DD143767A5 - Verfahren zur herstellung von d-aminosaeuren - Google Patents
Verfahren zur herstellung von d-aminosaeuren Download PDFInfo
- Publication number
- DD143767A5 DD143767A5 DD79213063A DD21306379A DD143767A5 DD 143767 A5 DD143767 A5 DD 143767A5 DD 79213063 A DD79213063 A DD 79213063A DD 21306379 A DD21306379 A DD 21306379A DD 143767 A5 DD143767 A5 DD 143767A5
- Authority
- DD
- German Democratic Republic
- Prior art keywords
- carbamoyl
- amino acid
- amino acids
- preparation
- hydrolysis
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von D-Aminosäuren aus racemischeri Geraischen von N»Carbamoyl-derivaten dieser Säuren oder aus den entsprechenden Hydantoinen» Erfindungsger werden die racemischen Verbindungen der enzymatischen und iiiiki'obiologischen Wirkung eines Enzymkorrtp lex es unterworfen, der erhalten worden ist von Mikroorganismen der Art Agrobacterium, insbesondere dem Stamm NRRL B 11 291.
Description
Anwendungsgebiet der Erfindung
Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von D-Aminosäuren, ausgehend von racemischen Gemischen der K-Carbamoylderivate oder von den entsprechenden Hydantoinen,
Einige D-Aminosäuren, besonders Phenylglycin und p-Hydroxyphenylglycin sind wichtige Zwischenprodukte zur Herstellung von Verbindungen, die verbreitet in der pharmazeutischen Industrie angewandt werden,
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen
Die chemischen Verfahren, die bisher zur Trennung der optischen Antipoden angewandt wurden und die auf der Verwendung von Camphe'jrsulfonsäure beruhen, sind sehr teuer und führen zu geringen Ausbeuten
Ein anderes Verfahren besteht in der Hydrolyse von D-Acyl~ aminosäuren mit dem Enzym D-Acylase.
Dieses enzymatischen Präparate enthalten jedoch immer L-Acylase als Verunreinigung, was dazu führt, daß das erhaltene Produkt nur eine geringe optische Reinheit besitzt.
Ein Verfahren zur enzymatischen Auftrennung von D,L~Ajaino~ säuren oder deren Derivaten ist in der IT-PS 987 278, der DE-OS 2 811 303 und der DE-OS 2 631 048 angegeben.
Dieses Verfahren besteht im wesentlichen darin, daß man die racemische Form von Verbindungen der Formel
-HH
X = Η,-ΟΗ,-ΟΟΗ-
der enzymatischen Hydrolyse durch Hydropyrimidin-Hydrolase (E»C,3.5*2*2) unterwirft j die aus Organen oder von Mikroorganismen extrahiert worden ist. Die Hydrolyse läuft entsprechend der folgenden Gleichung ab;
£ 1
COOH I? "θ-πττ_ΗΗ«00-ΗΗ,
Racemisierung
C~0
Anschließend vjird das K-Carbamoy!derivat durch Oxydation mit Nitrit zu der D-Aminosäure abgebaut (DE-OS 2 615 594)
Ziel der Erfindun
Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines einfachen und wirtschaftlichen Verfahrens, mit dem D-Aminosäure in optisch reiner Form hergestellt werden kann·
Darlegung des Wesens der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, geeignete Verbindungen zu hydrolysieren und die Hydrolyse durch enzymatisch^ Komplexe zu katalysieren.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man die D-Aminosäuren aus den entsprechenden Hydantoinen
-3- . U-52
herstellt mit Hilfe einer Hydrolyserea.ktion, die ausschließlich durch enzyma.tische Komplexe katalysiert wird, entsprechend dem. folgenden Schema: . · .. .
R - CH - NH - CO - NH
COOIi R - CH - NH
Λ*
wobei S ein aliphatischer oder aromatischer substituierter oder nichtsubstituierter Rest sein kann.
Bas erfindungsgemäße Verfahren ist ferner dadurch gekennzeichnet, daß die D-Aminosäuren erhalten werden können, ausgehend von eir.em racemischen Gemisch von Verbindungen der · folgenden allgemeinen Formel:
R-CM-NlI-CO-NH
i 2
COOH
in der R ein substituierter oder unsubstituierter alipha.tischer oder aromatischer Rest ist und das Enzym II (Carbamoyla.se) für die D-Form stereoselektiv ist.
Die· erfindungsgemäße enzymatische Hydrolyse findet na.oh dem unten angegebenen Schema statt und führt zur Bildung einer einzelnen stereoisomeren Form einer Aminosäure und eines Deriva.ti davon, ausgehend von einem racemischen Gemisch:
-4-
-4- | 1A-52 | H I | 291 | |
I . COOH . | ||||
C - NIICONH2: COOH · '· | Ca r b a mo y 1 a s e | D C-) | ||
DL | 2 · | |||
R-C- NHCONII COOH |
Die erfixidungsgemäß angewandten Enzyme haben,im Gegensatz zu denjenigen die D-Acylase enthalten keinerlei Aktivität gegenüber dem L-Ena/ntiomer. Dadurch können D-Atninosäuren erhalten werden, die optisch absolut rein sind.
. Die erfindungsgemäßen Enzymkomplexe werden gebildet durch Mikroorganismen der Artfe.groba.kt er ium, die aus Ackerboden isoliert worden sind und die Nummern 1302, 1303 und 1304 erhalten haben. .. "·"·
Sie besitzen die folgenden morphologischen und biochemischen Eigenschaften: .
Mikroskopische Morphologie: . · .
Diskrete Stäbchen, Emnchaial gepaart, gram-negativ, 0,8 χ 1,5 bis 2,0 um , keine Kapseln und Sporen,·beweglich mit 4 bis 6 peritrichia.len Geißeln.
Makroskopische Morphologie: '
Kolonien auf Agar Nährmedien (Difco): aufgerichtet, glatte Kanten, Gremfarben, transparent, 0,5'"bis. 1 ram Durchmesser} glatte Oberfläche, reichliches Wachstum auf Calcium-glycerophosphat~Mannitol-nitra.t~lgar, unter braun werden und Ringbildung«
- 5 - 1A-52 291
Biochemische Eigenschaften: . .
Wachstum zwischen 4 und 39 0 auf allen 'einfachen La.bor-
medien auch ohne Y/achsturaafaktoren und Aminosäuren unter Ausnutzung quellen
nutzung von NH.+ , ΝθΓ oder Aminosäuren als einzige Stickstof f-
Oxidase : postiv (N. Kovacs, 1956, Natur, London, 178,703)
Catala.se: postiv (M. Levine, D. Q. Anderson, 1932, J.Bact. 337-347)
Nitrit-Bildung aus Nitraten (CE. Zobell, 1932, J.Bact.24 273).
Twenn 80; nicht hydrolysiert (C. Sierra, 1957, Antonie van Leeuwenhoek, 23, 15-22).
Casein, Gelatine, Cellulose, Stärke, Agax : nicht hydrolyse (V.BcD. Skerma.nn, "A Guide to the Identification of the Genera of Bacteria ", 2. Aufl., The Williams & Wilkins Book Co9, Ba.ltiro.c 1967). ' .
3-Ketoglycoside werden gebildet (M, J. Bernaerts, J.De Ley, 1963, Nature 197, 406). . ·
Anilin-Bla.u-Mannitol-Agar :' Wachstun unter Absorption des Farbstoffs (A„A. Hendrickson, J.L. Baldwin, A.J„ Riker, · 1934, J. Bact. 28, 597-618). ·
Lackmus-Milch : grau-bra.un .
Verwertung von Kohlenhydraten: oxyda.tiv (R.Hugh, E.Leifson, 1953, J. Bacte 66, 24-26).
Die folgenden Verbindungen werden als einzige Kohlenstoff quelle ausgenutzt, wie von R..Y, Stanier abgegeben. (ReY» Sta.nier et Al., 1966, J.GeD.Microbiol 43, 159-271): D(+)Glucose, L( + )Ara.binose, D(+)Xylose, D( + )Threose, D( + )Threa.lose, D(-)Rinose L(+)RIiamnose, Lactose, Cellobiose, Maltose, Citrat, Acetat, .
_ 6 - 1A-52 291
Lactat, Propionat, L-Asparaginsäure, L-Asparagin, L-Histidin, L-Alawin, L-Arginin«
Vergleicht ma,n die Eigenschaften mit den Beschreibungen in Bergey's Manual of Determinative Ba.cteriology, YIII Aufl., so zeigt es sich, daß die erfindungsgemäßen . Mikroorganismen zur Gattung Rhizobiaceae Art" Agrobakterium gehören.
Der als Stamm 1302 bezeichnete Stamm ist am 6.April 1978, bei dem Northern Regional Research Center of Peoria, 111.,USA hinterlegt worden, wo er die Nummer HEEL B 11291 erhielt.
Die Mikroorganismen der Art Agrobakterium werden, erfindungs gemäß, unter a.eroben Bedingungen in einem Kulturmedium gezüchtet, das Quellen für Stickstoff, Kohlenstoff, Phosphor sowie Mineralsalze enthält, bei einer Temperatur zwischen 200C und 400C, vorzugsweise zwischen 25 und 35°C und zwa.r 10 bis 48 h, vorzugsweise 20 bis 30 h bei einem pH-Wert von 6, 0 bis 8,0, vorzugsweise von 7 bis 7,5. Glucose, Lactat,. Acetat, Maiswasser und Lactose können als Kohlenstoffq.uelle angewandt werden. . '
Fleischhydrolysate, Hydrolysate von Casein und Sojabohnen, Ammoniumsalze und Harnstoff, Hydantoine und N-Carba.moylderiva.te von Aminosäuren sind als Stickstoffquellen geeignet.
Ein geeignetes | Kulturmedium besitzt z.B. die folgende | g . · |
Zusammensetzung? · | g .. '. ^ ' - .· . | |
Pleischpepton | 5 | g . '. . ' ·. |
Pleischextrakt | 5 | 000 ml |
Glucose | 5 | η — 7 ? |
Destilliertes | Wasser 1 | |
pH | 7, | |
-7-
D(-)Aminosäuren werden direkt in dem Fermentationsmedium gebildet, das DL-Hydantoine oder DL-N-Carbanioylderivate von Aminosäuren enthält, und zwar beide als einzige Stickstoff quelle und zusammen mit üblichen Stickstoffquellen.
D(-)Aminosäuren können auch direkt hergestellt werden, indeia man die mikrobiologische Zellaufschlämmung (as resting cells) oder Auszüge davon verwendet.
Die Extraktion der erfindungsgemäßen Enzymkomplexe findet nach üblichen in der Enzymologie angewandten Verfahren statt»
Zu diesem Zweck werden die Zellen mit entsprechenden Vorrichtungen aufgebrochen (French Pressure Cell Press, Manton Gauling Homogenizer) Zellmühlen sowie mit Ultraschallvibratoren.
Die Hydrolyse der Hydantoine oder der N-Carbamoylderivate der Aminosäuren kann durchgeführt werden, durch Zugabe des Enzyms zu dem Reakt ions gemisch in den folgenden Formen ί Frische Zellen, gefriergetrocknete Zellen, toluolisierte Zellens acetonhaltiges Pulver oder roher oder gereinigter Auszug bzw. Extrakt.
Eine weitere technische und wirtschaftliche Verbesserung kann erreicht werden, indem man die Enzyme.immobilisiert durch Zusammenbringen mit makromolekularen Verbindungen, unter Bildung chemischer Bindungen mit der Matrix oder lonenbindungen oder physikalische Immobilisierung.
Ausführungsbe ispiel
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert,
Es wurde ein Kulturmedium der folgenden Zusammensetzung hergestellt;
' ' ΊΑ-52
Fleischpepton 5 g
Fleischextrakt . 3 g
Glucose 5g
Destilliertes Wasser 1 000 ml .
Der pH-Wert wurde mit Soda a.uf 7>2 eingestellt und das Kulturmedium in Mengen von jeweils 100 ml in .500 ml Kolben" gegeben. ' . '' .
Nach 30 raiii langem Sterillisieren bei 1100C wurden die Kolben mit einer Kultur des Stammes Wr. 1302 "beimpft,- der von Schrägen gewonnen v/orden wax, die das gleiche Mediumf zusammen1 mit 2 $ Agar (OIFGO) enthielten und 24 h bei -300C unter kreisförmigem Schütteln (orbital stirring) mit 220 UpM ineubiert worden waren« . ·
Aus dieser Vorkultur (optische Dichte, bei 550 nnu 0,250 Verdünnung (dil X) 1:10) wurde 1 ml in fünf 500-ml Kolben, enthaltend 100 ml des gleichen Mediums gegeben und die Kultur bei 300C unter kreisförmigem Schütteln (220 UpM)24 h incubiert (optische Dichte bei 550 nm - 0,250; Verdünnung 1 :1O)*
Die Zellen wurden abschließend gewonnen^it einer physiologischen Lösung gewa.schen und in 100 ml Pyrophospha.t-Puffer (0,1 m; pH -7$7) enthaltend 10 g DfL-5~Phenylhydantoin
ο bei 40 C unter StickstoffSchutzatmosphäre (UPP) aufgeschlämmt,
Nach 200 h langer Incubation unter den abgegebenen Bedingungen wa.r eine vollständige Hydrolyse zu Aminosäure (D-Phenylglycih) erreicht, wie sowohl aus der polarimetrischen Analyse des Reaktionsgemisches als auch durch Dünnschichtchroma.tographie (Suzuki in J. of Chromatography, 80 (1973? 199-204) gezeigt werde« konnte.
1A-52 291
Die Aminosäure'wurde., nach Ausfällen der Proteine mit Trichloressigsäure und Entfernung durch Abzentrifugieren isoliert durch Einstellen des pH-wertes a.uf den isoelektrisch* Punkt (5,8).' .
Der Niederschlag vrurde mit Wasser gewa.schen und im Va.kuum getrocknet. Die Identität der D(-)Phenylglycin-aminosäu wurde, durch das IR und NMR~Spektrum "bestätigt.
Die spezifische optische Drehung betrug /^oCj = - 154°
(c '- 1$ in HClLn) gegenüber einem V/ert von -157,8° wie er in der Literatur für die.reine Aminosäure angegeben ist.
Beispiel 2 ' .
Entsprechend Beispiel 1 gebildete Zellen aus 100 ml Kulturmedium wurden in 10 ml Pyrophosphatpuffer (0,1 m, pH 7,7 aufgeschlämmt und 10 min bei 5°C "beschallt. Das entstehende Produkt wurde zu 500 ml einer Lösung von D,L-N-Carbamoylphenyl· glycin 20 niM in Pyrophosphatpuffer (0,1m pH 7,7 ) gegeben und bei 65 C incubiert«
Der Reaktionsabla.uf wurde üborwa.cht durch Beobachtung des bei der Hydrolyse von N-Ca.rbamcyi freigesetzten Ammoniums nach dem Phenol-fiypochlorit.-Yerfahren.
. Nach 40 h langer Incubation wax eine Konzentration/M,+ —en/ _ '+
Ion/von 10 mMol pro .biter erreicht und es wurde im Laufe der Zeit keine weitere Zunahme beobachtet. .
Das .Rcaktionsgemisch wurde unter Vakuum bei 50 C auf 100 ml eingeengt. .
-10-
·«*» «10- Berlin,d.1O.1O«1979
55 539 12
Nach Einstellung des pH-Wertes auf 5,8 mit konzentrierter HGl wurde der entstandene Niederschlag abfiltriert.
Der so erhaltene niederschlag wurde in 1n KGl gelöst und erneut mit NaOH bei einem pH-Wert von 5»B ausgefällt.
Nach dem Trocknen wurde die spezifische optische Drehung bestimmt* Sie betrug -153 Identität der Aminosäure.
bestimmt* Sie betrug -153°. Das ΙΕ-Spektrum bestätigte die
Aus dem Eiltrat, das vorsichtig mit 3n HGl auf einen pH-Wert von 2,5 eingestellt worden war» wurde auf dem Eisbad ein Niederschlag erhalten, der wurde zur Trockne eingedampft und mit absiedendem Äthanol extrahiert. Beim Abkühlen der alkoholischen Lösung erhielt man einen kristallinen Niederschlag, der nach dem Trocknen der Dünnschichtchromatographie und IK-Spektroskopie unterworfen wurde«
Diese Analysen bestätigten, daß chemisch reines H-Garbamoylphenylglycin erhalten worden war.
Die spezifische optische Drehung betrug £"<£j^ - 134° (c κ 1 % in 1n NaOH) gegenüber einem Wert von + 137° s> wie er in der Literatur für das L-Enantiomer angegeben ist.
Aus einer entsprechend Beispiel 1 hergestellten Vorkultur wurden fünf 500-JDl-KoIben beimpft., die jeweils 100 ml eines Mediums enthielten^ das ausschließlich aus einer 5 %igen Lösung von Maiswasser bestand, di© mit NaOH auf einen pH-Wert von 7j8 gebracht und 30 min bei 121 0O sterilisiert worden ist«,
. Die Kultur wurde 24 h bei 300C unter kreisförmigen Schütteln (220 ΌρΨί) incubiert. Die Zellen wurden abzentrifugiert, mit Pyrophosphat-Puffer (0,1 m pH 7,7) gewaschen und in 100 ml des gleichen Puffers enthaltend 10 g 5-p-Hydroxy-D,L-phenylhy- dantoin aufgeschlämmt und bei 400C unter einer (UPP) Stickstoffschutzatmosphäre incubiert. Nach 160 h-langer Incubation unter diesen Bedingungen war vollständige Hydrolyse zu der Aminosäure (D(-)-p~Hydroxyphenyl-glycin) eingetreten, was sowohl durch polariaetische Untersuchung des Reaktionsgemisches als auch durch Dünnschichtchromatografie nach Suzuki (J. of Chromatography, 80, 1973, 199 bis 204),bestätigt wurde.
Die Amimosäure wurde aus dem Reaktionsgemisch nach Ausfällen der Proteine mit Trichloressigsäure und Entfernung durch Zentrifugieren isoliert, indem man den pH-Wert auf dem isoelektrischen Punkt (5,2) brachte. Der Niederschlag wurde mit Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die Identität der Aminosäure wurde durch das IR-und NMR-Spektrum bestätigt. Die spezifische optische Drehung betrug &3τ?~ -156,5° (c = 1 %.in 1n HCl) gegenüber einem Wert von -161,2 ,wie/in der Literatur für die reine Aminosäure angegeben ist.
Es wurden Zellen des Stammes Agrobacterium sp, aus 100 ml Kulturmedium auf Basis von Maiswasser, wie sie entsprechend Beispiel 1 hergestellt worden waren, angewandt.
-12-
Die gewaschenen Zellen wurden in 10 ml Pyrophosphat-Puffer (0,1 m pH 7,7) aufgeschlämmt und 15 min unter Rühren bei Raumtemperatur mit Toluol behandelt. . . . ·.; '
Die mit Toluol behandelte Aufschlämmung wurde zu 500 ml einer Lösung von 20 mMol N-Carbamoyl-D,L-p~hydroxyphenylglycin in Pyrophosphat-Puffer (0,1 m pH 7,7) gegeben und bei 650C unter einer UPP 1 StickstoffSchutzatmosphäre incubiert. . -
Der Re.aktionsverlauf wurde überwacht durch Beobaichtung des bei der Hydrolyse des N-Carbamoylderivatß freigesetzten Amoniums nach dein Phenol-Hypo-
i chlorit verfahren wie im Beispiel 1 angegeben* · . ·!' .' . ·
Nach 18 stündiger Incubation hatten die Nat-Io~ nen eine Konzentration von 10 mMol pro Liter erreicht und im Laufe der.Zeit wurde keine weitere Zunahme beobachtet.
in diesem Stadium wurde das Reaktionsgemisch im ei 500C/ Vakuum/auf ein.. Gesamtvolumen von 100 ml eingeengt. Nach Einstellung des pH-Wertes auf 5»2 mit konzentrierter HCl wurde ein Niederschlag erhalten, der abfiltriert wurde* . .
Entsprechend dem in Beispiel 2 angegebenen Verfahren wurden die D-Aminosäure und das L,N-Car~ bamoyl isoliert und identifiziert. Die spezifische Drehung betrug.; -157* 2° bzw* +171 ° gegenüber V/erten von -161,2 bzw« +175,40C, wie sie in der Literatur für die reinen Produkte angegeben sind.
-13-
Beispiel 5 ' ' '.. . · '...
Zellen von Agrobacterium sp. wurden entsprechend Beispiel 1 hergestellt. Einige g einer feuchten Zellaufs chiämmung wurden·in Pyröphosphat-Puffer (0,1 m" pH 7*7) aufgeschlämmt und in der Kälte mit Aceton behandelt.
Nach Entfernen des Acetpns durch Filtration wurde das so erhaltene acetonhaltige Produkt im Vakuum bei 35°C auf Gewichtskonstanz getrocknet. Das getrocknete Produkt wurde in einer Reibschale homogenisiert und das so erhaltene Pulver zur Untersuchung der Enzyrnaktivität angewandt.
Das acetonische Pulver wurde mit folgenden Substraten untersucht: N-Carbamoyl-D-(-)-alanin,..N-Carbamoyl-I3[-)-valin, N-Carbampyl-D-(-)-glutamin^, N-Carbamoyl-D(-)-p.-hydroxyphenylglycin, N-Carbamoyl-r(- )- -p.-methoxyphenylglycin, N-Carbamoyl-D-(-)-phenylglycin, N-Carbamoyl-L(+)-phenylglycin, N-Carbamoyl-
*~ saure/ D(-)~phenylalanin, N-Carbamoyl-LC+J-glutaminrund.N- ' Carbamoyl-D(-)-(2-thienyl)-glycin.
Eine Lösung von 20 mMol. jedes Carbamoylderj.vats in 0,1 m Pyrophosphat-Puffer (pH 7,7) wurde herge-
2U/
stellt und/jeweils 10 ml dieser Lösung wurde eine entsprechende Menge des acetonischen Pulvers, die für jedes Substrats gleich war, zugegeben.
Die Incubation wurde unter UPP~Stickstoffschutzatmosphäre unter Rühren bei einer Temperatur von 4O0C durchgeführt. Nach 1 stündiger Incubation wurde die Menge der entstandenen Aminosäure gemessen,indem man
-14-
die Konzentration an NH^-Ionen in dem Reaktionsgemisch nach dem Beispiel 2 angegebenen Phenol-Hypochlorit-Verfahr en bestimmte. ·
Es zeigte sich, daß die höchste Aktivität des carbamoylytischen Enzyms gegenüber N-Carbamoyl-D-(-)~p.-hydroxypheiiylglycin erzielt wurde.
Die Ergebnisse dieser Versuche sind in der folgenden Tabelle angegeben, γ/obei die hydrolytische Aktivität gegenüber M-Carbamoyl-D(-)~p.-hydroxyphenylglycin gleich 100 gesetzt wurde.
T a b e 1 1 e 1
Substrat Aktivität
N-Carbamoyl-D-(-)-alanin 57,5
N-Carbamoyl-D(-)-iralin . 34,25
N-Carbamoyl-D(-)glutaminsäure 21,7
N-Carbamoyl-L(+)glutaminsäure 0
N-Carba33aöyl-D(-)-p,.-hydroxyphenylglycin 100,0
N-Carbamoyl-D(-)-pJI-'methoxyphenylglycin 40,0
N~Carbamoyl-D(-)-plienylglyein .81,25
N-Carbamoyl-L(+)-piienylglycin 0
N-Carbamoyl-D(-)-(2-thienyl)glycin 40,7
N-Carbamoyl-D(-)-plaenylalanin 50,0
Beispiel 6 . .
• Ein Kulturmedium der folgenden Zusammensetziing wurde hergestellt:
MgSO4.7H2O - . . 0,2 g
Na2HPO4-^H2O '. 6 g
KH2PO4 ' 3g
1 3 063 - 15 - Berlin,d,10.10.1979
55 539 12
IiE4Cl 2 g
NaCl . 0,5 S
Glycerin 5 δ
5~Phenyl-D,L-hydantoin 2 g
Hefe-Extrakt 0,1 g
destilliertes Wasser 1000 ml
Jeweils 100 ml des Mediums wurden in 500-ml-Kolben gegeben und 30 min bei 116 0C sterilis: durch Eiltration sterilisiert.
und 30 min bei 116 0C sterilisiert· Das Hydantoin wurde
Aus einer entsprechend Beispiel 1 erhaltenen Vorkultur wur« den 5 ml pro Kolben zugegeben und die neue Kultur bei 30 0C unter kreisförmigem Schütteln mit 220 UpM 36 h incubiert. Anschließend wurden die Zellen abzentrifugiert und die Aminosäure aus der überstehenden Flüssigkeit nach Einengen und Einstellung des pH-Wertes auf den isoelektrischen Punkt gewonnen. Aus 10 1 des so behandelten Kulturmediums erhielt man"11,2 g D(~)-Phenylglycin mit der spezifischen optischen Drehung von f^J/ψ s -156° (c = 1 % in 1n HCl) gegenüber einem Wert von -15718°, wie er in der Literatur für die reine Aminosäure angegeben ist.
Ein Kulturmedium der folgenden Zusammensetzung wurde hergestellt:
MgSO4 . | 7H2O | 0 | ,2 | g |
Ha2HPO4 | . 12H2O | 6 | g | |
EH2PO4 | 3 | S | ||
5-Methyl | -hydantoin | 2 | S | |
MaCl | 0 | ,5 | S | |
Glucose | 1 | S |
13 063 — 16- Berlin,d.10.10.1979
539 12
Hefe-Extrakt 0,1 g ·
destilliertes Wasser 1000 ml pH 7,1
Jeweils 100 ml des Kulturmediums wurden in 500ml-Kolben gegeben und 20 min bei 116 0C sterilisiert· Methylhydantoin wurde getrennt sterilisiert·
Von einer entsprechend Beispiel 1 hergestellten Vorkultur wurden $ wl in jeden Kolben gegeben und die neue Kultur unter kreisförmigem Schütteln (220 UpM) 24 h bei 30 0C incubiert.
Die aus 1000 ml Kulturmedium durch Zentrifugieren erhaltene ZeIlaufschlämmung wurde in Phosphat-Puffer (pH 7,5) gewaschen und erneut in 100 ml des gleichen Puffers, enthaltend 4 g DL-5~-(2-thienyl)-hydantoin, auf geschlämmt·
Dieses Eeaktionsgemisch wurde unter einer TJPP-Stickstoffschutaatmosphäre bei 40 0G incubiert· Nach 30 h war die Hydrolyse zn der Aminosäure (D(-)-(2-thienyl)glycin) vollständig. Die Aminosäure wurde isoliert durch Einengen des Re akt ions gemisches auf ein Volumen von 20 ml und Einstel- . lung des pH-Wertes auf 5,6, Der so erhaltene Niederschlag wurde im Vakuum getrocknete Die Identität der Aminosäure wurde durch IR- und HMR-Spektram bestätigt*
Die spezifische optische Drehung betrug £~<£j^ = -72,6° (c ss 1 % in H2O) gegenüber einem Wert von -73*7°, wie er in der Literatur für die reine Aminosäure angegeben ist·
Claims (2)
1. Verfahren zur Herstellung von D-Aminosäure, ausgehend von racemischen Gemischen der H-Garbamoylderivate oder den entsprechenden Hydantoinen, gekennzeichnet dadurch, daß man die Reaktion in Gegenwart von Enzymkomplexen durchführt, die erhalten worden sind von Mikroorganismen der Art Agrobacterium.
2* Verfahren zur Herstellung von D-aminosäure nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man als Mikroorganismus der Art Agrobacterium denjenigen mit der Nummer KBRL B 11 verwendet.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
IT23679/78A IT1109506B (it) | 1978-05-23 | 1978-05-23 | Processo enzimatico-microbiologico per la produzione di amminoacidi otticamente attivi a partire da idantoine e/o carbamil-derivati racemi |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DD143767A5 true DD143767A5 (de) | 1980-09-10 |
Family
ID=11209095
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DD79213063A DD143767A5 (de) | 1978-05-23 | 1979-05-22 | Verfahren zur herstellung von d-aminosaeuren |
Country Status (25)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4312948A (de) |
JP (1) | JPS5511569A (de) |
AR (1) | AR225284A1 (de) |
AT (1) | AT367023B (de) |
AU (1) | AU530574B2 (de) |
BE (1) | BE876408A (de) |
CA (1) | CA1122552A (de) |
CH (1) | CH639695A5 (de) |
CS (1) | CS211400B2 (de) |
DD (1) | DD143767A5 (de) |
DE (1) | DE2920963C2 (de) |
DK (1) | DK153953C (de) |
ES (1) | ES481269A1 (de) |
FI (1) | FI66021C (de) |
FR (2) | FR2431536A1 (de) |
GB (1) | GB2022581B (de) |
HU (1) | HU181494B (de) |
IE (1) | IE49297B1 (de) |
IL (1) | IL57276A (de) |
IT (1) | IT1109506B (de) |
LU (1) | LU81297A1 (de) |
NL (1) | NL192118C (de) |
NO (1) | NO151899C (de) |
SE (1) | SE436755B (de) |
ZA (1) | ZA792366B (de) |
Families Citing this family (22)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IL70022A0 (en) * | 1982-11-08 | 1984-01-31 | Standard Oil Co | Method for introducing foreign genes into green algae cells utilizing t-dna of agrobacterium |
IT1209495B (it) * | 1984-02-02 | 1989-08-30 | A San Donato Milanese Milano | Procedimento per la preparazione di l-alfa-amminoacidi. |
DK164923C (da) * | 1984-04-11 | 1993-01-25 | Denki Kagaku Kogyo Kk | Fremgangsmaade til fremstilling af l-alfa-aminosyrer |
JPS6172762A (ja) * | 1984-09-17 | 1986-04-14 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | 光学活性ヒダントイン類の製造法 |
JPS63133631U (de) * | 1987-02-23 | 1988-09-01 | ||
FR2620731B1 (fr) * | 1987-09-21 | 1990-03-23 | Hoechst France | Nouveau systeme enzymatique, son procede de preparation et son application notamment dans la preparation de la d-parahydroxyphenylglycine |
DE3918057C1 (de) * | 1989-06-02 | 1990-05-03 | Degussa Ag, 6000 Frankfurt, De | |
SG84486A1 (en) * | 1990-12-07 | 2001-11-20 | Kanegafuchi Chemical Ind | Process for production of d--g(a)-amino acids |
US5824522A (en) * | 1990-12-07 | 1998-10-20 | Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha | Recombinant decarbamylases for producing D-α-amino acids |
ES2121001T3 (es) * | 1990-12-07 | 1998-11-16 | Kanegafuchi Chemical Ind | Procedimiento de produccion de d-alfa aminoacidos. |
WO1992022643A1 (en) * | 1991-06-12 | 1992-12-23 | Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha | IMMOBILIZED ENZYME PREPARATION AND PRODUCTION OF D-α-AMINO ACID |
ES2042409B1 (es) * | 1992-04-10 | 1994-06-01 | Control & Gestion Instr | Procedimiento para la preparacion de d-aminoacidos o derivados de d-aminoacidos. |
EP0650525B1 (de) * | 1992-06-30 | 2004-05-19 | SmithKline Beecham plc | D-n-carbamoylaminosaureamidohydrolase und hydantoinase |
KR100293585B1 (ko) * | 1992-10-05 | 2001-09-17 | 후루타 다케시 | D-알파-아미노산의제조방법 |
US5330008A (en) * | 1992-12-02 | 1994-07-19 | Trustees Of The University Of Pennsylvania | Protective covering for a horse's hoof and method of attaching |
IT1274167B (it) * | 1994-04-15 | 1997-07-15 | Eniricerche Spa | Procedimento per la produzione di d- -amminoacidi |
US5962279A (en) * | 1994-06-24 | 1999-10-05 | Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha | Process for producing D-amino acids with composite immobilized enzyme preparation |
US5707836A (en) * | 1995-03-10 | 1998-01-13 | Nitto Chemical Industry Co., Ltd. | Production of alkylene or phenylenediamine disuccinic acid from fumaric acid and a diamine using lyase from microbes |
IT1276163B1 (it) | 1995-11-23 | 1997-10-27 | Eniricerche Spa | Procedimento migliorato per la preparazione di d-alfa-amminoacidi |
IT1277125B1 (it) * | 1995-12-21 | 1997-11-04 | Eniricerche Spa | Mutanti termostabili della d-n-alfa-carbamilasi |
JP5096911B2 (ja) | 2005-01-31 | 2012-12-12 | 株式会社カネカ | 5−置換ヒダントインラセマーゼ、これをコードするdna、組換えdna、形質転換された細胞、および、光学活性n−カルバミルアミノ酸または光学活性アミノ酸の製造方法 |
WO2007040272A1 (ja) * | 2005-10-06 | 2007-04-12 | Kaneka Corporation | D-(4-アミノメチル)フェニルアラニン誘導体の製造法 |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4065353A (en) * | 1975-05-12 | 1977-12-27 | Snamprogetti, S.P.A. | Method for the preparation of D-carbamyl aminoacids and the corresponding D-aminoacids |
IT1039757B (it) * | 1975-07-10 | 1979-12-10 | Snam Progetti | Complessi enzimatici atti a trasformare idantoine raceme in am minoacidi otticamente attivi e loro applicazione |
JPS52125692A (en) * | 1976-02-04 | 1977-10-21 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | Preparation of l-methionine |
US4094741A (en) * | 1976-02-04 | 1978-06-13 | Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha | Process for preparing D-(-)-N-carbamoyl-2-(phenyl or substituted phenyl)glycines |
JPS5391189A (en) * | 1976-12-30 | 1978-08-10 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | Preparation of d-n-carbamoyl-alpha-amino acids |
US4211840A (en) * | 1977-06-08 | 1980-07-08 | Ajinomoto Company, Incorporated | Method for producing D-α-amino acid |
CH628009A5 (de) * | 1977-07-26 | 1982-02-15 | Hoffmann La Roche | Verfahren zur herstellung von optisch aktiven alpha-hydroxycarbonsaeuren. |
-
1978
- 1978-05-23 IT IT23679/78A patent/IT1109506B/it active
-
1979
- 1979-05-11 US US06/038,232 patent/US4312948A/en not_active Expired - Lifetime
- 1979-05-14 CA CA327,511A patent/CA1122552A/en not_active Expired
- 1979-05-14 DK DK198379A patent/DK153953C/da not_active IP Right Cessation
- 1979-05-14 IL IL57276A patent/IL57276A/xx unknown
- 1979-05-16 AU AU47118/79A patent/AU530574B2/en not_active Ceased
- 1979-05-16 ZA ZA792366A patent/ZA792366B/xx unknown
- 1979-05-17 GB GB7917304A patent/GB2022581B/en not_active Expired
- 1979-05-21 NO NO791662A patent/NO151899C/no unknown
- 1979-05-21 LU LU81297A patent/LU81297A1/xx unknown
- 1979-05-21 BE BE0/195282A patent/BE876408A/xx not_active IP Right Cessation
- 1979-05-22 FR FR7913046A patent/FR2431536A1/fr active Granted
- 1979-05-22 AT AT0375879A patent/AT367023B/de not_active IP Right Cessation
- 1979-05-22 FI FI791624A patent/FI66021C/fi not_active IP Right Cessation
- 1979-05-22 DD DD79213063A patent/DD143767A5/de unknown
- 1979-05-22 AR AR276637A patent/AR225284A1/es active
- 1979-05-22 ES ES481269A patent/ES481269A1/es not_active Expired
- 1979-05-22 HU HU79SA3183A patent/HU181494B/hu unknown
- 1979-05-23 DE DE2920963A patent/DE2920963C2/de not_active Expired
- 1979-05-23 CS CS793538A patent/CS211400B2/cs unknown
- 1979-05-23 JP JP6276679A patent/JPS5511569A/ja active Granted
- 1979-05-23 SE SE7904548A patent/SE436755B/sv unknown
- 1979-05-23 NL NL7904097A patent/NL192118C/nl not_active IP Right Cessation
- 1979-05-23 CH CH485579A patent/CH639695A5/it not_active IP Right Cessation
- 1979-08-08 IE IE984/79A patent/IE49297B1/en not_active IP Right Cessation
- 1979-10-10 FR FR7925259A patent/FR2438087A1/fr active Granted
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DD143767A5 (de) | Verfahren zur herstellung von d-aminosaeuren | |
CH638241A5 (de) | Enzympraeparat mit l-alpha-aminoacylamidase-aktivitaet. | |
DE3048612C2 (de) | "Verfahren zur enzymatischen Trennung von L-2-Ami no-4-methylphosphinobuttersäure" | |
DE2631048C3 (de) | Verfahren zur Herstellung von D-Phenylglycin | |
DE3587839T2 (de) | Verfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin. | |
DE2939269C2 (de) | Verfahren zur optischen Trennung von DL-2-Amino-4-hydroxy(methyl)phosphinoylbuttersäure | |
DE3307607C2 (de) | ||
DE1767653C3 (de) | Verfahren zur Erzeugung von Isoamylase | |
DE2757980C2 (de) | ||
DE2167078B1 (de) | Verfahren zur Herstellung einer Amylase und deren Verwendung zur Gewinnung von Maltose aus Staerke | |
DE2811303C3 (de) | Enzymatische Komplexe, die zur Umwandlung racemischer Hydantoine in optisch aktive Aminosäuren geeignet sind, sowie deren Anwendung | |
CH644896A5 (de) | Polysaccharid, verfahren zur herstellung desselben und dasselbe enthaltendes, den cholesterinspiegel senkendes mittel. | |
DE3247703A1 (de) | Verfahren zur herstellung von l-threonin | |
DE3039132C2 (de) | Verfahren zur stereospezifischen Herstellung von Carbamylderivanten von &alpha;-Hydroxysäuren | |
DE2318650C2 (de) | Fermentative Herstellung von Deacetylcephalosporin C | |
DE2600682A1 (de) | Verfahren zur herstellung von l(+)-weinsaeure | |
DE2126181C3 (de) | Biotechnisches Verfahren zur Herstellung von L-Arginase | |
DE3025424A1 (de) | Verfahren zur herstellung von galactoseoxidase | |
DE3018584A1 (de) | Verfahren zur herstellung von d- alpha -aminosaeuren | |
DE2209591A1 (de) | Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-5-Hydroxytryptophan | |
DE2241091A1 (de) | Verfahren zur herstellung von cephalexin | |
JPS5840094A (ja) | 微生物によるテアニン関連物質の製造法 | |
DE1960524A1 (de) | Fermentatives Verfahren zur Herstellung von L-Dihydroxyphenylalanin | |
DE2050983C3 (de) | Verfahren zur Herstellung von alpha-Amino benzylpenicillin | |
DE3712539A1 (de) | Verfahren zur mikrobiellen herstellung von l-alpha-aminosaeuren |