Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia pochodnych 3a -metyloszesciowodoroindanu o wzorach 1 i 2 sto¬ sowanych jako produkty posrednie do wytwarza¬ nia uzytecznych steroidów.Przeksztalcanie steroidów przeprowadzane przy uzyciu drobnoustrojów jest szeroko znane i opi¬ sane w literaturze. Jednymi z najwczesniej opu¬ blikowanych prac sa publikacje Mamoli i Ver- cellone w Ber. 70, 470, 1937 i Ber. 70, 2079, 1937.Autorzy ci opisali proces redukcji 17Jketosteroi- dów do 17(3-hydroksysteroidów przeprowadzany przy uzyciu drozdzy fermentacyjnych. W pózniej¬ szej pracy Petersona i Murraya opisano proces lla-hydroksylacji progesteronu, prowadzony przy uzyciu grzybów Rhizopusnigricans /patrz opis pa¬ tentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 2 602 769/. W opisie patentowym St. Zjedn. Ame¬ ryki nr 3 684 657 opisano selektywny mikrobiolo¬ giczny proces rozkladu 17-alkilosteroidów, w któ¬ rym grupa alkilowa w polozeniu 17 oznacza grupe o co najmniej 8 atomach wegla, przeprowadzany przy uzyciu Mycobacterium sp NRRL B-3683, w celu uzyskania androsten-4-dionu-3,17, androsta- dieno-l,4-dionu-3,17 i 20a-hydroksymetylopregnadie- no-l,4-onu-3. W opisie patentowym St. Zjedn. Ame¬ ryki nr 3 759 791 opisano selektywne mikrobiolo¬ giczne wytwarzanie androsteno-4-dionu-3,17 na drodze fermentacji steroidu z serii cholestanu lub stigmastanu, posiadajacego w polozeniu 17 grupe 10 15 20 25 alkilowa o co najmniej 8 atomach wegla, przepro¬ wadzane przy uzyciu Mycobacterium sp NRRL B-3805.Zwiazki o wzorze 1 i o wzorze 2 sa nowe.Wprawdzie Schubert i jego wspólpracownicy w 1964 roku /Steroids 4, 581—586/ opisali zwiazek o wzorze 1, ale w jego postaci z otwartym pierscie¬ niem, czyli 7a-metylo-perhydroindanodion-1,5-/(3- -propylol-4/, jako produkt posredni w procesie rozkladu progesteronu przy uzyciu Mycobacterium smegmatis.Sposób wedlug wynalazku polega na holowaniu mutantów zdolnych do selektywnego rozkladu ste¬ roidów zawierajacych ewentualnie w polozeniu 17 boczny lancuch bedacy grupa alkilowa o 2—10 atomach wegla i do gromadzenia w brzeczce fer¬ mentacyjnej zwiazku o wzorze 1, czyli hemiketalu 3aa-H-4a-/3'-hydroksypropylo/-7a|3-metyloszescio- wodoroindanodionu-1,5 i zwiazku o wzorze 2, czyli 3aa-H-4a-/3'-hydroksypropylo/-5a-hydroksy-7aP- -metyloszesciowodoroindanonu/-l.Mutanty stosowane w sposobie wedlug wynalaz¬ ku mozna uzyskac z nastepujacych rodzajów drob¬ noustrojów rozkladajacych sterole metodami prze¬ prowadzania mutacji przedstawionymi w dalszej czesci opisu lub innymi metodami mutowania na¬ stepujacych drobnoustrojów: Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia, Protaminobacter, Serratia i Slreptorny- ces. Korzystnie stosuje sie rodzaj Mycobacterium. 106 849106 84S Przykladowymi szczepami tego rodzaju sa: Myco¬ bacterium phlei, Mycobacterium smegmatis, My- ccbacterium rhodochrous, Mycobacterium mucosum, Mycobacterium fortuitum oraz Mycobacterium bu- tyricum. 5 Szczególnie dokladnie opisano sposób wedlug wynalazku prowadzony przy uzyciu nowego mu¬ tanta szczepu Mycobacterium fortuitum NRRL E-8129, który stosuje sie do selektywnego rozkla¬ du steroidów ewentualnie zawierajacych w polo- 10 zeniu 17 boczny lancuch alkilowy o 2—10 atomach wegla, do zwiazków o wzorze 1 i 2. Przykladowy¬ mi odpowiednimi steroidami poddawanymi rozkla¬ dowi sa sitosterole, cholesterol, stigmasterol, kam- pesterol i tym podobne steroidy, posiadajace w u polozenia 17 alkilowy lancuch boczny o 2—10 ato¬ mach wegla oraz androsteno-4-dion-3,17, aridrosta- dieno-l,4-dion-3,17, dehydroepiandrosteron i testo¬ steron. Substancje steroidowe mozna stosowac za¬ równo; w postaci czystej jak i w postaci surowej. 2f Mutanty, charakteryzujace sie zdolnoscia selek¬ tywnego rozkladu steroidów, ewentualnie zawiera¬ jacych w polozeniu 17 boczny lancuch alkilowy o 2—10 atomach wegla oraz do gromadzenia zwiaz¬ ków o wzorze 1 i 2 w brzeczce fermentacyjnej 25 mozna uzyskac, przeprowadzajac mutacje nastepu¬ jacych rodzajów drobnoustrojów, zdolnych do roz¬ kladania steroli: Arthrobacter, Basillus, Brevibac- terium, Corynebacterium, Mycobacterium, Nocar- dia, Protaminobacter, Serratia i Streptomyces. My- 30 cobacterium fortnitum ATCC 6842, poddaje sie mutacji sposobem opisanym w dalszej czesci opi¬ su, uzyskujac nowy, laboratoryjnie zmutowany drobnoustrój. W katalogu ATCC z roku 1974 obok hasla ATCC 6842 zamieszczono informacje „J. C. 35 Cruz 2. Cold abscoss. Acta Med. Rio de Janeiro 1:1 /1936/. Medium 90 37C". Szczep Mycobacterium fortuitum ATCC 6842 rozklada nieselektywnie ste¬ role do zwiazków o niewielkim ciezarze czastecz¬ kowym, na przyklad do dwutlenku wegla i wody. 40 Takwiec, drobnoustrój ten nie nadaje sie do selek¬ tywnego rozkladu steroidów.Mutacja szczepu Mycobacterium fortuitum ATCC 6842 przeprowadzona przy uzyciu nitrozoguanidy- ny daje nowy mutant, który selektywnie rozkla- 45 da steroidy zawierajace ewentualnie w polozeniu 17 alkilowy lancuch boczny o 2—19 atomach wegla z wytworzeniem zwiazków o wzorach 1 i 2, gro¬ madzacych sie w brzeczce fermentacyjnej. Ten zmutowany drobnoustrój szczepu Mycobacterium B0 fortuitum uzyskal numer rejestru NRRL B-8129 nadany przez Northera Regional Research Labo- ratory, Ministerstwa Rolnictwa Stanów Zjednoczo¬ nych Ameryki Peoria, Illinois, Stany Zjednoczone Ameryki, gdzie mutant ten zdeponowano w trwa- 55 lej kolekcji. Na zyczenie, latwo uzyskuje sie pod- hodowle z wymienionej kolekcji. Zrozumiale jest, ze dostepnosc hodowli nie stanowi zezwolenia na stosowanie w praktyce sposobu wedlug wynalazku i uszczuplenie praw patentowych w tym przed- 60 miocie grozi wszczeciem postepowania sadowego.Morfologia i wrazliwosc na leki szczepu Myco¬ bacterium fortuitum NRRL B-8129 nie róznia sie od odpowiednich ceclf szczepu rodzicielskiego My¬ cobacterium fortuitum ATCC 6842. Obydwa oma- h wiane szczepy Mycobacterium fortuitum nie wy¬ twarzaja kwasów tluszczowych, nie wytwarzaja sporów, naleza do rodziny Mycobacteriaceae rzedu Actinomycetales. Zgodnie z klasyfikacja Runyona /Runyon E. H., 1959 Med Clin. North America 43, 273/ stanowia one niechromogeniczna grupe my¬ cobacterium IV, to znaczy szczepy te szybko wzra¬ staja w niskiej temperaturze, dajac kolonie nieza- barwione na stosunkowo prostych pozywkach.Szczepy Mycobacterium fortuitum ATCC 6842 i Mycobacterium fortuitum NRRL B-8129, wyraz¬ nie róznia sie dzialaniem na czasteczki steroidów.Jak wspomniano poprzednio szczep Mycobacterium fortuitum ATCC 6842 rozklada steroidy nieselek¬ tywnie, podczas gdy szczep Mycobacterium fortui¬ tum NRRL B-8129 rozklada te substancje selek¬ tywnie. Ta wlasciwosc szczepu Mycobacterium for¬ tuitum NRRL B-8129 czyni ten szczep wysoce przy¬ datnym.Mutacje szczepu Mycobacterium fortuitum ATCC 6842 w celu uzyskania szczepu Mycobacterium for¬ tuitum NRRL B-8129 przeprowadza sie przy uzy¬ ciu nitrozoguanidyny. Sposób przeprowadzenia mu¬ tacji szczególowo opisano nizej. Jakkolwiek spo¬ soby przeprowadzenia mutacji sa ogólnie znane, nieznana jest obecnie teoria pozwalajaca okreslic lub nawet zasugerowac typ mutanta, który ewen¬ tualnie mozna uzyskac przy zastosowaniu odpo¬ wiedniego sposobu przeprowadzania mutacji. Rów¬ niez, chociaz sposób przeprowadzania mutacji i przeksztalcen opisano szczególowo w odniesieniu do szczepu Mycobarcetrium, jest zrozumiale, ze podobny lub równowazny sposób postepowania mozna stosowac w odniesieniu do drobnoustrojów innych rodzajów, wymienionych w opisie.Selektywne przeksztalcenie, sposobem wedlug wynalazku przeprowadza sie za pomoca wzrastaja¬ cej hodowli szczepu Mycobacterium fortuitum NRRL B-8129, dodajac do hodowli w czasie in¬ kubacji substrat steroidowy lub wprowadzajac go bezposrednio do pozywki przed zaszczepieniem.Steroid mozna dodawac pojedynczo lub w pola¬ czeniu z innym steroidem. Korzystnie, lecz nie wylacznie, steroid stosuje sie w stezeniu 0,1—100 g w litrze hodowli. Hodowla wzrasta na pozywce wzrostowej, która jako zródlo wegla zawiera, na przyklad przyswajalne weglowodory, oraz jako zródlo azotu, na przyklad przyswajalne zwiazki azotowe lub substancje bialkopodobne. Jako zród¬ lo wegla korzystnie stosuje sie glikoze, melase, sacharoze, gliceryne, skrobie, skrobie kukurydzia¬ na, laktoze, dekstryne, cukier brunatny i tym podobne.Jako zródla azotu korzystnie stosuje sie wyciag namokowy kukurydzy, drozdze, autolizowane droz¬ dze browarniane ze stalymi substancjami stalymi uzyskanymi z mleka, make sojowa, make z ziaren bawelny, make kukurydziana, substancje stale uzy¬ skane z mleka, pankrostynowy wyciag z kazeiny, maczke rybna, gorzelniane substancje stale, wyciag peptonu zwierzecego, odpadowe mieso i kosci, sole amonowe i tym podobne. Wymienione zródla we¬ gla i azotu mozna dowolnie laczyc. Do pozywki fermentacyjnej nie potrzefba dodawac metali w106 849 ilosciach sladowych, na przyklad cynku, magnezu, manganu, kobaltu, zelaza i tym podobnych, po¬ niewaz jako skladniki pozywki przed wyjalawia¬ niem, stosuje sie wode wodociagowa i nieoczysz- czone inne skladniki.Proces przeksztalcenia przeprowadza sie w ciagu od okolo 72 j godzin do 15 dni. W czasie procesu przeksztalcenia utrzymuje sie temperature inku¬ bacji w granicach 25—37°C, korzystnie 30°C, w celu ulatwienia wzrostu drobnoustrojów i tym sa¬ mym zwiekszenie skutecznosci procesu przeksztal¬ cenia. Zawartosc naczynia, w którym przeprowa¬ dza sie przeksztalcenie napowietrza sie wyjalowio¬ nym powietrzem i miesza. Po zakonczeniu procesu przeksztalcenia, co stwierdza sie za pomoca chro¬ matografii cienkowarstwowej przy uzyciu plytek pokrytych zelem krzemionkowym /E. Merck, Darmstadt/, oraz ukladu rozpuszczalników sklada¬ jacych sie z octanu etylu i cykloheksanu w sto¬ sunku objetosciowym 2:3. Przeksztalcone steroidy izoluje sie w znany sposób. Na przyklad, po prze- kszalceniu fermentacyjna mieszanine reakcyjna skladajaca sie z cieczy fermentacyjnej i komórek drobnoustrojów mozna ekstrahowac organicznym rozpuszczalnikiem steroidów, nie mieszajacych sie z woda. Jako odpowiednie rozpuszczalniki stosuje sie korzystnie chlorek metylenu albo chloroform, czterochlorek wegla* chlorek etylenu, trójchloro¬ etylen, eter, octan amylu, benzen i tym podobne.Alternatywnie, ciecz fermentacyjna i komórki drobnoustroju oddziela sie najpierw w znany spo-^ sób, na przyklad przez saczenie lub odwirowanie, po czym ciecz i cialo stale oddzielnie ekstrahuje odpowiednim rozpuszczalnikiem. Komórki mozna ekstrahowac zarówno rozpuszczalnikiem mieszaja¬ cym sie z woda jak i nie mieszajacym sie z woda.Pozbawiona komórek ciecz fermentacyjna mozna ekstrahowac rozpuszczalnikiem nie mieszajacym sie z woda.Ekstrakty mozna saczyc przez warstwe ziemi okrzemkowej i z przesaczu oddestylowac do sucha pod zmniejszonym cisnieniem. Nastepnie uzyska¬ na pozostalosc, zawierajaca pozadane, przeksztal¬ cone steroidy, rozpuszcza sie w 10% . roztworze chloroformu w Skellysolve B i poddaje chroma¬ tografii na zelu krzemionkowym przy uzyciu jako eluantu Skellysolve B /izomeryczna mieszanina hek¬ sanów/ oraz jego mieszaniny ze wzrastajaca ilos¬ cia octanu etylu. W ten sposób wymywa sie zwia¬ zek o wzorze 1. Zwiazek o wzorze 2 mozna wy¬ mywac na przyklad 5% roztworem metanolu w octanie etylu. Krystaliczne produkty uzyskuje sie przy uzyciu rozpuszczalnika, na przyklad octanu etylu. Nastepnie roztwór oziebia sie do tempera¬ tury pokojowej i saczy, usuwajac z niego wytra¬ cony steroid. Przeksztalcone steroidy mozna rów¬ niez uzyskac po oddestylowaniu rozpuszczalnika z roztworów uzyskanych po dekantacji.Zwiazki o wzorach 1 i 2-sa przydatne jako pro¬ dukty posrednie w syntezie chemicznej uzytecz¬ nych steroidów. Na przyklad, wymienione zwiazki mozna przeksztalcac w substancje wyjsciowa sto¬ sowana w procesie ujawnionym w opisie patento¬ wym St. Zjedn. Ameryki nr 3 880 884 dotyczacym sposobu przeprowadzania totalnej syntezy uzytecz- 30 nych 19-uersteroidów. Takie przeksztalcenie w sub¬ stancje wyjsciowe mozna przeprowadzac w znany sposób, na przyklad przez utlenianie kwasem chro¬ mowym w kwasie octowym, z nastepna obróbka 5 otrzymanych produktów bezwodnikiem octowym i octanem sodowym. /Biochem. 2, 1238—1243 oraz J.A.C.S. 85, 2135—2137/.Sposób wedlug wynalazku oraz produkty wy¬ twarzane tym sposobem sa blizej opisane w na- io stepujacych przykladach. Jesli nie zaznaczono, ze jest inaczej, wszystkie procenty wymienione w przykladach sa wagowe a wszystkie stosunki okres¬ lajace sklady mieszanin rozpuszczalników sa obje¬ tosciowe. / 15 Przyklad I. Wytwarzanie mutanta Myco- bacterium fortuitum NRRL B-8129 ze szczepu My- cobacterium fortuitum ATCC 6842. a/ Mutageneza nitrozoguanidyn. Komórki szczepu Mycobacterium fortuitum ATCC 6842 hoduje sie 20 w temperaturze 28°C na wyjalowionej pozywce o nastepujacymskladzie: - .Bulion odzywczy 8 g/litr Ekstrakt drozdzy 1 g/litr Proponian sodowy 0,5 g/litr 25 Woda destylowana do objetosci 1 litra.Wartosc pH uzyskanego roztworu doprowadza sie do 7,0 dodatkiem 1 n roztworu wodorotlenku sodowego, po czym calosc wyjalawia w tempera¬ turze 121°C w ciagu 20 minut.Hodowle prowadzi sie do uzyskania gestosci 5 • 108 komórek/ml, komórki oddziela sie przez od¬ wirowanie, po czym przemywa je równa obojetos- cia wyjalowionego 0,1 molowego roztworu , cytry¬ nianu sodowego o wartosci pH=5,6. Po prze¬ myciu, komórki zawiesza sie w takiej samej obje¬ tosci buforu cytrynianowego i z zawiesiny pobiera sie próbke w celu oznaczenia miana /liczenie ko¬ mórek/, po czym dodaje sie nitrozoguanidyne w tt ilosci wystarczajacej do uzyskania jej koncowego stezenia wynoszacego 50 jig/ml. Zawiesine komórek inkubuje sie w temperaturze 37°C w lazni wodnej, w ciagu 30 minut, ponownie pobiera sie próbke w celu oznaczenia miana, zas pozostalosc wiruje 45 sie i oddzielone komórki przemywa równa obje¬ toscia wyjalowionego 0,1 molowego roztworu fo¬ sforanu potasowego o wartosci pH=7,0. Nastepnie komórki zawiesza sie ponownie w wyjalowionym podlozu o minimalnej zawartosci soli, nie zawie- 50 rajacym zródla wegla, o nastepujacym skladzie: NH4NOs 1,0 g/litr K2HP04 0,25 g/litr MgS04.7 H20 0,25 g/litr NaCl 0,005 g/litr 55 FeS04.7 H20 0,001 g/litr Woda destylowana do objetosci 1 litra.Nastepnie dodatkiem 1 n kwasu solnego dopro¬ wadza sie pH zawiesiny do wartosci 7,0, po czym poddaje sie ja wyjalawianiu w temperaturze 121°C 60 w ciagu 20 minut. Nastepnie wylewa sie zawiesine na plyty w celu wybrania komórek zmutowanych. b/ Selekcja i izolacja mutanta Mycobacetrium fortuitum NRRL B-8129. Komórki zmutowane jak opisano wyzej rozciencza sie i wysiewa na plyt- C5 kach zawierajacych pozywke o nastepujacym skla- 35106 849 dzie /zmodyfikowana pozywka wedlug Frasera i Jerrela 1963, J. Biol. Chem. 205, 291—295/: gliceryna 10,0 g/litr Na2HP04 8,4 g/litr KHsPC^ 4,5 g/litr NH4C1 2,0 g/litr MgS04.7 H20 0,3 g/litr FeCl8.6H20 0,05 g/litr Woda destylowana do objetosci 1 litra.Do mieszaniny dodaje sie agar w ilosci 15 g/litr, calosc wyjalawia w autoklawie w temperaturze 121aC w ciagu 30 minut, po czym wylewa sie na wyjalowione plytki Petriego.Hodowla na takiej pozywce eliminuje wiekszosc zywieniowych auksetrofów wytwarzanych w pro¬ cesie mutagenezy, na przyklad eliminuje sie ho¬ dowle, które wymagaja witamin, czynników wzro¬ stu i innych, celem prowadzenia hodowli na po¬ zywce chemicznie zdefiniowanej. Po inkubacji w ciagu 7 dni, w temperaturze 28°C, uzyskane kolonie przenosi sie na plytki testowe odpowiednie dla celów selekcji mutantów, po czym ponownie prze¬ nosi sie na plytki kontrolne zawierajace pozywke przygotowana w oparciu o gliceryne. Plytki testo¬ we przygotowuje sie sposobem opisanym przez Petersona G. K, H. Lu, Lewisa i J. R. Davisa w 1962 w „Preparation of uniform dispersions of cholesterol and other water-insoluble carbon sources in agar media". J. Lipid Research. 3, 275—276. Na plytkach stosuje sie pozywke o mini¬ malnej zawartosci soli, taka jaka opisano-poprzed¬ nio. Do pozywki tej dodaje sie agar w ilosci 15 g/litr oraz odpowiednie zródlo wegla, takie jak sitosterol lub androstenodion /AD/ w ilosci 1,0 g/litr. Nastepnie uzyskana mieszanine wyja¬ lawia sie w autoklawie w ciagu 30 minut w tem¬ peraturze 121°C. Wyjalowiona, goraca mieszanine wylewa sie do wyjalowionego mieszalnika, miesza sie w ciagu kilku minut i nastepnie wylewa na wyjalowione plytki Petriego.W opisywanym sposobie pewna trudnosc stanowi tendencja pozywki do pienienia sie, co mozna ogra¬ niczyc, mieszajac calosc i ogrzewajac plomieniem powierzchnie stopionego agaru na plytce. W ten sposób uzyskuje sie jednorodna zawiesine nieroz¬ puszczalnych w wodzie zródel wegla, która ulatwia wytwarzanie bardzo jednorodnych, lecz opalizuja¬ cych plytek agarowych.Kolonie, które wzrosly na plytkach kontrolnych, ale nie na plytkach testowych zawierajacych jako jedyne zródlo wegla AD, oczyszcza sie za pomo¬ ca wysiewu kreskowego na plytach z pozywka agarowa. Po przeprowadzeniu hodowli w tempera¬ turze 28°C, poszczególne klony wybiera sie z ply¬ tek z pozywka agarowa wyjalowiona lopatka den¬ tystyczna i ponownie testuje przez inokulowanie potraktowanych plytek zawierajacych AD jako zródlo wegla. Oczyszczone izolaty, które wykazuja fenotyp inny niz hodowla rodzicielska, ocenia sie w kolbach trzesawkowych. c/ Ocena hodowli w kolbach trzesawkowych.Kolby trzesawkowe o pojemnosci 500 ml, napelnia sie 100 ml porcjami pozywki sluzacej do przepro¬ wadzania przeksztalcenia biologicznego, zawieraja¬ cej nastepujace skladniki: gliceryna Na2HP04 KH2P04 NH4C1 5 MgS04.7 HfO FeCl,.6 H20 10,0 g/litr 8.4 g/litr 4.5 g/litr 2,0 g/litr 0,3 g/litr 0,05 g/litr Woda destylowana do objetosci 1 litra.Z pozywka miesza sie maczke sojowa w ilosci 1 g/litr po czym calosc miesza z sitosterolem w 10 ilosci 10,0 g/litr. Nastepnie kolby wyjalawia sie w autoklawie w ciagu 20 minut w temperaturze 121°C, oziebia do temperatury 28°C i zaszczepia 10 ml hodowli posiewowej, przygotowanej nastepu¬ jaco. 15 Oczyszczone izolaty uzyskane jak opisano po¬ przednio hoduje sie na skosach agarowych w tem¬ peraturze 28°C. Pobiera sie oczko czy komórek ze- skósu i stosuje do inokulacji kolb o pojemnosci 500 ml, zawierajacych 100 ml wyjalowionej po- 20 zywki do hodowli posiewowej o nastepujacym skladzie: Bulion odzywczy /Difco/ 8 g/litr Ekstrakt drozdzy 1 g/litr Gliceryna 5 g/litr 25 Woda destylowana do objetosci 1 litra.Stosujac 1 n roztwór wodorotlenku sodowego doprowadza sie pH mieszaniny do wartosci 7,0 i wyjalawia w autoklawie w temperaturze 121°C w ciagu 20 minut. Zaszczepione kolby inkubuje sie 30 w temperaturze 28°C w ciagu 72 godzin.Jak podano poprzednio, 10 ml hodowli posiewo¬ wej stosuje sie nastepnie do zaszczepienia kazdej z kolb o pojemnosci 500 ml i zawierajacych 100 ml wyjalowionej pozywki sluzacej do przeprowadza¬ nia przeksztalcenia. Kolby te inkubuje sie w tem¬ peraturze 28—30°C, jednoczesnie wytrzasajac na wytrzasarce obrotowej i w róznych okresach czasu pobierajac próbki hodowli, kazda o pojemnosci 10 ml. Próbki te ekstrahuje sie, wytrzasajac je trzykrotnie z chlorkiem metylenu. Porcje ekstrak¬ tów bada sie metoda chromatografii cienkowar¬ stwowej przy uzyciu zelu krzemionkowego oraz opisanego poprzednio ukladu rozpuszczalników, to znaczy mieszaniny octanu etylu i cykloheksanu w stosunku objetosciowym 2:3 oraz metoda chroma¬ tografii gazowo-cieczowej. Obecnosc zwiazków o wzorze 1 i 2 potwierdza selektywny rozklad sito- sterolu przeprowadzany przez nowy mutant wy- 50 tworzony z rodzicielskiego szczepu Mycobacterium fortuitum ATCC 6842.Przyklad II. Przeksztalcanie sitosterolu w zwiazki o wzorach 1 i 2.Stosuje sie pozywke opisana w czesci przykladu 55 dotyczacej oceny hodowli w kolbach trzesawko¬ wych. Pozywke te wyjalawia sie w temperaturze 121°C w ciagu 30 minut, nastepnie oziebia do tem¬ peratury 30°C, po czym zaszczepia 10 czesciami hodowli posiewowej mutanta Mycobacterium for- 90 tuitum NRRL B^8129, która uzyskuje sie jak opi¬ sano w przykladzie I. Po zaszczepieniu mieszanine inkubuje sie w ciagu 336 godzin w temperaturze 30°C przy jednoczesnym mieszaniu w celu ulat¬ wienia hodowli glebinowej. Po przeprowadzeniu m inkubacji, calosc ekstrahuje sie chlorkiem metyle- 35 40 15106 849 10 nu. Ekstrakt saczy sie przez, warstwe ziemi okrzem¬ kowej, zas przesacz odparowuje sie do sucha pod zmniejszonym cisnieniem. Pozostalosc rozpuszcza sie w 10°/« roztworze chloroformu w Skallysolve B i poddaje chromatografii na zelu krzemionkowym przy uzyciu jako eluentu Skellysolve B i jego mieszanin z octanem etylu o wzrastajacej ilosci octanu etylu* Mieszaninami tymi eluuje sie zwia¬ zek o wzorze 1. Zwiazek o wzorze 2 eluuje sie z kolumny ,5§/o roztworem metanolu w octanie etylu. Zwiazki eluuje w nastepujacej kolejnosci zwiazek o wzorze 1 — zwiazek o wzorze 2. Wy¬ mienione zwiazki wykazuja na chromatogramach cienkowarstwowych /cykloheksan — octan etylu w stosunku 3:2/ nastepujace wartosci Rf: zwiazek o wzorze 1 Rf=0,37 zwiazek o wzorze 2 Rf=0,05.Sklad odpowiednich frakcji oznacza sie metoda chromatografii cienkowarstwowej. Laczy frakcje o odpowiednim, podobnym skladzie i odparowuje do sucha, otrzymujac z dobra wydajnoscia zwiazki o wzorach 1 i 2.Po przekrystalizowaniu z octanu etylu otrzymuje sie zwiazek o wzorze 1, bedacy mieszanina dwóch epimerów w stosunku 1:1 o temperaturze topnienia 100—112°C; i zwiazek o wzorze 2 o temperaturze topnienia 148—150°C. Za pomoca chromatografii cienkowarstwowej stwierdza sie slady hemiacetalu 3aa-H-4a-/3'-hydróksypropylo/-5a-hydroksy-7a|3- -metyloszesciowodoroindanomi-1 i 6-laktonu 3aa-H- -4a-/2'-karboksyetyIo/-5a-hydroksy-7ap-metylo- szesciowodoroindanonu-1.Przyklad III. Postepujac jak w przykladzie II i zastepujac sitosterol cholesterolem, otrzymuje sie zwiazki o wzorach 1 i 2.Przyklad IV. Postepujac jak w przykladzie II i stosujac zamiast sitosterolu stigmasterol, otrzy¬ muje sie zwiazki o wzorach 1 i 2.Przyklad V. Postepujac jak w przykladzie II i stosujac zamiast sitosterolu kampesterol, o- trzymuje sie zwiazki o wzorach 1 i 2.Przyklad VI. Postepujac jak w przykladzie II i stosujac oprócz lub zamiast sitosterolu mie¬ szaniny sitosterolu z jakimkolwiek ze steroidów, wymienionych w przykladach II—V, otrzymuje sie zwiazki o wzorach 1 i 2.Przyklad VII. Postepujac jak w przykladzie I i stosujac zamiast szczepu Mycobacterium for¬ tuitum ATCC 6842, drobnoustrój zdolny do roz¬ kladu steroidów, wybrany sposród rodzajów: Arthrobacter, Baicllus, Brevibacterium, Corynebac- terium, Nocardia, Protaminobacter, Serratia i Streptomyces, otrzymuje sie mutanty tych drob¬ noustrojów, które charakteryzuja sie zdolnoscia do selektywnego rozkladu steroidów ewentualnie zawierajacych w czasteczce w polozeniu 17 alkilo¬ wy lancuch boczny o 2—10 atomach wegla i zdol¬ nych do zwiekszania zawartosci zwiazków o wzo¬ rach 1 i 2 w brzeczce fermentacyjnej.Przyklad VIII. Postepujac jak w przykla¬ dach II—VI i stosujac zamiast mutanta Mycobac¬ terium tortuitum NRRL B-8129, mutant otrzyma¬ ny sposobem opisanym w przykladzie VII, otrzy¬ muje sie zwiazki o wzorach 1 i 2.Przyklad IX. Postepujac jak w przykladzie I i stosujac zamiast szczepu Mycobacterium for¬ tuitum ATCC 6842 drobnoustrój rozkladajacy ste¬ role wybrany sposród drobnoustrojów: Mycobac¬ terium phlei, Mycobacterium smegmatis, Mycobac- 5 terium rhodochrous, Mycobacterium mocusum i Mycobacterium butyricum, otrzymuje sie mutant, charakteryzujacy sie zdolnoscia selektywnego roz¬ kladu steroidów, ewentualnie zawierajacych w cza¬ steczce w polozeniu 17 alkilowy lancuch boczny !0 o 2—10 atomach wegla i zdolny do zwiekszania zawartosci zwiazków o wzorach 1 i 2 w brzeczce fermentacyjnej.Przyklad X. Postepujac jak w przykladach II—VI i stosujac zamiast mutanta Mycobacterium 15 fortuitum NRRL B-8129 mutanty uzyskane sposo¬ bem opisanym w przykladzie IX, otrzymuje sie zwiazki o wzorach 1 i 2.Przyklad XI. Postepujac jak w przykladzie II i stosujac zamiast sitosterolu androsteno-4-dion- 2t -3,17, androstadieno-l,4-dion-3,17, dehydroepiandro- steron lub testosteron, otrzymuje sie zwiazki o wzorach 1 i 2.... Przyklad XII. Postepujac jak w przykladzie II i stosujac zamiast sitosterolu mieszanine dwóch s& lub wiecej takich zwiazków jak sitosterol, chole¬ sterol, stigmasterol, androsteno-4-dion-3,17, andro- stadieno-l,4-dion-3,17, dehydroepiandrosteron i te¬ stosteron, otrzymuje sie zwiazki o wzorach 1 i 2.Przyklad XIII. Postepujac jak w przykla- ® dzie XI i XII i stosujac zamiast mutant Myco¬ bacterium fortuitum NRRL B-8129 odpowiedni mu¬ tant, otrzymany jak opisano w przykladzie VII, otrzymuje sie zwiazki o wzorach 1 i 2.Przyklad XIV. Postepujac jak w przykladzie 35 XI i XII i stosujac zamiast mutanta Mycobacetrium fortuitum NRRL B-8129, mutanty uzyskane spo¬ sobem opisanym w przykladzie IX, otrzymuje sie zwiazki o wzorach 1 i 2. w Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania pochodnych 3aa-H-4a-/3'- -hydroksypropylo/-7a|3-metyloszesciowodoroindanu o wzorach 1 i 2, znamienny tym, ze hoduje sie 45 Mycobacterium fortuitum NRRL B-8129 w pozyw¬ ce wodnej w warunkach tlenowych, w obecnosci steroidu ewentualnie zawierajacego w polozeniu 17 alkilowy lancuch boczny o 2—10 atomach wegla, i wyodrebnia sie otrzymane zwiazki. 50 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako steroid stosuje sie sitosterol, cholesterol, stig¬ masterol, kampesterol, androsteno-4-dion-3,17, an- drostadieno-l,4-dion-3,17, dehydroepiandrosteron i testosteron. 55 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze hoduje Mycobacterium fortuitum NRRL B-8129 w pozywce wodnej w warunkach tlenowych w obec¬ nosci mieszaniny dwóch lub wiecej steroidów. 4. Sposób wedlug zastrz. 3, znamienny tym, ze 30 jako skladniki mieszaniny steroidów stosuje sie sitosterol, cholesterol, stigmasterol, kampesterol, androsteno-4-dion-3,17, androstadieno-l,4-dion-3,17, dehydroepiandrosteron i testosteron. 5. Sposób wytwarzania pochodnych 3aa-H-4a-/3'- 65 -hydroksypropylo/-7a(3-metyloszesciowodoroindanu106 849 11 12 o wzorach 1 i 2, znamienny tym, ze hoduje sie mutant drobnoustroju Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Nocardia, Pro- taminobacter, Serratia lub Streptomyces, charak¬ teryzujacy sie zdolnoscia do selektywnego rozkla¬ du steroidów ewentualnie zawierajacych w poloze¬ niu 17 alkilowy lancuch boczny o 2—10 atomach wegla i zdolnoscia do gromadzenia w brzeczce fermentacyjnej hemiketalu 3a propylo/-7ap-metyloszesciowodoroindanodionu-1,5 i 3aa-H-4a-/3'-hydroksypropylo/-5a-hydroksy-7a|3- -metyloszesciowodoroindanonu-1, przy czym ho¬ dowle prowadzi sie w pozywce wodnej w warun¬ kach tlenowych w obecnosci steroidu ewentualnie zawierajacego w polozeniu 17 alkilowy lancuch boczny o 2—10 atomach wegla, i wyodrebnia sie otrzymane zwiazki. 6. Sposób wedlug zastrz. 5, znamienny tym, ze mutant drobnoustroju hoduje sie w pozywce wod¬ nej w warunkach tlenowych w obecnosci ^miesza¬ niny dwóch lub wiecej steroidów. 7. Sposób wedlug zastrz. 5, znamienny tym, ze jako steroid stosuje sie sitosterol, cholesterol, stig- masterol, kampesterol, androsteno-4-dion-3,17, an- drostadieno-l,4-dion-3,17, dehydroepiandrósteron i testosteron 8. Sposób wedlug zastrz. 6, znamienny tym, ze jako skladniki mieszaniny steroidów stosuje sie sitosterol, cholesterol, stigmasterol, kampesterol, androsteno-4-dion-3,17, andfostadieno-l,4-dion-3,17, dehydroepiandrósteron i testosteron. 9. Sposób wytwarzania pochodnych 3aa-H^4tt-73'- -hydroksypropylo/-7aP^metyl0S2es<5iowOdoroindanu o wzorach 1 i 2, znamienny tym, ze hoduje sie mutant Mycobacterium charakteryzujacy sle zdol- 5 noscia do selektywnego rozkladu steroidów ewen¬ tualnie zawierajacych w polozeniu 17 alkilowy lancuch boczny o 2—10 atomach Wegla i zdolnoscia do gromadzenia w brzeczce fermentacyjnej hemi¬ ketalu 3aa-H-4a-/3'-hydroksypropyló/-7a(3-metylo- 10 szesciowodoroindanodionu-1,5 i 3a droksypropylo/-5a-hydroksy-7a|3-metylosze&ciowo- doroihdanonu-1, przy czym hodowle prowadzi sie w pozywce wodnej w warunkach tlenowych w obecnosci steroidu ewentualnie zawierajacego w po- 15 lczeniu 17 alkilowy lancuch boczny o 2^10 ato¬ mach wegla, i wyodrebnia sie otrzymane zwiazki. 10. Sposób wedlug zastrz. 9, znamienny tym, ze mutant drobnoustroju hoduje sie w pozywce Wod¬ nej w warunkach tlenowych w obecnosci niiesza- 20 niny dwóch lub wiecej steroidów. 11. Sposób wedlug zastrz. 9, znamienny tym, ze jako steroid stosuje sie sitosterol, cholesterol, stig¬ masterol, kampesterol, androsteno-4-dion-3,17, an- drostadieno-l,4-dion-3,l7, dehydroepiandrósteron lub testosteron. 12. Sposób wedlug zastrz. 10, znamienny tym, ze jako ^skladnik mieszaniny steroidów stosuje sie sitosterol, cholesterol, stigmasterol, kampesterol, androsteno-4-dion-3,17, androstadieno-1,4^0^3,17, 25 30 dehydroepiandrósteron i testosteron.106 849 hlzórl HO KS HO Wzór 2 PL