FI66021C - Enzymatiskt foerfarande foer framstaellning av optiskt aktiva d-aminosyror ur motsvarande hydantoiner eller rasemiska karbamoylderivat - Google Patents
Enzymatiskt foerfarande foer framstaellning av optiskt aktiva d-aminosyror ur motsvarande hydantoiner eller rasemiska karbamoylderivat Download PDFInfo
- Publication number
- FI66021C FI66021C FI791624A FI791624A FI66021C FI 66021 C FI66021 C FI 66021C FI 791624 A FI791624 A FI 791624A FI 791624 A FI791624 A FI 791624A FI 66021 C FI66021 C FI 66021C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- carbamoyl
- amino acid
- rasemiska
- hydantoiner
- enzymatisc
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Description
ESSFn [el (11)KUULUTUSjULKAISU π
lJ 1 1 UTLÄGGNINCSSKRI FT 66U2 I
C Patentti nyenno L Ly 10 C3 1984 ^ (51) Kv.lkf/Int-Ct5 C 12 P 13/Oi» SUOMI —FINLAND (21) F^.nttlh*Vemu*-FWtuweknlnt 791 62^» (22) Htk*ml*ptlvi — Antttknlngadaf 22.05.79 ^ ^ (23) Alkupilvi — Glhl|h*tid*| 22 05 79 (41) Tullut lulklMktl — Blhrlt off*mHg 2^ ^ yq
Patentti· ja rakietarihallitut .... ...... .. . ^ _ ' . (44) NihtlvUuIptnon 1· kuuUulkaiiun p*m. — , „,
Patent- och ragittorttyralaan ' AmMum utlagd oeh utljUutft«n pubikmd 30.04.84 (32)(33)(31) Pyy't,»«r «tuolit·»»—B«f«rd prior*·! 23.05.78 I ta 1ia-1 ta 1 ien(IT) 23679 A/78 (71) Anie S.p.A., Via Ruggero Settimo 55, Palermo, I ta 1ia-I ta 1ien (IT) (72) Roberto Olivieri, Mentana, Aurelio Viglia, Monterotondo,
Ludwig Oegen, Roma, Leone 1lo AngeIini, Monterotondo,
Eugenio Fascetti, Roma, I taii a-1 taiien(IT) (74) Antti Impola (54) Entsymaattinen menetelmä optisesti aktiivisten D-aminohappojen valmistamiseksi vastaavista hydantoiineista tai raseemisista karbamyy1ijohdannaisista - Enzymatiskt förfarande för fram-ställning av optiskt aktiva D-aminosyror ur motsvarande hydantoiner eller rasemiska karbamoylderivat
Keksinnön kohteena on menetelmä D-ainmohappOJen valinistaai-seksi hydrolysoimalla niiden M-karbamoyyl 1 johdanna isten raseemisia seoksia tai vastaavia hydantonneja. Muutamat C-aminohapot, varsinkin fenyyliglysiini p-hydroksifenyyli&lysuni , ovat tärkeitä välituotteita lääketeollisuudessa laajalti käytettyjen, yhdisteiden valmistamiseksi .
Optisten antipodien erottamiseen tähän asti sovelletut, Kamfo-sulfonihapon käyttöön perustuvat kemialliset menetelmät ovat erittäin kalliita ja johtavat pieniin saantoihin.
Erään toisen menetelmän mukaan hydrolysoioaan D-asyyllamino-happo D-asyylientsyymm avulla.
Nämä entsyymi valmisteet sisältävät kui terin in aina epäpuhtautena L-asylaasia, minkä seurauksena saadaan tuote, jonka optinen puhtaus on heikko.
Menetelmä D,L-ammohappojen tai niiden johdannaisten erottamiseksi entsymaattisesti on jo esitetty hakijan toimesta italialaisessa patentissa no. 987.278, luxemburgilaisessa patentissa no. 79.217 ja belgialaisessa patentissa no. 843.991, jotna on päivätty vastaavasti 20.2.197b, 26.8.1978, 1.10. 1977.
__ _ - e: 2 66021
Ecellä mainittu menetelmä perustuu pääasiallisesti ontsymaat-tisen hydrolyysin suorittamiseen hydropyrimidi1 ru-nydrolaasin (n.o.
K.o.2.2.) avulla, joka on saatu erotetuksi elimistä tai mikro-oröanis-neista, jolloin yhdisteiden raseemisen muodon yleinen kaava on seuraa va : 0
II
^C-NH
τ-4 VcH | X » -H, - OH, -OCH,
H
Hydrolyysi tapahtuu eeuraavalla tavalla
? COOH
/C “ N - H__v X CH-NH-CO-NH0 X D(-) ^ X=-/ -C=0 0
DL I ---_ » - NH
H ^ ]
X CH I
, N - C - O
t _I i
Raseemieaatio L(+) Tämän jälkeen N-karbamoyyli johdannainen hajotetaan D-aminohapok- si hapettamalla nitriitin avulla siten kuin on esitetty ruotsalaisessa patenttihakemuksessa 7u0 42S7-:>.
DE-hakemusjulkaisussa 2 YOt 212 (C 07 2 149/2^7) on esitetty menetelmä L-aminouapon (L-metioni in i) valmistamiseksi vastaavan iM-karbamoyyl i johdannaisen raseemisesta seoksesta .min. A^robacter l un-sukuun kuuluvasta n ikro-organismikanriasta saatavan entsyymin avulla. Keksinnön mukainen menetelmä tunnetaan siitä, että hydrolyysi suoritetaan Agro bac ter i un- suk uun kuuluvasta kannasta wHRL O 112j'i saaatujen entsyymikompleks ien avulla. D-aminohappoja valmistetaan keksinnön mukaan vastaavista hydantoiineista soveltantalla hvdrolyyttisiä reaktiota, joissa kata lysaat toreina käytetään ainoastaan entsyymikompiekseja, seuraavan kaavan mukaisesti: 5 6-5021 D(-)
O OOOH
il I
--NH entsyymi Is R-CH-KH-CO-
R - CH"^ \ Entsyymi II
-C^Q \ 0 ,^°°H
[ 0 \. Y S - CH - NHp
DL H * C HH
- · + ώ o/' I L(+) DC-1
^raseemiBOinti R - CB^ I
----\jj — c Η υ jossa kaavassa H tarkoittaa alifaattista tai aromaattista radikaalia, joka on joko substituoitu tai substituoimaton.
Keksinnön mukaan D-ammohappoja voidaan valmistaa myös raooe-raisista yhdisteistä, joiden yleinen Kaava on
R - C!! - N: i - C 0 - N H I
COGH
jossa kaavassa R tarkoitaa ryhmää, joka on valittu substιtuoitujen ja substitucimattornien aiifaattisten ja aromaattisten radikaal ien joukosta, ja entsyymi II (karbamoylaasi) on stereoselektnvinen L-muotojn kohtaan.
Keksinnön mukaan entsymaattmen hydrolyysi tapahtuu seuraavansa esitetyn kaavan mukaan, ja tuloksena saadaan muodostumaan aminohapon ja sen johdannaisen yksi ainoa s t e r · e ois o me e rιn e n muoto, kun valmistus aloitetaan raseemisesta yhdisteestä:
H H
I I
R - C — NHCONH- karbaroovlaasi H — o — k H., I ^ ' \ d
COOH COOH
H h ( - ) DL j R-C —NHCONIL- I *
COOH
L (+) Tässä keksinnössä selitetyillä entsyymivalmiste:11a ei olo mitään L-enantiomeen-aktiviteettia, siis vastakohtana D-asyiaasia sisältäville valmisteille. Tämän ansiosta voidaan valmistaa optisesti täysin puhtaita D-ammohappc ja .
___ — · r 6 5021
Keksinnön mukaisia entsyymiKomplekseja Kehittävät Agrobacte-rium-suvun mikro-organismit f jotka on eristetty maanvil jelymaasta ja rekisteröity numerolla 1302. Tämä kanta on 6.4. 1976 luovutettu Laitokseen "Northern Regional Research Center of Peoria, 111., 13 A " , jossa sille on annettu deponoititunnus NRRL B 11291.
Tämän rnikro-organismin morfologiset ja biokemialliset ominaisuudet ovat seuraavat:
Mikroskooppinen morfologia:
Erillisiä sauvoja, joskus parillisia, gram-negatiivisia, 0,8 x 1,5 x 2,0 jum, kapselit ja itiöt puuttuvat, liikkuvat 4...o peritriiikkisellä sumalla.
Makroskooppinen morfologia:
Pesäkkeet agar-elatusameella (Difco): Koholla, yhtenäinen reuna, kermanvärmen, läpinäkyvä, halkaisija 0,5...1 mm, pinta sileä. Runsas kasvu kalsiumglyserolifosfaatti-mannitoimitruatti-agaralustalla, muuttuu ruskeaksi ja muodostuu "halo".
Biokemialliset ominaisuudet:
Kasvaa 4... 59 °C:ssa kaikilla yksinkertaisilla labora Lono-elatusaineilla, myös ilman kasvua edistäviä aineita ja aminohappoja, jolloin ainoana typpilähteinä käytetään NH^+, N0_,~, tai aminohappoja.
OksIdaasi: positiivinen (N. Kovacs, 195b, Nature, Lonodon, 178, 703).
Katalaasi: positiivinen (M. Levine, D.Q. Anderson, 19:>2, ,7. Bact. 23, 33 7-247 ).
Nitriittejä muodostuu nitraateista (C.E. Zcbeii, 19o2, J. Bact. 24, 275).
Tuote "Tween 60", ei hydrolysoidu (C. äierra, 1957, Antonio van Leeuwenhoek, 25. 13-22).
Kaseiini, gelatiini, selluloosa, tärkkelys, agar: ei hydrolysoidu (V.B.D. Skermann, A Guide to the Identification of the Genera of Bacteria, 2nd Edition, The Niliiams & WilKins Book Co., Baltimore, 1967).
Muodostuu 5-ketoglykosideja (M.J. Bernaerts, J. De Lev, 1'96ρ, Nature 197, 406).
6 '5 O 21
Anilimisininen-mannitoli-agar: kasvua ja värin absorboitumista (A.A. Hendrickson, J.L. Baldwin, A. J , RiKer, 19o4, J. Haet. Bo, 597-618).
Litmus-maito: harmaanruskea.
Hiilihydraattien käyttö: hapettava (R. Hugh, h. Leifson, 1953, J. Bact. 6o, 24-26).
Seuraavia yhdisteitä käytetään ainoina hulilänteinä viljely-väliaineessa tarkoitukseen, jonka R.Y. Stamer on selittänyt (H.Y. Stanier et ai., 1966, J. Gen. Microbiol 4j>, 159-271 ): D ( +) -g I ukoos ι, L(+)-arabinoosi, D(+)-ksyloosi, D(+)-treoosi, D(+)-trehaloosi, D( -) -rinoosi, L(+)-raranoosi, laktoosi, seilobioosi, maltoosi, sitraatti, asetaatti, laktaatti, propionaatti, L-asparagimihappo, L-asparagimi, L-histidimi, L-alaniini, L-ar6injini.
Verrattaessa näitä ominaisuuksia selityksiin, jotka on esitetty julkaisussa "Bergay's Manual of Determinative Bacteriology, VIII painos", todetaan, että keksinnön mukaiset mikro-organismit kuuluvat Rhizobiaceae-heimoon, Agrobacterlum-sukuun.
Keksinnön mukaan Agrobacterium-sukuun kuuluvia niiKro-or^anisine-ja viljellään serobisissa olosuhteissa käyttämällä elatusainetta, joka sisältää typpi-, hiili-, fosforilähteatä ja nuneraalisuoioja, jolloin lämpötila on 20...40 °C, sopivasti 25...55 °C, viljelysaika on 10...48 h, sopivasti 20...30 h, ja pH-arvo on 6,0...8,0, sopivasti 7.-.7,5. Hillllähteinä voidaan käyttää glukoosia, laktaattia, asetaab-tia, maissiuutetta ja laktoosia.
Typpilähteinä voidaan käyttää lihahydrolysaatteja, kaseiini- ja soijapapuhydrolysaatteja, ammornumsuoloja ja karbamidia, hydantoi3 noja ja aminohappojen N-karbamoyylιjohdannnaisia..
Sopivan elatusameen koostumus on esim. seuraava: lihapeptonia 5 g lihauutettta 5 g glukoosia 5 e tislattua vettä 1000 ml pH-arvo 7,0...7,2 D(-)aminohappoja muodostuu suoraan elatusameessa, joka sisältää DL-hydantouneja tai aminohappojen DL-N-karbamoyy11johdannaisia , kun näitä käytetään joko ainoina typpilähteinä tai yhdessä muiden tavanomaisten typpilähteiden kanssa.
Τ'
_ - L
6 66021 D(-jaminohappoja voidaan myös valmistaa käyttämällä suoraan mikrobi-lietettä kuten jäljellä olevia soluja tai tämän lietteen uutteita .
Keksinnön mukaiset entsyymikomplekslt uutetaan bekteerillettees-tä soveltamalla entsymolo^iassa yleisesti käytettyjä menetelmiä.
Tätä varten solut hajotetaan sopivien laitteiden avulla, joista esimerkkeinä mainittakoon "French Pressure Cell Press", "Kanton Gaulinfe Homogenizer", pyöriviä hajottimia myös uitraäunitäryttimiä.
Aminohappojen M-karbainoyyl 1 johdannaisten tai hydantoiimen hyd-rolyysi voidaan suorittaa lisäämällä reaktloseokseen entsyymiä seuraa-vina muotoina: tuoreina soluina, jäähdytyskuivattuina soluina, tolu-enoituina soluina, asetoni jauheena tai raakoina tai puhdistettuina uutteina .
Tekninen ja taloudellinen lisäparannus voidaan saavuttaa sitomalla entsyymit siten, että ne yhdistetään makromolekyylisun yhdisteisiin, jolloin entsyymit muodostavat kemiallisia sidoksia näiden rungon kanssa tai ionityyppisiä sidoksia tai saatetaan Fysikaalisesti sitoutumaan.
Seuraavat esimerkit havainnollistavat keksinnön eräitä muita käytännöllisiä yksityiskohtia.
Esimerkki 1
Valmistettiin elatusameliuos, jonka koostumus oli seuraava: lihapeptonia 5 g lihauutetta o & glukoosia 5 g tislattua vettä 100u ml pH säädettiin arvoon /,2 soodan avulla ja elatusaine jaettiin 100 ml osina 500 ml pulloihin.
Pullot steriloitiin 30 min 110 ^C:ssa, minkä jälkeen niihin ympättiin kannan no. 1302, joka on talletettu rekisteröintinumerolla NRRL B 11291, viljelmää vinolevyltä, jotka sisälsivät samaa elatusai-netta, jossa oli 2 % agaria, (Difco) ja mkuboitiin 29 h 30 °C:ssa pyörivällä sekoittimei1 a sekoittaen (220 kierr/min).
Tästä esiviljeimästä (D.O. Kohdassa 550 nm: 0,2b0 laim. x 1:10) ympättiin 1 ml viiteen 500 ml pulloon, joissa oli 100 ml samaa viljely vällainetta, ja viljelmää inkuboitiin 30 °C:ssa sekoittaen (220 kierr/min) 24 h, D.O. 55 nm - 0,250; laim. 1:10).
Tämän jälkeen solut koottiin, pestiin fysiologisella suolaliuoksella ja lietettiin lopuksi 100 rahaan pyrofosfaattipuskuria (0,1 M, pH - 7,7) jossa oli 10 g D,L-5-fenyy1ihydantouni a, 40 °C:ssa typpeä suojakaasuna käyttäen.
7 66021 Näissä olosuhteissa 200 h kestäneen viljelyn iäiseen saavutettiin täydellinen hydrolysoituminen aminohapoksi (D-fenyyllglys linik-si), mikä todistettiin analysoimalla reaktioseosta sekä polarometn-sesti että ohutkerroskromatografoimalla, soveltaen menetelmää, jonka Suzuki on selittänyt julkaisussa "J. of Chromatography, do (197.5), 199-209 f.
Aminohappo eristettiin reaktioseoksesta sen jälkeen, kun proteiinit oli saostettu trikloorietikkahapon avulla ja poistettu linkoamalla, jolloin pH säädettiin isoelektrlseen pisteeseen (5,8).
Sakka peitettiin vedellä ja kuivattiin alipaineessa. D-(-)fe-nyyliglysiiniaminohapon identiteetti vahvistettiin mfrapuna- ja ydm-magneettisten resonanssispektrien avulla.
Spesifinen optinen kierto oli - - 15*4° (c = 1 jo, HC1, IN), jota voidaan verrata arvoon 197,8 , joKa Kirjallisuudessa on esitetty puhtaalle aminohapolle.
Esimerkki 2
Esimerkin 1 mukaisella tavalla valmistettuja soluja, jotka olivat peräisin 10 ml:sta viljelyilentä , lietettiin 100 ml:aan pyrofos-faattipuskur ia ( 0 , 1M M, pH=7,7) .ia ui traäänikäsitel ti in n °C:ssa 10 min. Käsitelty tuote lisättiin 90 ralraan liuosta, jossa oli 2u mM D,L-N-karbamoyylifenyyliglysiiniä pyrofosfaattipuskunssa (0,1 H, pH = 7,7) ja inkuboituin 65 °C:ssa.
Reaktion edistymistä valvottiin määrittämällä aiiimon· akki , joka vapautui N-karbamoyylin hyrdrolysoituessa fenolihypoKloridiMeneLel-iktä soveltaen.
90 h inkuboinnin jälkeen oli NH^+~ionien konsentraatio saavuttanut arvon 1C mM/Ι, eikä tämän arvon suurenemista myöhemmin havaittu.
Reaktioseos haihdutettiin 90 °C:ssa alipaineessa 100 ml:n tilavuuteen. Reaktloseoksen pH säädettiin arvoon 9,8 konsentroidulla suolahapolla, minkä jälkeen muodostunut sakka poistettiin suodattamalla, liuotettiin 1 N HCl-liuos ja säestettiin uudelleen NaOH::. avulla pH-arvossa 5,8.
Kuivauksen jälkeen optinen kiertokyky määritettiin, jolloin arvoksi saatiin -158°. Aminohappo tunnistettiin lnfrapunaspekrrm avulla .
Suodoksen pH säädettiin varovasti arvoon 2,5 8 N suolahappo-liuoksella jääkylpyä käyttäen, minkä jälkeen saatu sakka haihdutettiin kuiviin ja uutettiin kiehuvalla absoluuttisella etanolilla. Alkoholi-liuoksen jäähdyttyä muodostui kiteinen sakka, joka Kuivattuaan onut-kerrcskromatografoitiin ja suoritettiin infrapunaspektrm määritys.
8 65021 Nämä analyysit todistivat, että oli kysymys Kemiallisesti puhtaasta N-Karbamoyylifenyyliglysiinistä.
— o
Spesifinen optinen kierto oli = 13^4 (c = 1 %, 1 N
NaOH), ja tämä arvo on verrattavissa arvoon + 157, joka kirjallisuudessa on ilmoitettu L-enatiomeerllle.
Esimerkki 3
Esimerkin 1 mukaan valmistetusta esiviljelmästä ympättiin viisi 500 ml pulloa, joissa jokaisessa oli 100 ml elatusainetta joka on yksinomaan valmistettu maissiuutteen 5 % liuoksesta, jonka pH oli säädetty arvoon 7,8 natriumhydroksidm avulla, ja joka oli steriloitu 30 mm 121 °C:ssa.
Viljelmää inkuboitun 24 h 30 °C:ssa sekoittaen (220 kierr/min). Linkoamalla taiteenotetut solut pestä m pyrofosfaattipuskurilla (0,1 M, pH = 7,7), minkä jälkeen lietettiin 100 ml:aan samaa puskuria, jossa oli 10 g 5-parahydroksi-D,L-fenyylihydantoimia ja inkuboitun 40 °C: ssa typpeä suojakaasuna käyttäen. 160 h kestäneen inkubcimisen jälkeen näissä olosuhteissa saavutettiin täydellinen hydrolysoituminen aminohappo (parahydroksifenyyllglysnni-D(-):ksi, mikä todettiin sekä pola-rometrisesti kokeilemalla reaktioseosta ja suorittamalla ohutkerros-kromatografointi tavalla, jonka on selittänyt Suzuki (J. of Chromatography 80 (1973) 199-204).
Aminohappo eristettiin reaktioseoksesta sen jälkeen, Kun proteiinit oli seostettu trikloonetikkahapon avulla ja poistettu linkoamalla, ja p.H-arvo säädettiin isoelektriseen pisteeseen (5,2). Sakka pestiin vedellä ja kuivattiin alipaineessa. Aminohapon identiteetti todettiin infrapunaspektrl- ja ydmmagneettisen resonanssispektrm a-vulla. Optinen kiertokyky oli L&3 = -150,5° (C = 1 %, 1 N HC1), joka on verrattavissa arvoon -161,2°, joka kirjallisuudessa on ilmoitettu puhtaalla aminohapolla.
ESIMERKKI 4 Käytettiin Agrobacterium-soluja, jotka saatiin 100 ml:sta esimerkin 1 mukaan valmistettua maissiuutteeseen perustuvaa viljely-lientä.
Pestyt solut lietettiin 100 ml:aan pyrofosfaattipuskuria (0,1 M, pH = 7,7) ja suoritettiin toiuenointi 15 minuutin aikana ja huoneenlämmössä sekoittaen.
Toluenoitu liete lisättiin 100 ml:aan liuosta, jossa oli 20 mmol N-karbamoyyli-D,L-parahydroksifenyyli^lysiXniä pyrofosfaatti-puskurissa (0,1 H, pH = 7,7) ja inkuboitun 65 °C:ssa typpikaasua suojana käyttäen.
9 6:3021
Reaktion edistymistä valvottiin määrittämällä N-karbamoyyli-johdannaisen nydrolyysin seurauksena vapautunut aminonium-maäru soveltaen esimerkissä 1 mainittua f enol lhy ροκΐ or nt t imene telmiä .
Inkuboinmn kestettyä 1Ö h olivat ηΗ;,+ -ionit saavuttaneet kon-sentraation 10 mM/1 eikä tämä määrä enää lisääntynyt viljelyä jatkettaessa .
Tässä vaiheessa reaktioseos haihdutettiin alipaineessa ja 50 °C:ssa 100 ml:n lopulliseen tilavuuteen. häätämällä pH arvoon 5,2 konsentroidun suiahapon avulla, muodostui sakka, joka o tettiin talteen suodattamalla.
Soveltamalla tarkasti samoja menetelmiä kuin esimerkissä 2 saatiin D-aminohappo ja N-karbamoyyl i-L eristetyksi ja maar itetyks i , ja niiden optiset kiertokyvyt olivat vastaavasti -T57,2° ja + 171°, verrattuna arvoihin -161,2° ja +175,4°, jotka kirjallisuudessa on ilmoitettu puhtaille tuotteille.
Esimerkki 5
Valmistettiin esimerkissä 1 selitetyllä tavalla kannan Agru-bactenum sp. -soluja. Muutama gramma kosteaa soiulietettä lietettim pyrofosfaattipuskuriin (0,1 H, pH 7,7) ja suoritettiin asetorukäsi t-tely kylmässä. Tämän jälkeen asetoni poistettiin suodattamalla ja täten saatu asetonivalmiste kuivattiin vakiopamoon alipaineessa ja 35 °C:ssa. Kuivattu materiaali homogenoitiin huhmaressa ja täten saatua jauhetta käytettiin entsymaattisen aktiviteetin tutkimiseen.
Asetonijauhetta viljeltiin seuraavilla Kasvualustoilla: N-karbamoyyll-D-(-)-alaniini, N-karbamoyyli-D-(-)-vai imi, N-karoamo-yy 1 i-D- ( - ) -gl iltamiini happo , N-karbamoyyli-L·-(-)-parahydroksifenyyll-glyslini , N-karbamoyy 1 i-D-(-) -parametoks ifenyy 1 lgiysimi, N-karDumo-yyli-D-(-)-fenyyliglysiini, N-karnamoyyLi-L-(+)-fenyyllylysimι, N-karbamoyyli-D-(-)-fenyyliglys3ini, N-karbamoyyl i-L- ( + ) -^,1 utaini ι n ihappo ja N-karbamoyyli-D-( - ) - (2-tienyyli )-glysnni.
Täten valmistettiin 20 mil liuoksia jokaisesta karbaruoyyl ι johdannaisesta pyrofosfaattipuskurissa (0,1 M, pH 7,7), ja 10 ml:aan jokaista liuosta lisättiin sopiva määrä asetoni jauhetta, yhtä paljon jokaiseen alustaa.
Viljely suoritettiin sekoittaen 40 °C:ssa ja typpeä suojakaa-suna käyttäen. Inkuboinmn kestettyä tunnin mitattiin muodostunut aminohappomäärä määrittämällä saavutettu NH^ + -ionien konsentraatio reaktioseoksessa soveltamalla esimerkissä 2 selitettyä fenoli-hypo-klcriittimenetelmää.
_ Γ 10 66021
Todettiin, että karbamolyyttisen entsyymin suurin aktiviteetti saatiin kehittymään käyttämäiiä N-karbamoyyli-D-(-)-parahyd-roksifenyyliglysiiniä.
Kokeiden tulokset on esitetty taulukossa 1. numerolla 100 on ilmaistu hydrolyyttinen aktiviteetti, joka saavutettiin käyttämällä N-karbamoyyli-D-(-)-parahydroksifenyyllglysiimä.
Taulukko 1
Kasvualusta Aktiviteetti % N-karbamoyyli-D-(-)-alaniinia 57,5 N-karbamoyyli-D-(-)-valiinia . 34,25 N-karbamoyyli-D-(-)-glutamiinihappo 21,7 N-karbaraoyyl i-L-(+) -glut am imi happo 0 N-karbamoyyli-D-(-)-parahydroksifenyyliglysimi 100,0 N-karbamoyyli-D-(-)-parametoksifenyyliglysiim 40,0 N-karbamoyyli-D-(-)-fenyyliglysnni 61,25 N-karbamoyyl i-L- (+ )-fenyyliglysnni 0 N-karbamoyyl i-D-(-)-(2-tienyyli )glysnni 40,7 N-karbamoyyli-D-(-)-fenyylialaniini 50,0
Esimerkki 6
Valmistettiin viljelyllemi, jonka koostumus oli seuraava:
MgSO„.7H~0 0,2 g M d
Na2HP04.12H20 6 g kh2po14 3 g NH^Cl 2 g
NaCl 0,5 &
Glyserolia 5 g 5-fenyyl i-D, L-hydantoimia 2 g
Hiivauutetta 0,1 g
Tislattua vettä 1.000 ml
Elatusaine jaettiin 100 ml:n ennä 500 ml:n pulloihin, jotka steriloitiin 30 minuuttia 116 °C:ssa. Hydantonni steriloitiin suodattamalla .
Esimerkin 1 mukaan valmistetusta es ινιΐ jelrnastä ympättiin o ml pulloa kohden, ja viljelmä inkuboitun 30 °C:ssa 36 tuntia sekoittaen, (220 kierr/mm). Tämän jälkeen solut poistettiin linkoamalla ja aminohappo otettiin talteen pinnalle nousevasta nesteestä, minkä jälkeen konsentroitiin ja säädettiin pH-arvo tämän pinnalle nousevan nesteen isoelektnseen pisteeseen. 10 litrasta täten käsiteltyä elatusaine- 1 1 66021 liuosta saatiin 11,2 g D- (-)-f enyyl iglys n mu , jonka otmen kiertoky-ky oli ToCJ^ = - 1b 6° (c = 1 %, 1 N HCl), jota arvoa verrattiin arvoon -157,6°. joka kirjallisuudessa on ilmoitettu puhtaalle aminohapolle .
Esimerkki 7
Valmistettiin viljelyliemi, jonka koostumus oli seuraava:
MgSO^.7H^O 0,2 ώ
Na~HP0,.12H.0 6 b KHgPO^ 3 g 5-metyyli-hydantonnia 2 g
NaCl 0,5 g
Glukoosia 1 g
Hiivauutetta 0,1g
Tislattua vettä 1.000 ml pH 7 , 1
Viljelyväliaine jaettiin 100 ml:n osina 500 ml:n pulloihin, jotka steriloitiin 116 °C:ssa 20 minuuttia. Metyyllhydantoiini eten-loitiin erikseen.
Esimerkin 1 mukaan valmistettua esiviljelmää ympättiin 5 ml pulloa kohden, ja viljelmä inkuboitiin 30 °C:ssa 2U tuntia sekoittaen (220 kierr/min).
Soluliete, joka linkoamalla oli erotettu 10 rnl:sta viljely-seosta, pestiin fosfaattipuskurilla (pH 7,5) ja lietettun uudelleen 100 ml:aan samaa puskuria, jossa oli A g DL-5-(2-1 lenyy 11)-hy dantoi ι n ia .
Reaktloseosta inkuboitiin U0 °C:ssa typpeä sipjakaasuna Käyttäen. 30 tuntia kestäneen reaktion jälkeen hydrolysoituminen cii sujunut loppuun ja muodostunut ammohappo-D-( - )-2-1ienyy 1 ι )-^1 ys iin ia .
Aminohappo eristettiin konsentroimalla reaktloseos lopulliseen tilavuuteen 20 ml ja säätämällä pH arvoon 5,0. Täten saatu sakka kuivattiin alipaineessa. Aminohapon identiteetti määritettiin in frapunapa ydinmagneetcisen resonanssispektrm avulla.
Optinen κlertokyky,oli f «C = -72,6° (c=1 %, H 2 0) , jota arvoa voidaan verrata arvoon -73,7°, joka kirjallisuudessa on ilmoitettu puhtaalle aminohapolle.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT2367978 | 1978-05-23 | ||
| IT23679/78A IT1109506B (it) | 1978-05-23 | 1978-05-23 | Processo enzimatico-microbiologico per la produzione di amminoacidi otticamente attivi a partire da idantoine e/o carbamil-derivati racemi |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI791624A FI791624A (fi) | 1979-11-24 |
| FI66021B FI66021B (fi) | 1984-04-30 |
| FI66021C true FI66021C (fi) | 1984-08-10 |
Family
ID=11209095
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI791624A FI66021C (fi) | 1978-05-23 | 1979-05-22 | Enzymatiskt foerfarande foer framstaellning av optiskt aktiva d-aminosyror ur motsvarande hydantoiner eller rasemiska karbamoylderivat |
Country Status (25)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4312948A (fi) |
| JP (1) | JPS5511569A (fi) |
| AR (1) | AR225284A1 (fi) |
| AT (1) | AT367023B (fi) |
| AU (1) | AU530574B2 (fi) |
| BE (1) | BE876408A (fi) |
| CA (1) | CA1122552A (fi) |
| CH (1) | CH639695A5 (fi) |
| CS (1) | CS211400B2 (fi) |
| DD (1) | DD143767A5 (fi) |
| DE (1) | DE2920963C2 (fi) |
| DK (1) | DK153953C (fi) |
| ES (1) | ES481269A1 (fi) |
| FI (1) | FI66021C (fi) |
| FR (2) | FR2431536A1 (fi) |
| GB (1) | GB2022581B (fi) |
| HU (1) | HU181494B (fi) |
| IE (1) | IE49297B1 (fi) |
| IL (1) | IL57276A (fi) |
| IT (1) | IT1109506B (fi) |
| LU (1) | LU81297A1 (fi) |
| NL (1) | NL192118C (fi) |
| NO (1) | NO151899C (fi) |
| SE (1) | SE436755B (fi) |
| ZA (1) | ZA792366B (fi) |
Families Citing this family (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL70022A0 (en) * | 1982-11-08 | 1984-01-31 | Standard Oil Co | Method for introducing foreign genes into green algae cells utilizing t-dna of agrobacterium |
| IT1209495B (it) * | 1984-02-02 | 1989-08-30 | A San Donato Milanese Milano | Procedimento per la preparazione di l-alfa-amminoacidi. |
| DK164923C (da) * | 1984-04-11 | 1993-01-25 | Denki Kagaku Kogyo Kk | Fremgangsmaade til fremstilling af l-alfa-aminosyrer |
| JPS6172762A (ja) * | 1984-09-17 | 1986-04-14 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | 光学活性ヒダントイン類の製造法 |
| JPS63133631U (fi) * | 1987-02-23 | 1988-09-01 | ||
| FR2620731B1 (fr) * | 1987-09-21 | 1990-03-23 | Hoechst France | Nouveau systeme enzymatique, son procede de preparation et son application notamment dans la preparation de la d-parahydroxyphenylglycine |
| DE3918057C1 (fi) * | 1989-06-02 | 1990-05-03 | Degussa Ag, 6000 Frankfurt, De | |
| SG84486A1 (en) * | 1990-12-07 | 2001-11-20 | Kanegafuchi Chemical Ind | Process for production of d--g(a)-amino acids |
| US5824522A (en) * | 1990-12-07 | 1998-10-20 | Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha | Recombinant decarbamylases for producing D-α-amino acids |
| EP0515698B1 (en) * | 1990-12-07 | 1998-07-29 | Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha | Process for producing D-alpha-amino acids |
| JP3392865B2 (ja) * | 1991-06-12 | 2003-03-31 | 鐘淵化学工業株式会社 | 固定化酵素調製物およびＤ―α―アミノ酸の製造法 |
| ES2042409B1 (es) * | 1992-04-10 | 1994-06-01 | Control & Gestion Instr | Procedimiento para la preparacion de d-aminoacidos o derivados de d-aminoacidos. |
| JP3510625B2 (ja) * | 1992-06-30 | 2004-03-29 | スミスクライン・ビーチャム・パブリック・リミテッド・カンパニー | Ｄ−ｎ−カルバモイル−アミノ酸アミドヒドロラーゼおよびヒダントイナーゼ |
| US5902736A (en) * | 1992-10-05 | 1999-05-11 | Kanegafuchi Chemical Industry Co., Ltd. | Process for the production of D-α-amino acids by hydrolysis of the corresponding N-carbamyl derivative |
| US5330008A (en) * | 1992-12-02 | 1994-07-19 | Trustees Of The University Of Pennsylvania | Protective covering for a horse's hoof and method of attaching |
| IT1274167B (it) * | 1994-04-15 | 1997-07-15 | Eniricerche Spa | Procedimento per la produzione di d- -amminoacidi |
| US5962279A (en) * | 1994-06-24 | 1999-10-05 | Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha | Process for producing D-amino acids with composite immobilized enzyme preparation |
| US5707836A (en) * | 1995-03-10 | 1998-01-13 | Nitto Chemical Industry Co., Ltd. | Production of alkylene or phenylenediamine disuccinic acid from fumaric acid and a diamine using lyase from microbes |
| IT1276163B1 (it) | 1995-11-23 | 1997-10-27 | Eniricerche Spa | Procedimento migliorato per la preparazione di d-alfa-amminoacidi |
| IT1277125B1 (it) * | 1995-12-21 | 1997-11-04 | Eniricerche Spa | Mutanti termostabili della d-n-alfa-carbamilasi |
| EP1852510A4 (en) | 2005-01-31 | 2009-11-11 | Kaneka Corp | 5-SUBSTITUTED HYDANTOIN RACEMASE, DNA ENCODING THE SAME, RECOMBINANT DNA, TRANSFORMING CELL, AND PROCESS FOR SYNTHESIZING OPTICALLY ACTIVE N-CARBAMYLAMINE ACID OR OPTICALLY ACTIVE AMINO ACID |
| WO2007040272A1 (ja) * | 2005-10-06 | 2007-04-12 | Kaneka Corporation | Ｄ－（４－アミノメチル）フェニルアラニン誘導体の製造法 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4065353A (en) * | 1975-05-12 | 1977-12-27 | Snamprogetti, S.P.A. | Method for the preparation of D-carbamyl aminoacids and the corresponding D-aminoacids |
| IT1039757B (it) * | 1975-07-10 | 1979-12-10 | Snam Progetti | Complessi enzimatici atti a trasformare idantoine raceme in am minoacidi otticamente attivi e loro applicazione |
| JPS52125692A (en) * | 1976-02-04 | 1977-10-21 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | Preparation of l-methionine |
| US4094741A (en) * | 1976-02-04 | 1978-06-13 | Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha | Process for preparing D-(-)-N-carbamoyl-2-(phenyl or substituted phenyl)glycines |
| JPS5391189A (en) * | 1976-12-30 | 1978-08-10 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | Preparation of d-n-carbamoyl-alpha-amino acids |
| US4211840A (en) * | 1977-06-08 | 1980-07-08 | Ajinomoto Company, Incorporated | Method for producing D-α-amino acid |
| CH628009A5 (de) * | 1977-07-26 | 1982-02-15 | Hoffmann La Roche | Verfahren zur herstellung von optisch aktiven alpha-hydroxycarbonsaeuren. |
-
1978
- 1978-05-23 IT IT23679/78A patent/IT1109506B/it active
-
1979
- 1979-05-11 US US06/038,232 patent/US4312948A/en not_active Expired - Lifetime
- 1979-05-14 CA CA327,511A patent/CA1122552A/en not_active Expired
- 1979-05-14 DK DK198379A patent/DK153953C/da not_active IP Right Cessation
- 1979-05-14 IL IL57276A patent/IL57276A/xx unknown
- 1979-05-16 ZA ZA792366A patent/ZA792366B/xx unknown
- 1979-05-16 AU AU47118/79A patent/AU530574B2/en not_active Ceased
- 1979-05-17 GB GB7917304A patent/GB2022581B/en not_active Expired
- 1979-05-21 NO NO791662A patent/NO151899C/no unknown
- 1979-05-21 LU LU81297A patent/LU81297A1/xx unknown
- 1979-05-21 BE BE0/195282A patent/BE876408A/xx not_active IP Right Cessation
- 1979-05-22 FI FI791624A patent/FI66021C/fi not_active IP Right Cessation
- 1979-05-22 AT AT0375879A patent/AT367023B/de not_active IP Right Cessation
- 1979-05-22 DD DD79213063A patent/DD143767A5/de unknown
- 1979-05-22 ES ES481269A patent/ES481269A1/es not_active Expired
- 1979-05-22 FR FR7913046A patent/FR2431536A1/fr active Granted
- 1979-05-22 AR AR276637A patent/AR225284A1/es active
- 1979-05-22 HU HU79SA3183A patent/HU181494B/hu unknown
- 1979-05-23 SE SE7904548A patent/SE436755B/sv unknown
- 1979-05-23 NL NL7904097A patent/NL192118C/nl not_active IP Right Cessation
- 1979-05-23 JP JP6276679A patent/JPS5511569A/ja active Granted
- 1979-05-23 CH CH485579A patent/CH639695A5/it not_active IP Right Cessation
- 1979-05-23 DE DE2920963A patent/DE2920963C2/de not_active Expired
- 1979-05-23 CS CS793538A patent/CS211400B2/cs unknown
- 1979-08-08 IE IE984/79A patent/IE49297B1/en not_active IP Right Cessation
- 1979-10-10 FR FR7925259A patent/FR2438087A1/fr active Granted
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI66021C (fi) | Enzymatiskt foerfarande foer framstaellning av optiskt aktiva d-aminosyror ur motsvarande hydantoiner eller rasemiska karbamoylderivat | |
| US4774179A (en) | Process for preparing a 7-aminocephalosporanic acid compound | |
| JP2793812B2 (ja) | イブプロフェンの製造方法 | |
| GB2160870A (en) | Process for preparing peptides | |
| US4226941A (en) | Process for the optical resolution of d,l-2-amino-4-methylphosphinobutyric acid | |
| Kim et al. | Purification and characterization of novel sulfotransferase obtained from Klebsiella K-36, an intestinal bacterium of rat | |
| JPH0253029B2 (fi) | ||
| US4248967A (en) | Enzymic complexes adapted to convert racemic hydantoins into optically active aminoacids, and their applications | |
| KR100297619B1 (ko) | 비오틴의제조방법 | |
| FI71167C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av d-mandelsyrakarbamat | |
| JP2712331B2 (ja) | アシルアミノ酸ラセマーゼ、その製造法および用途 | |
| JPH022589B2 (fi) | ||
| DE2241091C3 (fi) | ||
| JP3917723B2 (ja) | ラクトン加水分解酵素およびその製造法 | |
| JPH0795947B2 (ja) | α−１，３−グルカナーゼの製造方法 | |
| JPH0321158B2 (fi) | ||
| JPS6319158B2 (fi) | ||
| JP3415218B2 (ja) | Ｄ−α−アミノ酸の製造法 | |
| JP2899071B2 (ja) | Ｌ―α―アラニンの製造法 | |
| CA1178548A (en) | Homocitric acid oligoriboside derivative for prevention of dental caries | |
| JPH02119796A (ja) | Ｌ−ホモフエニルアラニンの製造法 | |
| JPH0631311B2 (ja) | 抗生物質ｒｋ−１０６１ａ，ｒｋ−１０６１ｂ、及びｒｋ−１０６１ｃ並びにその製造法 | |
| JPH04325096A (ja) | （Ｒ）−２−ハロプロピオン酸および（Ｒ）−２−ハロ−ｎ−酪酸の製造法 | |
| JPS5928399B2 (ja) | リフアマイシン誘導体を製造するための生物学的方法 | |
| JPS62205055A (ja) | 新規生理活性物質ｓｋ−１８９４およびその製造法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC | Transfer of assignment of patent |
Owner name: RECORDATI INDUSTRIA E FARMACEUTICA S.P.A |
|
| MM | Patent lapsed | ||
| MM | Patent lapsed |
Owner name: RECORDATI INDUSTRIA E FARMACEUTICA S.P.A |