DE19653730A1

DE19653730A1 - Immobilisierte Proteine aus Rohextrakt und deren Verwendung zur Umsetzung von Estern

Info

Publication number: DE19653730A1
Application number: DE19653730A
Authority: DE
Inventors: Mathias Reymann; Heidi Dr Hummel; Heiko Dr Karels
Original assignee: Schering AG
Current assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 1996-12-11
Filing date: 1996-12-11
Publication date: 1998-06-18
Anticipated expiration: 2016-12-12
Also published as: WO1998026055A1; CZ208799A3; AU729928B2; DE19653730C2; EP0948607A1; JP2001505772A; AU5661098A; HUP0000599A2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft immobilisierte Proteine aus Rohextrakt und deren Verwendung für die Fermentation in Bioreaktoren.

Bei biochemischen und biotechnologischen Verfahren laufen sehr häufig mehrere Reaktionen gleichzeitig ab, von denen in der Regel nur eine das gewünschte Produkt liefert.

Alle dabei ablaufenden Reaktionen werden als Simultanreaktionen bezeichnet (z. B. Folge- und Parallelreaktionen).

In der Produktion, die im technischen Maßstab erfolgt, kommt es darauf an, eine möglichst hohe Ausbeute an Endprodukten bei gleichzeitig hoher Reinheit und geringen Kosten zu erhalten.

Wichtige Enzyme, die bei biochemischen bzw. biotechnologischen Umsetzungen in Fermentern bzw. Bioreaktoren zur Anwendung kommen, sind Esterasen.

Carboxylesterasen sind in der Natur sehr weit verbreitet. Sie katalysieren die Hydrolyse von Carbonsäureestern zu freien Säureanionen und Alkoholen.

Es ist bereits ein Verfahren zur Herstellung von Benzodicarbonsäuremonomeren und deren Derivaten unter Verwendung von Schweineleber-Carboxyesterase bekannt (JP 2-199616).

Es ist ferner bekannt, daß für die Fermentation geeignete Enzyme immobilisiert werden können.

Die Immobilisierung wird jedoch immer mit den isolierten und gereinigten Enzymen durchgeführt.

Es wäre deshalb wünschenswert, für eine Fermentation eine Immobilisierung der Enzyme derart durchzuführen, daß die Enzyme vorher weder isoliert noch gereinigt werden müssen, was Kosten einspart und was zu erheblich weniger Aktivitätsver lusten und damit zu einer besseren Ausbeute an Produkten führt.

Es wurde nun gefunden, daß Esterasen direkt aus dem Rohextrakt von Geweben und Zellen von Tieren oder Pflanzen ohne vorherige Isolierung und Reinigung durch Anbindung an Harze immobilisiert werden können.

Geeignete Harze hierfür sind zum Beispiel Epoxidharze.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind deshalb an Harze kovalent gebundene und damit immobilisierte Esterasen aus Rohextrakten von tierischen oder pflanzlichen Zellen und tierischem oder pflanzlichem Gewebe.

Als besonders wertvoll hat sich Esterase aus Schweineleber-Rohextrakt erwiesen.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit insbesondere an Harze gebundene Esterase aus dem Rohextrakt der Schweineleber.

Ein hierfür geeignetes Harz ist zum Beispiel das Epoxidharz Eupergit C.

Die an Harze gebundene Esterase aus Schweineleber-Rohextrakt kann zur Spaltung von Carbonsäureestern zu freien Säureanionen und Alkoholen in Bioreaktoren mit hoher Ausbeute und hoher Aktivität verwendet werden.

Die erfindungsgemäße immobilisierte Esterase kann vorzugsweise zur Spaltung von Nitroisophthalsäuredimethylester (NIPA-DME) zu Nitroisophthalsäuremono methylester (NIPA-MME) verwendet werden, wobei die unerwünschte Reaktion zu Nitroisophthalsäure (NIPA) nicht stattfindet.

Ferner kann die erfindungsgemäße immobilisierte Esterase vorzugsweise zur Verseifung von 2-Fluor-Ara-adenin-triacetat zum 2-F-ara-Adenin (F-araA), einer Vorstufe von Fludara, verwendet werden.

Eine weitere vorzugsweise Verwendung der erfindungsgemäßen immobilisierten Esterase ist die Verwendung bei der Partialverseifung vom ReichsteinS-17,21- Diacetat zum ReichsteinS-17-Monoacetat.

Überraschend konnte mit der erfindungsgemäßen immobilisierten Esterase bei der Fermentation eine hohe Ausbeute an Endprodukt erzielt werden.

Dies war nicht vorhersehbar, da allgemein bekannt ist, daß man bei enzymatischen Reaktionen isolierte und gereinigte Enzyme verwendet um einen möglichst großen Umsatz bzw. große Ausbeute zu erzielen. Eine Verunreinigung des Enzyms gilt allgemein als aktivitätshemmend. Ferner ist allgemein davon auszugehen, daß weitere im Rohextrakt vorliegende Enzyme die Umsetzung stören oder sogar weitere enzymatische Reaktionen katalysieren.

Beschreibung der Abbildungen

Fig. 1 zeigt die SDS-Gelelektrophorese (12,5%iges Acrylamidgel) mit gereinigter Esterase aus Schweineleber und Schweineleberesterase aus dem Rohextrakt.

Es bedeuten:
1,7 Markerproteine (26,6 kd Triosephosphatisomerase, 55,56 kd Glutamatdehydrogenase)
2,3 gereinigte Schweineleberesterase
4-6, 8-9 Schweineleber-Rohextrakt in verschiedenen Verdünnungen

Fig. 2 zeigt den für die Fermentation benötigten Aufbau
In der Abbildung bedeuten:
PC = Computer
NH3 = wäßrige Ammoniaklösung
718Stat Titrino = Titrationsgerät
T = Temperatur, gemessen über Temperaturfühler

Fig. 3a zeigt den spezifischen Aktivitätsverlust des Immobilisats beim Langzeiteinsatz.

Fig. 3b zeigt den normierten Aktivitätsverlust des Immobilisats beim Langzeiteinsatz.

Die nachfolgenden Ausführungsbeispiele erläutern die Erfindung ohne diese auf die Beispiele zu beschränken.

Beispiel 1 Extraktion der Esterase aus Schweineleber

Frische Schweineleber wird mit Kaliumphosphat-Puffer bei pH 7,5 im Massen verhältnis 1 : 4 bei Raumtemperatur 3 Minuten in einem Homogenisator aufgeschlos sen. Das Homogenisat wird zentrifugiert. Der Überstand wird abdekantiert. Das Sediment wird verworfen. Die Menge an Überstand entspricht dem eingesetzten Puffer. Der so gewonnene Überstand ist der Schweineleberrohextrakt, der eine hohe katalytische Aktivität besitzt. Es wurden 66 mg Gesamtprotein/ ml Extrakt erhalten. Die Volumenaktivität der Esterase beträgt ca. 6,5 U/ ml, die spezifische Aktivität beträgt ca. 0,1 U/ mg.

Beispiel 2 Untersuchung der Esterase aus Schweineleber

Die Quartäre Struktur der Esterase aus Schweineleber ist in den meisten Fällen ein trimeres Protein mit drei identischen Untereinheiten und jeweils einem aktiven Zentrum mit einem Molekulargewicht von ca. 60 kd.

Bei der Gelelektrophorese darf deshalb nur eine Bande bei 60 kd auftreten. Zur Untersuchung der Esterase wurde deshalb ein Schweineleberextrakt, der wie im Beispiel 1 beschrieben hergestellt wurde, in verschiedenen Verdünnungen auf ein SDS-Gel neben käuflicher Schweineleberesterase und Markerproteinen aufgetragen. Das Ergebnis der Gelelektrophorese ist in der Fig. 1 dargestellt.

Beispiel 3 Herstellung der immobilisierten Esterase aus Schweineleber-Rohextrakt

Zu 10 ml des in Beispiel 1 erhaltenen Rohextraktes werden 1 g Eupergit C Harz gegeben und bei Raumtemperatur 72 Stunden langsam geschüttelt. Die an Eupergit C immobilisierte Rohextrakt-Esterase wird über eine Filternutsche von Schleim und Blut getrennt und dreimal mit jeweils 20 ml 0,1 M Kaliumphosphat-Puffer gewaschen. Die immobilisierte Rohextrakt-Esterase wird mit 0,1 M Kaliumphosphat-Puffer im Verhältnis 1 : 1 gelagert.

1 g Eupergit C bindet ca. 0,7 g Protein kovalent. Die Volumenaktivität der immobilisierten Esterase beträgt ca. 8,5 U/ g mit NIPA-DME als Substrat.

In analoger Verfahrensweise wird isolierte und gereinigte Schweineleberesterase zum Vergleich behandelt.

Beispiel 4 Durchführung der Fermentation im Reaktor

Die Immobilisate der Rohextrakte aus Beispiel 3 werden im Reaktor vorgelegt. Das Produkt kann ohne den Reaktor vollständig zu entleeren mit einem Filter abgesaugt werden. Anschließend kann der Reaktor wieder mit Substraten neu beschickt werden. Dieser Vorgang kann so lange wiederholt werden, bis das Enzym seine Aktivität verloren hat.

Es hat sich in der Praxis gezeigt, daß das Verfahren mehr als 100 mal ohne Aktivitätsverlust wiederholt werden kann.

4.1 Ergebnisse der Kinetikstudien am Immobilisat

Für das Immobilisat wurden Kinetikstudien mit 10 g/l und 50 g/l NIPA-DME Anfangskonzentration durchgeführt. Die kinetischen Untersuchungen zeigen, daß die Kinetikparameter für die Substrataffinität und der Inhibitionskonstante für Methanol der freien Esterase mit denen der immobilisierten Esterase übereinstimmen. Damit verhält sich das gebundene Enzym in seinen kinetischen Eigenschaften wie das freie Enzym.

Die spezifische Aktivität der feuchten immobilisierten Esterase beträgt ca. 8,5 U/g bzw. 0,51 mol Substrat/ Stunde und kg Immobilisat.

Die Gesamtaktivität des Immobilisats gegenüber der des eingesetzten Schweineleberextraktes ist durch den Immobilisierungsprozeß auf ca. 50% reduziert.

4.2 Langzeitstabilitätsuntersuchung der immobilisierten Esterase an Eupergit

Entscheidend für den Einsatz des Immobilisates im technischen Maßstab ist die Stabilität des immobilisierten Enzyms beim mehrmaligen Einsatz.

Zur Immobilisierung wurde die Leber im Verhältnis 1 : 4 mit 1 M Phosphatpuffer (pH 7,5) aufgeschlossen.

Auf 500 ml Schweineleberrohextrakt mit einer spezifischen Aktivität von 6,5 U/ml und einer Gesamtaktivität von 3250 U wurden 50 g Eupergit eingesetzt und 80 h bei 25°C geschüttelt. Nach dem Abtrennen des Eupergits vom Extrakt wurde eine spezifische Aktivität des Immobilisats von 35,75 U/g, bezogen auf das Trockengewicht, festgestellt. Dies entspricht einer Gesamtaktivität von 1787,5 U und einem Aktivitätsverlust durch die Immobilisierung von 45%. Das Immobilisat quillt während der Immobilisierung auf ca. den 4fachen Wert gegenüber der Trockenmasse (200 g). Da das Immobilisat im feuchten Zustand gelagert und eingesetzt wird, ist die Aktivität des Immobilisats für den gequollenen Zustand 8,94 U/ g, bezogen auf das Feuchtgewicht.

Mit diesem Immobilisat wurde eine Langzeitstudie durchgeführt, wobei der Einsatz von NIPA-DME pro Ansatz 10 g/ l betrug. Die Reaktion wurde bei 38°C und einem pH-Wert von 7,5 über einen Zeitraum von 24 Stunden durchgeführt. Dadurch erfolgte die Abtrennung des Immobilisats von der Lösung und der erneute Einsatz des Immobilisats. Die zeitliche Abnahme der spezifischen Aktivität und der normierten Aktivität des Enzyms ist in Fig. 3a und Fig. 3b dargestellt. Nach etwa 200 Betriebsstunden besitzt die immobilisierte Esterase aus dem Schweineleber-Rohextrakt noch 65% Restaktivität. Die Halbwertzeit des Immobilisats beträgt etwa 250 h und ist damit hervorragend für den technischen Einsatz im Fermenter geeignet. Bei einer Einsatzdauer von 500 h lassen sich bei 10%iger Beladung des Immobilisats mit 10 g/l NIPA-DME mindestens 100 Batches mit einer mittleren Reaktionszeit von 5 Stunden fahren.

Beispiel 5 Vergleich der Aktivität von isolierter und gereinigter Esterase mit Esterase aus Schweineleber-Rohextrakt im Fermentationsprozeß

Die Durchführung der kontrollierten Fermentation erfolgte in einem Biostat ED Fermenter gemäß der in Fig. 2 dargestellten Anordnung.

Der Vergleich wurde mit 10 g NIPA-DME/l durchgeführt.

Es wurde käufliche gereinigte Schweineleber-Esterase (103 U/ mg Protein) und Esterase aus Schweineleberrohextrakt in analoger Weise behandelt.

Es wurde zunächst jeweils die enzymatische Aktivität der ungebundenen Esterasen (gereinigt und aus Rohextrakt) untersucht.

Anschließend wurden die gereinigte Esterase und der Rohextrakt, der die ungereinigte Esterase enthält, gemäß Beispiel 3 mit Eupergit C umgesetzt.

5.1 Vergleich der Aktivitäten der ungebundenen Esterasen

Beim Vergleich der ungebundenen Schweineleber-Esterasen ergibt sich, daß für einen vergleichbaren Umsatz im Gegensatz zur gereinigten Esterase nur ca. 1/30 der Menge an immobilisiertem Rohextrakt verwendet werden muß. Hierbei entsprechen 2 g Proteinrohextrakt etwa 70 mg gereinigter käuflicher Esterase.

5.2 Vergleich der Aktivitäten der an Eupergit C gebundenen Esterasen

Beim Vergleich der an Eupergit C gebundenen Schweineleberesterasen ergibt sich, daß zur Erzielung vergleichbarer Resultate im Gegensatz zur gereinigten Esterase nur etwa 1/5 der Menge an immobilisiertem Rohextrakt aufgebracht werden muß. Hierbei entsprechen 4 g immobilisierter Rohextrakt etwa 0,75 g immobilisierter gereinigter Esterase.

Aus den Ergebnissen ist zu erkennen, daß das Immobilisat aus dem Rohextrakt der Schweineleber wesentlich aktiver ist, als das Immobilisat mit käuflicher Schweineleber-Esterase. Neben der wesentlich höheren Aktivität ist das Immobilisat aus dem Rohextrakt gegenüber dem Immobilisat aus gereinigter Esterase auch weitaus billiger in der Herstellung, da die vorgeschalteten aufwendigen Reinigungsverfahren entfallen.

Claims

1. An Harze kovalent gebundene nicht isolierte und gereinigte Esterasen aus Rohextrakten von tierischen oder pflanzlichen Zellen und tierischem oder pflanzlichem Gewebe zur Fermentation in Bioreaktoren.

2. An Harze gebundene Esterase gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Esterase aus dem Rohextrakt der Schweineleber gewonnen wird.

3. An Harze gebundene Esterase gemäß den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Harz ein Epoxidharz ist.

4. Verwendung der Esterasen gemäß den Ansprüchen 1-3 zur Spaltung von Carbonsäureestern zu freien Säureanionen und Alkoholen.

5. Verwendung der Esterasen gemäß den Ansprüchen 1-3 zur Spaltung von Carbonsäureestern zu freien Säureanionen und Alkoholen in Bioreaktoren.

6. Verwendung der Esterasen gemäß den Ansprüchen 1-3 zur Spaltung von Nitroisophthalsäuredimethylester (NIPA-DME) zu Nitroisophthalsäuremono methylester (NIPA-MME).

7. Verwendung der Esterasen gemäß den Ansprüchen 1-3 zur Verseifung von 2-Fluoro-Ara-triacetat zum 2-F-ara-Adenin.

8. Verwendung der Esterasen gemäß den Ansprüchen 1-3 zur Partialverseifung von ReichsteinS-17,21-diacetat zu ReichsteinS-17- monoacetat.