FR2468647A1 - Procede de production d'acyl-coa oxydase - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne un procédé de production d'acyl-CoA oxydase. Ce procédé est caractérisé en ce qu'on cultive un microorganisme producteur d'acyl-CoA oxydase appartenant au genre Macrophomina, au genre Cladosporium, au genre Aspergillus, au genre Monascus, au genre Saccharomyces ou au genre Arthobacter dans un milieu nutritif et on isole l'acyl-CoA oxydase ainsi formée. L'acyl-CoA oxydase catalyse une réaction dans laquelle une mole d'acyl-CoA consomme une mole d'oxygène pour produire une mole de 2,3-déhydroacyl-CoA et une mole d'eau oxygénée.

Description

La présente invention concerne un procédé pour

la production d'acyl-CoA oxydase (acyl-Coenzyme A oxy-

dase). L'acyl-CoA oxydase est une enzyme qui catalyse une réaction dans laquelle une mole d'acyl-CoA consomme

une mole d'oxygène pour produire une mole de 2,3-déhydro-

acyl-CoA et une mole d'eau oxygénée. -

On connaît un micro-organisme produisant l'acyl-

CoA oxydase qui est Candida utilis /-Arch. Biochem.

Biophys., 176, 591-603 (1976)_/.

On a trouvé que des moisissures appartenant au genre Macrophomina, souche Macrophomina phaseoli

ATCC 14383 tJThe American Type Culture Collection Catalo-

gue of Strains I (1978)_/; au genre Cladosporium, sou-

che Cladosporium resinae IFO 6367 / Institute for Fermen-

tation OSAKA List of Cultures (1978) /; au genre Asper-

gillus, souche Aspergillus candidus M-4815; et au genre

Monascus, souche Monascus sp M-4800; une levure appar-

tenant au genre Saccharomyces, souche Saccharomyces cerevisiae Y 0036 et une bactérie appartenant au genre Arthrobacter, souche Arthrobacter sp. B0720 produisent

de l'acyl-CoA oxydase et on a isolé cette enzyme.

Les propriétés taxonomiques des micro-organis-

mes ci-dessus sont les suivantes.

/ 1 _7 Aspergillus candidus M-4815 (1) Conditions de développement sur divers milieux: 1. Gélose de Czapeck Développement à 26 C: lent, 15 à 18 mm sur

une culture de 10 jours.

Colonies: minces et plates. Couleur des colo-

nies: blanche à un stade initial, crème (nuance A. Ca)

à jaune pâle (nuance 1 Ca) à maturité avec de nombreu-

ses conidies. Pas de formation de sclérotes. Envers de la colonie: incolore. Pas de production de pigment

diffusible ni d'exsudat.

2. Gélose à l'extrait de malt Développementà 26eC: normal, 42 à 45 mm de

diamètre sur une culture de 10 jours.

Colonies: minces et plates. Couleur des colo-

nies: blanche à un stade initial, crème (nuance 1.1 Ca) à maturité avec de nombreuses conidies. Envers de la

colonie: incolore. Pas de production de pigment diffu-

sible ni d'exsudat.

(2) Observation microscopique: Tête conidienne: blanche à crème, relativement grosse, 500 à 800 u de diamètre, globeuse à un stade

initial pour devenir polyradiale à un stade avancé.

Vésicule: globeuse à subglobeuse, 20 à 40 u de diamè-

tre. Stérigmates: deux couches. Stérigmates primai-

res: 5,0 - 12,0 - 3,0 - 4,0 p; stérigmates secondaires: 5,0 - 7,0 x 2,5 x 3,0 p. Conidies: globeuses, 2,5

à 3,5 y, paroi lisse.

(3) Propriétés physiologiques: pH de croissance: 3 à 11 Température de croissance: 15 à 37 C D'après les propriétés taxonomiques ci-dessus, la souche M 4815, ayant des vésicules sur le dessus des conidies, de nombreux stérigmates sur les vésicules et une chaîne de conidies à une seule cellule sur le dessus des vésicules, est confirmée comme appartenant au genre Aspergillus. Cette souche, ayant une grosse tête conidienne et d'abondantes conidies blanches à crémeuses, est appelée Aspergillus candidus /-K.B. Raper et D.I. Fennell, The Genus Aspergillus, 686 pages (1965), J.A. von Arx, The Genera of Fungi Sporulating in Pure Culture, 315 pages (1974)_/ et a été appelée Aspergillus

candidus M-4815. Cette souche a été déposée à l'Insti-

tute for Industrial Microbial Technology and Science, M.I.T.I., Japon (appelé ci-après Fermentation Institute)

sous le numéro de collection de culture permanente FERM-

P n 5226.

C 2_7 Monascus sp. M-4800 (1) Conditions de croissance sur divers milieux: 1. Gélose à l'extrait de malt Croissance à 26 C: rapide, 60 à 65 mm sur une

culture de 10 jours.

Colonies: minces et plates. Des hyphes aérien-

nes blanches floconneuses se développent à un stade initial de la culture, l'aspect floconneux disparaissant suivant la progression de la culture. Couleur: corail (nuance 7 lc). Envers de la colonie: rouge brique

(nuance 6 ng).

2. Gélose glucosée à la pomme de terre Développement à 26 C: rapide, 60 à 63 mm sur

une culture de 10 jours.

Colonie: mince et plate, centre légèrement élevé. Des nymphes aériennes blanches floconneuses se développent à un stade initial de la culture, l'aspect floconneux disparaissant suivant la progression de la cultureo

Couleur: rose colonial (nuance 7 ic).

Envers de la colonie: rouge brique (nuance

6 ng).

(2) Observation microscopique Ascocarpe: globeux, 20 à 45 de diamètre, formé sur le dessus d'une tige de 40 60 x 3 - 5 po

Ascospores: elliptiques, 4,5 - 5,5 x 4,- 4,5 p, incolo-

res, paroi lisse.

Conidies: type à méristème-anthrospore, se formant en chaîne sur le dessus des conidies, type en forme de poire, incolores, 7 à 10 p de diamètre. Dans les hyphes végétatives, il se forme un pigment brun rougeâtre. (3) Propriétés physiologiques: 1. Conditions optimales de croissance: pH optimal de croissance: 4 à 9 Température optimale de croissance: 22 à 30 C 2. Conditions de croissance: pH de croissance: 3 à 11

Température de croissance: 15 à 35 C.

Comme expliqué ci-dessus, la souche M-4800, formant un ascocarpe globeux sur le dessus de la tige et présentant une disparition des asques à un stade

initial, est identifiée comme appartenant au genre Mo-

nascus Z-The Genera of Fungi Sporulating in Pure Culture,

315 pages (1974)_7 et est appelée Monascus sp M-4800.

Cette souche a été déposée au Fermentation Institute

sous le numéro de collection de culture permanente FERM-

P n 5225.

C3_7 Saccharomyces cerevisiae Y 0036: (1) Conditions de croissance sur divers milieux: 1. Milieu liquide MY:

Bonne croissance à 26 C sur le fond du milieu.

Pas de formation de cortex. Légèrement trouble lors

de la croissance. Pas de coloration du milieu.

2. Milieu de gélose MY

Bonne croissance à 260C. La périphérie de colo-

nies géantes est complètement ou partiellement ondulée.

Surface: plusieurs plissements radiaux. Aspect terne.

Caractère butyreux. Couleur crème.

3. Culture inclinée sur milieu gélosé à l'ex-

trait de pomme de terre: Cellules végétatives: 3,0 - 8,0 x 2,5 x 7,0 p,

asphériques, ovoides ou ellipsoidiques.

Développement par bourgeonnement multipolaire.

Pas de formation d'hyphes ni de pseudo-hyphes. (2) Formation d'ascospores: Bonne formation d'ascospores sur milieu de Gorodkwa. Globeuses ou ovoldes. Surface lisse. 2,5

à 3,0 p de diamètre 1 à 4 spores dans un asque.

(3) Formation de spores radiales: néant (4) Propriétés physiologiques: 1. Conditions optimales de développement: pH optimal de développement: 3 à 7 Température optimale de développement: 20 à 30 C 2. Conditions de développement pH de développement: 2 à 9 Température de développement: 10 à 40 C

3. Assimilation de nitrate: -

4. Décomposition des lipides: -

5. Décomposition de l'urée: -

6. Liquéfaction de la gélatine: -

7. Pression anti-osmotique: limite de dévelop-

pement dans une concentration de NaC1 de 12 à 14%.

8. Formation de calotinoide: -

9. Formation typique d'acides organiques: -

10. Formation de substance du genre amidon: -

11. Besoin de vitamine: -

12. Fermentation et assimilation des sucres: Fermentatif: assimilable: Darabinose L-arabinose D-ribose D-xylose _ D-glucose + + D-mammose + Dgalactose + + D-rhamnose D-fructose + L(-)-sorbose maltose + + sucrose + + lactose - _ mélibiose cellobiose tréhalose raffinose 1/3 + + mélézitose + arbutine amidon soluble inuline DL-lactate + succinate + citrate + D'après les propriétés taxonomiques ci-dessus, la souche Y 0036, ayant des caractéristiques de levure, de forme globeuse ou ovoïde, formation d'ascospores

lisses, développement d'hyphes végétatives par bour-

geonnement multipolaire, pas de formation de spores

radiales, pas d'assimilation du nitrate et bonne fer-

mentation du glucose, appartient au genre Saccharomyces.

D'autres détails concernant la morphologie de la souche, le développement, la fermentation et l'assimilation

des sueres et d'autres propriétés permettent l'identi-

fication avec la description de Saccharomyces cerevisiae

tJ. Lodder, The Yeast, a taxonomie study, 1385 pages

(1950)_7. Cette souche est appelée Saccharomyces cere-

visiae et a été déposée au Fermentation Institute sous le numéro de collection de culture permanente FERM-P

n 5174.

/4_7 Arthrobacter sp. B-0720 (1) Croissance sur divers milieux: 1. Plaque de gélose nutritive: Colonie: circulaire, périphérie lisse, convexe,

blanc grisâtre à jaune pâle après 2 à 3 jours de cultu-

re. 2. Culture inclinée sur gélose nutritive:

Bonne croissance, croissance filiforme. Produc-

tion de pigment diffusiblo après 2 à 3 jours de culture.

3. Bouillon nutritif: Croissance faible, trouble, pas de formation

de pellicule.

4. Lait BCP

Faiblement alcalin après 5 à 7 jours.

(2) Observation microscopique: 1. Forme et dimensions des cellules:

Jeunes cellules (culture de six heures): bâton-

nets ou bâtons droits ou légèrement courbes. Un petit

nombre de cellules ramifiées.

Vieilles cellules (culture de 20 heures): bâ-

tonnets courts ou forme globeuse (polymorphisme).

Dimensions: 0,5 - 0,98 x 1,5 390 (jeunes cel-

lules) 0,5 - 0,8 x 095 1,0 p (vieilles

cellules). Pas de formation de spores.

2. Motilité: flagelles subpolaires ou flagelles polaires. (3) Propriétés physiologiques: 1. Température de croissance: Pas de croissance à 10 C. Croissance faible

à 42 C. Bonne croissance à 25-350C.

2. pH de croissance: pas de croissance à pH

6,0. Croissance à un pH de 6,5 à 9,0.

3. Coloration: coloration de Gram: +

coloration résistant aux acides: -

4. Décomposition de la cellulose: -

5. Décomposition de la gélatine: + 6. Décomposition de la caséine: + 7. Décomposition de l'esculine: + 8. Hydrolyse de l'amidon: + 9. Formation de catalase: + 10. Formation d'oxydase: +

11. Formation d'uréase: -

12. Formation d'indole: -

13. Formation de H2S: -

14. Formation d'acétolne: -

15. Réduction des nitrates: -

16. Utilisation des citrates: + 17. Utilisation de l'ammonium: + 18. Utilisation des nitrates: + 19. Essai 0-Fi: 0 (oxydation) 20. Formation d'acide à partir de sucres Formation d'acide (pas de formation de gaz):

L(+)-arabinose, cellobiose, D-galactose,D-glucose, gly-

cérol, lactose, D-mannose, amidon, sucrose.

Pas de formation d'acide: adonitol, dulcitol, mésoérythritol, fucose, isonitol, inuline, maltose,

mannitol, mélézitose, raffinose, L(+)-rhamnose, salici-

ne, L(-)-sorbose, sorbitol, tréhalose.

Il en résulte que, les propriétés taxonomiques de la souche B-0720 sont identiques à celles du genre

Arthrobacter /Bergey's Manual of Determinative Bacterio-

logy, 7ème édition (1957), Can. J. Microbiol. 20, 1411-

'/J. Gen. Microbiol., 30, 400 - 420 (1963)_7.

1414 (1974)_/ en ce qui concerne la coloration Gram

positive, l'absence de solidité aux acides, le polymor-

phisme, la caractéristique de bactérie aérobie et l'ab-

sence de décomposition de la cellulose. En conséquence, la souche B-0720 est appelée Arthrobacter sp. B-0720

et a été déposée au Fermentation Institute sous le nu-

méro de collection de culture permanente FERM.P n 5224.

Un but de la présente invention est de fournir

un procédé pour la production d'acyl-CoA oxydase carac-

térisé en ce qu'on cultive des micro-organismes produc-

teurs d'acyl-CoA oxydase appartenant au genre Macropho-

mina, au genre Cladosporium, au genre Aspergillus, au

genre Monascus, au genre Saccharomyces ou au genre Ar-

throbacter dans un milieu nutritif et on isole l'enzyme

produite.

La souche qui peut être utilisée dans la présen-

te invention est, par exemple, Macrophomina phaseoli ATCC 14383, Cladosporium resinae IFO 6367, Aspergillus candidus M-4815, Monascus sp. M-4800, Saccharomyces

cerevisiae Y 0036 ou Arthrobacter sp. B-0720. Ces sou-

ches ne sont pas limitatives et les autres souches pro-

ductrices d'acyl-CoA appartenant aux genres ci-dessus et leurs mutants naturels ou artificiels peuvent être

utilisés dans la présente invention.

Dans un mode de mise en oeuvre de la présente invention, le microorganisme producteur d'acyl-CoA ci-dessus est cultivé dans un milieu classique pour

la production d'enzymes. La culture du micro-organis-

me peut être effectuée en utilisant un milieu liquide

ou solide. Une culture immergée avec aération est pré-

férable pour une production industrielle.

On peut utiliser de préférence un milieu clas-

sique pour micro-organismes. En ce qui concerne les sources de carbone, on peut utiliser des sources de carbone assimilables comme le glucose, le galactose, la mélasse, l'hydrolysat d'amidon, un acide gras supérieur

comme l'acide oléique, l'acide palmitique, l'acide stéari-

que, l'acide palmitoléique ou l'acide myristoléique.

On peut utiliser des sources d'azote assimilables comme de la peptone, de la poudre de soja, de l'hydrolysat de caséine, de la liqueur de macération de mais, de

l'extrait de viande, de l'extrait de levures, un nitra-

te ou un sel d'ammonium. On utilise éventuellement divers sels comme le chlorure de sodium, le chlorure de potassium, le phosphate de potassium ou le sulfate de magnésium. L'addition au milieu d'un acide gras

supérieur tel que l'acide oléique comme source de car-

bone stimule la production d'acyl-CoA oxydase. La quan-

tité ajoutée est de préférence de 0,5 à 1% en poids

dans le milieu.

On peut faire varier la température de culture dans les plages de développement des micro-organismes et de production de l'enzyme et la température est de

préférence de 25 - 300C pour les moisissures et de 28 -

330C pour les levures ou les bactéries. On peut modi-

fier la durée de la culture suivant les conditions et cette durée est habituellement de 40 à 100 heures pour les moisissures, de 50 à 80 heures pour les levures

et de 15 à 40 heures pour les bactéries. On doit natu-

rellement arrêter la culture quand la production d'acyl-

CoA oxydase est sensiblement complète. L'acyl-CoA oxy-

dase est une endo-enzyme qui existe dans les cellules

de micro-organismes.

Des modes d'exécution de l'extraction de l'acyl-

CoA oxydase à partir de la masse de culture sont les

suivants. La masse de culture est filtrée et les cel-

lules humides sont mises en suspension dans un tampon

phosphate ou un tampon tris-HCl, et rompues par traite-

ment à la lysozyme, par sonification ou à la presse française. L'acyl-CoA oxydase brute ainsi obtenue est purifiée par des techniques classiques d'isolement

et de purification pour les protéines et les enzymes.

Par exemple, on utilise de préférence une précipita-

tion fractionnée par l'acétone, l'éthanol ou l'isopropa-

nol et le relargage par le sulfate d'ammonium. Une purification suppélementaire peut être effectuée par

exemple par électrophorèse ou chromatographie, l'acyl-

CoA oxydase brute étant dissoute dans un tampon phospha-

te ou un tampon tris-HC1 et chromatographiée en utili-

sant des échangeurs d'ions comme la diéthylamino éthyl-

cellulose (DEAE-cellulose) ou un gel de dextrane, ou des agents de filtration gélatineux comme un gel de

dextrane ou un gel de polyacrylamide. L'acyl-CoA oxy-

dase purifiée peut être conservée sous la forme d'une

poudre lyophilisée.

L'acyl-CoA oxydase de la présente invention est titrée par la méthode suivante et a les propriétés

physico-chimiques suivantes.

(1) Méthode de titrage: On ajoute une solution d'enzyme (10 ul) à un mélange réactionnel (0,5 cm3) constitué de 0,2 M tampon phosphte (pH 7,0) ou de 0,2 M tampon tris-Hcl (pH 8,0) (0,1 cm3), de 5 mM 4-aminoantipyrine (0,05 cm3), de 3 mS diéthyl m-toluidine (0,05 cm3), de peroxydase (0,5 mg/cm3, 0,05 cm3), de 25 mM palmitoyl-Coa (0,02 cm3) et d'eau distillée (0,23 cm3) et on fait incuber le

mélange à 37 C pendant 10 minutes. On ajoute une solu-

tion 4 M d'urée (0,5 cm3) pour faire cesser la réaction, on ajoute 1% en poids de Triton X-100 (2 cm3) et on

mesure l' eau oxygénée produite par colorimétrie à 545 nm.

Une unité (1 unité, 1 U) d'activité d'enzyme est définie comme l'activité d'enzyme qui produit 1

mole d'eau oxygénée par minute.

(2) Action de l'enzyme: L'oxydation d'une mole d'acyl-CoA consomme une

mole d'oxygène et libère une mole de 2,3-déhydroacyl-

CoA et une mole d'eau oxygénée.

(3) pH optimal: On détermine le pH optimal en titrant l'activité d'enzyme dans un tampon diméthylglutaryle (pH 6,0 - 7,0), un tampon phosphate (pH 6,5 - 7,5) et un tampon tris-HCl (pH 7,5 - 9,0). Le pH optimal de l'enzyme est indiqué

dans le tableau.

Sur la figure 1:.-.: Arthrobacter sp. B-0720 oo: Macrophomina phaseoli

ATCC 14383.

(4) Stabilité au pH: On ajoute une solution d'enzyme dans divers pH de tampon, on fait incuber le mélange à 37 C pendant 60 minutes et on détermine l'activité restante. On utilise un tampon phosphate pour un pH de 6,5 à 7,5,

un tampon tris-HC1 pour un pH de 7,5 à 9,0 et un tam-

pon glycine pour un pH de 9,0 à 10,0. La stabilité

au pH de l'acyl-CoA oxydase est indiquée dans le tableau.

Sur la figure A:.-.: Arthrobacter sp. B-0720 oo: Macrophomina phaseoli

ATCC 14383.

(5) Stabilité à la chaleur: On traite l'enzyme à 40 C, 45PC, 50 C, 55 C et 60 C pendant 10 minutes et on détermine l'activité d'enzyme restante. Le résultat est indiqué dans le

tableau.

Sur la figure 3:.-.: Arthrobacter sp. B-0720 -: Macrophomina phaseoli

ATCC 14383.

(6) Valeur de Km: indiquée dans le tableau.

(7) Point iso-électrique: indiqué dans le tableau.

Comme expliqué ci-dessus, l'acyl-CoA oxydase de la présente invention catalyse l'oxydation d'une

acyl-CoA à chaîne longue comme la palmitoyl-CoA en con-

sommant une mole d'oxygène et en produisant de la 2,3-

déhydroacyl-CoA et de l'eau oxygénée.

L'enzyme de la présente invention peut être utilisée pour analyse des acides gras, de CoA et des triglycérides dans un système de formation d'acyl-CoA, par exemple un système de formation d'acyl-CoA dans un mélange réactionnel constitué d'acide gras, de CoA

et d'enzyme activant l'acide gras et le système de forma-

tion d'acide gras étant constitué de triglycéride et de lipase ou de lipoprotéine lipase. L'enzyme peut aussi être utilisée pour détermination de l'activité

d'enzyme activant les acides gras, de lipase ou de li-

poprotéine lipase.

Les exemples suivants illustrent la présente

invention.

*Exem2le 1

Un milieu (10 cm3) comprenant 1% en poids d'aci-

de oléique, 0,25% en poids d'extrait de levures, 1% en poids de peptone, 0,2% en poids de KCl, 0,1% en poids de K2HP04, 0,05% en poids de MgSO4. 7H20 et 0,2% en poids

d'agent anti-mousse (Disfoam BC-51Y) dans un tube d'es-

sai est stérilisé. On y inocule Arthrobacter sp. B-

0720 et on conduit une culture à secousses à 30 C toute une nuit. On transfère cette culture d'ensemensement

dans le même milieu stérilisé (5 litres) dans un fermen-

teur cylindrique de 8 litres et on conduit la culture à 30 C pendant 20 heures, à 600 tpm, avec aération à litres par minute. m ru o -4 Microorganisme producteur pH-optimal stabilité au stabilité Km point

d'acyl-CoA pH à la cha- iso-électri-

leur que Arthrobacter sp. B-0720 8,0 - 8,5 6,0 - 7,5 <45 C 0,13 mM 4,70 Macrophomina phaseoli ATCC 14383 6,5 - 7,5 6,5 - 8,5 <40 C 0,087 mM 5,19 Clasdosporium resinae IFO 6367 6,5 - 7,5 6,5 - 8,0 <40 C 0,12 mM Aspergillus candidus M-4815 6,5 - 7,5 6,5 - 8,5 <40 C 0,11 mM Monascus sp. M-4800 6,5 - 8,0 6,5 - 8,0 <40 C 0,15 mM Saccharomyces cerevisiaB environ 8,0 6,0 - 10,0 <45 C 0,50 mM

Les cellules bactériennes recueillies par cen-

trifugation sont mises en suspension dans une solution (1 litre) constituée de tampon phosphate 10 mM (pH 7,0), de 2 mM EDTA et de lisozyme (095 mg/cm3) et agitées à 37 C pendant 60 Minutes. On ajoute de la désoxyribo-

nucléase (5 mg), on agite encore pendant 10 minutes.

Au liquide surnageant obtenu par centrifugation à 10.000 tpm pendant 20 minutes, on ajoute de l'acétone

(200 cm3) et on centrifuge. On ajoute encore de l'acé-

tone (1,8 litre) au liquide surnageant, puis le précipi-

té, recueilli par centrifugation, est dissous dans du tampon phosphate 10 mM (200 cm3, pH 7,0). La substance insoluble est éliminée par centrifugation et le liquide surnageant est fractionné par addition d'une solution

saturée de sulfate d'ammonium pour saturation à 30-75%.

Le précipité est dissous dans du tampon phosphate 10 mM (40 cm3, pH 790) et relargué à travers une colonne de gel d'acrylamide (nom commercial Biogel P-2, produit de Biorad Co.). La solution dépouillée de sel est passée à travers une colonne de gel de phosphate de calcium qui absorbe l'enzyme, cela étant suivi d'un lavage et

d'une élution par le gradient de tampon phosphate 0,05 -

0,5 M (pH 7,0). La fraction active (environ 0,45 M)

est recueillie et dialysée et concentrée par ultra-fil-

tration (nom commercial: membrane Diaflow PM-10, produit de Amicon Co.), puis lyophilisée pour donner une poudre dvacyl-CoA oxydase. (Activité spécifique: 5,5 U/mg,

activité totale: 850 U9 rendement: 8,5%).

Exemple 2

On stérilise dans un tube à essai un milieu (10 cm3) comprenant 1% en poids d'acide oléique, 0,25% en poids d'extrait de levures, 1% en poids de poudre de soja dégraissée (nom commercial Protoflower),9 0,2% en poids de KC19 0,1% en poids de K2HPO4, 0,5% en poids de CaCO3 et 0,2% en poids de 1isfoam BC-51Y. On y ino= cule Macrophomina phaseoli ATCC 14383 et on conduit une culture à secousses à 260C pendant 4 jours. On

transfère la culture d'ensemencement dans le même mi-

lieu (5 litres) dans un fermenteur cylindrique de 8 litres et on conduit la culture à 26 C pendant 45 heu-

res, à 700 tpm, avec aération à 5 litres par minute.

Des cellules fongiques sont obtenues par fil-

tration et sont mises en suspension dans du tampon phos-

phate 10 mM (pH 7,0, 1,5 litre). La suspension est homogénéisée pendant 15 minutes. Le liquide surnageant - obtenu par centrifugation est concentré sous vide à

1/10 de son volume pour séparation des matières insolu-

bles. On ajoute au liquide surnageant une solution saturée de sulfate d'ammonium jusqu'à une saturation

de 30 à 80$, pour fractionnement. On dissout le préci-

pité dans du tampon phosphate 10 mM (pH 7,0, 75 cm3)

et on fractionne encore au moyen d'une solution à 30-

% de sulfate d'ammonium. Le précipité ainsi obtenu est dissous dans du tampon phosphate (pH 7,0, 40 cm3)

et les matières insolubles sont élimintées par centri-

fugation. On charge la solution sur une colonne de Sephacryl S-300 (nom commercial: Pharmacia Fine Chem.

Co.) et on élue pour obtenir les fractions actives.

On concentre la fraction active au moyen d'une membrane d'ultrafiltration (membrane Diaflow XM-50, Amicon Co.) et on la lyophilise pour obtenir une poudre d'acyl-CoA oxydase (activité spécifique: 1,2 U/mg, activité totale:

U, rendement: 11,0%).

Exemples 3 à 5

Dans l'exemple 2, on remplace Macrophomina pha-

seoli ATCC 14383 par Aspergillus candidus M-4815, Clados-

porium resinae IFO 6367 et Monascus sp. M-4800 et on inocule ces souches respectivement dans le même milieu (100 cm3) que dans l'exemple 2 dans un erlenmeyer de 500 cm3 et on conduit une Culture à secousses à 26 C pendant 4 jours. Le mycélium séparé par filtration est mis en suspension dans du tampon phosphate 10 mM (pH 7,0, 1/5 volume de suspension) et on effectue une

sonication pendant 10 minutes. Les activités d'acyl-

CoA oxydase de la solution surnageant obtenue par cen- trifugation sont déterminées comme suit: Micro-organismes: Enzyme (U/cm3) Aspergillus candidus M-4815 0,047 Cladosporium resinae IFO 6367 0,035 Monascus sp. M4800 0,065 On les purifie par le même mode opératoire

que dans l'exemple 1.

Exemple 6

Une souche de Saccharomyces cerevisiae Y 0036

est inoculée dans un milieu (pH 4,2, 100 cm3) compre-

nant 1% en poids d'acide oléique, 0,25% en poids d'ex-

trait de levures, 0,5% en poids de peptone, 0,2% en poids de KCl, 0,1% en poids de KH2PO4 et 0,05% en poids de MgS04.7H20 dans erlenmeyer de 500 cm3 et on conduit une culture à secousses à 30 C pendant 3 jours. Les cellules de levure, recueillies par centrifugation, sont mises en suspension dans du tampon phosphate 10 mM (pH 7,0, 1/5 volume de la suspension) et on effectue

une sonication pendant 10 minutes. L'activité d'acyl-

CoA dans la solution surnageante obtenue par centrifu-

gation est de 0,75 U/cm3. Les modes opératoires de

purification sont les mêmes que dans l'exemple 1.

Les dessins illustrent: Fig. 1: le pH optimal Fig. 2: la stabilité au pH

Fig. 3: la stabilité à la chaleur.

Sur les figures:.-.: acyl-CoA oxydase obtenue à partir d'Arthrobacter sp. B-0720 0: acyl-CoA oxydase obtenue à partir de Macrophomina

phaseoli ATCC 14383.

Claims (11)

REVENDICATIONS

1. Un procédé pour la production d'acyl-CoA

oxydase, caractérisé en ce qu'on cultive un micro-orga-

nisme producteur d'acyl-CoA oxydase appartenant au genre Macrophomina, au genre Cladosporium, au genre Aspergillus, au genre Monascus, au genre Saccharomyces ou au genre

Arthrobacter dans un milieu nutritif et on isole l'acyl-

CoA oxydase ainsi formée.

2. Un procédé selon la revendication 1, caracté-

risé en ce que le micro-organisme appartenant au genre

Macrophomina est Macrophomina phaseoli ATCC 14383.

3. Un procédé selon la revendication 1, carac-

térisé en ce que le micro-organisme appartenant au gen-

re Cladosporium est Cladosporium resinae IFO 6367.

4. Un procédé selon la revendication 1, carac-

térisé en ce que le micro-organisme appartenant au genre

Aspergillus est Aspergillus candidus M-4815 FERM-P n 5226.

5. Un procédé selon la revendication 1, caracté-

risé en ce que le micro-organisme appartenant au gen'e

Monascus est Monascus sp. M-4800 FERM-P n 5225.

6. Un procédé selon la revendication 1, carac-

térisé en ce que le micro-organisme appartenant au genre

Saccharomyces est Saccharomyces cerevisiae Y 0036 FERM-

P n 5174.

7. Un procédé selon la revendication 1, caracté-

risé en ce que le micro-organisme appartenant au genre

Arthrobacter est Arthrobacter sp. B-0720 FERM-P n 5224..

8. La souche de micro-organisme producteur

d'acyl-CoA oxydase Aspergillus candidus M-4815 FERM-

p n 5226.

9. La souche de micro-organisme producteur

d'acyl-CoA oxydase Monascus sp. M-4800 FERM-P n 5225.

10. La souche de micro-organisme producteur

d'acyl-CoA oxydase Saccharomyces cerevisiae Y 0036 FERM-

P n 5174.

11. La souche de micro-organisme producteur

d'acyl-CoA oxydase Arthrobacter sp. B-0720 FERM-P U 5224.