CZ208799A3

CZ208799A3 - Imobilizované esterázy ze surového extraktu a jejich použití

Info

Publication number: CZ208799A3
Application number: CZ992087A
Authority: CZ
Inventors: Heidi Hummel; Mathias Reymann; Heiko Karels
Original assignee: Schering Aktiengesellschaft
Priority date: 1996-12-11
Filing date: 1997-12-10
Publication date: 1999-09-15
Also published as: WO1998026055A1; AU729928B2; DE19653730C2; EP0948607A1; JP2001505772A; DE19653730A1; AU5661098A; HUP0000599A2

Description

Tento vynález se týká imobilizoavých bílkovin ze surového extraktu a jejich použití pro fermentaci v bioreaktorech.

Dosavadní stav techniky

Při biochemických a biotechnologických postupech velmi často probíhá více reakcí, z nichž zpravidla jen jedna poskytuje požadovaný produkt. Všechny při tom probíhající reakce se označují jako reakce simultánní (například reakce následné a paralelní). Při výrobě, která probíhá v technickém měřítku, jde o to, získat co nejvyšsí výtěžek konečných produktů při současné vysoké čistotě a při nízkých nákladech.

Důležitými enzymy, které se používají při biochemických, případně biotechnologických reakcích, ve fermentorech nebo bioreaktorech, jsou esterázy.

Karboxylesterázy jsou v přírodě velmi široce rozšířené. Katalyzují hydrolýzu esterů karboxylových kyselin na volné anionty kyselin a na alkoholy.

Již je znám způsob výroby monomerů kyseliny benzodikarboxylové a jejich derivátů za použití karboxyesterázy z vepřových jater (JP 2-199616).

• · • · · ·

Dále je známo, že se enzymy, vhodné pro fermentaci, mohou imobilizovat.

Imobilizace se však provádí vždy s izolovanými a vyčištěnými enzymy.

Proto by bylo žádoucí, provádět imobilizaci enzymů pro fermentaci tak, aby se enzymy nemusely předem ani izolovat ani čistit, což šetří náklady a což vede ke značně nižším ztrátám aktivity a tím k vyšším výtěžkům produktů.

Podstata vynálezu

Nyní bylo zjištěno, že se esterázy mohou imobilizovat vazbou na pryskyřice přímo ze surového extraktu bez předchozí izolace a bez předchozího čištění.

Vhodnými pryskyřicemi k tomu jsou například epoxidové pryskyřice.

Předmětem předloženého vynálezu jsou tedy esterázy ze surových extraktů zvířecích nebo rostlinných buněk a ze zvířecích nebo rostlinných tkání, kovalentně vázané na pryskyřice a tím imobilizované.

Jako zvláště cenná se ukázala esteráza ze surového extraktu z vepřových jater.

K tomu vhodnou pryskyřicí je například epoxidová pryskyřice Eupergit C.

• · · * ··· ···· ·· · · ···· · ·· · • · · · · ·· ·· ··· ··· ······· · · ····· · · ·· ·· ··

Esteráza ze surového extraktu z vepřových jater, vázaná na pryskyřici, se může použít s vysokým výtěžkem a s vysokou aktivitou ke štěpení esterů karboxylových kyselin v bioreaktorech na volné anionty kyselin a na alkoholy.

Imobilizovaná esteráza podle vynálezu se může použít výhodně pro štěpení dimethylesteru kyseliny nitroisoftalové (NIPA-DME) na monomethylester kyseliny nitroisoftalové (NIPA-MME), přičemž nedochází k nežádoucí reakci na kyselinu nitroisoftalovou (NIPA).

Dále se imobilizovaná esteráza podle vynálezu může výhodně použít ke zmýdelnění 2-fluor-Ara-adenintriacetátu na 2-fluor-Ara-adenin (F-araA), což je předstupeň pro fludara.

Dalším výhodným použitím imobilizované esterázy je použití při částečném zmýdelnění reichsteinS-17,21-diacetátu na reichtseinS-17-monoacetát.

Pomocí imobilizovaných estráz podle vynálezu mohou překvapivě při fermentaci docílit vysoké výtěžky konečného produktu.

To nebylo předvídatelné, protože je obecně známo, že se při enzymetických reakcích používají isolované a vyčištěné enzymy proto, aby se docílila co největší konverse, případně aby se dosáhlo vysokých výtěžků. Znečištění enzymu se obecně považuje za příčinu snížení aktivity. Dále se musí vycházet z toho, že další enzymy, přítomné v surovém extraktu reakci ruší, nebo dokonce katalyzují další enzymatické reakce.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 ukazuje SDS gelovou elektroforézu (12,5% akrylamidový gel) s čištěnou esterázou z vepřových jater a esterázy ze surového extraktu z vepřových j ater.

Zde značí:

1,7 značkovací bílkoviny (26,6 kd triosefosfátisomeráza, 55,56 kd glutamatdehydrogenáza)

2,3 čištěná esteráza z vepřových jater

4-6, 8-9 surový extrakt z vepřových jater v různých ředěních

Obrázek 2 ukazuje sestavu, potřebnou pro fermentaci. Na obrázku značí:

PC = počítač

NHj = vodný roztok amoniaku

718Stat Titrino = titrační přístroj

T = teplota, měřená teplotním čidlem

Obrázek 3a ukazuje specifickou ztrátu aktivity imobilizátu při dlouhodobém použití

Obrázek 3b ukazuje normovanou ztrátu aktivity imobilizátu při dlouhodobém použití

Dále uvedené příklady provedení vynález vysvětlují, aniž by jej omezovaly na tyto příklady.

···· · · · ···· • · · · · · · · · ·· ·

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Extrakce esterázy z vepřových jater

Čerstvá vepřová játra se vyluhovala v homogenizátoru pufrem z fosforečnanu draselného při pH 7,5 v hmotnostním poměru 1:4 při teplotě místnosti. Homogenizovaná hmota se odstředila. Vzplývající kapalina se dekantovala. Sediment se zahodil. Množství vzplývající kapaliny odpovídalo použitému pufru. Takto získaná vzplývající kapalina je surovým extraktem z vepřových jater, který má vysokou katalytickou aktivitu. Získalo se 66 mg/ml celkových bílkovin v extraktu. Objemová aktivita esterázy činila asi 6,5 U/ml, specifická aktivita činila asi 0,1 U/ml.

Příklad 2

Zkoušení esterázy z vepřových jater

Kvartérní strukturou esterázy z vepřových jater je ve většině případů triraerní protein se třemi totožným podjednotkami a s jedním aktivním centrem s molekulovou hmotností asi 60 kd. Při elektroforéze na gelu proto smí vzniknout jen jeden pás okolo 60 kd. Pro zkoumání esterázy se proto nanášel na gel SDS extrakt z vepřových jater, získaný postupem popsaným v příkladu 1, v různých zředěních vedle komerčně dostupné esterázy z vepřových jater a vedle značkovacích bílkovin.

Výsledek elektroforézy na gelu je znázorněn na obrázku

1.

Příklad 3

Výroba zmobilizované esterázy ze surového extraktu z vepřových jater.

K 10 ml surového extraktu, získaného postupem podle příkladu 1, se přidal 1 g pryskyřice Eupergit C a vše se při teplotě místnosti pomalu protřepávalo po dobu 72 hodin. Esteráza ze surového extraktu, imobilizovaná na Eupergitu C, se pomocí filtrační nuče oddělila od slizu a krve a třikrát se promyla vždy 20 ml pufru 0,1 M fosforečnanu draselného. Imobilizovaná esteráza ze surového extraktu se skladovala v poměru 1:1 v pufru s 0,1 M fosforečnanu draselného.

g Eupergitu C kovalentně váže asi 0,7 g proteinu. Objemová aktivita imobilizované esterázy činila asi 8,5 U/g s NIPA-DME jako substrátem.

Podobným postupem se pro srovnání zpracovala isolovaná a vyčištěná esteráza z vepřových jater.

Příklad 4

Provádění fermentace v reaktoru

Imobilizáty surového extraktu z příkladu 3 se vložily do reaktoru. Produkt se může bez úplného vyprázdnění reaktoru odsát přes filtr. Pak se může reaktor znovu nově naplnit substrátem. Tento pochod se může opakovat tak dlouho, až enzym ztratí svou aktivitu. V praxi se ukázalo, že se postup může opakovat více než stokrát bez ztráty aktivity.

Ί

4.1 Výsledky studií kinetiky na imobilizátu

Na imobilizátu se prováděly studie kinetiky při počáteční koncentraci 10 g/1 a 50 g/1 NIPA-DME. Zkoumání kinetiky ukázala, že parametry kinetiky pro afinitu substrá tu a inhibiční konstantu pro methanol volné esterázy souhla sí s údaji pro imobilizovanou esterázu. Tím se vázaný enzym svými kinetickými vlastnostmi chová jako volný enzym.

Specifická aktivita vlhké imobilizované esterázy činí asi 8,5 U/g, případně 0,51 mol substrát/hodina a kg imobili zátu.

Celková aktivita imobilizátu vůči použitému extraktu z vepřových jater se postupem imoblizace snížila na asi 50 %.

4.2 Zkoumání dlouhodobé stability imobilizované esterázy na Eupergitu.

Pro používání imobilizátu v technickém měřítku je rozhodující stabilita imobilizovaného enzymu pří vícenásobném použití.

Pro imobilizaci se játra vyluhovala v poměru 1:4 ÍM fosfátovým pufrem (pH 7,5).

Na 500 ml surového extraktu z vepřových jater se spéci fřekou aktivitou 6,5 U/ml a s celkovou aktivitou 3250 U se použilo 50 g Eupergitu a protřepávalo se po 80 hodin při teplotě 25 °C . Po oddělení Eupergitu od extraktu se zjisti la specifická aktivita imobilizátu 35,75 U/g, vztaženo na

sušinu. To odpovídá celkové aktivitě 1787,5 U a ztrátě aktivity imobilizací asi 45 %. Během imobilizace imobilizát nabotná asi na čtyřnásobnou hodnotu vůči sušině (200 g). Protože se imobilizát skladuje a používá ve vlhkém stavu, činí aktivita imobilizátu pro nabobtnalý stav 8,94 U/g, vztaženo na vlhkou hmotnost. S tímto imobilizátem se prováděly dlouhodobé studie, přičemž se pro násadu použilo 10 g/1 NIPA-DME. Reakce probíhala při 38 °C a při pH 7,5 po dobu 24 hodin. Pak následovalo oddělení imobilizátu z roztoku a nové použití imobilizátu. Časový úbytek specifické aktivity a normované aktivity enzymu je znázorněn na obrázcích 3a a 3b. Po asi 200 hodinách provozu vykazovala imobilizovaná esteráza ze surového extraktu vepřových jater ještě 65 % zbytkové aktivity. Hodnota poločasu imobilizátu činí asi 250 hodin a imobilizát je tedy výborně vhodný pro technické použití ve fermentačních nádobách. Při době použití 500 hodin se při 10 % zatížení imobilizátu s 10 g/1 NIPA-DME může provést nejméně 100 dávek se střední dobou reakce 5 hodin.

Příklad 5

Porovnání aktivity izolované a čištěné esterázy s esterázou ze surového extraktu z vepřových jater při fermentačním procesu

Provádění kontrolované fermentace probíhalo ve fermentačním zařízení Biostat ED podle uspořádání, znázorněném na obrázku 2.

Porovnání se provádělo s 10 g NIPA-DME/1.

Pracovalo se s komerční čištěnou esterázou z vepřových ······· · 9

9 9 99 99 99 99 99 jater (103 U/mg proteinu) a s esterázou ze surového extraktu z vepřových jater analogickým způsobem. Nejprve se vždy zkoumala enzymatická aktivita nevázaných esteráz (čištěné a ze surového extraktu).

Pak byly podle příkladu 3 vyčištěná esteráza a surový extrakt zpracovány pomocí Eupergitu C.

5.1 Porovnání aktivit nevázaných esteráz

Při porovnávání nevázaných esteráz z vepřových jater se ukázalo, že pro srovnatelný rozklad se proti čištěné esteráze musí použít jen asi 1/30 množství imobilizovaného surového extraktu. Při tom odpovídají 2 g surového proteinového extraktu asi 70 mg čištěné komerční esterázy.

5.2 Porovnání aktivit esteráz, vázaných na Eupergit C

Při porovnání esteráz z vepřových jater, vázaných na Eupergit C, se ukázalo, že pro dosažení srovnatelných výsledků se proti vyčištěné esteráze musí nasadit jen asi 1/5 množství imobilizovaného surového extraktu.

Při tom odpovídají 4 g imobilizovaného surového extraktu asi 0,75 g imobilizované čištěné esterázy.

Z výsledků je patrné, že imobilizát ze surového extraktu vepřových jater je značně aktivnější, než imobilizát z prodávané esterázy z vepřových jater. Vedle podstatně vyšší aktivity je imobilizát ze surového extraktu proti imobilizátu z vyčištěné esterázy při výrobě též daleko levnější, protože odpadají předcházející nákladné postupy čištění.

Claims

1. Na pryskyřice kovalentně vázané neizolované a nečištěné esterázy ze surového extraktu ze zvířecích nebo rostlinných buněk a zvířecích, nebo rostlinných tkání, pro fermentaci v bioreaktorech.

2. Esteráza, vázaná na pryskyřice podle nároku 1, vyznačující se tím, že esteráza je získána ze surového extraktu vepřových jater.

3. Esteráza, vázaná na pryskyřice podle nároků 1 a 2, vyznačující se tím, že pryskyřicí je epoxidová pryskyřice.

4. Použití esteráz podle nároků 1 až 3 pro štěpení esterů karboxylových kyselin na volné anionty kyselin a alkoholy.

5. Použití esteráz podle nároků 1 až 3 pro štěpení esterů karboxylových kyselin na volné anionty kyselin a alkoholy v bioreaktorech.

6. Použití esteráz podle nároků 1 až 3 pro štěpení dimethylesteru kyseliny nitroisoftalové (NIPA-DME) na monomethylester kyseliny nitroisoftalové (NIPA-MME).

7. Použití esteráz podle nároků 1 až 3 pro zmýdelnění 2-fluoro-ara-triacetátu na 2-F-ara-adenin

8. Použití esteráz podle nároků 1 až 3 pro částečné zmýdelnění reichsteinS-17,21-diacetátu na reichsteinS-17-monoacetát.