JPH0462300B2

JPH0462300B2 -

Info

Publication number: JPH0462300B2
Application number: JP63015341A
Authority: JP
Inventors: Koji Hayashi; Takao Konishi; Koichi Matsumoto
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1988-01-26
Filing date: 1988-01-26
Publication date: 1992-10-05
Also published as: EP0327259A2; DE68906172T2; KR890011901A; ATE88614T1; KR950013454B1; AU2874989A; CA1328188C; DE68906172D1; ES2040993T3; AU611251B2; US4906612A; JPH01190633A; EP0327259A3; EP0327259B1

Description

【発明の詳細な説明】

産業上の利用分野本発明は、式；（式中Ｒは

【式】

【式】を表わす。）で示される化合物およびその塩からなる群から選
択される１種以上の化合物を有効成分とする動物
用成長促進剤に関する。従来の技術グリコペプチド系抗生物質としては、従来よ
り、バンコマイシンおよびその誘導体など数多く
の化合物が知られており、これらを動物に投与す
ることによりその成長を促進することができるこ
とも良く知られている（例えば、特開昭57−
129693、特開昭59−213394、特開昭59−213395、
特表昭61−502335、特開昭61−122300、特開昭62
−126970、特開昭60−199397、特開昭60−
237099、特開昭60−231698、特開昭61−251699、
米国特許4558036、米国特許4537770、欧州公開特
許119575など）。本発明に関わる化合物のうち、式中Ｒがである化合物PA−42867−Ａは特開昭62−174099
に開示されており、また、式中Ｒがまたは水素である化合物は、特願昭61−188865
に、デス−（４−エピバンコサミニル）PA−
42867−Ａ、および、デス−（４−エピバンコサミ
ニル−Ｏ−グルコシル）PA−42867−Ａとして記
載されている。現在、動物用成長促進剤としてチオペプチンな
どが市販されている。発明が解決しようとする課題上記のように、バンコマイシン系抗生物質が動
物に対して成長促進作用を有することが知られて
いたが、本発明に関わる化合物が成長促進作用を
有することは全く知られていなかつた。課題を解決するための手段本発明者らは、上記３化合物が動物成長促進作
用の指標となる、クロストリジウム属に属する菌
株に対する強い抗菌活性を有することを見出し、
かつ、これら化合物を動物飼料に添加して動物を
飼育すると、その体重が顕著に増加することを見
出し本発明を完成した。本発明の成長促進剤を動物に投与する場合に
は、直接投与する場合には、本発明に関わるグリ
コペプチド類を直接経向投与してもよいが、一般
的には通常使用されている担体（例えば、脱脂米
糠、脱脂大豆粉、ふすま、カオリン、タルク、炭
酸カルシウム、乳糖、水など）と混合したものを
投与するか、あるいはこのように混合したものも
しくはグリコペプチド類単独を動物飼料もしくは
水と混合して投与する方法が好ましい。ここで使
用するグリコペプチド類は、必ずしも純品である
必要はなく、例えば本発明に関わるグリコペプチ
ド生産菌を培地に培養して得られた培養物を部分
的に精製したものであつてもよい。さらに、グリ
コペプチドの製薬上許容される塩を使用してもよ
く、カリウム、ナトリウムなどのアルカリ金属、
アルミニウム、マグネシウムなどのアルカリ土類
金属、塩酸、硫酸、硝酸などの無機酸および酢
酸、フマル酸などの有機酸との塩があげられる。本発明に関わるグリコペプチド類の１または２
以上を含有する動物の飼料は、動物の飼料として
一般に使用される飼料であればいずれでもよい。
その例を挙げると次の通りである。すなわち、と
うもろこし、ふすま、米、麦、綿実粕、マイロ、
大豆粕、魚粉、脱脂米ぬか、油脂、アルフアルフ
ア、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、塩化ナ
トリウム、塩化コリン、ビタミンＡ、ビタミン
Ｄ、ビタミンＥ、ビタミンB₁、ビタミンB₂、ビ
タミンB₆、ビタミンB₁₂、パントテン酸カルシウ
ム、ニコチン酸アミド、葉酸などのビタミン剤、
硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸銅、硫酸亜鉛、
ヨウ化カリウム、硫酸コバルトなどの無機塩、な
どの一部または全部を混合し使用される。この他
に、他の抗生物質や殺菌剤、抗コクシジウム剤、
駆虫剤などを添加してもよい。また、本発明に係るグリコペプチド類１種また
は２種以上の飼料中の含有量は、それらをそれぞ
れ単独に使用する場合、それらの任意の混合物を
使用する場合、それらを含有する菌体、それらを
含む抽出粗製物を使用する場合のいずれの場合で
も、使用するグリコペプチド類として、0.5〜
100ppmの範囲が適当である。この発明の成長促進剤は動物一般に使用でき、
その例として、にわとり、七面鳥、あひる、うず
ら、牛、馬、豚、羊、山羊、ミンク、うさぎなど
家禽および家畜が挙げられる。また動物の飼育法は、一般に行なわれている方
法をそのまま用いればよい。本発明の成長促進剤は、動物の成長を促進する
のみならず、動物の飼料要求率を改善する。ま
た、細菌性疾患などにも有効である。さらに、動
物に対して低毒性であり、動物体内には全く残留
しない特徴を有しているので、極めて優れてい
る。以下に、本発明に係る化合物の雄マウス静注
におけるLD₅₀値を示す。 LD₅₀（mg／Kg） PA−42867−Ａ 1955 デス（４−エピバンコサミニル）PA−42867−Ａ
＞3000 デス（４−エピバンコサミニル−Ｏ−グルコシ
ル）PA−42867−Ａ 205 本発明に係る化合物の製造法は、特開昭62−
174099および特願昭61−188865に詳述されている
が、下記の通りに製造することができる。 (a) 発酵工程：可溶性澱粉0.5％、グルコース0.5％、ポリペ
プトン0.5％、牛肉エキス0.5％、酵母エキス
0.25％、食塩0.25％、脱イオン水（PH7.0、殺菌
前）よりなる培地800mlを含む２容三角フラ
スコにノカルデイア・エスピーPA−42867（微
工研条寄第1230号）の種培養スラントを接種
し、毎分180回転で、28℃、48時間振盪培養を
行なう。この培養液800mlを、上記と等しい成
分からなる培地20を含む30容ジヤーフアー
メンターに植菌し、通気量20／分、内圧0.5
Kg／cm²Ｇ、撹拌回転数200rpmで、28℃、24時
間培養する。次いでこの培養液10を、トマト
ペースト2.4％、デキストリン2.4％、乾燥酵母
（ビースト、岩城製薬製）1.2％、塩化コバル
ト・６水和物0.0006％、消泡剤Ｐ−2000（大日
本インキ製）0.08％、水道水（PH7.0、殺菌前）
よりなる培地140を含む250発酵タンクに植
菌し、通気量150／分、内圧5psi、撹拌回点
数325rpmで、28℃、64時間培養する。 (b) 分離工程：上記工程で得られた培養液は10％水酸化ナト
リウムにてPH10.5に調整し、遠心分離によつて
上清液145を得る。この上清液をPH4.0に調整
御、13のダウエツクス50×２（Na⁺型）（ダウ
ケミカル社製）のカラムに流し、水70で洗浄
後、１％トリエチルアミンを含む30％アセトン
水40で溶出する。枯草菌を用いたパルプデイ
スク拡散法で活性を示すフラクシヨン22を集
め、PH５に調整する。これを減圧濃縮しアセト
ンを留去する。次いで、HP−20（三菱化成社
製）２のカラムに流す。水20で洗浄後、50
％アセトン水で溶出する。活性フラクシヨン６
を集める。これを減圧濃縮し、凍結乾燥する
とPA−42867の粗粉末35.6ｇを得る。 (c) 精製工程：PA−42867−Ａおよび−Ｂ上記粗粉末12ｇを用いて0.01N塩酸150ml溶
液とし、MCI GEL CHP−20P（三菱化成社
製）100mlでクロマトする。HPLCで含有程度
をチエツクしながら0.01N塩酸で溶出し、PA
−42867−Ａ、Ｂを含む分画をPH7.0とし、再度
CHP−20Pでクロマトする。PA−42867−Ａ、
Ｂ含有液をアプライした後、15％メタノール水
で充分洗浄し、15％メタノール−0.005N塩酸
で溶出し、PA−42867−Ａ含有分画およびPA
−42867−Ｂ含有分画に分ける。PA−42867−
Ｂ含有分画をPH7.0に調整後濃縮凍結乾燥し、
残渣683mgを得た。PA−42867−Ａ含有分画は
PH7.0に調整後濃縮し、脱色目的でCHP−
20P10mlでクロマトし、希塩酸（PH5.0）水溶液
で溶出し、PA−42867−Ａを含む分画を集め、
濃縮後凍結乾燥して、残渣571mg（純度70％）
を得る。この571mgを水に溶解した後希塩酸を
加えPH5.0に調整し、CHP−20P10mlのカラム
に付し、水で溶出し、PA−42867−Ａ含有分画
を集めPH7.0に調整し、濃縮後再度脱塩目的で
CHP−20P10ml（0.05Mリン酸塩緩衝液（PH
7.0）で安定化）のカラムに付し、0.05Mリン
酸塩緩衝液（PH7.0）で洗浄、水洗後50％メタ
ノール水で溶出、PA−42867−Ａ含有分画を集
め、濃縮後凍結乾燥しPA−42867−A256mg
（純度95％）を得る。PA−42867−Ｂ含有残渣
683mgは水に溶解後希塩酸を加えPH4.0に調整し
脱色目的でCHP−20P5mlのカラムに付し、希
塩酸水溶液（PH4.0）で溶出し、PA−42867−
Ｂ含有分画を集めPH7.0に調整し濃縮した後、
パツクドカラムRQ−２（富士ゲル販売株式会
社）に付す。HPLCで純度をチエツクしながら
７％アセトニトリル−0.05Mリン酸塩緩衝液
（PH4.9）、次いで８％アセトニトリル−0.05M
リン酸塩緩衝液（PH4.9）で溶出、95％純度以
上の分画を集めPH7.0に調整し、濃縮後脱塩の
ためCHP−20P10ml（0.05Mリン酸緩衝液（PH
7.0）で安定化）のカラムに付す。水洗後、50
％メタノール−水で溶出しPA−42867−Ｂ含有
分画を集め、濃縮、凍結乾燥し、PA−42867−
B102mg（純度98％）を得る。 (d) 精製工程；デス−（４−エピバンコサミニル）
PA−42867−Ａおよびデス−（４−エピバンコ
サミニル−Ｏ−グルコシル）PA−42867−Ａ上記工程(b)で得た粗生成物（PA−42867−A53
％とPA−42867−B9％を含有）2.00ｇを、20％
塩酸（和光純薬工業、精密分析用）200mlに溶解
し、窒素雰囲気下氷冷（０〜１℃）して16時間撹
拌する。反応液に6N水酸化ナトリウム（約204
ml）を加えてPH9.2に調整する。MCI GEL CHP
−20P（200〜400メツシユ、100ml）に付し、水
（600ml）、0.01N塩酸（450ml）、水（450ml）、25
％メタノール水（450ml）、50％メタノール水
（400ml）、メタノール（400ml）、50％メタノール
−0.005N塩酸（400ml）で順次溶出する。 HPLC［ヌクレオシル（Nucleosil）300−7C18、
4.6φ×250mm、10％アセトニトリル−0.05M PBS
（PH3.5）流速１ml／分、220nｍUV検出］による
分画チエツクにより、分画Ａ（0.01N塩酸、水溶
出部）と分画Ｂ（50％メタノール、メタノール、
50％メタノール−0.005N塩酸溶出部）を得る。分画Ｂを濃縮後、PH3.5に調整し、MCI GEL
CHP−20P（200〜400メツシユ、10ml）に付し、
水（PH4.0に塩酸水で調整、約10^-4N塩酸）300
ml、15％メタノール−水（PH4.0）100ml、30％メ
タノール−水（PH4.0）100ml、50％メタノール−
水（PH4.0）100ml、メタノール50ml、50％メタノ
ール−0.005N塩酸50mlで順次溶出し、分画Ｃ［水
（PH4.0）溶出部］と分画Ｄ［50％メタノール−水
（PH4.0）溶出部］を得る。分画Ａ、Ｃを合わせて濃縮し、PH7.0に調整し
た後、MCI GEL CHP−20P（200〜400メツシ
ユ、10ml）を用いた脱塩する。水（100ml）、25％
メタノール水（100ml）、50％メタノール水（100
ml）、メタノール（100ml）、50％メタノール−
0.005N塩酸（50ml）で溶出し、分画Ｅ（未脱塩
部）と分画Ｆ（脱塩部）を得る。分画Ｅ（未脱塩
部）を同一条件で再脱塩し、分画Ｇ（脱塩部）を
得る。得られた分画Ｆ、Ｇの沈殿部（各分画を濃縮
後、メタノールを加え沈殿を生成させる）800mg
を水（39ml）に加熱溶解後、メタノール（39ml）
を加え再結晶し、結晶557mg（五塩化燐の存在下、
30℃で1.5時間減圧乾燥）を得る。［デス−（４−
エピバンコサミニル）PA−42867−Ａ、HPLC93
％、収率46.0％］別に、結晶母液、沈殿生成母液から凍結乾燥体
350mg［デス−（４−エピバンコサミニル）PA−
42867−Ａ、HPLC91％、収率28.3％］を得る。分画Ｄを同様に脱塩することにより、凍結乾燥
体30mg［デス−（４−エピバンコサミニル−Ｏ−
グルコシル）PA−42867−Ａ、HPLC93％、収率
2.8％］を得る。上記工程(c)と同様にして得た純度90％のPA−
42867−A100mgを20％塩酸10mlに溶解し、窒素雰
囲気下油浴温度40〜45℃で加温しながら10分間撹
拌する。反応液を6N水酸化ナトリウムでPH9.2に
調整し、MCI GEL CHP−20P（200〜400メツシ
ユ、10ml）に付し、水（100ml）、0.01N塩酸（50
ml）、水（50ml）、25％メタノール（50ml）、50％
メタノール（50ml）、メタノール（50ml）、50％メ
タノール−0.005N塩酸（50ml）で順次溶出する。 HPLC（ヌクレオシル300−7C18、10％アセト
ニトリル−0.05M PBS（PH3.5）、220nｍUV検出）
による分画のチエツクにより分画（0.01N塩
酸、水溶出部）と分画（50％メタノール、メタ
ノール、50％メタノール−0.005N塩酸溶出部）
を得る。分画を濃縮後、PH3.5に調整し、MCI GEL
CHP−20P（200〜400メツシユ、10ml）に付し、
水（PH4.0）50ml、15％メタノール−水（PH4.0）、
30％メタノール−水（PH4.0）、50％メタノール−
水（PH4.0）、メタノール50ml、50％メタノール−
0.005N塩酸50mlで溶出し、分画［水（PH4.0）
溶出部］と分画［50％メタノール−水（PH
4.0）、50％メタノール−0.005N塩酸溶出部］を得
る。分画、を合わせて濃縮し、PH7.0に調整し
た後、MCI GEL CHP−20P（200〜400メツシ
ユ、５ml）を用いて脱塩し、デス−（４−エピバ
ンコサミニル）PA−42867−Ａ 31.5mg（収率
38.6％）を得る。分画も同様に脱塩し、デス−（４−エピバン
コサミニル−Ｏ−グルコシル）PA−42867−Ａ
36.3mg（50.1％）を得る。なお、PA−42867−Ａを産生するノカルデイ
ア・エスピー PA−42867は、昭和61年１月８日
よりNocardia orientalis PA−42867、微工研菌
寄第8601（FERM Ｐ−8601）として茨城県つく
ば市東１−１−３の微生物工業技術研究所に寄託
されており、昭和61年12月４日に微工研条寄第
1230（FERM BP−1230）としてブダペスト条約
に基づく寄託に移管された。参考例 PA−42867−Ａ、デス−（４−エピバンコサミ
ニル）PA−42867−Ａ、デス−（４−エピバンコ
サミニル−Ｏ−グルコシル）PA−42867−Ａのク
ロストリジウム・ペルフリンジエンス
（Clostridium perfringens）に対するin vitro試
験とブロイラー雛に対する成長促進効果試験を実
施した。１ Cl.perfringensに対するin vitro試験試験菌のCl.perfringensは牛および鶏由来の
合計11株を用いた。感受性測定方法は、測定用
培地としてGAM寒天培地（日水）を用いて、
寒天平板希釈法による嫌気培養（ガスパツク
法）を行なつた。判定は、37℃で24時間培養し
た後、肉眼で明らかに発育が阻止された最低濃
度（MIC）をもつてその薬剤のMIC値とした。生長促進を目的とした抗生物質のin vitroス
クリーニングでは、グラム陽性菌に対する活
性、特にCl.perfringensに対する活性が１つの
目安とされている（Poultry Science 62、1633
〜1638、1983；Poultry Science 63、2036〜
2042、1984）。

【表】

【表】２雛に対する成長効果試験 PA−45867−Ａのブロイラ雛（８日令、アバ
ーエーカー種）に対する成長促進効果を、既知
抗生物質チオペプチンを対照薬剤として用いて
検討した。添加濃度は、それぞれ抗菌剤無添加
飼料マツシユ（粗蛋白濃度（CP）：18％）に
20ppmにの添加濃度で10日間与えバタリー飼育
方式で検討した。実験方法は、初生雛を８日令
時までCP濃度23％の飼料で平飼い飼育した後、
１群25〜26羽（雌雄各12〜13羽）ずつ各群の体
重が均一になるように合計３群の実験群に区分
した。各実験群は、PA−42867−Ａ群20ppm×
10日間、チオペプチン20ppm×10日間、無添加
対照群CP18％飼料10日間である。これらの各
実験群は、６〜７羽ずつケージ（435×600×
410mm）に収容した後、10日間（18日令）環境
温度26±２℃の条件下で飼育した。有効性の評
価法は、試験期間中（10日間）の増体重と飼料
要求率から評価した。試験成績は表２に示す通りである。

【表】たもの
＊＊ P＜0.01(T検定)
PA−42867−Ａ添加群は、対照薬のチオペプチ
ン添加群と無添加対照群に比べて有意（Ｐ＜
0.01）に体重が重いものであつた。また、飼料要
求率においても、PA−42867−Ａ添加群とチオペ
プチン添加群が無添加群に比べて優れた成績を示
した。次いで、デス−（４−エピバンコサミニル）PA
−42867−Ａとデス（４−エピバンコサミニル−
Ｏ−グルコシル）PA−42867−Ａのブロイラ雛に
対する成長促進効果について、対照薬剤にチオペ
プチンを用いて20ppmの添加濃度で13日間（８〜
21日令）雛に与えて検討した。試験方法は、PA−42867−Ａの場合とほぼ同様
に、初生雛を８日令まで抗菌剤無添加飼料マツシ
ユ（粗蛋白濃度（CP）23％）で平飼い飼育した
後、１群24羽ずつ（雌雄各12羽）合計４群の実験
群を設定した。これらの実験群はデス−（４−エ
ピバンコサミニル）PA−42867−Ａ、デス−（４
−エピバンコサミニル−Ｏ−グルコシル）PA−
42867−Ａ、チオペプチン、無添加対照群である。
各実験群は、ケージに各々６〜７羽（雌雄別々に
して）づつ収容した後、８〜21日令までの13日
間、CP18％の飼料に各薬剤を20ppm濃度に添加
して与えた。有効性は、試験期間中の増体重（10日目、13日
目）と飼料要求率から評価した。試験成績は表３
に示す通りである。飼料添加群では、無添加対照群に比べて成長促
進が認められた。

【表】実施例以下に、飼料への各化合物の添加例を示す。 (1) とうもろこし 46.45％マイロ 15.00％大豆粕 5.00％魚粉 3.00％脱脂米ぬか 25.00％アルフアルフア 3.00％炭酸カルシウム 1.00％リン酸カルシウム 0.70％塩化ナトリウム 0.40％ビタミンＡ、Ｄ、Ｅ混合物 0.05％＊無機塩混合物 0.1％＊＊ビタミンＢ群混合物 0.1％ PA−42867−Ａ 10ppm 上記をよく混合する。＊無機塩混合物：硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫
酸銅、硫酸コバルト、ヨウ化カリウム＊＊ビタミンＢ群混合物：ビタミンB₁、ビタ
ミンB₂、ビタミンB₆、ビタミンB₁₂、ビオチ
ン、葉酸、パントテン酸カルシウム (2) とうもろこし 41.00％マイロ 25.00％大豆粕 19.10％魚粉 8.00％油脂 4.00％炭酸カルシウム 1.40％リン酸カルシウム 0.85％＊ビタミン無機塩混合物 0.26％メチオニン 0.10％塩化ナトリウム 0.29％ PA−45052−Ａ 20ppm 上記をよく混合する。＊ビタミン無機塩混合物：ビタミンＡ、ビタミ
ンD₃、ビタミンＥ、ビタミンB₁、ビタミンB₂、
ビタミンB₆、ビタミンB₁₂、パントテン酸カル
シウム、ニコチン酸アミド、ビタミンK₄、塩
化コリン、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸
銅、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、ヨウ化カリウム (3) とうもろこし 78％大豆油粕９％魚粉 10％脂肪 3.9％粗繊維 2.4％粗灰分 5.1％カルシウム 1.07％リン酸 0.73％アルフアルフアミール、食塩、炭酸カルシウム
の混合物３％ PA−42867−Ａ 20ppm 上記をよく混合する。 (4) デス−（４−エピバンコサミニル）PA−
42867−Ａまたはデス−（４−エピバンコサミニ
ル−Ｏ−グルコシル）PA−42867−Ａを上記
(1)、(2)、(3)と同様に混合して、薬剤添加飼料と
する。

Claims

【特許請求の範囲】１式；（式中Ｒは
【式】または【式】を表わす。）で示される化合物およびその塩からなる群から選
択される１種以上の化合物を有効成分とする動物
用成長促進剤。