Procédé d'hydroxylation de stéroïdes
L'invention a pour objet un procédé de 8 p-hydroxy- lation de stéroldes, pour l'obtention de composés u.tili- sables comme intermédiaires dans la préparation de nouvelles hormones oestrogènes. Conformément à ce procédé, on soumet un 19-nor-stéroide de formule
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dans laquelle C17 est un groupe
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à l'action d'enzymes du micro-organisme Corynespora melonis ou Corynespora cassilcola. Ensuite, on peut soumettre le stérolde aux enzymes du micro-organisme Corynebacterium simplex pour former des produits aromatisés de formule
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Il a été trouvé, en effet,
qu'un micro-organisme 1-dé
hydrogénérateur peut être utilisé pour l'aromatisation
dans le noyau A, bien que la position 10 soit non substi
tuée. En plus du micro-organisme utilisable comme men
tionné ci-dessus, les organismes suivants agissent comme
1-déhydro-générateurs: Nocardia restrictus (ATCC
14,887); Pseudomonas testosteroni (ATCC 11996); Cy
lindrocarpon radicicola (ATCC 11011); Mycobacterium
rhodochrous (ATCC 4277).
D'une manière générale. les conditions de culture des micro-organismes mentionnés sont les mêmes que oelles
de la culture de diverses autres bactéries pour la production d'acides organiques ou de glycols, c'est-à-dire que le micro-organisme est cultivé en aérobie en contact avec (dans ou sur) un milieu de fermentation approprié.
Un milieu approprié comprend essentiellement une source de facteurs azotés et une source de carbone et d'énergie. Cette dernière peut être un hydrate de carbone (par exemple saccharose. mélasse, glucose, maltose, amidon ou dextrine), un acide gras, une graisse et/ou le stéroide lui-même. Cependant, le milieu contient de pré
férence une source assimilable de carbone et d'énergie
en plus du steroide. La source de facteurs azotés peut
être organique (par exemple farine de soja, corn steep,
extrait de viande et/ou résidus solubles de distillerie) ou
synthétique (c'est-à-di,re constituée de composés o,rgani-
ques et inorganiques simples, synthétisables, tels que sels
d'ammonium, nitrates alcalins, acides aminés ou urée).
Une alimentation suffisante en air stérile doit être
maintenue pendant la fermentation, par exemple par les
méthodes dassiques d'exposition d'une grande surface du milieu à l'air ou en utilisant une culture submergée
aérée. Le stéroide peut être ajouté à la culture pendant
la période d'incubation, ou il peut être incorporé au
milieu avant la stérilisation ou l'ensemencement.
Les composés ainsi obtenus peuvent être utilisés
comme agents inhibiteurs de la gonadotrophine oestro-
gène et sont utiles en thérapie substitutive dans la ménopause et également pour agir sur la fécondité de la
femme et des animaux. Ces composés ont également une activité anti-oestrogène et peuvent donc être employés pour le traitement des tumeurs du sein et de l'utérus.
Ils peuvent être pastillés de manière connue et admmis-
trés en doses de 0,10 à 10,0 mg/kg de poids du corps par jour aux humains et de 0,05 mg à 5 mg/kg de poids du
corps par jour aux animaux (par exemple aux vaches).
Ces composés peuvent être administrés sous forme de comprimés comme mentionné ou en solution injectable.
Dans ce cas, on les dissout dans une huile végétale (par exemple de sésame) ou dans du sérum physiologique et
on les administre par voie parentérale.
Dans les exemples qui suivent, toutes les tempera- tures sont en degrés centigrades.
Exemple 1: 8ss-hydroxy-19-nor-#4-androstène-3,17-dione
A. Fermentation. - La prolifération en surface de chacune de quatre cultures de dix jours sur gélose oblique de Corynespora melonis (CBS), Centraal Bureau voor
Schimmel Cultures, Barn, Pays-Bas, cette culture obli- que contenant comme milieu nutritif (A):
grammes
Farine d'avoine 20
Pâte de tomate
à ajouter à 500 ml d'eau
du robinet bouillante 20
Gélose 15
Eau du robinet 500 ml est suspendue dans 5 mli d'une solution aqueuse à 0,01 O/o de lauryl-suifate de sodium.
On utilise des portions d'l mi de la suspension pour ensemencer douze fioles coniques de 250 ml, contenant chacune 50 ml du milieu stérilisé suivant (B):
grammes
Glucose 30
Farine de soja 20
Huile de soja 2,2
CaCO3 2,5
Eau distillée pour 1 litre
Après 72 heures d'incubation à 250 C avec agitation
rotative continue (280cyoles/mn; 5 cm de course), on
procède à des transferts de 5 O/o en volume à 80 fioles coniques de 250 ml contenant chacune 50 ml du milieu
stérilisé suivant (C):
:
grammes
Glucose 10
Cern steep 6
NH4H2PO4 3
Extrait de levure 2,5
CaCO3 2,5
Eau distillée pour 1 litre
Après 24 heures d'incubation en utilisant les mêmes conditions que décrit ci-dessus, on ajoute le stéroide
(500 mg/ml) en ajoutant dans chaque fiole 0,25 ml d'une solution stérile (100 mg/ml) de 19-,nor-A4-androstène-
3,17-dione dans du N,N-diméthylformamide. On fait fermenter un total de 2,0 g. Après encore 6 heures d'incubation dans des conditions identiques à celles décrites ci-dessus, on récolte la fermentation. On réunit les contenus des fioles, obtenant un volume total de 4500 ml.
B. Isolement et identification. - On extrait les moûts de fermentation réunis trois fois avec des portions de 900 mi de chloroforme. On réunit les extraits chiorofor- miques et on les lave à l'eau, on les sèche sur du sulfate de sodium anhydre et on les concentre à sec sous vide, ce qui laisse environ 900 mg de produit brut On chromatographie cette matière sur 24 plaques de verre de 40 cl
X 20 cm, revêtues d'une mince couche de Silica Gel
GF (Merck), de 1 mm d'épaisseur, avec du chloroforme contenant 5 O/o en volume de méthanol comme agent développant la mobilité du substrat, c'est-à-dire la 19-norandrostène-dione, est éluée avec un mélange 1:
:1 (en volume) de méthanol et de chloroforme. Après évaporation du solvant, on répartit le résidu entre du chloroforme et un mélange d'eau et de méthanol 1:1 (en volume).
Après évaporation à sec sous vide, la phase chiorofor- mique laisse de la 8ss-hydroxy-19-nor-#4-androstène-3,17- dione cristalline. On la recristallise dans de l'acétone- hexane, obtenant ainsi le produit pur, p.f. environ 2082100; X CDCI3 3605, 1731, 1654, 1600cm-1; ###### 8,82; 4,17 ppm.
Exemple 2:
En procédant comme dans l'exemple 1, mais en substituant une quantité équivalente de l9-n,ortestosté- rone à la 19-nor-#4-androstène-3,17-dione, on obtient la 8f3-hydroxy-l 9-nortestostérone.
En procédant comme dans l'exemple 2, mais en utilisant la matière de départ indiquée à la place de la 19 nor-A4-androstène-3,17-dione, on obtient le produit indi qué.
Stéroide de départ Produit l 9-nor-17a-méthyl- 8t-hydroxy-19-nor- 17a- testostérone méthyltestostérone 19-nor-17α-éthynyl-8ss-hydroxy-19-nor-17α- testostérone éthynyltestostérone
Les stéroldes obtenus selon les exemples précédents peuvent être utilisés pour les préparations suivantes:
A. 8ss-hydroxyoestrone par culture de
Corynebacterium simplex
A.
Fermentation. - La prolifération en surface d'une culture de Corynebacterium simplex (ATCC 6946) sur gélose oblique, de deux semaines, ces cultures obliquels contenant comme milieu nutritif (A)
grammes
Glucose 10
Extrait de levure 2,5 K2HPO4
Gélose 20
Eau distillée pour 1 litre est suspendue dans 5 mi d'une solution aqueuse de laurylsulfate de sodium à 0,01 /o. On utilise des portions de i mi de cette suspension pour ensemencer deux fioles
Erlenmeyer dle 250 mi, contenant chacune 50 mi du milieu stérilisé suivant (B)
grammes
Extrait de boeuf 1,5
Extrait de levure 3
Peptone 6 Dextrose
Eau distillée pour I litre
Après 24 heures
d'incubation à 25 C avec agitation rotative continue (280cyeles/mln: 5 cm de course). on procède à des transferts de 5 % en volume dans deux fioles Erlenmeyer de 250 ml, contenant chacune 50 ml de milieu B fraîchement stérilisé. Après encore 24 heures d'incubation, dans les mêmes conditions que décrit cidessus, on ajoute le stéroïde (500 ug/ml) en complétant chaque fiole avec 0,25 mi d'une solution stérile (100 mgl ml) de 8ss-hydroxy19-nor-#4-androstène-3,17-dione dans du N.N-diméffiyllormamide. On fait fermenter un total de 50 mg.
Après encore 48 heures d'incubation dans des conditions identiques à celles décrites ci-dessus, on réunit les contenus des fioles et on extrait le moût trois fois avec des portions de 50 mi de méthylisobutylcétone.
Après évaporation des extraits réunis sous vide à sec, on obtient de la 80-hydroxyoestrone cristalline. On la recristallise deux fois dans de l'acétonehexane. obtenant ainsi environ 40 mg du produit pur, p.f. 2600 (déc.).
# ### 3565, 3370, 1720, 1606, 1580 (sh) 1504 cm-l.
B. 8ss-hydroxyoestrone par cellules lavées de
Corynebacterium simplex
En procédant comme dans A,, mais en utilisant de la testostérone à la place de la 8p-hydroxy- i 9-norandros- tènedione, on récolte les cellules de la culture de Coryne bacterium simplex à la fin des 72 heures par centrifugation. On lave les cellules agglomérées trois fois au moyen d'un tampon phosphaté contenant 0,005 mole de KHoPO4 et 0,005 mole de Na2H2P2O7 par litre et ajusté à pH 7,0. Ensuite, on suspend les cellules lavées dans le même tampon phosphaté de façon à obtenir u!n volume égal à un quart du volume de la culture originale.
On ajoute la matière de départ, la 85-hydroxy-19-norandros- tènedione, et l'accepteur d'hydrogène. par exemple la 2-méthyl-naphtoquinone, sous forme de leurs solutions éthanoi'ques, pour obtenir des concentrations finales de 100 g/ml et de 0,4 mM, respectivement, la quantité d'éthanol introduite étant maintenue à pas plus de 5 % du total. On laisse reposer le mélange réactionnel à 300 pendant 4 à 6 heures, après quoi on l'extrait deux fois avec un quart de son volume de méthyl isobutyl cétone.
On traite l'extrait exactement de la même manière que décrit dans l'exemple 3. obtenant ainsi de la 8ss-hydroxy- oeestrone pure fondant à 2600 (déc.).
C. 8ss-hydroxyoestrone par cellules séchées à l'acé
tone de Corynebacterium simplex
En procédant comme dans B, on dilue les cellules tassées avec un volume égal de tamlpons phosphatés de pH 7,0. On ajoute goutte à goutte cette suspension de cellules, avec agitation constante, dans dix fois son volume d'acétone que l'on refroidit à une température non supéneure à So Le dépôt sur le fond est imlmédiate- ment recueilli sur un entonnoir filtrant de Buchner avec aspiration, on lave avec un petit volume d'acétone, puis on sèche à l'air.
Une suspension de 10 mg des cellules séchées à l'acétone par ml du tampon à pH 7,0, préparée en mélangeant les cellules avec le tampon dans un mé langeur Waring est utilisée à la place de la suspension des cellules lavées de l'exemple 4. La matière de départ et l'accepteur d'hydrogène sont ajoutés de la même ma nière que décrit plus haut. En utilisant les mêmes conditions pour l'incubation, l'extraction, etc.. on obtient également la 8p-hyd roxyoestrone sous forme cristalline, p.f. 2600 (déc.).
D. 8p4zydnxyoestrone as: moyen d'une préparation
enzymafl'que exempte de cellules, provenant de
Corvnehacfrriom simplex
En procédant comme da;ns B, on place les cellules tassées dans un mortier avec une quantité égale en poids d'alumine (finement pulvérisée) et on les traite dans un oscillateur magnétostrictif Raytheon pendant 20 minutes.
Le mélange traité aux ultrasons est centrifugé pendant 10 minutes à 20()0 fois G pour séparer les débris cellulaires et l'alumine.
De la 8ss-hydroxy-19-norandrostènedione (1 mg). de la 2-méthyl-naphtoquinone (500) g) et 2,0 ml de la pré parution de déhydrogénase du noyau A exempte de cellules. décrite ci-dessus, sont placées dans un tube à essais et le tout est porté à un volume de 5,0ml au moyen d'un tampon aux phosphates de sodium 0,03 M. On laisse reposer le mélange pendant i h à 300 C, après quoi on l'extrait deux fois avec l ml de méthyl isobutyl cétone.
On chromatographie les extraits réunis sur du papier en utilisant de l'é,thylèneglycol comme phase fixe et un mélange de volumes égaux de benzène et de chloroforme comme phase mobile. Une tache se déplaçant avec le même Rf (0.19 et présentant les mêmes réactions colorées caractéristiques que la 8ss-hydroxyoestrone obtenue dans la préparation A, est observée.
De même, en suivant les méthodes A. B. C ou D.
mais en uilisant la 8B-hydroxy-19-nor-l 7u-méthyltesto- stérone, la 8ss-hydroxy-19-nor-17α-éthynyltestostérone et la 8P-hydroxy-l 9-nortestostórone à la place de la 8ss- hydroxy-19-nor-#4-androstène-3,17-dione, on obtient les dérivés correspondants du 8ss-hydroxyoestrane.