine Hinterlegung (FERM BP-1230) umgewandelt.

Experiment

PA-42867-A (Verbindung 1), Des-(4-epi-vancosaminyl)PA- 42867-A (Verbindung 2) und Des-(4-epi-vancosaminyl-O-glucosyl)PA-42867-A (Verbindung 3) wurden unter Verwendung von Clostridium perfringens anti-Mikroorganismen-Untersuchungen unterzogen und ihre wachstumsfördernden Wirkungen wurden bei Küken untersucht.

1. Bestimmung der MIK gegenüber Cl. perfringens

Elf von Kühen und Küken stammende Stämme der Cl. perfringens wurden bei der Untersuchung verwendet. Die Bestimmung der Empfindlichkeit wurde unter anaeroben Kulturbedingungen (Gasschutzverfahren) mit dem Agarplattenverdünnungsverfahren unter Verwendung von GAM-Agarmedium (Nippon Suisan Kaisha, Ltd.) durchgeführt. Nach Züchtung des Mikroorganismus bei 37ºC für 24 Stunden wurde die niedrigste Konzentration des Arzneimittels, bei der das Wachstum des Mikroorganismus sichtbar gehemmt war, d.h. eine Minimuminhibitorkonzentration (MIK) des Arzneimittels, bestimmt (Tabelle 1).
Bei der in vitro Überprüfung der Antibiotika wird angenommen, daß das Aufweisen einer antimikrobiellen Wirksamkeit gegen grampositive Bakterien, insbesondere Cl. perfringens, einen Indikator der wachstumsfördernden Wirksamkeit des untersuchten Arzneimittels darstellt (Poultry Science 62, 1633 - 1638, 1983; Poultry Science 63, 2036 - 2042, 1984). Tabelle 1. Bestimmung der MIK gegenüber Cl. perfringens MIK (ug/ml)) Stamm Ursprung Verbindung Kuh Küken Verbindung 1: PA-42867-A Verbindung 2: Des-(4-epi-vancosaminyl)PA-42867-A Verbindung 3: Des-(4-epi-vancosaminyl-O-glucosyl)PA-42867-A

2. Wachstumsfördernde Wirkung auf Küken

Die wachstumsfördernde Wirkung des PA-42867-A auf Küken (8 Tage alt, Abaeker-Spezies) wurde unter Verwendung eines bekannten Antibiotikums, Thiopeptin, als Kontrolle bestimmt. PA-42867-A und Thiopeptin wurden zu einem Antibiotika-freien Futterbrei (roher Proteingehalt (RP): 18 %) in einer Konzentration von 20 ppm gegeben, und die Küken wurden 10 Tage lang mit dem entstandenen Futter gemäß dem Batterieverfahren aufgezogen. Um das Verfahren des Experiments genauer zu beschreiben: Frisch geschlüpfte Küken wurden bis zu einem Alter von 8 Tagen mit einer Futterration mit 23 % RP mit dem Flachfütterungsverfahren gefüttert, dann wurden die Küken in drei Gruppen mit jeweils 25 - 26 Küken (jeweils 12 - 13 männliche und weibliche) so aufgeteilt, daß das mittlere Gewicht der Küken in allen Gruppen fast das gleiche war. Die PA-42867-A-Gruppe erhielt 10 Tage lang 20 ppm des Antibiotikums tägliche die Thiopeptingruppe erhielt 10 Tage lang 20 ppm, und die Kontrollgruppe erhielt 10 Tage lang antibiotikafreies Futter mit 18 % RP. Das vorstehende Füttern wurde fortgesetzt, nachdem man die Küken jeder Gruppe in Untergruppen mit 6 -7 Küken aufgeteilt und jede Untergruppe in einen Käfig (435 x 600 x 410 mm) gegeben hatte. Das Füttern wurde 10 Tage lang (bis zu einem Alter von 18 Tagen) bei einer Umgebungstemperatur von 26 ± 2ºC fortgesetzt. Die Wirksamkeit des Arzneimittels wurde bezogen auf die Zunahme an Körpergewicht und die während der 10 Tage des Experiments beobachtete Futterverwertung beurteilt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 aufgeführt. Tabelle 2 Wachstumsfördernde Wirkung auf Küken Zunahme an Körpergewicht* (g) Experimentelle Gruppe Anzahl der Küken Mittelwert ± Standardfehler (Index) Futterverwertung Kein Antibiotikum Thiopeptin (20 ppm x 10 Tage) PA-42867-A (20 ppm x 10 Tage) * Unterschied zwischen dem Körpergewicht am Ende des Experiments (Alter von 18 Tagen) und dem anfänglichen Gewicht. ** P < 0.01 (T Test)
Verglichen mit der Kontrollgruppe, die kein Antibiotikum erhielt, und mit der Gruppe, die Thiopeptin erhielt, zeigte die Gruppe, die PA-42867-A erhielt, eine deutlich höhere Zunahme an Körpergewicht (p < 0.01). Die PA-42867-A- Gruppe und die Thiopeptingruppe zeigten bessere Ergebnisse in der Futterverwertung verglichen mit der Gruppe, die mit antibiotikafreiem Futter aufgezogen wurde.
Genauso wurden andere wachtumsfördernde Untersuchungen des Des-(4-epi-vancosaminyl) PA-42867-A und Des-(4-epi-vancosaminyl-O-glucosyl)PA-42867-A durch Verabreichen von 20 ppm des Testarzneimittels an 8 - 21 Tage alte Küken während 13 Tagen unter Verwendung von Thiopeptin als Kontrolle durchgeführt.
Die frisch geschlüpften Küken wurden bis zu einem Alter von acht Tagen mit einem Futterbrei (roher Proteingehalt (RP): 23 %) ohne Zugabe eines Antibiotikums mittels Flachfütterung gefüttert. Dann wurden die Küken in vier Gruppen mit jeweils 24 Küken (jeweils 12 männliche und weibliche) aufgeteilt. Jede Gruppe wurde nach Aufteilen in vier gleichgeschlechtliche Untergruppen, die jeweils aus 6 - 7 Küken bestanden, in vier Käfige gegeben und 13 Tage lang mit einem Tierfutter mit 18 % RP mit oder ohne Antibiotika aufgezogen. So erhielt jede der vier Gruppen 20 ppm Des-(4-epi-vancosaminyl)PA-42867-A, 20 ppm Des-(4-epi-vancosamnyl-O-glucosyl)PA-42867-A, 20 ppm Thiopeptin bzw. kein Antibiotikum.
Die Zunahme an Körpergewicht und die Futterverwertung wurden am 10. und 13. Tag gemessen. Die Untersuchungsergebnisse sind in der Tabelle 3 aufgeführt.
Eine Wachstumsförderung wurde bei den Gruppen, die Antibiotika erhielten, verglichen mit der Gruppe, die kein Antibiotikum erhielt, beobachtet. Tabelle 3 Wachstumsfördernde Wirkung auf Küken Zunahme an Körpergewicht* (g) ± Standardfehler (Index) Futterverwertung Experimentelle Gruppe Anzahl der Küken Tage Kein Antibiotikum* Verbindung (20 ppm x 13 Tage) Thiopeptin (20 ppm x 13 Tage) *: Die Kontrollgruppe erhielt ein Tierfutter mit nur 18 % Rohprotein. **: Die Zahlen in ( ) zeigen einen Vergleichsindex jeder Gruppe, wenn die Körpergewichtszunahme der Kontrollgruppe als 100 angenommen wird. Verbindung 1: Des-(4-epi-vancosaminyl)PA-42867-A Verbindung 2: Des-(4-epi-vancosaminyl-O-gulcosyl)PA-42867-A
Die erfindungsgemäß verwendeten Tierfutter, die das Tierwachstum fördern, können auf übliche Weise hergestellt werden und werden durch die folgenden Beispiele veranschaulicht.

Beispiel 1

Mais 46.45 %
Milo 15.00 %
Sojabohnenmehl 5.00 %
Fischmehl 3.00 %
Entfettete Reiskleie 25.00 %
Luzerne 3.00 %
Calciumcarbonat 1.00 %
Calciumphosphat 0.70 %
Natriumchlorid 0.40 %
Gemisch der Vitamine A, D und E 0.05 %
* Gemisch an anorganischen Salzen 0.10 %
** Gemisch der Vitamin B-Gruppe 0.10 %
PA-42867-A 10 ppm
Die vorstehenden Bestandteile werden gründlich vermischt, wobei ein Tierfutter für Geflügel oder Schweine erhalten wird. *Gemisch der anorganischen Salze: Mangansulfat, Zinksulfat, Kupfersulfat, Kobaltsulfat und Kaliumjodid. **Gemisch der Vitamin B-Gruppe: Vitamin B&sub1;, Vitamin B&sub2;, Vitamin B&sub6;, Vitamin B&sub1;&sub2;, Biotin, Folsäure und Calciumpantothenat.

Beispiel 2

Mais 41.00 %
Milo 25.00 %
Sojabohnenmehl 19.10 %
Fischmehl 8.00 %
Öl und Fett 4.00 %
Calciumcarbonat 1.40 %
Calciumphosphat 0.85 %
* Gemisch der Vitamine und anorganischen Salze 0.26 %
Methionin 0.10 %
Natriumchlorid 0.29 %
PA-42867-A 20 ppm
Die vorstehenden Bestandteile werden gründlich vermischt, wobei ein Tierfutter für Geflügel oder Schweine erhalten wird.

*Gemisch der Vitamine und anorganischen Salze: Vitamin A, Vitamin D&sub3;, Vitamin E, Vitamin B&sub1;, Vitamin B&sub2;, Vitamin B&sub6;, Vitamin B&sub1;&sub2;, Calciumpantothenat, Nicotinamid, Vitamin K&sub4;, Cholinchlorid, Magnesiumsulfat, Eisensulfat, Kupfersulfat, Zinksulfat, Kobaltsulfat und Kaliumjodid.

Beispiel 3

Mais 78 %
Sojabohnenmehl 9 %
Fischmehl 10 %
Fett 3.9 %
rohe Faser 2.4 %
rohe Asche 5.1 %
Calcium 1.07 %
Phosphorsäure 0.73 %
Gemisch aus Luzernemehl, Natriumchlorid und Calciumcarbonat 3.0 %
PA-42867-A 20 ppm
Die vorstehenden Bestandteile werden gründlich vermischt, wobei ein Tierfutter für Geflügel oder Schweine erhalten wird.

Beispiel 4

Des- (4-epi-vancosaminyl) PA-42867-A oder Des-(4-epi-vancosaminyl-O-glucosyl) PA-42867-A wird mit anderen Bestandteilen genauso wie in den vorstehend erwähnten Beispielen 1, 2 oder 3 vermischt, wobei ein Tierfutter für Geflügel oder Schweine erhalten wird.

Claims

1. Verwendung eines Mittels zum Fördern des Tierwachstums, umfassend, als einen wesentlichen Bestandteil, eine Verbindung der Formel I: in der R

oder ein Wasserstoffatom bedeutet, oder ein Salz davon.

2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Mittel die in Anspruch 1 definierte Verbindung im Gemisch mit üblichen Trägern und/oder Stoffen für ein Tierfutter umfaßt.

3. Verwendung nach Anspruch 1, wobei eine wie in Anspruch 1 definierte Verbindung der Formel I oder ein Salz davon in einer Formulierung vorliegt, die ein Premix zum Vermischen mit Tierfutter oder einer Tierfutterration ist.

4. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Verbindung der Formel I oder ein Salz davon an sich vorliegt oder in Form einer diese enthaltenden Mikroorganismuskultur oder in Form eines Rohextrakts einer solchen Kultur vorliegt.

5. Verwendung einer Verbindung der Formel I gemäß Anspruch 1 oder eines Salzes davon für die Herstellung einer das Tierwachstum fördernden Zubereitung.