NO155698B - Fremgangsmaate for fremstilling av stereospesifikke karbamylderivater av aaa-hydroksysyrer. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av stereospesifikke karbamylderivater av 0(-hydroksysyrer, og det særegne ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er at 5-substituerte 2,4-oksazolidin-dioner med generell formel I,

hvor R er en substituert eller usubstituert aromatisk eller alifatisk rest, hydrolyseres stereospesifikt ved hjelp av preparater med enzymatisk aktivitet oppnådd fra homogenisert kalvelever eller fra mikroorganismer valgt fra Agrobacterium radiobacter NRRL B 11291, Bacillus Brevis NRRL B 11080, Bacillus stearothermophilus NRRL B 11079, Pseudomonas sp CBS 145.75, Pseudomonas sp CBS 146.75, Pseudomonas sp ATCC 11299, Pseudomonas desmolytica NCI B 8859, Pseudomonas fluorescens ATCC 11250 eller Pseudomonas putida ATCC 12633.

Disse trekk ved oppfinnelsen fremgår av patentkravet.

Ved den foreliggende oppfinnelse underkastes forbindelser med den generelle formel I, d.v.s. 5-substituerte 2,4-oksazolidin-dioner, en hydrolysereaksjon som åpner ringen i samsvar med følgende reaksjonsskjerna:

Forbindelsen med formel II som oppnås ved hydrolysen er karbamylderivatet av en -hydroksysyre hvorfra O^-nydroksysyren eventuelt kan oppnås ved å underkaste forbindelsen II for ytterligere hydrolyse i samsvar med reaksjonsskjemaet.

Sluttproduktet III vil da være 0(-hydroksysyren.

Nærmere angitt utgjør den foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for direkte fremstilling av D-karbamyl-0(-hydroksysyrer ved stereoselektiv enzymatisk hydrolyse av racemiske blandinger av forbindelser med generell formel I, basert på den overraskende erkjennelse at det er funnet mulig enzymatisk å hydrolysere 5-substituerte DL-2,4-oksazolidin-dioner på en slik måte at det oppnås bare D-karbamyl-CX-hydroksysyren, d.v.s. bare en av de to mulige optiske isomerer. Den fri CX-hydroksysyre med D-konfigurasjon kan da eventuelt lett oppnås fra det optisk aktive karbamylderivat ved enkel hydrolyse. Forbindelser med formel I kan lett fremstilles fra de tilsvarende -hydroksysyrer ved å omsette dem med urea som beskrevet av Helge Aspelund i Acta Acad. Aboensins Math. and Phys. 22 (7) 12 (1961).

Oppdelingen av den racemiske blanding gjennomføres ved stereoselektiv hydrolyse av oksazolidinringen gjennomført ved hjelp av enzymer som lett kan oppnås fra kulturer av forskjellige mikroorganismer eller fra ekstrakter av animalske organer som for eksempel kalvelever.

Et spesielt tilfelle som er særlig interessant er fremstil-lingen av D(-) mandelsyre som er en viktig utgangsforbindelse ved fremstilling av halvsyntetiske antibiotika.

Dette utgangsprodukt fremstilles vanligvis ved oppdeling av den racemiske blanding ved dannelse av diastereoisomersalter med optisk aktive naturlige baser som for eksempel brucin. Disse prosesser gir i alle fall ikke mer enn et maksimalt teoretisk utbytte på 50 % ved at L-enantiomeren må racemiseres før den resirkuleres.

Ved den foreliggende oppfinnelse kan karbamylderivatet av

D(-) mandelsyre fordelaktig fremstilles ved den stereo-selektive enzymatiske hydrolyse av det tilsvarende 5-fenyl-2,4-oksazolidin-dion. En ytterligere vesentlig fordel ved fremgangsmåten i henhold til den foreliggende oppfinnelse er at det enzymatiske reaksjonssubstrat racemiserer spontant under hydrolysebetingelsene, slik at ved slutten av reaksjonen oppnås karbamatet av D-mandelsyre i støkiometrisk mengde i forhold til utgangssubstratet.

Reaksjonsskjemaet er som følger:

D(-) mandelsyre oppnås så fra D-mandelsyrekarbamatet ved hydrolyse i en sur omgivelse.

Den enzymatiske aktivitet som kreves for fremstilling av

D(-) mandelsyrekarbamat er blitt funnet både i homogenisert kalvelever og i mikroorganismer av de følgende typer:

Agrobacterium radiobacter NRRL B 11291

Bacillus Brevis NRRL B 11080

Bacillus stearothermophilus NRRL B 11079

Pseudomonas sp CBS 145.75

Pseudomonas sp CBS 146.75

Pseudomonas sp ATC 11299

Pseudomonas desmolytica NCI B 8859

Pseudomonas fluorescens ATCC 11250 eller

Pseudomonas putida ATCC 12633

Ved gjennomføring av fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen dyrkes mikroorganismene av de ovennevnte typer under aerobe betingelser i dyrkningsmedia inneholdende kilder for nitrogen, karbon, fosfor og uorganiske salter ved en temperatur mellom 20 og 80°C i et tidsrom på mellom 10 og 72 timer og ved pH mellom 6,0 og 8,0.

Glukose, laktat, acetat, kornstøpvæske og laktose kan anvendes som karbonkiIder.

Hydrolysert kjøtt, kasein eller soya, ammoniumsalter, urea, hydantoin, etc. kan anvendes som nitrogenkilder. Et passende dyrkningsmedium har for eksempel følgende sammensetning:

D(-) karbamatet av mandelsyre kan fremstilles direkte i gjær-ingsmediet inneholdende det tilsvarende DL-2,4-oksazolidin- dion, eller kan fremstilles ved direkte å anvende mikrobe-pasta som hvilende celler eller ved å anvende ekstrakter derav.

De enzymatiske komplekser som anvendes ved den foreliggende oppfinnelse ekstraheres fra bakteriepastaen ved de vanlige metoder anvendt innenfor enzymologien.

For dette formål knuses cellene under bruk av passende appara-tur som for eksempel "French Pressure-Cell Press","Manton Gaulin Homogenizer", roterende knusere, etc., eller ved å anvende ultralydteknikk.

Hydrolyse av det 5-substituerte DL-2,4-oksazolidin-dion kan gjennomføres ved å tilsette enzymet i de følgende former til reaksjonsblåndingen: friske celler, frysetørkede celler, tolueniserte celler, acetonholdig pulver eller rå eller rensede ekstrakter. En ytterligere teknisk og økonomisk for-bedring kan gjennomføres ved å immobilisere enzymet ved kom-binasjon med makromolekylære forbindelser ved å danne kjemiske bindinger med grunnmassen eller ved ioniske bindinger, eller ved hjelp av mekanisk immobilisering.

De følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen.

EKSEMPEL 1.

En dyrkningsbuljong ble fremstilt med følgende sammensetning:

pH ble innstilt til 7,2 med soda og mediet ble fordelt i 500 ml kolber i porsjoner på 100 ml. Etter sterilisering i 30 minutter ved 110°C ble kolbene podet med en kultur av Pseudomonas CBS 145.75 stamme inneholdende det samme medium

med 2 % agar (DIFCO) og inkubert i 24 timer ved 30°C under orbital omrøring (220 omdreininger pr. min.).

1 ml av denne forkultur (optisk densitet ved 500 nm =

0,250 dil x 1:10) ble anbragt i fem 500 ml kolber inneholdende 100 ml av det samme medium, og kulturen ble inkubert ved 30°C under orbital omrøring (220 omdreininger pr. min.) i 24 timer (optisk densitet ved 550 nm = 0,450 dil 1:10).

Cellene ble så oppsamlet, vasket i fysiologisk saltløsning og endelig suspendert i 100 ml av 0,1 M pyrofosfatbuffer ved pH 8,7 inneholdende 2 g av DL 5-fenyl-2,4-oksazolidin-dion ved en temperatur på 50°C.

Etter 70 timers inkubasjon under disse betingelser var hydrolysen til D-mandelsyrekarbamat fullført, påvist ved polari-metrisk analyse av reaksjonsblandingen.

Karbamatet ble isolert fra reaksjonsblandingen etter fjernelse av cellepastaen ved sentrifugering, etterfølgende avkjøling og pH ble innstilt til 2,5 med konsentrert HC1. Bunnfallet oppnådd på denne måte ble frafiltrert, vasket med koldt og tørket under vakuum. Det ble oppnådd 1,8 g karbamat med identitet påvist ved hjelp av I.R. og NMR og ved hjelp av elementær analyse.

Den spesifikke optiske dreiningsevne, /^- JD^ av ^en a-'-'<0_ holiske løsning av karbamatet oppnådd som beskrevet i det foregående var -141.

Dets smeltepunkt (med spaltning) var 169°C.

1,4 gram karbamat ble suspendert i 100 ml f^O, og deretter oppvarmet under tilbakeløp i fire timer. Den således oppnådde vandige løsning ble surgjort og deretter ekstrahert med etyl-eter, og den organiske fase ble inndampet under vakuum til

r~ ~* 25 ;tørrhet. 1,10 gram ra mandelsyre ble oppnådd ved // D ;på -120 (optisk utbytte 76 %). ;Ved krystallisering fra vann hadde råproduktet smeltepunkt 130°C og /o</n 5 På -154,5 i vann, i forhold til smeltepunkt 133°C og / j^ J^*P=<>>-158 som beskrevet i litteraturen for D(-) mandelsyre.

EKSEMPEL 2.

1 g acetonpulver av homogenisert kalvelever ble tilsatt til en løsning inneholdende 500 mg DL-5-fenyl-oksazolidin-dion i

50 ml 0,1 M pyrofosfatbuffer med pH 8,5.

Den således oppnådde reaksjonsblanding ble inkubert ved

30°C i 40 timer.

D-mandelsyrekarbamatet ble så isolert som beskrevet i eksempel 1.

380 mg rått karbamat ble oppnådd med en spesifikk optisk dreiningsevne j^ J^ pa -136 i etanol.

Sur hydrolyse av det rå karbamat ble så gjennomført, og mandelsyren ble ekstrahert som beskrevet i eksempel 1, til åf~ 7 25 gi 300 mg rå D-mandelsyre med / CXV D på -116 (optisk utbytte 73, 5 %).

Claims (1)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av stereospesifikke karbamylderivater av 0(-hydroksysyrer,karakterisert vedat 5-substituerte 2,4-oksazolidin-dioner med generell formel I,

   hvor R er en substituert eller usubstituert aromatisk eller alifatisk rest, hydrolyseres stereospesifikt ved hjelp av preparater med enzymatisk aktivitet oppnådd fra homogenisert kalvelever eller fra mikroorganismer valgt fra Agrobacterium radiobacter NRRL B 11291, Bacillus Brevis NRRL B 11080, Bacillus stearothermophilus NRRL B 11079, Pseudomonas sp CBS 145.75, Pseudomonas sp CBS 146.75, Pseudomonas sp ATCC 11299, Pseudomonas desmolytica NCI B 8859, Pseudomonas fluorescens ATCC 11250 eller Pseudomonas putida ATCC 12633.