DE2313864A1 - Mikrobielle herstellung von biotin - Google Patents

Mikrobielle herstellung von biotin

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DE2313864A1
DE2313864A1 DE2313864A DE2313864A DE2313864A1 DE 2313864 A1 DE2313864 A1 DE 2313864A1 DE 2313864 A DE2313864 A DE 2313864A DE 2313864 A DE2313864 A DE 2313864A DE 2313864 A1 DE2313864 A1 DE 2313864A1
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DE
Germany
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biotin
nutrient medium
microorganism
compound
acid
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DE2313864A
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Shigehisa Fujimoto
Shigeo Ogino
Yukio Tanigawa
Hiroo Wada
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Sumitomo Chemical Co Ltd
Original Assignee
Sumitomo Chemical Co Ltd
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    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/185—Heterocyclic compounds containing sulfur atoms as ring hetero atoms in the condensed system
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Description

Mikrobielle Herstellung von Biotin 2313864 Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Biotin der Formel
durch Oxydation des im folgenden mit Verbindung A bezeichneten cis-Ietrahydro-2-oxo-4-n-pentyl-thieno-^~"3 f 4—<3._7~ imidazolin der Formel
p- GH«—CH ~
unter Verwendung eines Mikroorganismus und sie betrifft insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von Biotin durch Kultivie rung eines Mikroorganismus, der zur Gattung Pseudomonas, Coryne bacterium, Arthrobacter, Brevibacterium, Mycobacterium, Nocardia, Candida, Cunninghamela, Cladosporium, Gibberella, Penicillium oder Mucor gehört, in einem ein geeignetes Nährmedium ent— haltenden Kulturmedium, vorzugsweise unter aeroben Bedingungen, unter Zugabe der Verbindung A in geeigneter Konzentration von Beginn an oder nach dem Wachstum des Mikroorganismus, wobei die Kultivierung bis zur Umwandlung der Verbindung A in Biotin fort gesetzt wird, und wobei ferner die Herstellung von Biotin aus der Verbindung A erfolgen kann durch Verwendung von Ruhe- oder Dauersporen bzw. -zellen (resting cells), die vorher gezüchtet wurden in einem geeigneten Nährmedium in Gegenwart oder Abwesenheit einer geeigneten Menge an Verbindung A, wobei nach Anwendung der angegebenen Verfahrensweisen das Biotin dann abge-
: ' -23138B4
trennt wird aus dem Nährmedium oder der die Ruhe- Zellen enthaltenden Inkubationsflüssigkeit.
Das Verfahren der Erfindung hat den Vorteil, daß- eine Vereinfachung der komplizierten Verfahrensstufen,.die bei der Herstellung von Biotin mit Hilfe üblicher bekannter Verfahren zur Biotinsynthese erforderlich sind, erzielt wird, und daß die Menge an erfindungsgemäß hergestelltem Biotin hoch ist (z, B. mehrere Gramm pro Liter) verglichen mit üblichen bekannten Ferment ierungsmethoden, in denen die Ausbeute-an biotinaktiver Substanz höchstens 20 mg/l beträgt.
Biotin, und selbstverständlich auch das erfindungsgemäß hergestellte, findet bekanntlich Verwendung als Beifuttermittel· und in der Fermentierungsindustrie.
Die zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung verwendbare Ausgangsverbindung A ist eine neue Substanz, die beispielsweise wie fol·gt hergestellt werden kann: Unter Verwendung eines Grignard-Reagenz kann z. B. N-substituiertes cis-Tetrahydrothieno-/~3,4-d_J7-imidazolin-2,4-dion der Formel
mit n-Pentylbromid umgesetzt werden,. worauf das·Reaktionsprodukt dehydratisiert und hydriert wird unter anschließender Entfernung der F-Substituenten.
Zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung können für die Kultivierung des Mikroorganismus bekannte,- zur Kultivierung von Mikroorganismen üblicherweise verwendete Fährmedien ange-
309881/1143
wandt werden. Als Kohlenstoffquelle dient vorzugsweise z. B. η-Paraffin, Essigsäure, Kerosin oder eine Kombination derselben, obwohl auch Glucose, Stärke, Glycerin oder Sorbose verwendbar sind. Als Stickstoffquelle sind z, B. Pepton, Kornquelliquor (corn steep liquor), Sojabohnenpulver, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat, Harnstoff oder deren Gemische verwendbar. Als anorganische Salze sind z. B, Natriumchlorid oder ein Phosphat verwendbar, und als Spurenelemente können ein Sulfat oder Hydrochlorid von Magnesium, Eisen, Mangan, Cobalt, Zink oder Kupfer verwendet werden. Der pH-Wert des Kultivierungsmediums kann etwa 6 bis 8, vorzugsweise etwa 7» betragen bei Verwendung eines Bakteriums, und kann etwa 4 bis 7» vorzugsweise etwa 5 bis 6 sein bei Verwendung von Pilzen oder Hefe. Die Kultivierungstemperatur ist zweckmäßig etwa 25 bis 37°O, vorzugsweise etwa 25 bis 300O, für Bakterien und etwa 22 bis 300O, vorzugsweise etwa 25°C bei Verwendung von Hefe oder Pilzen. Wird während der Kultivierung belüftet und gerührt, so führt dies zu vorteilhaften Ergebnissen·
Es zeigte sich, daß während des Verfahrens der Erfindung Biotinol als Zwischenprodukt gebildet wird vor der Herstellung des Biotins. Ist die Isolierung dieses Biotinols erwünscht, so kann die Kultivierung oder Inkubation abgestoppt werden, sobald Biotinol gebildet ist.
Zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung wird einer der angegebenen Mikroorganismen in einem Kulturmedium gezüchtet, das die angegebenen Nähr st off quell en enthält. Die Verbindung A, gelöst in einem geeigneten organischen Lösungsmittel, z. B. Äthanol, Methanol oder Dimethylformamid, wird von Beginn an zugegeben oder nach dem Wachstum des Mikroorganismus, und die Kultivierung wird 2 bis 7 Tage lang fortgesetzt. Die Konzentration der Verbindung A-im Nährmedium kann 0,05 bis 0,3 #t vorzugsweise 0,1 bis 0,2 fot betragen.
309881/114
• 2 3Ί 3064
Nach der Kultivierung kann das im Kulturmedium gebildete Biotin abgetrennt und gereinigt werden. Zu diesem Zwecke ist ein bekanntes, üblicherweise zur Extraktion eines bestimmten Produktes aus dem Kulturmedium verwendetes Verfahren anwendbar unter Ausnützung verschiedener Eigenschaften des Biotins. So können z. B. die Zellen aus der Kulturflüssigkeit abgetrennt werden, worauf die im Filtrat vorliegende gewünschte Substanz an Aktivkohle adsorbiert und danach von der Kohle eluiert und mit Hilfe eines Ionenaustauscherharzes gereinigt wird. Wahlweise kann das Kulturfiltrat gereinigt werden durch direkte Behandlung mit einem Ionenaustauscherharz und nach der Elution des gewünschten Produktes wird dieses aus Wasser oder Alkohol umkristallisiert. Ferner kann in einigen Fällen das Kulturfiltrat ohne Verwendung eines Ionenaustauscherharzes konzentriert werden, worauf die abgesetzten Kristalle gesammelt werden durch Einstellen des pH-Werts der Flüssigkeit nahe dem isoeLektrischen Punkt.
Die erfindungsgemäß verwendbaren Mikroorganismen gehören, wie bereits erwähnt, zu den Pseudomonas-, Corynebacterium-, Arthrobacter-, Brevibacterium-, Mycobacterium-, Nocardia-, Candida-, Cunninghamela-, Cladosporium-, Gibberella-, Penicillium- und -. Mucorarten.
Typische geeignete Mikroorganismen sind z. B. die folgenden:
(1) Pseudomonas mutabilis B-3252 FEiM-P Nr. 1429, -
(2).Oorynebacterium primorioxydans B-321 FERM-P Nr. 1427,
(3) Corynebacterium primorioxydans var. forte, B-323 FEHM-P Nr. 1428,
(4) Arthrobacter paraffineus ATGO 21003,
(5) Brevibacterium ketoglutamicum ATOO 21004,
(6) Mycobacterium smegmatis IFO 3003,
(7) Nocardia corallina IFO 1954,
(8) Candida arborea IAM 4147, . . . . , . .. .
(9) Cunninghamela.blakesleeana IFO 4443, ■ .. ,-
3 Q 9 8 Ö 1 /■ 1 U 3 . ■ . .
ORIGINAL INSPEGTEO
(10) Oladosporium herbarum IFO 4458,
(11) Gibberella fujikuroi A1SOO 14842,
(12) Penicillium chrysogenum ATOO 7326,
(13) Penicillium patulum ATGO 10120, und
(14) Mucor microsporus ATCG 8541.
Die angegebenen Stämme (1) bis (3) wurden erst kürzlich isoliert und identifiziert. Ihre mycölοgisehen Gharakteristika und Identifikationen werden im folgenden angegeben. Die Identifikation basiert auf "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", 7. Auflage.
Der Stamm (1) hat eine polare Plagella und bildet Ketten, Er weist die Form eines kurzen Stäbchens auf. Der Stamm gehört daher zu den Pseudomonadalen. Ferner weist er kein photosynthetisches Pigment auf und produziert grünliche wasserlösliche Pigmente, und er gehört daher zu den Pseudomonadineaen. Ferner liegt/ffi Form kurzer Stäbchen vor, ist nicht an ein Substrat gebunden, ist oxydativ, bisweilen fermentativ, greift Glucose oxydativ oder fermentativ an und produziert nicht H2 und GO2 t und deshalb gehört er zu der Gattung Pseudomonas. Verglichen mit den Eigenschaften der in Bergey's Manual, 7· Auflage, angegebenen Pseudomonas, ähnelt er am meisten Pseudomonas striata» Der Stamm B-3252 unterscheidet sich jedoch insofern, als er zwar ebenfalls dünne Stäbchen bildet, jedoch oval ist und auf einem Agar-Schrägmedium (agar slant) nicht gelblich-grün wird· Die Beschreibung in Bergey's Manual ist übrigens so dürftig, daß ein Vergleich und eine Prüfung schwierig ist, es kann jedoch gesagt werden, daß B-3252 verschieden ist von Pseudomonas striata* Ferner ist festzustellen, daß im Vergleich mit den von Iizuka et al in "J. Gen. Appl* Microbial1* J£f 1964, 207 und "J. Gen. Appl, Microbial" £, 1963* 73 beschriebenen Stämmen Ps. nitroreducens, Ps. maltophila und Ps, desmolytica» der erfindungsgemäß verwendbare Stamm B 3252 verschieden ist von Pe» nitroreducens im Hinblick darauf, daß kein gasförmiger Stickstoff und H9S gebildet wird, und daß er ferner verschieden ist
C,
309881/1143
ORIGINAL INSPECTED
_ 6 - ■
231 386 A
vom Muster der Säurebildung aus dem Zucker— und OF-Test.
Der Stamm (1) ist auch verschieden von Ps. maltophila bezüglich des Wachstums mit einer Lackmusmilch oder Succinat—nitrat-Lö-'-sung, und er ist ferner verschieden von Ps. desmolytica in der Nitratproduktion und im OF-Test.
Aufgrund obiger Angaben kann der Stamm B-3252 zu keinem der üblichen bekannten Ps.-Gattungen gehören, weshalb er Ps. mutabilis B-3252 genannt wird.
Jeder der beiden Stämme (2) und (3) gehört zu den Eubacterialen II, hat keine ländosporen (endospore), läßt einen Pleomorphismus und eine Verzweigung der Zellen erkennen, ebenso eine Einschnapp division (snapping division) und Keulenformen. Jeder dieser Stäm me gehört daher zu Gorynebaoteriacea. Ferner kat keiner der Stämme Peritrichenflagellen und ;jeäer der Stämme ist Katalasepositiv und Gram-positiv, weshalb beide Stämme zu den Gorynebacteriumarten gehören. Werden ferner verschiedene Eigenschaften dieser Stämme mit denen von in Bergey*s Manual angegebenen Stämmen verglichen, so zeigt sich, daß der Stamm B-321 am ähnlichsten ist Oorynebacterium agrapyri und Corynebacterium facians, vom erstgenannten jedoch verschieden ist in bezug auf Wachstum mit einer Nährstoffflüssigkeit und Säureproduktion aus Zucker, wowie vom letztgenannten verschieden ist in bezug auf Wachstum mit einer Lackmusmilch und Säureproduktion von Zucker· Beim Stamm B—321 handelt es sich somit um einen in Bergeyfs Manual nicht erwähnten Stamm* Beim Vergleich mit dem Stamm der Oorynebacterium-Gattung, der von Yamada et al in "Agr· Bial· Okem.* 22» 1963, 773 beschrieben wird, zeigt sich ferner, daß er auch von diesem Stamm verschieden ist in bezug auf Stärkeabbau und OF-Test, so daß er mit diesem nicht als identisch bezeichnet werden kann» Ferner ist er auch verschieden τοη Oorynebacterium petrophilum, beschrieben von Iguchi et al in "Amino Acid & Nucleic Acid11 £Xf 1965, 86, in bezug auf Wachstumsteraperatur, Nitritproduktion, HgS-Produktion und Säurepro-
309881/1143
231386Λ
duktion von Zucker, und er ist auch verschieden von Gorynebacterium polymorpha, beschrieben von lakahashi et al in "Amino Acid & Nucleic Acid" X2f 1966, 64, in bezug auf Pigmentproduktion mit Bouillon Agar, Nitritproduktion, HpS-Produktion, Verflüssigung von Gelatine, Verhalten mit einer Lackmusmilch und Stärkeabbau. Es ergibt sich somit, daß B-321 nicht zu der in der bekannten Literatur erwähnten Corynebacteriumgattung gehören kann, weshalb er Oorynebacterium primorioxydans B-321 genannt wird.
Auch der Stamm B-323 ist ähnlich Gorynebacterium renale, Corynebaeterium phocae, Oorynebacterium agropyri und Corynebacterium facians, unterscheidet sich jedoch von Corynebacterium renale in bezug auf Befund mit einer Lackmusmilch und optimale Temperatur, und unterscheidet sich von Gorynebacterium phocae in bezug auf Wachstumstemperatur in Bouillon, HpS-Produktion und Säureproduktion aus Zucker. Ferner ist er verschieden von Corynebacterium agropyri in bezug auf Wachstum mit einer Bouillon und Säureproduktion aus Zucker. Ferner unterscheidet er sich von Gorynebacterium facians in bezug auf Befund mit einer Lackmusmilch und Säureproduktion aus Zucker, und er ist ferner auch verschieden von dem angegebenen, von Yamada et al beschriebenen Stamm in bezug auf Stärkeabbau und OF-Test, und er ist außerdem verschieden von den von Iizuka et al beschriebenen Stämmen in bezug auf HpS-Produktion und OF-Test, und er ist auch verschieden von dem von Iguchi et al beschriebenen Stamm in bezug auf Wachstumspemperatur, Nitritproduktion, HpS-Produktion und Säureproduktion von Zucker, und außerdem ist er verschieden von dem von Takahashi et al beschriebenen Stamm in bezug auf Wachstum in Nähragar, Nitritproduktion, HpS-Produktion, Wachstum mit Gelatine, Wachstum mit einer Lackmusmilch und Stärkeabbau, Demzufolge kann der Stamm B-323 nicht zu den üblichen Gorynebacterium gehören und er ist auch verschieden von B-321 in bezug auf Säureproduktion, weshalb er Gorynebacterium primorioxydans var, forte genannt wird.
3 O 9 8 8 1 / 1 1 ι·. 7
Die mycologischen Gharakteristika der Stämme B-321, B 323 und B-3252 sind in der folgenden Tabelle aufgeführt:
309881/11 43
B-321
B-323
B-3252
Morpho Form kugelige bis kurze kurze Stäbchen kurze Stäbchen
logische Stäbchen
Oharakte-
ristika		 Größe 0,8-1,0μ χ 1,4-1,7μ 0,8-1,0μ χ 1,4-1,7μ 0,8-1,0μ χ 1,4-1,7μ
Motilität nicht frei beweg nicht frei beweg frei beweglich
lich, lich
Flagella keine keine.. Multi-Haar-
flagella
Gram-Färbung positiv positiv negativ
to Säurefest- negativ negativ negativ
O
co
οα		 Färbung
OD
-mi
""S.
•4		 Agar- Form kreisförmig kreisförmig kreisförmig
—»
-JN-		 kolonie Oberfläche glatt glatt glatt
Kante ganz ganz ganz
Erhebung konvex konvex konvex
Farbe weiß bis leicht weiß bis leicht leicht braun
orange orange
Glanz glitzernd glitzernd glitzernd
optisch opak opak fluoreszierend
B-321
B-323
B-3252
Agar-Schrägkultur (agarslant)
Wachstum Form Glanz Farbe
Konsistenz
reichlich
faserförmig
glitzernd
weiß bis leicht orange ,
butterartig
reichlich
faserförmig
glitzernd
weiß bis leicht orange
butterartig
reichlich faserförmig glitzernd *
leicht gelblichbraun
butterartig
(O
OO
CO
Nährlösung Oberflächenwachstum
Trübung Sediment
zerbrechliches Häutchen
trüb reichlich
zerbrechliches Häutchen
trüb
reichlich
Hautchen (Membran) stark trüb reichlich
Gelatineansatz (Gelatin stab)
Wachstum
Verflüssigung
dürftig keine.
dürftig keine
gut
keine
Lackmusmilch
unverändert
leicht vermindert
unverändert
leicht vermindert
unverändert
leicht vermindert
U)
CJ OO
B-321 B-323
B-3252
Wirkung auf
Nitrat
Nitrit aber kein Gas Nitrit aber kein
Gas
Nitrit aber kein Gas
Hydrogensulfid
positiv positiv
positiv
Ind'olproduk
tion
negativ negativ
negativ
V.P.-Test
negativ negativ
negativ
Hydrolyse von
Stärke
negativ negativ
negativ
Spaltung aerob
von Glucose
nach der Hugh-
& Leifson- anaerob
Methode
Säure aber kein Säure aber kein Säure aber kein CO
Gas Gas Gas
CO
Säure aber kein Säure aber kein Säure aber kein CO
Gas Gas Gas CT)
B-321
B-323
B-3252
Katalase
positiv
positiv
positiv
Urease
positiv
positiv
positiv
to
CD OO OO
Beziehung zu pH
pH 5-10, kein Wachstum bei pH 4,0
pH 6-10, kein
Wachstum bei
pH 5,0
pH 5-10, kein Wachstum bei pH 4,0
Optimal-Temp eratur
25-30 0",schwaches Wachstum bei 200G kein Wachstum bei 37*C
25-30 C,schwaches
Wachstum bei 200C"
kein Wachstum bei
37*0
25-37 C,schwaches Wachstum bei 20 C
Methylrot-Test
positiv
negativ
negativ
B-321
B-323
B-3252
Spaltung von Arabinose
Zucker in		 keine
Gas		 Säure, kein keine
Gas		 Säure, kein keine
Gas		 Säure, kein I ho
CO
Flüssigkul- ^1 Λ_Ω
+ην. AJrJLOSB
υ ULi		 keine
Gas		 Säure, kein keine
Gas		 Säure, kein keine
Gas		 Säure, kein UJ CO
OD
CD
Glucose keine
Gas		 Säure, kein Säure , kein Gas Säure , kein Gas I
Mannose keine
Gas		 Säure, kein keine
Gas		 Säure, kein keine
Gas		 Säure, kein
Fructose keine
Gas		 Säure, kein keine
Gas		 Säure, kein keine
Gas		 Säure, kein
Galactose Säure , kein Gas Säure , kein Gas Säure , kein Gas
Maltose keine
Gas		 Säure, kein keine
Gas		 Säure, kein keine
Gas		 Säure, kein
Sucrose keine
Gas		 Säure, kein keine
Gas		 Saure, kein keine
Gas		 Säure, kein
Lactose keine
Gas		 Säure, kein keine
Gas		 Säure, kein keine
Gas		 Säure, kein
Trehalose keine
Gas		 Säure, kein keine
Gas		 Säure, kein keine
Gas		 Säure, kein
Sorbitol keine
Gas		 Säure, kein keine
Gas		 Säure, kein keine
Gas		 Säure, kein
Mannitol keine
Gas		 Säure, kein keine
Gas		 Säure, kein keine
Gas		 Säure, kein
B-321
B-323
B-3252
Zucker in Flüssigkultur
Inositol keine
Gas
Glycerin keine
Gas
Stärke keine
Gas
Rhamnose keine
Gas
Inulin keine
Gas
Glycogen keine
Gas
Dextrin keine
Gas
kein
Zucker		 keine
Gas
Säure, kein
Säure, kein
Säure, kein
Säure, kein
Säure, kein
Säure, kein
Säure, kein
Säure, kein
keine
Gas		 Säure, kein keine
Gas		 Säure, kein
keine
Gas		 Säure, kein keine
Gas		 Säure, kein
keine
Gas		 Säure, kein keine
Gas		 Säure, kein
keine
Gas		 Säure, kein keine
Gas		 Säure, kein
keine
Gas		 Säure, kein keine
Gas		 Säure, kein
keine
Gas		 Säure, kein keine
Gas		 Säure, kein
keine
Gas		 Säure, kein keine
Gas		 Säure, kein
keine
Gas		 Säure, kein keine
Gas		 Saure, kein
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern.
Beispiel 1
100 ml eines flüssigen Kulturmediums (pH 6,0) mit einem Gehalan 2 $ n-Paraffin, 0,35 $> Natriumhydrogenphosphat, 0,25 $> Kaliumdihydrogenphosphat, 0,1 ?S Magnesiumsulfat, 0,01 $ Natriumchlorid, 0,01 $> Kornquelliquor und 0,2 $ Harnstoff wurden jeweils in 10 sogenannte Sakaguchi-Kolben einer Kapazität von 500 ml geschüttet. Nach der Sterilisation wurde mit 2 # Gorynebacterium primorioxydans B-321 FERM-P 1427, das zuvor in einem Kulturmedium der selben Zusammensetzung kultiviert worden war, angeimpft, worauf bei 300G auf einer Ri tung 24 Stunden lang kultiviert wurde.
angeimpft, worauf bei 300G auf einer Reziprok-Schüttelvorrich—
Danach wurden 2 ml einer Äthanollösung der Verbindung A (50 mg/ml) zu jedem Kolben zugesetzt und die Kultivierung wurde bei 30 G 5 Tage lang fortgesetzt. Nach Vervollständigung der Kultivierung wurde die Kulturlösung mit Hilfe einer Zentrifuge in Zellen und FiItrat getrennt. Die Zellen wurden mit destilliertem Wasser gewaschen und das Filtrat sowie die Waschflüssigkeit wurden kombiniert, worauf der pH-Wert der Losung auf 3,0 eingestellt wurde. Danach wurden 2 $> Aktivkohle unter Rühren der Flüssigkeit zugesetzt, um das gebildete Biotin zu adsorbieren. Die Aktivkohle wurde durch Filtration gesammelt und danach wurde mit 50 tigern ammoniakalkalischem Äthanol eluiert. Das Lösungsmittel wurde abdestilliertj wobei 1,45 g Rückstand erhalten wurden. Der erhaltene Rückstand wurde in schwach alkalischem Wasser gelöst und auf einer Säule (3 x 150 cm) an/x ^Θχ 2 (Formiat-Typ) adsorbiert. Danach wurde die Säule mit Wasser gewaschen, worauf mit 0,01 m-Ameisensäure eluiert wurde. Die biotinhaltige Fraktion wurde unter vermindertem Druck konzentriert, wobei 0,85 g rohe Kristalle erhalten wurden. Es wurde aus Wasser umkristallisiert, wobei 0,80 g Biotin mit einem Schmelzpunkt von 232°C erhalten wurden.
309881/1U3
-.16 -
Das Infrarot-Absorption- und NMR-Spektrum (kernmagnetische Resonanzspektrum) des erhaltenen Produktes entsprachen denjenigen eines Standardproduktes.
Beispiel 2
Gorynebacterium primorioxydans var, forte B-323 FERM-P 1428 wurde kultiviert und die erhaltene Kulturlösung wurde in der in Beispiel 1 beschriebenen V/eise behandelt, wobei 0,85 g Biotin erhalten wurden. Das erhaltene Produkt entsprach dem Standardprodukt in bezug auf Infrarotabsorption und NMR-Spektrum.
Beispiel 3 ,
100 ml eines Kulturmediums der in Beispiel 1 beschriebenen Zusammensetzung wurden in e,inen 500 ml-Sakaguchi-Kolben geschüttet. Nach der Sterilisation wurde mit 2 fo Pseudomonas mutabilis B-3252 FERM-P 1429, das zuvor in einem Kulturmedium der selben Zusammensetzung kultiviert worden war, angeimpft, und die Kultivierung wurde bei 25°G in einer Reziprok-Schüttelvorrichtung 24 Stunden lang durchgeführt. Danach wurden 2 ml einer Äthanollösung der Verbindung A (50 mg/ml) dem Kulturmedium zugesetzt, worauf die Kultivierung bei '25 C 5 Tage lang fortgesetzt wurde. Nach Vervollständigung der Kultivierung wurde die Kulturlösung in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise behandelt, wobei 73 mg Biotin erhalten wurden. Das erhaltene Produkt entsprach dem Standardprodukt in bezug auf Infrarotabsorption.
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Beispiel 4
Nocardia corallina IFO 1954 wurde kultiviert und die erhaltene Kulturlösung wurde in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise behandelt, wobei 0,56 g Biotin (Fp = 232°C) erhalten wurden, Das Infrarotabsorptionsspektrum des erhaltenen Produktes entsprach demjenigen des Standardproduktes.
Beispiel 5
Mycobacterium smegmatis IFO 3083 wurde kultiviert und die erhaltene Kulturlösung wurde in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise behandelt, wobei 0,40 g Biotin erhalten wurden. Das erhaltene Produkt entsprach dem Standardprodukt in bezug auf Infrarotabsorption.
Beispiel 6
100 ml eines flüssigen Kulturmediums (pH 7,0) mit einem Gehalt an 2 % Paraffin, 0,35 $> Natriumhydrogenphosphat, 0,25 # Kaliumdihydrogenphosphat, 0,10 % Magnesiumsulfat, 0,01 # Natriumchlorid, 0,01 $> Calciumchlorid, 8 mg/l Zinksulfat, 8 mg/l Mangansulfat, 10 mg/l Eisen(II)sulfat, 40 mg/L Kupfersulfat, 0,01 $ Komquelliquor und 0,2 ^ Harnstoff wurden jeweils in 10 Sakaguchi—Kolben einer Kapazität von 500 ml geschüttet, worauf sterilisiert wurde. Danach wurde mit 2 # Arthrobacter paraffineus ATOC 21003, das zuvor in einem Kulturmedium der selben Zusammensetzung kultiviert worden war, beimpft und die Kultivierung wurde bei 300G in einer Reziprok-Schüttelvorrichtung 2 Tage lang durchgeführt. Danach wurden 2 ml einer Äthanollösung der Verbindung A (50 mg/ml) jedem Kolben zugesetzt und die Kultivierung wurde bei 300C 5 Tage lang fortgesetzt· Nach vollendeter Kultivierung wurde die Kulturlösung in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise behandelt, wobei 0,72 g Biotin er—
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■- 18 - '
halten wurden. Das Infrarotabsorptionsspektrum und KMR-Spektrum des erhaltenen Produktes entsprach demjenigen des Standardproduktes.
Beispiel 7 - '
Brevibaeterium ketoglutamicum ATGC 21004 wurde kultiviert und die erhaltene Kulturlösung wurde in der in Beispiel 6 beschriebenen Weise behandelt, wobei 0,35 g Biotin erhalten wurden. Das Infrarotabsorptionsspektrum des erhaltenen Produktes entsprach demjenigen des Standardproduktes.
Beispiel 8
100 ml eines flüssigen Kulturmediums mit einem Gehalt an 5 /» n-Paraffin, 0,5 f° Ammoniumchlorid, 0,34 ί° Natriumhydrogenphosphat, 0,16 $> Kaliumdihydrogenphosphat, 0,05 i° Magnesiumsulfat, 0,05 $> Natriumchlorid und 0,01 % Kornquelliquor wurden in einen 500 ml-Sakaguchi-Kolben geschüttet. Nach der Sterilisation wurde mit 2 # Candida arborea IAM 4147» das zuvor in einem Kulturmedium der selben Zusammensetzung kultiviert warden war, beimpft und danach wurde bei 27 C kultMert« Nach etwa 20 Stunden wurden 5,0 ml einer Äthanollösung der Verbindung A (5Ö mg/ ml) zugesetzt und die Kultivierung wurde 5 Tage lang fortgesetzt. Danach wurde die erhaltene Kulturflüssigkeit in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise behandelt, wobei 162 mg Biotin erhalten, wurden. Das Infrarotabsorptionsspektrum und NMR-Spektrum des erhaltenen Produktes entsprach demjenigen des Standardproduktes.
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Beispiel 9
100 ml eines flüssigen Kulturmediums mit einem Gehalt an 5 $ n-Paraffin, 0,1 ^ Malzextrakt, 0,2 <fo Ammoniumsulfat, 0,4 ^ Kaliumdihydrogenphosphat, 0,6 $ Natriumhydrogenphosphat, 0,02 $ Magnesiumsulfat, 1,0 mg/l Eisen(II)sulfat, 10 mg/l Borsäure, 10 mg/l Mangansulfat, 70 mg/l Zinksulfat und 50 mg/l Kupfersulfat wurden in einen 500 ml-Sakaguchi-Kolben eingebracht. Nach der Sterilisation wurde mit Ounninghamella blakesleeana IPO 4443f das zuvor in einem Kulturmedium der selben Zusammensetzung kultiviert worden war, beimpft, worauf bei 25°C 3 Tage lang kultiviert wurde. Danach wurden 5»0 ml einer äthanolischen Lösung der-Verbindung A(50 mg/ml) zugesetzt und die Kultivierung wurde 7 Tage lang fortgesetzt. Danach wurde das gebildete Biotin isoliert und nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren gereinigt, wobei 140 mg Kristalle erhalten wurden. Das erhaltene Produkt stimmte mit dem Standard-Biotin in der Infrarotabsorption überein.
Beispiel 10
Das in Beispiel 9 beschriebene Verfahren wurde wiederholt, jedoch mit der Ausnahme, daß Gibberella fujikuroi ATCC 14842 verwendet wurde. Es wurden 155 mg Biotin erhalten. Das Infrarotabsorptionsspektrum des erhaltenen Produktes stimmte mit demjenigen des Standardproduktes überein.
Beispiel 11
Das in Beispiel 9 beschriebene Verfahren wurde wiederholt, jedoch mit der Ausnahme,'daß Penicillium Chrysogenum IAM 7326 verwendet wurde. Es wurden 112 mg Biotin erhalten. Das erhaltene Produkt stimmte mit dem Standardprodukt in der Infrarοtabsorption überein.
3 0 9 8 8 1 f 1 1 /4 3
Beispiel 12
500 mg Ruhe- Zellen von Gorynebacterium pririiorioxydans B-321, die in einem Kulturmedium der in Beispiel 1 beschriebenen Zusammensetzung kultiviert waren, wurden in 10 ml 0,05 m-Phosphatpuffer (pH 7f0) suspendiert. Danach wurden 0,2 ml einer Ä'thanollösung der Verbindung A (50 mg/ml) zu der Suspension zugesetzt, worauf die Suspension über Nacht bei 280G in einer sogenannten Monod-Schüttelvorrichtung inkubiert wurde» Danach wurden die Zellen durch Zentrifugieren entfernt und die überstehende Flüssigkeit wurde konzentriert. Das angestrebte Verfahrensprodukt wurde daraus abgetrennt und gereinigt mit Hilfe einer DünnschichtChromatographie (Benzol/ Methanol/Aceton/Essigsäure 7/2/0,5/0,5)» wobei 3»5 mg Biotin erhalten wurden. Das erhaltene Produkt stimmte mit dem Standardprodukt in der Infrarotabsorption, gemessen mit Hilfe einer KBr-Tablettenmethode,überein.
Beispiel ,13
Zellen von Arthrobacter paraffineus ATGG 21003 s» die durch Kultivierung in einem Kulturmedium des in Beispiel 6 angegebenen Typs erhalten wurden, wurden gefroren und getrocknet. Es wurden sodann 200 mg der Zellen in 10 ml 0,05 m-Phosphatpuffer (pH 7,0) suspendiert. Danach wurden 0,2 ml einer Äthanollösung der Verbindung A (50 mg/ml) zu der Suspension zugesetzt und die erhaltene Suspension wurde über Nacht bei 260G inkubiert unter Schütteln mit einer Reziprok-Schüttelvorrichtung. Danach wurden die Zellen genauso wie in Beispiel 12 behandelt, wobei 3,0 mg Biotin erhalten wurden. Das Infrarotabsorptionsspektrum des erhaltenen Produktes stimmte mit demjenigen des Standardproduktes überein.
309881/1,1O
ORIGINAL

Claims (1)

  1. Patentansprüche
    Iy Verfahren zur mikrobiellen Umwandlung einer Verbindung A der Formel
    HN jpi
    / VoH2-CH2-CH2-OH2-OH
    in Biotin der Formel
    0
    HN NH
    CH2-Oh2-OH2-OH2-COOH
    dadurch gekennzeichnet, daß man die Verbindung A in Gegenwart eines Mikroorganismus enzymatisch oxydiert·
    2, Verfahren zur Herstellung von Biotin der Formel
    HNNH
    OH2-Oh2-CH2-GH2-COOH
    dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus, der bei der Kultivierung eine im Nährmedium enthaltene Verbindung A der Formel
    309881/114
    ην
    in Biotin umzuwandeln vermag, in Gegenwart der Verbindung A so lange kultiviert, bis sich Biotin im Fermentierungsnährmedium angesammelt hat, und das im Fermentierungsnährmedium angesammelte Biotin isoliert.
    3. Verfahren zur Herstellung von Biotin der Formel
    OH2-GH2-OH2-Oh2-OOOH
    dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung A der Formel
    OH2-GH2-GH2-OH2-OH3
    mit vorher in einem Nährmedium gezüchteten Ruhe- oder Dauersporen bzw. -zellen (resting cells) von Mikroorganismen so lange inkubiert, bis sich Biotin im Fermentierungsnährmedium angesammelt hat, und das im Fermentierungsnährmedium auge- . sammelte Biotin isoliert.
    309881/1143
    4. Verfahren nach Ansprüchen 2 und 3» dadurch gekennzeichnet, daß man ein Nährmedium verwendet, das eine Kohlenstoffquelle und eine Stickstoffquelle enthält.
    5. Verfahren nach Ansprüchen 2 und 3» dadurch gekennzeichnet, daß man die Fermentierungoier Inkubation bei einer Temperatur von 25 bis 400G und einem pH-Wert von 6,5 bis 9fO durchführt.
    6. Verfahren nach Ansprüchen 2 und 3» dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus verwendet, bei dem es sich um einen zu Pseudomonas, Corynebacterium, Arthrobacter, Brevibacterium, Mycobacterium, Nocardia, Candida, Cunninghamella, Oladosporium, Gibberella, Penicillium oder Mucor gehörenden Stamm handelt.
    7. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus verwendet, bei dem es sich um einen der folgenden Stämme handelt: öorynebacterium primorioxydans B-321 FERM-P Nr. 1427, Corynebacterium primorioxydans var. forte B-323 FERM-P Nr. 1428, Pseudomonas mutabilis B-3252 FERM-P Nr. 1429, Arthrobacter paraffineus ATCC 21003, Brevibacterium ketoglutamicum ATCC 21004, Mycobacterium smegmatis IFO 3083, Nocardia corallina IFO 1954f Candida arborea IAM 4147» Cunninghamella blakesleeana IFO 4443, Cladosporium herbarum IFO 4458, Gibberella fujikuroi ATCC 14842, Penicillium chrysogenum ATCC 7326, Penicillium patulum ATCC 10120 oder Mucor microsporus ATCC 854I.
    8. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 3» dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Corynebacterium primorioxydans B-321 FERM-P Nr. 1427 verwendet.
    3 0 9 8 8 1 / 1 1 I 3
    9· Verfahren nach. Ansprüchen 1 "bis 3> dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Gorynebacterium primorioxydans var. forte B-323 FERM-P Nr. 1428 verwendet.
    10. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis.3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Pseudomonas mutaMlis B-3252
    PEHM-P 1429 verwendet.
    11. Verfahren nach Ansprüchen 2 Ms 7, dadurch gekennzeichnet, daß man die Verbindung A in dem Nährmedium in einer Konzen tration von 0,05 Ms 0,3 f° verwendet·
    309881/1143
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