NO151899B

NO151899B - Fremgangsmaate for fremstilling av d-amino-syrer ved mikrobiologisk hydrolyse av racemiske blandinger av n-karbamoylderivatene eller de tilsvarende hydantoiner

Info

Publication number: NO151899B
Application number: NO791662A
Authority: NO
Inventors: Roberto Olivieri; Aurelio Viglia; Ludwig Degen; Leonello Angelini; Eugenio Fascetti
Original assignee: Anic Spa
Priority date: 1978-05-23
Filing date: 1979-05-21
Publication date: 1985-03-18
Also published as: FR2431536B1; NO791662L; LU81297A1; ATA375879A; IL57276A; AU4711879A; NL192118C; IT1109506B; US4312948A; FR2438087A1; FI66021B; NL192118B; SE7904548L; DD143767A5; ZA792366B; AR225284A1; NL7904097A; SE436755B; BE876408A; JPS5511569A

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av D-aminosyrer ved hydrolyse av racemiske bland-

inger av N-karbamoylderivatene eller de tilsvarende hydanto-

iner, og det særegne ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er at hydrolysen gjennomføres ved hjelp av friske celler, frysetørkede celler, tolueniserte celler, acetonholdig pulver, rått eller renset uttrekk henholdsvis ekstrakt av Agrobacterium NRRL B-11291 .

Disse trekk ved oppfinnelsen fremgår av patentkravet.

Et fåtall D-aminosyrer, spesielt fenylglycin og p-hydroksy-fenylglycin er viktige utgangsforbindelser for fremstilling av forbindelser som finner bred anvendelse innenfor den farma-søytiske industri.

De kjemiske metoder som hittil har vært anvendt for separering

av de optiske antipoder, og som er basert på bruk av kamfer-sulfonsyre er meget dyre og gir lave utbytter.

En annen metode består i å hydrolysere D-acylaminosyre med D-acylase-enzym.

Dise preparater har imidlertid alltid L-acylase som en urenhet

og dette fører til oppnåelse av et produkt med lav optisk renhet.

En fremgangsmåte for enzymatisk separering av D,L-aminosyrer eller deres derivater er foreslått i italiensk patentskrift 987.278, videre norsk patentansøkning 780882 samt norsk patentansøking 762324.

De tidligere forslag består i at den racemiske form av forbindelser med den følgende generelle formel

utsettes for en enzymatisk hydrolyse ved hjelp av hydro-pyrimidin-hydrolase ekstrahert fra organer eller fra mikroorganismer, og

hydrolysen foregår etter det følgende skjema:

Deretter spaltes N-karbamoylderivåtet til D-aminosyre ved oksydasjon med et nitrit i henhold til den metode som er om-handlet i norsk patentansøkning 761189.

Ved fremgangsmåten i henhold til den foreliggende oppfinnelse fremstilles D-aminosyrene fra de tilsvarende hydantoiner ved utnyttelse av hydrolytiske reaksjoner som katalyseres utelukkende av enzym-komplekser, i samsvar med følgende reaksjons-mønster : hvori R kan være et alifatisk eller et aromatisk radikal, enten substituert eller usubstituert, eller også kan D-aminosyrer oppnås ved å gå ut fra racemiske forbindelser med den følgende generelle .formel:

hvori R er valgt fra gruppen bestående av substituerte og usubstituerte alifatiske og aromatiske radikaler, idet enzymet II (karbamoylase) er stereoselektivt mot D-formene.

Den enzymatiske hydrolyse i henhold til den foreliggende oppfinnelse foregår i samsvar med det reaksjonsmønster som er gjengitt i det følgende og resulterer i fremstilling av en enkel stereoisomer form av en aminosyre og av et derivat derav ved å gå ut fra en racemisk forbindelse:

De enzympreparater som beskrives i forbindelse med utøvelse av den foreliggende oppfinnelse er i motsetning til dem som inneholder D-acylase, fullstendig uten noen virkning på L-enantiomerforbindelsen. Dette forhold tillater at D-aminosyrer med absolutt optisk renhet kan oppnås.

Enzymkompleksene fremstilles av mikroorganismer av slekten Agrobacterium isolert fra landbruksområder og betegnet med nummer 1302, 1303 og 1304 hvorav. 1302 er deponert ved NRRL.

Stammen 1302 anvendes ved den foreliggende oppfinnelse. De nevnte stammer har de følgende morfologiske og biokjemiske egenskaper:

Mikroskopisk morfologi:

Separate staver, enkelte ganger i par, gram-negative, 0,8 x 1,5 til 2,0 mikron, kapsler og sporer mangler; mobile med 4 til 6 peritrichiale flageller.

Makroskopisk morfologi:

Kolonier på agar-dyrkingsmedium (Difco): opphøyet, uavbrutt kant, fløtefarget, transparente, 0.5 til 1 mm diameter, med glatt overflate» Rikelig vekst på kalsium-glycerofosfat-manitol nitrat-agar, med brunfarging og halo-dannelse.

Biokjemiske egenskaper;

Vekst mellom 4°C\og 39°C på alle enkle laboratorie-media, også uten vekstfaktorer og aminosyrer, under anvendelse av NH^ NO~ eller aminosyrer som eneste nitrogenkilder.

Oksydase: positiv (N.Kovacs, 1956, Nature, London, 178, 703).

Katalase: positiv (M. Levine, D.Q. Anderson, 1932, J. Bact.

23, 337-347).

Nitriter fremstilles fra nitrater (CE. Zobell, 1932,

J. Bact. 24, 273).

"Tween 80" hydrolyseres ikke (C. Sierra, 1957, Antonie van Leeuwenhoek, 23, 15-22).

Kasein, gelatin, cellulose, stivelse, agar: ikke hydrolysert.

(V.B.D. Skermann, A Guide to the Identification of the Genera of Bacteria, annen utgave, The Williams & Wilkins Book Co., Baltimore, 1967).

3-ketoglykosider fremstilles (M.J. Bernaerts, J. De Ley, 1963, Nature 197, 406).

Anilin-blått-manitol-agar: vekst med absorbsjon av fargestoffet (A.A. Hendrickson, J.L. Baldwin, A.J. Riker, 1934, J. Bact. 28, 597-618).

Lak~mus-melk: gråbrun.

Utnyttelse av karbohydrater: oksydativ (R. Hugh, E. Leifson, 1953, J. Bact. 66, 24-26).

De følgende forbindelser anvendes som eneste karbonkilder i mediet for det formål som er beskrevet av R. Y. Stanier,

(R.Y. Stanier et Al., 1966, J. Gen. Mikrobiol 43, 159-271: D(+)glukose, L(+)arabinose, D(+)xylose, D(+)threose, D(+)threalose, D(-) rinose, L(+)rhamnose, laktose, cellobiose, maltose, citrat, acetat, laktat, propionat, L-asparagin, L-asparaginsyre, L-histidin, L-alanin, L-arginin.

Ved å sammenligne disse egenskaper med beskrivelsene i

Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, utgave VIII, hører mikroorganismene som anvendes ved den foreliggende oppfinnelse til familien Rhizobiaceae, slekten Agrobacterium.

Stammen betegnet med nr. 1302 er den 6. april 1978 deponert

i Northern Regional Research Center of Peoria, 111., USA

hvor den er blitt tildelt symbolet NRRL B 11291.

Ved den foreliggende oppfinnelse dyrkes mikroorganismene

av slekten Agrobacterium under aerobe betingelser i et dyrkingsmedium som inneholder kilder for nitrogen, karbon, fosfor og mineral sal ter ved en temperatur mellom 20°C og 40°C, foretrukket mellom 25°C og 35°C i en periode på fra 10 timer til 48 timer, foretrukket mellom 20 timer og 30 timer, ved en pH på 6.0

til 8.0, foretrukket 7 til 7.5. Glukose, laktat, acetat, kornstøovæske og laktose kan anvendes som karbonkilder.

Kjøtthydrolysater, hydrolysater av kasein og soyabønner, ammoniumsalter og urea, hydantoiner og N-karbamoylderivater av aminosyrer er nitrogenkilder.

Et passende dyrkningsmedium har f.eks. følgende sammensetning:

D(-)aminosyrer fremstilles direkte i dyrkingsmediet som inneholder DL-hydantoiner eller DL-N-karbamoylderivater av aminosyrer, både som enkle kilder for nitrogen og integrert med de vanlige nitrogenkilder.

D(-)aminosyrer kan også fremstilles ved å anvende mikrobe-dispersjonen direkte som hvilende celler eller å anvende ekstrakter derav.

Ekstraheringen av enzymkompleksene som anvendes ved den foreliggende oppfinnelse fra bakteriedispersjonen foregår ved hjelp av de vanlige metoder som anvendes innen enzymologien.

For dette formål desintegreres cellene med passende apparatur, f.eks. French trykkcellepresse, Manton-Gauling homogenisator, roterende desintegratorer og også ved hjelp av ultrasoniske vibratorer.

Hydrolysen av hydantoinene eller av N-karbamoylderivatene av aminosyrene kan gjennomføres ved at man til reaksjonsblandingen tilsetter enzymet i de følgende former: friske celler, frysetørkede celler, tolueniserte celler, aceton-pulver eller rå eller rensede ekstrakter.

En ytterligere teknisk og økonomisk forbedring kan oppnås ved at man fikserer enzymene ved kombinasjon med makromolekylære forbindelser ved dannelse av kjemiske bindinger med grunnmassen eller bindinger av ionisk karakter eller ved hjelp av fysisk fiksering.

De følgende eksempler illustrerer foretrukne utførelsesformer av oppfinnelsen.

EKSEMPEL 1

Er. dyrkings væske ble fremstilt med følgende sammensetning:

pH ble innstilt til 7.2 med soda og dyrkingsmediet ble fordelt i 100 ml porsjoner i 500 ml kolber.

Etter sterilisering i 30 minutter ved 110°C ble kolbene inokulert med en kultur av stammen nr. 1302 fra skråkulturer inneholdende det samme medium med 2% agar (DIFCO) og inkubert i 24 timer ved 30°C med orbital-omrøring (220 omdreininger pr. minutt).

Fra denne for-kultur (D.O. ved 550 nm: 0.250 dil X 1:10) ble det inokulert 1 ml i fem 500 ml kolber inneholdende 100 ml av det samme medium og kulturen ble inkubert ved 30°C med orbital-omrøring (220 omdreininger pr. minutt) i 24 timer (D.O. ved 550 nm - 0.250} dil. 1:10).

Cellene ble deretter samlet, vasket i en fysiologisk løsning

og til slutt oppslemmet i 100 ml pyrofosfatbuffer (0.1 m;

pH 7.7) inneholdende 10 g D,L-5-fenylhydantoin ved temperatur 40°C under en UPP nitrogenatmosfære.

Etter 200 timers inkubering under disse betingelser ble det oppnådd fullstendig hydrolyse til aminosyre (D-fenylglycin) påvist både ved polarimetrisk analyse av reaksjonsblandingen og ved tynnsjiktkromatografering i henhold til metoden til Suzuki i J. of Chromatography, 80 (1973), 199-204.

Aminosyren ble isolert fra reaksjonsblandingen ved utfelling av proteinene med trikloreddiksyre og isolering med -sentrifugering,

idet pH ble bragt til det isoelektriske punkt (5.8).

Bunnfallet ble vasket med vann og borket i vakuum.

Identiteten av D(-)fenylglycin aminosyre bli.: bekreftet ved

hjelp av IR og NMR spektra.

25 o

Den spesifikke optiske dreiningsevne var /o7q —154

(c - 1% i IN HC1) 1 forhold til en verdi pa -157.H°

gjengitt i litteraturen lor den rene aminosyre.

EKSEMPEL 2

Celler fremstilt som i eksempel 1 fra 100 ml dyrkingsv^ske

ble oppslemmet i 10 ml pyrofosfatbuffor (0.1M, pH 7.7) og underkastet ultralyd ved 5°C i 10 minutter. Produktet ble tilsatt til 500 ml av en løsning av D,L-N-kurbamoylfenyl-

glycin 20 iiiM i pyrofosfatbuffer (0.1M pH 7.7) og inkubert ved G5°C.

De kinetiske forhold ble overvaket ved å bestemme frigitt

ammonium ved hydrolysen av N-karbamoyl med fenol-hypokloritt-

iiio todci i.

+

Etter en 40 timers inkubasjon hadde NH^ -ionet nådd konsentrasjonen av 10 millimol pr. liter og noen ytterligere økninger ble ikke iakttatt ettersom tiden gikk.

Reaksjonsblandingen ble konsentrert til 50°C under vakuum opp til 100 ml.

N.'ir pil ble innstilt til 5.8 med konsentrert HC1 ble det samlet

et bunnfall pa et filter.

Det således oppnådde bunnfall ble oppløst i IN HC1 og utfelt

pa nytt med NaOII ved pH 5.8.

Etter tørking ble den spesifikke, optiske dreiningsevne

bestemt og var -15 3°. IR-spektruin bekreftet identiteten av aminosyrei i.

Fra filtratet, forsiktig innstilt til pH 2.5 med 3N HG1 på et isbad ble det oppnådd et bunnfall som ble inndampet til

tørrhet og ekstrahert med absolutt kokende etanol. Ved avkjøling ga den alkoholiske løsning et krystallinsk bunnfall som etter tørking ble utsatt for tynnsjiktkromatografering og IR-spek trumtest.

Disse analyser bekreftet at kjemisk rent N-karbamoylfenyl-glycin var tilstede.

Den spesifikke optiske dreiningsevne var /qj7^ 134°

(c a 1% i IN NaOH) i forhold til verdien på +137°

gjengitt i litteraturen for L-enantiomeren.

EKSEMPEL. 3

Fra en forkultur fremstilt som i eksempel 1 ble det

inokulert 5 500 ml kolber som hver inneholdt 100 ml av eir blanding som utelukkende var sammensatt av en 5% løsning av kornstøovæske bragt til pH 7.8 med NaOH og sterilisert ved 121°C i 30 minutter.

Kulturen ble inkubert i 24 timer ved 30°C med orbitalomrøring (220 omdreininger pr. minutt). Cellene som var samlet ved sentrifugering ble vasket med pyrofosfatbuffer (0.1M pH 7.7)

og deretter oppslemmet i 100 ml av den samme buffer inneholdende 10 g 5-parahydroksy-D,L-fenylhydantoin og inkubert ved 40°C under en UPP nitrogenatmosfære. Etter 160 timers inkubasjon under disse betingelser ble den fullstendige hydrolyse til aminosyren parahydroksyfenylglycin D(-) oppnådd, bekreftet både ved den polarimetriske test av reaksjonsblandingen og ved hjelp av tynnsjikt-kromatograferingstest foretatt i henhold til Suzuki (J. of Chromatography, 80

(1973) 199-204^.

Aminosyren ble isolert fra reaksjonsblandingen ved utfelling av proteinene med trikloreddiksyre og deres fjernelse ved sentrifugering, idet pH ble bragt til det isoelektriske punkt (5.2). Bunnfallet ble vasket med vann og vakuumtørket.

Identiteten av aminosyren ble bekreftet på basis av IR og

NMR spektra. Den spesifikke optiske dreiningsevne var ZVq5 - -156.5° (c=l% i IN HC1) i forhold til en verdi på

-161.2° gjengitt i litteraturen for den rene aminosyre.

EKSEMPEL 4

Det anvendes celler av stammen Agrobacterium sp. som kommer

fra 100 ml av en dyrkingsvgske basert på kornstøpvæske og fremstilt som i eksempel 1.

De vaskede celler ble oppslemmet i 10 ml pyrofosfatbuffer

(0.1M pH 7.7) og underkastet toluenbehandling i 15 minutter ved omrøring ved romtemperatur.

Den toluenbehandlede oppslemning ble tilsatt til 500 ml av en løsning av N-karbamoyl-D,L-parahydroksyfenylglycin 20 mM i pyrofosfatbuffer (0.1M pH 7.7) og inkubert ved 65°C under en UPP nitrogenatmosfære.

De kinetiske forhold ved reaksjonen ble overvåket ved å avlese frigitt ammonium ved hydrolysen av N-karbamoylderivatet i henhold til metoden med fenol-hypokloritt som nevnt i eksempel 1.

Etter 18 timers inkubasjon hadde NH^ -ionene nådd konsentrasjonen på 10 millimol pr. liter og noen ytterligere økning kunne ikke iakttas med tiden.

Ved dette trinn ble reaksjonsblandingen konsentrert i vakuum

ved 50°C til et sluttvolum på 100 ml. Når pH ble innstilt til 5.2 med konsentrert HC1 ble det oppnådd et bunnfall og dette ble samlet på et filter.

Ved å følge nøyaktig den samme fremgangsmåte som beskrevet i eksempel 2 ble D-aminosyren og N-karbamoyl-L isolert og identifisert og de spesifikke optiske dreiningsevner var

henholdsvis -157.2° og +171° i forhold til verdiene på

-161.2° og +175.4° som angitt i litteraturen for de rene produkter.

EKSEMPEL 5

Celler av stammen Agrobacterium sp. ble fremstilt som beskrevet

i eksempel 1. Noen gram av fuktig celleoppslemning :ble dispergert i pyrofosfatbuffer CO.IM pH 7.7) og underkastet behandling med aceton i kulden. Etter fjernelse av aceton ved filtrering ble acetonpreparatet oppnådd på denne måte tørket til konstant vekt i vakuum ved 35°C. Det tørkede material ble homogenisert i en' morter og det således oppnådde pulver ble anvendt for de enzymatiske aktivitetstester.

Det pulverformede pulver fra acetonbehandlingen ble testet på følgende substrater: N-karbamoyl-D-(-)-alanin, N-karbamoyl-D-C-)-valin, N-karbamoyl-D-(-)-glutaminsyre, N-karbamoyl-D(-)-parahydroksyfenylglycin, N-karbamoyl-D(-)-parametoksyfenyl-glycin, N-karbamoyl-D-(-)-fenylglycin, N-karbamoyl-L(+)-fenylglycin, N-karbamoyl-D(-)-fenylalanin, N-karbamoyl-L(+)-glutaminsyre og N-karbamoyl-D(-) C2-tienyl)-glycin.

Det ble således fremstilt 20 mM løsning av hvert karbamoyl-derivat i pyrof osf atbuf f er 0.1M pH 7.7, og til 1'0 ml av hver løsning ble det tilsatt en passende mengde pulver fra acetonbehandlingen, den samme for hvert substrat.

Inkubasjonen ble gjennomført under en UPP nitrogenatmosfære med omrøring ved en temperatur på 40°C. Etter 1 times inkubasjon ble mengden av fremstilt aminosyre målt ved å bestemme konsentrasjonen av NH^ -ionet i reaksjonsblandingen som var oppnådd, ved hjelp av fenol-hypoklorittmetoden angitt i eksempel 2.

Det ble funnet at den høyeste aktivitet for det karbamoylaktive enzym opptrer mot N-karbamoyl-DC-)-parahydroksyfenylglycin. TABELL 1 gjengir resultatene av testene, idet det antas en verdi på 100 for den hydrolytiske aktivitet som utøves mot N-karbamoyl-D(-)-parahydroksyfenylglycin.

TABELL 1

EKSEMPEL 6

Ef) dyrkingsvæske ble fremstilt med følgende sammensetning:

Blandingen, fordelt i 100 ml porsjoner i 500 ml kolber,

ble sterilisert ved 116°C i 30 minutter. Hydantoin ble sterilisert ved filtrering.

Fra en forkultur fremstilt som i eksempel 1 ble det

inokulert 5 ml pr. kolbe og kulturen ble inkubert ved 30°C med orbitalomrøring med 220 omdreininger pr. minutt i 36 timer. Deretter ble cellene fjernet med sentrifugering og aminosyren ble isolert fra det overliggende væskesjikt ved konsentrering og innstilling av dette væskesj ikt til det isoelektriske punkt. Fra 10 liter av en således behandlet dyrkingsvæske ble det isolert 11.2 g D(-)-fenylglycin med spesifikk optisk dreiningsevne £qjfå «=* -156° (c « 1% i IN HC1) i forhold til en verdi på -157.8° som gjengitt i litteraturen for den rene aminosyre.

EKSEMPEL 7

En dyrkingsvæske ble fremstilt med følgende sammensetning:

Dyrkingsblåndingen, fordelt i 100 ml porsjoner i 500 ml kolber, ble sterilisert ved 116°C i 20 minutter. Metylhydantoin ble sterilisert separat.

Fra en forkultur fremstilt som i eksempel 1 ble det inokulert 5 ml pr. kolbe og kulturen ble inkubert ved 30°C med orbitalomrøring (220 omdreininger pr. minutt) i 24 timer.

Celledispers jonen ble samlet ved sentrif ugering f r-a 1000 ml væske og ble vasket i fosfatbuffer (pH 7.5) 'og oppslemmet på nytt i 100 ml av den samme buffer inneholdende 4 g DL-5-(2-tienyl)-hydantoin.

Reaksjonsblandingen ble inkubert ved 40°C under en UPP nitrogenatmosfære. Etter 30 timers reaksjon var hydrolyæn til aminosyren (D(-)(2-tienyl)glycin) fullført. Aminosyren ble isolert ved konsentrering av reaksjonsblandingen til et sluttvolum på 20 ml og ved innstilling av pH til 5.6. Det således oppnådde bunnfall ble vakuumtørket. Identiteten av aminosyren ble bekreftet ved hjelp av IR og NMR spektra.

Den spesifikke optiske dreiningsevne var /a7D 25 -72.6o

(c sa 1% i H20) i forhold til en verdi på -73.7° som gjengitt i litteraturen for den rene aminosyre.

(V

Claims

Fremgangsmåte for fremstilling av D-aminosyrer ved hydrolyse av racemiske blandinger av N-karbamoylderivatene eller de tilsvarende hydantoiner,

karakterisert ved at hydrolysen gjennom-føres ved hjelp av friske celler, frysetørkede celler, tolueniserte celler, acetonholdig pulver, rått eller renset uttrekk henholdsvis ekstrakt av Agrobacterium NRRL B-11291 .