CS211400B2 - Method of microbiological enzymatic production of d-aminoacids - Google Patents

Method of microbiological enzymatic production of d-aminoacids Download PDF

Info

Publication number
CS211400B2
CS211400B2 CS793538A CS353879A CS211400B2 CS 211400 B2 CS211400 B2 CS 211400B2 CS 793538 A CS793538 A CS 793538A CS 353879 A CS353879 A CS 353879A CS 211400 B2 CS211400 B2 CS 211400B2
Authority
CS
Czechoslovakia
Prior art keywords
carbamoyl
amino acid
amino acids
enzymatic
microbiological
Prior art date
Application number
CS793538A
Other languages
English (en)
Inventor
Roberto Olivieri
Aurelio Viglia
Ludwig Degen
Leonello Angelini
Eugenio Faszetti
Original Assignee
Snam Progetti
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Snam Progetti filed Critical Snam Progetti
Publication of CS211400B2 publication Critical patent/CS211400B2/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Description

Vynález se týká způsobu výroby D-aminokyse-lin z racemických směsí jejich N-karbamoylových .derivátů nebo z odpovídajících hydantoinů za použití stereospeclfíckých komplexních enzymů, získaných z mikroorganismů Agrobacterium genus.
Některé D-aminokyseliny, zejména lenylglycin a p-hydroxyfenylglycin, jsou důležitými meziprodukty při přípravě sloučenin, které jsou v . široké míře používány ve farmaceutickém průmyslu.
Dosud používané chemické postupy pro výrobu těchto D-aminokyselin separací .odpovídajících optických antipodů, založené na použití kyseliny kamlosullonové, jsou velmi nákladné, přičemž se navíc požadované D-aminokyseliny získávají pouze v nízkých výtěžcích.
Jiné známé postupy pro výrobu D-aminokyselin jsou založeny na hydrolýze odpovídajících D-acylaminokyselin enzymem D-acylázou.
Při těchto enzymatických postupech se však vždy získá finální D-aminokyselina, která jako nečistotu obsahuje použitý enzym D-acylázu, v důsledku čehož má finální D-aminokyselina malou optickou čistotu.
Rovněž již bylo navrženo enzymatické štěpení D.L-arninokyselin nebo· jejich deri vátů; tento postup je popsán v italském patentovém spisu č. · 987 278.
Toto enzymatické štěpení spočívá v tom, že .se racemícká forma sloučenin obecného· vzorce
O
II
I
H ve kterém X znamená skupinu -H, -OH nebo -OCHs, podrobí enzymatické hydrolýze enzymem hydropirimidinhydrolázou (E.C.3.5.2.2,), který byl extrahován z .orgánů nebo .z mikroorganismů.
Tato enzymatická hydrolýza. probíhá podle následujícího reakčního schématu:
Získaný M-karbamoylový derivát se potom konvertuje na odpovídající D-amincikyselinu oxidací dusitanem.
Předmětem vynálezu je způsob mikrobiologické enzymatické výroby D-amino-kyselin z racemických směsí jejich N-karbamoylových derivátů nebo z odpovídajících hydantoinů, jehož podstata spočívá v tom, že se na uvedené výchozí látky působí enzyma tickým komplexem získaným z mikroorganismu Agrobacterium Rhizobiaceae NRRL В 11 291 při teplotě 35 až 65 °C a pH 6 až 8.
D-Aminokyseliny se při způsobu podle vynálezu mohou tedy vyrábět z odpovídajících hydantoinů za použití hydrolyti-ckých reakcí, které jsou výlučně katalyzovány enzymatickými komplexy podle následujícího reakčního schématu:
/c R-CH f/H N-C=O
COOH R-CH-NH,
DC-I ve kterém
R znamená substituovaný nebo nesubstituovaný alifatický nebo aromatický zbytek.
Způsob podle vynálezu je rovněž vyznačený tím, že D-aminokyseliny mohou být ta ké získány z racemických sloučenin obec ného vzorce:
hrnující substituované nebo nesubstituované alifatické nebo aromatické zbytky, přičemž enzym II [kterým je karbamoyláza) je stereoselektivní na D-formy.
Enzymatická hydrolýza podle vynálezu probíhá podle následujícího reakčního schématu:
R—CH—NH—CO—NH2
СООН ve kterém
R znamená člen zvolený ze skupiny za-
ze kterého je zřejmé, že dochází к tvorbě jediné stereoizomerní formy aminokyseliny a jediné stereoizomerní formy výchozí racemické sloučeniny.
Na rozdíl od enzymatických postupů, při kterých se к výrobě D-aminokyselin používá enzymu D-acylázy, se způsobem podle vynálezu dochází к finální D-aminokyselině, která neobsahuje žádný podíl optické aktivity L-enantiomeru. S ohledem na tuto skutečnost mohou být způsobem podle vynálezu získány D-aminokyseliny s absolutní optickou čistotou.
Enzymatické komplexy, kterých se používá při způsobu podle vynálezu, se vyrábějí z mikroorganismu Agrobacterium genus, izolovaného ze zemědělské půdy a označeného· čísly 1302, .1303 a 1304.
Tyto mikroorganismy mají následující morfologické a biochemické znaky:
Mikroskopická morfologie:
Jemné tyčinky, někdy zpárované, gram-nega-tivní;
velikost: 0,8 X 1,5 až 2 μηι; chybí .tobolky a spory;
pohyblivé pomocí 4 až 6 peritrichiálních bičíků.
Makroskopická morfologie:
Kolonie na živném agaru:
vyvýšené, s nepřerušeným okrajem, krémově zbarvené, transparentní, s hladkým povrchem, průměr: 0,5 až 1 mm.
Na kalciumglycerofosfátmannitnitrátovém agaru dochází к hojiému nárůstu kolonií za tvorby nahnědlého zabarvení a světlého pruhu kolem kolonie.
Biochemické charakteristiky:
Růst při teplotách mezi 4 a 39 °C na všech jednoduchých laboratorních médiích, a to rovněž bez růstových faktorů a aminokyselin za použití amonných solí, dusičnanů nebo aminokyselin, jakožto jediných zdrojů dusíku.
Oxidáza:
pozitivní (N. Kovacs, 1956, Náturo, London, 178, 703).
Kataláza:
pozitivní (M. Levine, D. Q. Anderson, 1932, J. Bact 23, 337 — 347).
Z dusičnanů vytvořeny dusitany (С. E. Zobell, 1932, J. Bact. 24, 273).
Twenn 80:
nehydrolyzován (C. Sierra, 1957, Antonie van Leeuwenhoek, 23, 15 — 22].
Kasein, želatina, celulóza, škrob a agar:
nehydrolyzovány [V. B. D. Skermann, A
Guide to the Identification o-f the Genera of Bacteria, 2. vydání, The Williams & Wilkins Book Co., Baltimore, 1967).
masový pepton 5 g masový extrakt 5 g glukóza 5 g destilovaná voda 1000 ml pH ,7 až 7,2.
Produkce 3-ketoglykosidů:
pozitivní (M. J. Bernaerts, J, De Ley, 1963, Nátuře 197, 406).
Anilinová modř-mannit-agar:
růst s absorpcí barviva (A. A. Hendrickson, J. L. Baldwin, A. J. Riker, 1934, J. Bact. 28, 597 — 618).
Lakmusové mléko:
šedohnědé zbarvení.
Použití karbohydrátů:
oxidační účinek (R. Hugh, E. Leifson, 1953, J. Bact. 66, 24 — 26).
Pro metodu popsanou R. Y. Stanierem (R. Y. Stanier et AI., 1966, J. Gen. Microbiol. 43, 159 — 271) byly v živném prostředí použity jako jediné zdroje uhlíku následující sloučeniny:
D(+)glukóza, L( + )arabinóza, D( + )xylóza, D( + )threóza, D(4-)threalóza, D( —)rinóza, L(+)rhamnóza, laktóza, cellobióza, maltóza, citrát, acetát, laktát, propionát, kyselina L-asparagová, L-asparagin, L-histidin, L-alanin a L-arginin.
jestliže se výše uvedené vlastnosti porovnají s vlastnostmi popsanými pro jednotlivé rody mikroorganismů v publikaci Bergey‘s Manual of Determinative Bacteriology (VIII. vydání), dojde se к závěru, že mikroorganismy, kterých se používá při způsobu podle vynálezu, patří к rodu Agrobacterium třídy Rhizobiaceae.
Kmen označený číslam 1302 byl uložen 6. dubna 1978 ve sbírce mikroorganismů Northern Regional Research Center of Peoria, 111., USA, kde mu bylo přiděleno označení NRRL В 11 291.
Mikroorganismus rodu Agrobacterium se podle vynálezu kultivuje za aerobních podmínek na živném prostředí, které obsahuje zdroj dusíku, zdroj uhlíku a zdroj fosforu, jakož i minerální soli, při teplotě 20 až 40° Celsia, s výhodou při teplotě 25 až 35 °C po dobu 10 až 48 hodin, s výhodou po dobu 20 až 30 hodin, při hodnotě pH 6 až 8, s výhodou při hodnotě pH 7 až 7,5.
Jako zdroje uhlíku může být použito: glukózy, laktátu, acetátu, kukuřičného výluhu a laktózy.
Jako zdroje dusíku může být použito: masového hydrolyzátu, kaseinového hydrolyzátu, sójového hydrolyzátu, amonných solí, močoviny, hydantoinů a karbamoylových derivátů aminokyselin.
Použitelné živné prostředí má například následující složení:
D( —)-Aminokyseliny se vyrobí přímo ve fermentačním prostředí, které obsahuje buď pouze DL-hydantoiny nebo DL-N-karbamoylové deriváty aminokyselin jako jediný zdroj dusíku, nebo které ještě obsahuje další obvyklé zdroje dusíku.
D( —)-Aminokyseliny mohou být rovněž vyrobeny přímým použitím mikrobiální kaše s obsahem buněk nebo použitím extraktu z této bakteriální kaše.
Extrakce enzymatických komplexů z uvedené bakteriální kaše se provádí obvyklými metodami, používanými v enzymologii.
Za tímto účelem se buňky rozruší ve vhodném zařízení, jakým je například francouzský buněčný lis, homogenizátor typu Manton-Gauling, rotační desintegrátor nebo ultrazvukový vibrátor.
Hydrolýza hydantoinů nebo N-karbamoylových derivátů aminokyselin může být provedena přidáním enzymu v následujících formách:
a) přidá se enzym obsažený v živých buňkách;
b) přidá se enzym obsažený v lyofilizovaných buňkách;
c) přidá se enzym obsažený v toluenizovaných buňkách;
d) přidá se enzym obsažený v prášku, získaném působením na buňky acetonem, odstraněním acetonu, vysušením a homogenizací zbytku;
e) přidá se enzym obsažený v surovém nebo přečištěném buněčném extraktu;
к reakční směsi.
Dalšího technického a ekonomického zlepšení může být dosaženo imobilizací enzymů kombinací s makromolekulárními sloučeninami tvorbou chemických vazeb se strukturou makromolekulám! látky nebo vazeb iontového typu; rovněž může být použito fyzikální imobilizace.
Způsob podle vynálezu bude v následující části popisu blíže objasněn formou příkladů provedení.
Příklad 1
Připraví se živné prostředí, které má následující složení:
masový pepton 5g masový extrakt 3g glukóza 5g destilovaná voda 1000 ml.
pH takto připraveného živného prostředí se nastaví na hodnotu 7,2 přídavkem uhličitanu sodného, načež se živné prostředí rozdělí na 100' ml podíly, které se nalijí do
500 ml baněk.
,Po 30minutové sterilizaci při teplotě 110° Celsia se obsah baněk naočkuje kulturou kmene č. 1302 z šikmého živného média, tvořeného výše uvedeným živným prostředím s 2 %: agaru (DIFCO), které bylo inkubováno po dobu 24 hodin při teplotě 30 °C při orbitálním míchání (220 otáček za minutu).
Z této primární kultury se odebere vždy 1 ml a toto množství se převede do jednotlivých 500 ml baněk, obsahujících po 100 mililitrech výše uvedeného živného prostředí. Naočkované kultury se potom inkubují při. teplotě 30 °C po dobu 24 hodin za orbitálního míchání (220 otázek za minutu).
Buňky se potom izolují, promyjí ve fysiologickém roztoku a suspendují ve 100 ml pyrofosforečnanového pufru (0,1 m; pH 7,7), obsahujícího 10 g D,L-5-fenylhydantoinu, při teplotě 40 °C a pod dusíkovou atmosférou.
Po 200hodinové inkubaci za výše uvedených podmínek se dosáhne úplné hydrolýzy D,L-5-fenylhydantoinu na aminokyselinu (D-fenylglycin), což je prokázáno jednak polarimetrickou analýzou reakční směsi a jednak chromatografii reakční směsi na tenké vrstvě metodou popsanou Suzukim v J. Chromatography, 80 (1973), 199—204.
Získaná aminokyselina se izoluje z reakční směsi po vysrážení proteinů kyselinou trichloroctovou a jejich odstranění odstředěním upravením hodnoty pH na hodnoty isoelektrického bodu (5, 8).
Vylučená sraženina se promyje vodou a vysuší za vakua.
Identita získaného D( —)fenylglycinu byla potvrzena infračerveným spektrem a nukleárním magnetickorezonančním spektrem.
Bylo stanoveno, že získaná aminokyselina má [,«]d25 = —154° (1% roztok v IN HCI); v literatuře je pro odpovídající čistou aminokyselinu uváděna hodnota specifické optické otáčivosti —157,8°.
Příklad 2
Buňky připravené stejným způsobem jako v příkladu 1 a obsažené ve 100 ml živného prostředí se suspendují v 10 ml pyrofosforečnanového pufru (0,1 M; pH 7,7) a takto získaná suspenze se podrobí působení ultrazvuku po dobu 10 minut při teplotě 5 °C. Rezultující směs se potom přidá к 500 ml roztoku D,L-N-karbamoylfenylglycinu (obsahujícího 20 mM uvedeného glycinu) v pyrofosforečnanovém pufru (0,1 M; pH 7,7) a získaná směs se inkubuje při teplotě 65 °C.
Kinetika probíhající reakce se přitom sleduje měřením množství amoniaku uvolněného během hydrolýzy N-karbamoylového zbytku fenolchlornanovou metodou.
Po 40hodinové inkubaci dosáhla koncentrace NH4+-ion,tu hodnoty 10 mmolů na litr a během následující doby již nebylo zaznamenáno další zvýšení uvedené hodnoty.
Reakční směs se potom zahustí za vakua na konečný objem 100 ml.
Po nastavení hodnoty pH zahuštěné reakční směsi na 5,8 koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou se vyloučí sraženina, která se izoluje filtrací.
Takto získaná sraženina se potom rozpustí v IN kyselině chlorovodíkové a opětovně vysráží přidáním hydroxidu sodného к dosažení hodnoty pH 5,8.
Po vysušení sraženiny byla stanovena specifická optická otáčivost získaného produktu: —153°. Identita získané aminokyseliny byla potvrzena infračerveným spektrem.
Z filtrátu se opatrným nastavením pH na hodnotu 2,5 přidáním 3N kyseliny chlorovodíkové na ledové lázni vyloučí sraženina, která se vysuší к suchu a extrahuje vroucím absolutním ethanolem. Po ochlazení získaného alkoholického roztoku se vyloučí krystalická sraženina, která se vysuší a zkoumá chromatografii na tenké vrstvě a stanovením infračerveného· spektra.
Obě tyto analýzy potvrzují přítomnost chemičky čistého N-karbamoylfenylglycinu.
Pro tento produkt byla stanovena specifická optická otáčivost [a]D 25 = +134° (lý/o roztok v IN roztoku hydroxidu draselného), zatímco pro odpovídající L-enantiomer se v literatuře uvádí hodnota 4-137°
Příklad 3
Z primární (kultury připravené v příkladu 1 se naočkuje pět 100 ml podílů živného prostředí, tvořeného pouze 5% roztokem kukuřičného výluhu s hodnotou pH 7,8 (této hodnoty pH se dosáhne přidáním Na-OH) a sterilizovaného při teplotě 121 °C po dobu 30 minut. Uvedené 100 ml podíly živného prostředí jsou obsaženy v 500 ml baňkách.
Kultura se potom inkubuje po dobu 24 hodin při teplotě 30 °C za orbitálního míchání (220 otáček za minutu). Buňky izolované odstředěním se promyjí pyrofosforečnanovým pufrem (0,1 M; pH 7,7), načež se suspendují ve 100 ml téhož pufru, obsahujícího 10 g 5-parahydroxy-D,L-fenylhydantoinu; získaná suspenze se inkubuje po dobu 160 hodin při teplotě 40 CC pod atmosférou dusíku.
Po uplynutí uvedené doby je dosaženo úplné hydrolýzy výše uvedeného hydantoinu na odpovídající aminokyselinu [parahydroxyfenylglycin konfigurace D( —)]; konec hydrolýzy byl prokázán jak polarimetrickým testem, tak i chromatografii na tenké vrstvě vzorků reakční směsi metodou popsanou Suzukim v J. of Chromatography, 80 (1973) 199 — 204.
Získaná aminokyselina se potom izoluje z reakční směsi po vysrážení proteinů kyselinou trichloroctovou a po jejich odstranění odstředěním upravením hodnoty pH kapalného zbytku na 'hodnotu isoelektrického bodu (5,2). Oddělená sraženina se promyje vodou a vysuší za vakua.
Identita získané aminokyseliny byla potvrzena infračerveným spektrem a nukleárním magneticko-rezonančním spektrem. Byla stanovena specifická optická otáčivost finální aminokyseliny: [a]D 25 = —156,5° (1% roztok v IN kyselině chlorovodíkové).
Pro · tutéž čistou aminokyselinu se v literatuře uvádí hodnota —161,2°.
Příklad 4
Použije se buněk kmene Agrobacterium sp., získaných kultivací na 100 ml živného· prostředí na bázi kukuřičného výluhu způsobem popsaným· v příkladu 1.
Promyté buňky se potom suspendují v 10 mililitrech pyrofosforečnanového pufru (0,1 M; pH 7,7) a rezultující suspenze se podrobí toluenizaci po dobu 15 minut při teplotě okolí.
Toluenizovaná suspenze se přidá k 500 ml roztoku 20 mM N-karbamoyl-D,L-pariSihydroxyfenylglycinu v pyrofosforečnanovém pufru (0,1 M; pH 7,7) a rezultující směs se potom inkubuje při teplotě 65 °C pod dusíkovou atmosférou.
Kinetika probíhající reakce se sleduje měřením množství amoniaku uvolněného během hydrolýzy N-karbamoylového derivátu, fenolchlornanovou metodou, jak to· již bylo uvedeno v příkladu 1.
Po 18 hodinách inkubace dosáhne koncentrace iontů NH4+ hodnoty 10 mmolů na litr a během další doby se tato hodnota již nezvyšuje.
V tomto okamžiku se reakční směs zahustí za vakua při teplotě 50 °C na finální objem 100 ml. Po nastavení pH tohoto objemu na hodnotu 5,2 koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou dojde k vyloučení sraženiny, která se izoluje filtrací.
D-Aminokyselina a N-karbamoylový derivát konfigurace L se izolují postupy, které jsou již popsány v příkladu provedení 2. Specifická · optická otáčivost aminokyseliny je · —157,2° a specifická otáčivost N-karbamoylového derivátu je -|—171°; pro tutéž čistou aminokyselinu se v literatuře uvádí hodnota —161,2° a pro tentýž N-karbamoylový derivát se uvádí hodnota --175,4°.
Příklad 5
Připraví se buňky Agrobacterium sp. způsobem popsaným v · příkladu provedení 1. Několik griamů vlhké buněčné kaše se suspenduje v pyrofosforečnanovém pufru (0,1 M; pH 7,7) a rezultující suspenze se podrobí působení acetonu za chladu.
Po odstranění acetonu filtrací se takto získaný acetonový preparát vysuší za vakua do konstantní hmotnosti při teplotě 35 °C.
Vysušená látka· se potom homogenizuje v moždíři a takto získaný prášek se potom použije pro testy enzymatické účinnosti.
Získaný prášek se vyzkouší za použití následujících substrátů:
N-karbamoyl-D- (— ]-alanin, N-karbamoyl-D- (—) -valine, N-karbamoyl-D- ( — )-glutamová kyselina, N-karbamoyl-D- (—) -parahy droxyfenylglycin,
N-karbamoyl-D- (—) -paramethoxyfenylglycin,
N-karbamoyl-D- (—) -f enylglycin, N-karbamoyl-L- (--) -f enylglycin, N-karbamoyl-D- (—) -f enylalanin, N-karbamoyl-L-(--)-glutamová kyselina a N-karbamoyl-D- ( — ) - (2-thienyl) -glycin.
Připraví se roztok každého z uvedených N-karbaimoylových derivátů v· pyrofosfoirečnainovém pufru (0,1 M; pH 7,7) a ik 10 ml tohoto roztoku, obsahujícího 20 mM uvedeného derivátu, se potom přidá adekvátní množství výše uvedeným způsobem· získaného acetonového prášku, které je stejné pro všechny substráty.
Inkubace se provádí pod dusíkovou atmosférou za míchání a při teplotě 40 °C. Po· jednohodinové inkubaci se změří množství produkované aminokyseliny stanovením koncentrace · iontů NH4+ v reakční směsi feinol-chlioirnainovou metodou, jak to' již bylo uvedeno v příkladu provedení 2.
Bylo1 zjištěno, že nejvyšší účinnost má uvedený kairbamolytický enzym pro substrát tvořený N-karbamoyl-D- (—) -parahydroxyfenylglycinem.
Získané výsledky jsou shrnuty v následující tabulce, ve které je účinnost u jednotlivých derivátů vyjádřená v procentech účinnosti pro N-kairbamoyl-D-( — )-parahydroxyfe-nylglycin · [účinnost pro N-kairbamoyl-D-(—-)-pairahy;droxyfenylglycin = 100 %].
TABULKA
Substrát Účinnost (% )
N-karbarnoyl-D- -( — j-alanin 557,5
N-karbamioyl-D- -( — 34,25
Kyselina N-kairbamoyl-D- - ( — ) -glutiamová 21,7
Kyselina N-karbamoyl-L- -( + )-glutamová 0
N-karbamoyl-D- ( — ) -parahydroixyfenylglycin 100,0
N-karbarnoyl-D- (—) -paramethioxyf enylglycin· 40,0
N-karbamoy.l-D- ( — ) - -fenylglycin 81^5
N-karbamoyl-L- ( + ) -fenylglycin 0
N-karbamoyl-D- ( — ) -2-thienylglycin 40,7
N-karbamoyl-D- () -feny lalanin 50,0
Příklad 6
Připraví se živné prostředí následujícího
složení:
MgSO4.7 HžO 0,2 g
NazHPOí. 12 H2O 6 g
KH2PO4 3 g
NH4C1 2 g
NaCl 0,5 g
Glycerin 5 g
5-fenyl-D,L-hydantoin 2 g
kvasničný extrakt 0,1 g
Destilovaná voda 1000 ml.
Toto živné prostředí se rozdělí ve 100 ml podílech do 500 ml baněk, ve kterých se sterilizuje po· dobu 30 minut při teplotě 116° Celsia. Hydan-toin byl sterilizován filtrací.
Každý ze 100 ml podílu se potom naočkuje 5 ml primární kultury, připravené způsobem, uvedeným v příkladě provedení 1. Takto naočkované kultury se potom inkubují při teplotě 30 cC po dobu 36 hodin za orbitálního míchání (220 otáček za minutu).
Buňky se potom izolují odstředěním, načež se získaná, aminokyselina izoluje ze supernatantu po odstředění nastavením hodnoty pH supernatantu na hodnotu isoelektrického bodu.
Z 10 litrů takto zpracované buněčné kaše se zísiká 11,2 g D-( —)-fenylglycinu se specifickou optickou otáčivostí [ůj]d 25 = —156° (1% roztok v IN kyselině chlorovodíkové).
Pro tutéž čistou aminokyselinu se v literatuře uvádí hodnota specifické optické otáčí v-osti —157,8°.
P r í к 1 a d 7
MgSO4.7 H2O 0,2 g
NaaHPOt. 12 H2O 6 g
KH2PO4 3 g
5-methylhydantoin 2 g
NaCl 0,5 g
Glukóza 1 g
Kvasničný extrakt 0,1 g
Destilovaná voda 1000 ml
PH 7,1
Toto živné prostředí, distribuované po 100 mililitrových podílech do 50-0 ml baněk, se sterilizuje při teplotě 116 °C po) dobu 20 minut. Methylhydantoin byl sterilizován separátně.
Každý 100 ml podíl uvedeného živného prostředí se potom naočkuje 5 ml primární kultury, připravené postupem popsaným v příkladu provedení 1, a; naočkované kultury se potom inkubují při teplotě 30 °C po dobu 24 hodin za orbitálního míchání (220 otáček za minutu).
Buněčná kaše, izolovaná od 1000 ml živného prostředí, se promyje fosfátovým pufrem (pH 7,5) a resuspenduje ve 100 ml téhož pufru, obsahujícího 4 g DL-5-(2-thienyl)hydantoinu.
Reakční směs se potom inkubuje při teplotě 40 °C pod dusíkovou atmosférou. Po 30 hodinách se dosáhne úplné hydrolýzy hydantoinu na odpovídající aminokyselinu D-[ — )-(2-thienylglycin). Tato aminokyselina se izoluje zahuštěním reakční směsi na finální objem 20 ml a nastavením pH zbytku na hodnotu 5,6. Oddělená sraženina se vysuší za vakua!. Identita- této, aminoikyseiiiny byla potvrzena infračerveným sp-ektrem a nukleárním magneticko-rezonančním spektrern. Získaná aminokyselina má specifickou optickou otáčivost [α]υ 25 = —72,6°, zatímco pro tutéž čistou aminokyselinu se v literatuře uvádí hodnota —73,7°.
Připraví se živné prostředí následujícího složení:

Claims (1)

  1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU
    Způsob -mikrobiologické enzymatické výroby D-aminokyselin z racemických směsí jejich N-karbamoyloiVých derivátů nebo z odpovídajících hydantoinů, vyznačený tím, že se na uvedené výchozí látky působí en zymatickým komplexem získaným z miK-roor g ani srnu Agr o b ac t e.r iu m R h izobi acea e NRRL В 11291 při teplotě 35 -až 65 CC a pH 6 až 8.
CS793538A 1978-05-23 1979-05-23 Method of microbiological enzymatic production of d-aminoacids CS211400B2 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IT23679/78A IT1109506B (it) 1978-05-23 1978-05-23 Processo enzimatico-microbiologico per la produzione di amminoacidi otticamente attivi a partire da idantoine e/o carbamil-derivati racemi

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CS211400B2 true CS211400B2 (en) 1982-02-26

Family

ID=11209095

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS793538A CS211400B2 (en) 1978-05-23 1979-05-23 Method of microbiological enzymatic production of d-aminoacids

Country Status (25)

Country Link
US (1) US4312948A (cs)
JP (1) JPS5511569A (cs)
AR (1) AR225284A1 (cs)
AT (1) AT367023B (cs)
AU (1) AU530574B2 (cs)
BE (1) BE876408A (cs)
CA (1) CA1122552A (cs)
CH (1) CH639695A5 (cs)
CS (1) CS211400B2 (cs)
DD (1) DD143767A5 (cs)
DE (1) DE2920963C2 (cs)
DK (1) DK153953C (cs)
ES (1) ES481269A1 (cs)
FI (1) FI66021C (cs)
FR (2) FR2431536A1 (cs)
GB (1) GB2022581B (cs)
HU (1) HU181494B (cs)
IE (1) IE49297B1 (cs)
IL (1) IL57276A (cs)
IT (1) IT1109506B (cs)
LU (1) LU81297A1 (cs)
NL (1) NL192118C (cs)
NO (1) NO151899C (cs)
SE (1) SE436755B (cs)
ZA (1) ZA792366B (cs)

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL70022A0 (en) * 1982-11-08 1984-01-31 Standard Oil Co Method for introducing foreign genes into green algae cells utilizing t-dna of agrobacterium
IT1209495B (it) * 1984-02-02 1989-08-30 A San Donato Milanese Milano Procedimento per la preparazione di l-alfa-amminoacidi.
DK164923C (da) * 1984-04-11 1993-01-25 Denki Kagaku Kogyo Kk Fremgangsmaade til fremstilling af l-alfa-aminosyrer
JPS6172762A (ja) * 1984-09-17 1986-04-14 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd 光学活性ヒダントイン類の製造法
JPS63133631U (cs) * 1987-02-23 1988-09-01
FR2620731B1 (fr) * 1987-09-21 1990-03-23 Hoechst France Nouveau systeme enzymatique, son procede de preparation et son application notamment dans la preparation de la d-parahydroxyphenylglycine
DE3918057C1 (cs) * 1989-06-02 1990-05-03 Degussa Ag, 6000 Frankfurt, De
SG84486A1 (en) * 1990-12-07 2001-11-20 Kanegafuchi Chemical Ind Process for production of d--g(a)-amino acids
US5824522A (en) * 1990-12-07 1998-10-20 Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha Recombinant decarbamylases for producing D-α-amino acids
ES2121001T3 (es) * 1990-12-07 1998-11-16 Kanegafuchi Chemical Ind Procedimiento de produccion de d-alfa aminoacidos.
WO1992022643A1 (en) * 1991-06-12 1992-12-23 Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha IMMOBILIZED ENZYME PREPARATION AND PRODUCTION OF D-α-AMINO ACID
ES2042409B1 (es) * 1992-04-10 1994-06-01 Control & Gestion Instr Procedimiento para la preparacion de d-aminoacidos o derivados de d-aminoacidos.
EP0650525B1 (en) * 1992-06-30 2004-05-19 SmithKline Beecham plc D-n-carbamoyl-amino acid amidohydrolase and hydantoinase
KR100293585B1 (ko) * 1992-10-05 2001-09-17 후루타 다케시 D-알파-아미노산의제조방법
US5330008A (en) * 1992-12-02 1994-07-19 Trustees Of The University Of Pennsylvania Protective covering for a horse's hoof and method of attaching
IT1274167B (it) * 1994-04-15 1997-07-15 Eniricerche Spa Procedimento per la produzione di d- -amminoacidi
US5962279A (en) * 1994-06-24 1999-10-05 Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha Process for producing D-amino acids with composite immobilized enzyme preparation
US5707836A (en) * 1995-03-10 1998-01-13 Nitto Chemical Industry Co., Ltd. Production of alkylene or phenylenediamine disuccinic acid from fumaric acid and a diamine using lyase from microbes
IT1276163B1 (it) 1995-11-23 1997-10-27 Eniricerche Spa Procedimento migliorato per la preparazione di d-alfa-amminoacidi
IT1277125B1 (it) * 1995-12-21 1997-11-04 Eniricerche Spa Mutanti termostabili della d-n-alfa-carbamilasi
JP5096911B2 (ja) 2005-01-31 2012-12-12 株式会社カネカ ５−置換ヒダントインラセマーゼ、これをコードするｄｎａ、組換えｄｎａ、形質転換された細胞、および、光学活性ｎ−カルバミルアミノ酸または光学活性アミノ酸の製造方法
WO2007040272A1 (ja) * 2005-10-06 2007-04-12 Kaneka Corporation Ｄ－（４－アミノメチル）フェニルアラニン誘導体の製造法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4065353A (en) * 1975-05-12 1977-12-27 Snamprogetti, S.P.A. Method for the preparation of D-carbamyl aminoacids and the corresponding D-aminoacids
IT1039757B (it) * 1975-07-10 1979-12-10 Snam Progetti Complessi enzimatici atti a trasformare idantoine raceme in am minoacidi otticamente attivi e loro applicazione
JPS52125692A (en) * 1976-02-04 1977-10-21 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd Preparation of l-methionine
US4094741A (en) * 1976-02-04 1978-06-13 Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha Process for preparing D-(-)-N-carbamoyl-2-(phenyl or substituted phenyl)glycines
JPS5391189A (en) * 1976-12-30 1978-08-10 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd Preparation of d-n-carbamoyl-alpha-amino acids
US4211840A (en) * 1977-06-08 1980-07-08 Ajinomoto Company, Incorporated Method for producing D-α-amino acid
CH628009A5 (de) * 1977-07-26 1982-02-15 Hoffmann La Roche Verfahren zur herstellung von optisch aktiven alpha-hydroxycarbonsaeuren.

Also Published As

Publication number Publication date
AU530574B2 (en) 1983-07-21
FR2438087A1 (fr) 1980-04-30
NL7904097A (nl) 1979-11-27
SE436755B (sv) 1985-01-21
DK153953B (da) 1988-09-26
HU181494B (en) 1983-07-28
IT1109506B (it) 1985-12-16
IT7823679A0 (it) 1978-05-23
JPS6320520B2 (cs) 1988-04-27
SE7904548L (sv) 1979-11-24
FR2438087B1 (cs) 1983-07-29
JPS5511569A (en) 1980-01-26
FI66021B (fi) 1984-04-30
ATA375879A (de) 1981-10-15
DK153953C (da) 1989-02-06
IL57276A (en) 1982-03-31
NO791662L (no) 1979-11-26
FR2431536B1 (cs) 1983-07-18
AR225284A1 (es) 1982-03-15
IE49297B1 (en) 1985-09-18
DE2920963C2 (de) 1982-12-16
ZA792366B (en) 1980-05-28
NL192118B (nl) 1996-10-01
LU81297A1 (fr) 1979-09-11
GB2022581A (en) 1979-12-19
FR2431536A1 (fr) 1980-02-15
ES481269A1 (es) 1980-02-16
DE2920963A1 (de) 1979-11-29
DD143767A5 (de) 1980-09-10
NL192118C (nl) 1997-02-04
NO151899B (no) 1985-03-18
NO151899C (no) 1985-06-26
BE876408A (fr) 1979-11-21
CA1122552A (en) 1982-04-27
AU4711879A (en) 1979-11-29
FI791624A (fi) 1979-11-24
AT367023B (de) 1982-05-25
IE790984L (en) 1979-11-23
DK198379A (da) 1979-11-24
IL57276A0 (en) 1979-09-30
CH639695A5 (it) 1983-11-30
US4312948A (en) 1982-01-26
FI66021C (fi) 1984-08-10
GB2022581B (en) 1982-10-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CS211400B2 (en) Method of microbiological enzymatic production of d-aminoacids
US4774179A (en) Process for preparing a 7-aminocephalosporanic acid compound
IL34956A (en) Production of lipase
US4226941A (en) Process for the optical resolution of d,l-2-amino-4-methylphosphinobutyric acid
NO147570B (no) Fremgangsmaate for fremstilling av d-fenylglycin ved enzymatisk omdannelse av d,l-fenylhydantoin
FI70924B (fi) Foerfarande foer framstaellning av enzymen kolesteras
HU181488B (en) Process for the hydrolysis of racemic hydantoins into optically active n-carbamoyl-aminoacid derivatives and for preparing the hydrolyzing enzymatic complex
US4357425A (en) Process for producing L-amino acid oxidase
Sakai et al. Formation of β-cyanoalanine by cyanide-resistant strain Enterobacter sp. 10-1
US4011135A (en) Production of L(+)-tartaric acid
JPH01320991A (ja) Ｄ−ホモフエニルアラニン類の製造方法
JPH0148758B2 (cs)
JP2712331B2 (ja) アシルアミノ酸ラセマーゼ、その製造法および用途
JPS6319158B2 (cs)
CN1089807C (zh) 生产l－天冬氨酸的方法
JP2899071B2 (ja) Ｌ―α―アラニンの製造法
SU884576A3 (ru) Способ получени д-фенилглицина и его производных
JPH0438399B2 (cs)
Plháčková et al. Enzymic synthesis of L-Lysine from DL-α-Amino-ε-caprolactam by new microbial strains
JPS61108393A (ja) ピロガロ−ルの製造法
DK148360B (da) Fremgangsmaade til fremstilling af uricase
JPH0391478A (ja) コラーゲン分解酵素の製造方法
JPH08275776A (ja) 新規キチナーゼ及びその製造方法
CS219266B2 (en) Method of preparation of the glucosoizomeraze
JPH04325096A (ja) （Ｒ）−２−ハロプロピオン酸および（Ｒ）−２−ハロ−ｎ−酪酸の製造法