DE3040045C2

DE3040045C2 -

Info

Publication number: DE3040045C2
Application number: DE3040045A
Authority: DE
Inventors: Shigeru Ikuta; Shigeyuki Imamura; Hidehiko Ishikawa; Kazuo Matsuura; Masaki Takada; Hideo Tagata Shizuoka Jp Misaki
Original assignee: Toyo Jozo KK
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 1979-10-26
Filing date: 1980-10-23
Publication date: 1989-08-31
Also published as: DK449280A; IT8025518A0; DE3040045A1; CH646994A5; GB2064544B; FR2468647B1; CA1156572A; JPS5661991A; US4346173A; IT1195033B; GB2064544A; JPS5840466B2; FR2468647A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Acyl-CoA-oxidase (Acyl-Coenzym-A-oxidase), das dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Acyl-CoA-oxidase liefernde Mikroorganismen Macrophomina phaseoli ATCC 14383, Cladosporium resinae IFO 6367, Aspergillus candidus M-4815 FERM-P Nr. 5226, Monascus sp. M-4800 FERM-P Nr. 5225, Saccharomyces cerevisiae Y 0036 FERM-P Nr. 5174 oder Arthrobacter sp. B-0720 FERM-P Nr. 5224 in einem Nährmedium kultiviert und die so gebildete Acyl-CoA-oxidase daraus isoliert.

Acyl-CoA-oxidase ist ein Enzym, welches eine Reaktion katalysiert, bei der 1 Mol Acyl-CoA 1 Mol Sauerstoff verbraucht, um 1 Mol 2,3-Dihydroacyl-CoA und 1 Mol Wasserstoffperoxid zu bilden.

Ein Mikroorganismus, der Acyl-CoA-oxidase bildet, ist bekannt, Candida utilis [Arch. Biochem. Biophys., 176, 591-603 (1976)].

Es wurde gefunden, daß Schimmelpilze, die zum Genus Macrophomina, Stamm Macrophomina phaseoli ATCC 14383 [The American Type Culture Collection Katalogue of Strains I (1978)]; zum Genus Cladosporium, Stamm Cladosporium resinae IFO 6367 [Institute for Fermentation OSAKA List of Cultures (1978)]; zum Genus Aspergillus, Stamm Aspergillus candidus M-4815; und zum Genus Monascus, Stamm Monascus sp. M-4800, gehören, Hefe, die zum Genus Saccharomyces, Stamm Saccharomyces Y 0036, gehört, und Bakterien, die zum Genus Arthrobacter, Stamm Arthrobacter sp. B-0720, gehören, Acyl-CoA-oxidase ergeben und daß das Enzym isoliert werden kann.

Die taxonomischen Eigenschaften der obigen Mikroorganismen sind wie folgt.

[1] Aspergillus candidus M-4815 (1) Wachstumsbedingungen auf verschiedenen Medien

(1) Czapeck Agar:
Wachstum bei 26°C: langsam, 15 bis 18 mm Durchmesser bei 10 Tagen Kultur. Kolonien; dünn und flach. Farbe der Kolonie: weiß zum frühen Zeitpunkt, cremefarben (Ton 1½ Ca) bis schwachgelb (Ton 1 Ca), bestimmt zum Zeitpunkt mit vielen Konidien.
Keine Bildung von Sclerotia
Rückseite der Kolonie: farblos. Keine Bildung von diffundierbarem Pigment und Exsudat.
(2) Malzextrakt-Agar:
Wachstum bei 26°C: mäßig, 42 bis 45 mm im Durchmesser bei 10tägiger Kultur. Kolonien: dünn und flach. Farbe der Kolonie: weiß zum frühen Zeitpunkt, cremefarben (Ton 1½ Ca) zum gereiften Zeitpunkt mit vielen Konidien. Rückseite der Kolonie: farblos. Keine Bildung von diffundierbarem Pigment und Exsudat.
(2) Mikroskopische Beobachtung:
Konidienkopf: weiß bis cremefarben, vergleichsweise groß, 500 bis 800 µm im Durchmesser, Kugeln zum frühen Zeitpunkt, die sich zu mehreren Strahlen zum späteren Zeitpunkt umwandeln. Konidiophoren: 500 bis 1000 µm in der Länge, 8 bis 15 µm breit, glatte Wände. Bläschen: kugelförmig bis subkugelförmig, Durchmesser 20 bis 40 µm. Sterigma: zwei Schichten. Primäres Sterigma: 5,0 bis 12,0 × 3,0 bis 4,0 µm; sekundäres Sterigma: 5,0 bis 7,0 × 2,5 bis 3,0 µm. Konidien: kugelförmig, 2,5 bis 3,5 µm, glatte Wand.
(3) Physiologische Eigenschaften:

1. Optimale Wachstumsbedingungen
Optimaler Wachstums-pH-Wert 4-9
Optimale Wachstumstemperatur 25-32°C
2. Wachstums-pH: 3 bis 11
Wachstumstemperatur: 15 bis 37°C.

Aufgrund der obigen taxonomischen Eigenschaften wird bestätigt, daß der Stamm M 4815, der Bläschen auf dem oberen Teil der Konidien aufweist, viele Sterigma auf den Bläschen besitzt und einzelzellige Konidienketten auf dem oberen Teil der Bläschen besitzt, zum Genus Aspergillus gehört. Dieser Stamm mit großem Konidienkopf und zahlreichen weißen bis cremefarbenen Konidien wird Aspergillus candidus [K.B. Raper und D. I. Fennell, The Genus Aspergillus, 686ff (1965); J. A. von Arx, The Genera of Fungi Sporulating in Pure Culture, 315ff (1974)] zugeordnet und wird als Aspergillus candidus M-4815 bezeichnet. Dieser Stamm wurde am Institute for Industrial Microbial Technology and Science, M.I.T.I., Japan (im folgenden als "Fermentation Institute" bezeichnet) bei der permanenten Hinterlegungsstelle als FERM-P Nr. 5226 hinterlegt.

[2] Monascus sp. M-4800 (1) Wachstumsbedingungen auf verschiedenen Medien

(1) Malzextrakt-Agar:
Wachstum bei 26°C: schnell, 60-65 mm im Durchmesser bei 10täg. Kultur. Kolonien: dünn und flach. Flockige, weiße Lufthyphen, die zum frühen Zeitpunkt der Kultur wachsen und die in Abhängigkeit von dem Fortschreiten der Kultur verschwinden. Farbe: korallfarben (Ton 7 lc). Rückseite der Kolonie: ziegelrot (Ton 6 ng)
(2) Kartoffel-Glucose-Agar:
Wachstum bei 26°C: schnell, 60-63 mm im Durchmesser bei 10täg. Kultur. Kolonien: dünn und flach, Zentrum etwas erhöht. Flockenartige, weiße Lufthyphen, die zum frühen Zeitpunkt der Kultur wachsen, wobei, abhängig vom Fortschreiten der Kultur, die Flocken verschwinden. Farbe: kolonienbildend rosa (Ton 7 ic). Rückseite der Kolonie: ziegelrot (Ton 6 ng).

(2) Mikroskopische Beobachtung

Ascocarp: Kügelchen, Durchmesser 20 bis 45 µm, die sich auf dem oberen Teil des Stammes von 40 bis 60 × 3 bis 5 µm bilden. Ascosporen: elliptisch, 4,5 bis 5,5 × 4 bis 4,5 µm, farblos, glatte Wand. Konidien: Meristem-Anthrosporen-Typ, die sich kettenartig auf dem oberen Teil der Konidien bilden, birnenförmig, farblos, Durchmesser 7 bis 10 µm. In den vegetativen Hyphen bildet sich ein rötlichbraunes Pigment.

(3) Physiologische Eigenschaften

(1) Optimale Wachstumsbedingungen:
Optimaler Wachstums-pH: 4 bis 9
Optimale Wachstumstemperatur: 22 bis 30°C.
(2) Wachstumsbedingungen:
Wachstums-pH: 3 bis 11
Wachstumstemperatur: 15 bis 35°C.

Wie zuvor erwähnt, wird der Stamm M-4800, der kugelförmige Ascocarpien auf dem oberen Teil des Stammes bildet und wobei die Asci zu einem frühen Zeitpunkt verschwinden, als zum Genus Monascus [The Genera of Fungi Sporulating in Pure Culture, 315ff (1974)] gehörig betrachtet und als Monascus sp. M-4800 bzeichnet. Dieser Stamm wurde im Fermentation Institute bei der permanenten Hinterlegungsstelle als FERM-P Nr. 5225 hinterlegt.

[3] Saccharomyces cerevisiae Y 0036 (1) Wachstumsbedingungen auf verschiedenen Medien

(1) MY flüssiges Medium:
Gutes Wachstum bei 26°C am unteren Teil des Mediums. Keine Bildung von Häutchen. Etwas trübe beim Wachstum. Keine Verfärbung des Mediums.
(2) MY-Agarmedium:
Gutes Wachstum bei 26°C. Peripher eine Riesenkolonie die vollständig oder teilweise wellenartig ist. Oberfläche: radial Verlauf mehrere Falten. Stumpfer Glanz. Butterartig im Charakter. Cremefarben.
(3) Objektträgerkultur auf Kartoffelextrakt-Agarmedium:
Vegetative Zellen: 3,0 bis 8,0 × 2,5 bis 7,0 µm, asphärisch, eiförmig oder elliptisch.
Wachstum durch polypolare Knospen. Keine Bildung von Hyphen und Pseudohyphen.

(2) Bildung von Ascosporen

Gute Bildung von Ascosporen auf Gorodkwa-Medium. Kugelförmig oder eiförmig. Glatte Oberfläche. Durchmesser 2,5 bis 3,0 µm. 1 bis 4 Sporen in einem Ascus.

(3) Bildung von kugelförmigen Sporen

Keine

(4) Physiologische Eigenschaften

(1) Optimale Wachstumsbedingungen:
Optimaler Wachstums pH: 3 bis 7
optimale Wachstumstemperatur 20 bis 30°C.
(2) Wachstumsbereich:
Wachstums pH: 2 bis 9
Wachstumstemperatur: 10 bis 40°C.
(3) Nitratassimilierung: -
(4) Zersetzung von Lipid: -
(5) Zersetzung von Harnstoff: -
(6) Gelatineverflüssigung: -
(7) Antiosmotischer Druck: Wachstumsgrenze bei einer NaCl-Konzentration von 12 bis 14%.
(8) Bildung von Carotinoid: -
(9) Typische organische Säurebildung: -
(10) Bildung von stärkeähnlichen Substanzen: -
(11) Vitaminerfordernis: -
(12) Fermentierung und Assimilierung von Zucker:

Aufgrund der obigen taxonomischen Eigenschaften gehört der Stamm Y 0036, der Eigenschaften von Hefe aufweist, kugelförmig oder einförmig ist, die Bildung von glatten Ascosporen zeigt, Wachstum von vegetativen Hyphen durch polypolare Knospen aufweist, keine Bildung von kugelförmigen Sporen zeigt keine Assimilierung von Nitrat und gute Fermentation von Glucose zeigt, zum Genus Saccharomyces. Weitere Einzelheiten hinsichtlich der Morphologie des Stammes, des Wachstums, der Zuckerfermentierung und -assimilation und anderer Eigenschaften zeigen die Identifizierung bei der Beschreibung für Saccharomyces cerevisiae [J. Lodder, The Yeast, a taxonomic study, 1385ff (1950)]. Dieser Stamm wird als Saccharomyces cerevisiae bezeichnet und wurde beim Fermentation Institute bei der permanenten Hinterlegungsstelle als FERM-P Nr. 5174 hinterlegt.

[4] Arthrobacter sp. B-0720 (1) Wachstum auf verschiedenen Medien

(1) Nähragarplatte:
Kolonie: kreisförmig, glatt peripher, konvex, gräulich-weiß bis hellgelb nach 2- bis 3tägiger Kultur.
(2) Nähragarschrägkultur:
Gutes Wachstum, fadenförmiges Wachstum. Bildung von 2- bis 3tägiger Kultur von schwach gelbem Pigment.
(3) Bouillonbrühe:
Schwaches Wachstum, trübe, keine Bildung von Häutchen.
(4) BCP-Milch:
Schwach alkalisch nach 5 bis 7 Tagen.

(2) Mikroskopische Beobachtung

(1) Form und Größe der Zellen:
Junge Zellen (6 Stunden Kultivierung): gerade oder etwas gebogene Stäbe oder Stücke; etwas verzweigte Zellen; Alte Zellen (20 Stunden Kultivierung): kurze Stäbchen oder Kügelchen (Polymorphismus).
Größe:
0,5 bis 0,8 × 1,5 bis 3,0 µm (junge Zellen)
0,5 bis 0,8 × 0,5 bis 1,0 µm (alte Zellen).
Keine Bildung von Sporen.
(2) Motilität:
Subpolare Glagella oder polare Flagella.

(3) Physiologische Eigenschaften

(1) Wachstumstemperatur:
Kein Wachstum bei 10°C; schwaches Wachstum bei 42°C; gutes Wachstum bei 25 bis 35°C.
(2) Wachstums pH:
Kein Wachstum bei pH 6,0; Wachstum bei pH 6,5 bis 9,0.
(3) Verfleckung:
Gram-Färbung: + Gegenüber Säure beständige Verfleckung: -
(4) Cellulosezersetzung: -
(5) Gelatinezersetzung: +
(6) Caseinzersetzung: +
(7) Äsculinzersetzung: +
(8) Stärkehydrolyse: +
(9) Catalasebildung: +
(10) Oxidasebildung: +
(11) Ureasebildung: -
(12) Indolbildung: -
(13) H₂S-Bildung: -
(14) Acetoinbildung: -
(15) Nitratreduktion: +
(16) Citratausnutzung: +
(17) Ammoniumausnutzung: +
(18) Nitratausnutzung: +
(19) O-F-Test [J. Gen. Microbiol., 30, 400-420 (1963)]: O (oxidativ)
(20) Säurebildung aus Zucker [J. Gen. Microbiol., 30, 400-420 (1963)]:
Säurebildung (keine Gasbildung): L(+)-Arabinose, Cellobiose, D-Galactose, D-Glucose, Glycerin, Lactose, D-Mannose, Stärke, Saccharose.
Keine Säurebildung: Adonit, Dulcit, Meso-erythrit, Fucose, Inosit, Inulin, Maltose, Mannit, Melezitose, Melibiose, Raffinose, L(+)-Rhamnose, Salicin, L(-)-Sorbose, Sorbit, Trehalose.

Als Ergebnis der taxonomischen Eigenschaften ist der Stamm B-0720 identisch mit denen vom Genus Arthrobacter [Bergey′s Manual of Determinative Bacteriology, 8. Ed. (1974), Can. J. Microbiol., 20, 1411-1414 (1974)] hinsichtlich der positiven Gram-Färbung, der Nicht-Säurebeständigkeit, der aeroben Polymorphismus-Bakterien und der Nicht-Cellulosezersetzung. Der Stamm B-0720 wird daher Arthrobacter sp. B-0720 zugeordnet und wurde bei dem Fermentation Institute bei der permanenten Hinterlegungsstelle als FERM-P Nr. 5224 hinterlegt.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von Acyl-CoA-oxidase zur Verfügung zu stellen. das dadurch gekennzeichnet ist, daß man bestimmte Acyl-CoA-oxidase liefernde Mikroorganismen, die zum Genus Macrophomina, zum Genus Cladosporium, zum Genus Aspergillus, zum Genus Monascus, zum Genus Saccharomyces oder zum Genus Arthrobacter gehören, in einem Nährmedium züchtet und das gebildete Enzym isoliert (vgl. den Patentanspruch).

Bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die obigen, Acyl-CoA-oxidase liefernden Mikroorganismen in einem an sich bekannten Medium für die Enzymherstellung kultiviert. Die Kultivierung der Mikroorganismen kann in flüssiger oder fester Kultur durchgeführt werden. Eine submerse Kultur ist für die industrielle Erzeugung bevorzugt.

Bevorzugt kann ein an sich bekanntes Medium für Mikroorganismen verwendet werden. Als Kohlenstoffquellen können assimilierbare Kohlenstoffquellen, wie Glucose, Galactose, Melassen, Stärkehydrolysate, höhere Fettsäuren, wie Ölsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, Palmitoleinsäure oder Myristoleinsäure, verwendet werden. Als assimilierbare Stickstoffquellen können Pepton, Sojabohnenpulver, Caseinhydrolysat, Maisquellwasser, Fleischextrakte, Hefeextrakt, Nitrat oder Ammoniumsalze verwendet werden. Verschiedene Salze, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Kaliumphosphat oder Magnesiumsulfat, werden gegebenenfalls verwendet. Die Zugabe einer höheren Fettsäure, wie Ölsäure, als Kohlenstoffquelle zu dem Medium stimuliert die Bildung von Acyl-CoA-oxidase. Die Zugabemenge beträgt bevorzugt 0,5 bis 1% (Gew./Gew.).

Die Kulturtemperatur kann innerhalb der Bereiche für das Wachstum von Mikroorganismen und die Bildung von Enzymen variiert werden und beträgt bevorzugt 25 bis 30°C für Schimmelpilze und 28 bis 33°C für Hefe oder Bakterien. Die Kulturzeit kann in Abhängigkeit von den Bedingungen variiert werden und beträgt gewöhnlich 40 bis 100 Stunden für Schimmelpilze, 50 bis 80 Stunden für Hefe und 15 bis 40 Stunden für Bakterien. Die Kultur sollte natürlich beendigt werden, wenn die Acyl-CoA-oxidase-Bildung im wesentlichen beendigt ist. Die Acyl-CoA-oxidase ist ein endo-Enzym, welches in den Zellen der Mikroorganismen vorkommt.

Verfahren zur Extraktion von Acyl-CoA-oxidase aus der gezüchteten Masse sind die folgenden. Die gezüchtete Masse wird filtriert und die nassen Zellen werden in einem Phosphatpuffer oder Tris-HCl-Puffer suspendiert und durch Behandlung mit Lysozym, Ultraschallbehandlung oder mit einer französischen Presse zerstört. Die so erhaltene, rohe Acyl-CoA-oxidase wird nach an sich bekannten Isolierungs- und Reinigungsverfahren für Protein und Enzym gereinigt. Beispielsweise wird bevorzugt eine fraktionierte Ausfällung mit Aceton, Äthanol oder Isopropanol und ein Aussalzen mit Ammoniumsulfat durchgeführt. Eine weitere Reinigung kann z. B. durch Elektrophorese oder Chromatographie erfolgen, gemäß denen rohe Acyl-CoA-oxidase in einem Phosphatpuffer oder einem Tris-HCl-Puffer gelöst wird und unter Verwendung von Ionenaustauschern, wie Diäthylamino-äthylcellulose (DEAE-Cellulose) oder Dextrangel oder Gelfiltrationsmittel, wie Dextrangel oder Polyacrylamidgel, chromatographiert wird. Die gereinigte Acyl-CoA-oxidase kann als lyophilisiertes Pulver gelagert werden.

Die erfindungsgemäß erhaltene Acyl-CoA-oxidase wird gemäß dem folgenden Verfahren analysiert und besitzt die folgenden physikochemischen Eigenschaften.

(1) Assay bzw. Analyseverfahren
Enzymlösung (10 µl) wird zu einem Reaktionsgemisch (0,5 ml), das 0,2 M Phosphatpuffer (pH 7,0) oder 0,2 Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) (0,1 ml), 5 mM 4-Aminoantipyrin (0,05 ml), 3 mM Diäthyl-m-toluidin (0,05 ml), Peroxidase (0,5 mg/ml, 0,05 ml), 25 mM Palmitoyl-CoA (0,02 ml) und destilliertes Wasser (0,23 ml) enthält, gegeben und dann wird 10 min bei 37°C inkubiert. 4 M Harnstoff (0,5 ml) werden zur Beendigung der Reaktion zugesetzt. 1% (Gew./Gew.) Triton X-100 (2 ml) wird zugegeben und dann wird das erzeugte Wasserstoffperoxid bei 545 nm colorimetrisch bestimmt.
Eine Einheit (1 Einheit, 1 E) der Enzymaktivität wird als Aktivität des Enzyms definiert, welches 1 µMol Wasserstoffperoxid/min erzeugt.
(2) Enzymwirkung
Oxidation von 1 Mol Acyl-CoA verbraucht 1 Mol Sauerstoff und setzt 1 Mol 2,3-Dehydroacyl-CoA und 1 Mol Wasserstoffperoxid frei.
(3) Optimaler pH
Der optimale pH wird bestimmt, indem man die Enzymaktivität in Dimethylglutaracetat-NaOH-Puffer (pH 6,0 bis 7,0), Phosphatpuffer (pH 6,5 bis 7,5) und Tris-HCl-Puffer (pH 7,5 bis 9,0) analysiert. Der optimale pH-Wert des Enzyms ist in der Tabelle angegeben.
In Fig. 1 bedeutet:
.-. Arthrobacter sp. B-0720
o-o Macrophomina phaseoli ATCC 14383.
(4) pH-Stabilität
Die Enzymlösung wird in Puffer mit verschiedenen pH-Werten gegeben, 60 min bei 37°C inkubiert und die verbleibende Aktivität wird analysiert. Man verwendet Phosphatpuffer für pH 6,5 bis 7,5, Tris-HCl-Puffer für PpH 7,5 bis 9,0 und Glycin-NaOH-Puffer für pH 9,0 bis 10,0. Die pH-Stabilität der Acyl-CoA-oxidase ist in der Tabelle angegeben.
In Fig. 2 bedeutet:
.-. Arthrobacter sp. B-0720
o-o Macrophomina phaseoli ATCC 14383.
(5) Wärmestabilität
Das Enzym wird 10 min bei 40°, 45°, 50°, 55° und 60°C behandelt und die restliche Enzymaktivität wird analysiert. Die Ergebnisse sind in der Tabelle angegeben.
In Fig. 3 bedeutet:
.-. Arthrobacter sp. B-0720
o-o Macrophomina phaseoli ATCC 14383.
(6) Km-Wert: in der Tabelle angegeben.
(7) Isoelektrischer Punkt: vergl. die Tabelle.
Wie zuvor angegeben, katalysiert die erfindungsgemäße Acyl-CoA-oxidase die Oxidation von langkettigem Acyl-SoA, wie Palmitoyl-CoA, durch Verbrauch von 1 Mol Sauerstoff und erzeugt 2,3-Dehydroacyl-CoA und Wasserstoffperoxid.

Das erfindungsgemäße erhaltene Enzym kann für die Analyse von Fettsäure, CoA und Triglycerid in Acyl-CoA bildenden Systemen, z. B. in dem Acyl-CoA bildenden System, in einem Reaktionsgemisch, welches Fettsäure, CoA und Fettsäure-aktivierendes Enzym enthält, und in dem Fettsäure bildenden System, welches Triglycerid und Lipase oder Lipoproteinlipase enthält, verwendet werden. Das Enzym kann ebenfalls für die Analyse der Aktivität von Fettsäure aktivierendem Enzym, Lipase oder Lipoproteinlipase verwendet werden.

Tabelle

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

10 ml eines Mediums, welches 1% (Gew./Gew.) Ölsäure, 0,25% (Gew./Gew.) Hefeextrakt, 1% (Gew./Gew.) Pepton, 0,2% (Gew./Gew.)KCl, 0,1% (Gew./Gew.) K₂HPO₄, 0,05% (Gew./Gew.) MgSO₄ · 7 H₂O und 0,2% (Gew./Gew.) Antischäumungsmittel (Disfoam BC-51Y) enthält, werden in einem Reagenzglas sterilisiert. Arthrobacter sp. B-0720 wird darin inokuliert und dann wird über Nacht bei 38°C unter Schütteln kultiviert. Die Impfkultur wird in das gleiche sterilisierte Medium (5 l) in einem 8-l-Fermentationskolben überführt und dann wird 20 h bei 30°C, 600 U/min, Belüftung 5 l/min gezüchtet.

Die Bakterienzellen werden durch Zentrifugieren abgetrennt und in einer Lösung, die 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0), 2 mM EDTA und Lisozym (0,5 mg/ml) enthält, suspendiert. Dann wird 60 min bei 37°C gerührt. 5 mg Desoxyribonuclease werden zugesetzt und man rührt weitere 10 min. Zu dem überstehenden Material, das man durch Zentrifugieren bei 10 000 U/min während 20 min erhält, gibt man 200 ml Aceton und zentrifugiert erneut. Dann werden zu dem überstehenden Material 1,8 l Aceton zugegeben, der Niederschlag wird durch Zentrifugieren abgetrennt, in 10 mM Phosphatpuffer (200 ml, pH 7,0) gelöst. Unlösliche Materialien werden durch Zentrifugieren entfernt und das überstehende Material wird fraktioniert, indem man gesättigte Ammoniumsulfatlösung bis zu einer Sättigung von 30 bis 75% zugibt. Der Niederschlag wird in 10 mM Phosphatpuffer (40 ml, pH 7,0) gelöst und über eine Säure aus Acrylamidgel (Warenzeichen Biogel P-2) entsalzt. Die entsalzte Lösung wird einer Calciumphosphatgelsäule unterworfen, um das Enzym zu adsorbieren. Nach dem Auswaschen der nicht adsorbierten Fraktion wurde die Acyl-CoA-oxidase mit einem Gradienten von 0,05 bis 0,5 M Phosphatpuffer (pH 7,0) eluiert. Die aktive Fraktion (um 0,45 M) wird gesammelt und dialysiert und durch Ultrafiltration (Warzenzeichen Diaflow membran PM-10) konzentriert. Dann wird lyophilisiert, wobei man ein Pulver aus Acyl-CoA-oxidase erhält. (spezifische Aktivität: 5,5 E/mg, Gesamtaktivität: 850 E, Ausbeute: 8,5%).

Beispiel 2

10 ml eines Mediums, das (jeweils als Gew./Gew.) 1% Ölsäure, 0,25% Hefeextrakt, 1% entfettetes Sojabohnenpulver (Warenzeichen Protoflower), 0,2% KCl, 0,1% K₂HPO₄, 0,5% CaCO₃ und 0,2% Disfoam BC-51Y enthält, werden in einem Reagenzglas sterilisiert. Macrophomina phaseoli ATCC 14383 wird darin inokuliert und dann wird 4 Tage bei 26°C unter Schütteln gezüchtet. Die Impfkultur wird in das gleiche Medium (5 l) in einem 8-l-Fermentationskolben überführt und dann wird 45 h, 700 U/min, Belüftung 5 l/min bei 26°C kultiviert.

Die Pilzzellen werden durch Filtration abgetrennt und in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0; 1,5 l) suspendiert. Die Suspension wird 15 min homogenisiert. Das durch Zentrifugieren erhaltene, überstehende Material wird im Vakuum bis zu ¹/₁₀ Volumen zur Abtrennung der unlöslichen Materialien konzentriert. Gesättigte Ammoniumsulfatlösung wird zu dem überstehenden Material zur Fraktionierung bis zu einer Sättigung von 30 bis 80% zugegeben. Der Niederschlag wird in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0; 75 ml) gelöst und weiter aus einer 30-80%igen Ammoniumsulfatsättigung fraktioniert. Der so erhaltene Niederschlag wird in Phosphatpuffer (pH 7,0; 40 ml) gelöst und die unlöslichen Materialien werden durch Zentrifugieren entfernt. Die Lösung wird auf eine Säule aus Sephacryl S-300 (Warenzeichen) gegeben und dann wird eluiert; man erhält die aktiven Fraktionen. Die aktive Fraktion wird mit einer Ultrafiltrationsmembran (Diaflow membrane XM-50) konzentriert und lyophilisiert; man erhält ein Pulver aus Acyl-CoA-oxidase (spezifische Aktivität: 1,2 E/mg, Gesamtaktivität: 110 E, Ausbeute: 11,0%).

Beispiele 3 bis 5

In Beispiel 2 wird Macrophomina phaseoli ATCC 14383 durch Aspergillus candidus M-4815, Cladosporium resinae IFO 6367 und Monascus sp. M-4800 ersetzt, und diese Stämme werden in dem gleichen Medium (100 ml) wie in Beispiel 2 in einem 500-ml-Erlenmeyerkolben inokuliert und dann wird 4 Tage bei 26°C unter Schütteln kultiviert. Die filtrierten Mycelien werden in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0; ¹/₅ Volumen der Suspension) suspendiert und 10 min beschallt. Die Acyl-CoA-oxidase-Aktivitäten der überstehenden Lösung, die man beim Zentrifugieren erhält, sind wie folgt.

Mikroorganismus
Enzymaktivität (E/ml)
Aspergillus candidus M-4815
0,047
Cladosporium resinae IFO 6367	0,035
Monascus sp. M-4800	0,065

Diese werden nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 gereinigt.

Beispiel 6

Der Stamm Saccharomyces cerevisiae Y 0036 wird in einem Medium (pH 4,2; 100 ml), das (jeweils ausgedrückt als Gew./Gew.) 1% Ölsäure, 0,25% Hefeextrakt, 0,5% Pepton, 0,2% KCl, 0,1% KH₂PO₄ und 0,05% MgSO₄ · 7 H₂O enthält, in einem 500-ml-Erlenmeyerkolben inokuliert und dann wird 3 Tage bei 30°C unter Schütteln kultiviert. Durch Zentrifugieren gesammelte Hefezellen werden in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0; ¹/₅ Volumen der Suspension) suspendiert und 10 min beschallt. Die Acyl-CoA-oxidase-Aktivität in der durch Zentrifugieren erhaltenen, überstehenden Lösung beträgt 0,75 E/ml. Die Reinigungsverfahren sind die gleichen wie in Beispiel 1.

Erläuterung der Zeichnungen:
Fig. 1: optimaler pH
Fig. 2: pH-Stabilität
Fig. 3: Wärmestabilität
In den Figuren bedeuten:
.-. Acyl-CoA-oxidase, erhalten aus Arthrobacter sp. B-0720
o-o Acyl-CoA-oxidase, erhalten aus Macrophomina phaseoli ATCC 14383.

Claims

Verfahren zur Herstellung von Acyl-CoA-oxidase, dadurch gekennzeichnet, daß man als Acyl-CoA-oxidase liefernde Mikroorganismen Macrophomina phaseoli ATCC 14383, Cladosporium resinae IFO 6367, Aspergillus candidus M-4815 FERM-P Nr. 5226, Monascus sp. M-4800 FERM-P Nr. 5225, Saccharomyces cerevisiae Y 0036 FERM-P Nr. 5174 oder Arthrobacter sp. B-0720 FERM-P Nr. 5224 in einem Nährmedium kultiviert und die so gebildete Acyl-CoA-oxidase daraus isoliert.