DE2337828A1 - Neue carbonylpolymere - Google Patents

Description

PATnNTANWALT

Γ,R. !. KIAAS

III. is/22Q1/2QS

Case 23,647

American Cyanamid Company, Wayne, New Jersey /USA

Neue Carbonylpolymere

Die Erfindung betrifft Enzyme, die an Polymere gebunden sind. Die Erfindung betrifft insbesondere Enzyme, die an Carbonylpolymere gebunden sind, wobei das Polymer mit einem Dialdehyd vernetzt ist.

In den vergangenen Jahren hat die Bindung von Enzymen an geeigneten Trägerstoffen, um die Enzyme zu insolubilisieren (= unauflöslich zu machen) und dabei zu bewirken, daß sie wiederholt und kontinuierlich bei der Umwandlung enzymatisch umwandelbarer Substrate verwendet werden können, großes Interesse gefunden. Insbesondere beschreiben Silman et al, Water-Insoluble Derivates of Enzymes, Antigens and Antibodies, Annual Review of Biochemistry, Band 35, Teil II, Herausgeber P.I.Boyer, Annual Review Inc., Palo Alto, Californien, Seiten 873 bis 908, 1966, viele Verfahren, um Enzyme an Trägerstoffe zu binden, wie die Adsorption, den Einschluß im Inneren des Gitters eines Trägers, die kovalente Bindung und die kovalente Vernetzung.

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Erfindungsgemäß kann eine größere Menge an Enzym kovalent an Carbonylpolymere wie Aldehyd- und Ketonpolymere gebunden werden, wenn das Carbonylpolymer vernetzt ist, d.h. in unlöslichen Zustand überführt wurde, wobei man einen Dialdehyd und nicht bekannte Vernetzungsmittel verwendet. Auf diese Weise wird die Anzahl der Aldehydgruppen, die für die Enzymbindung zur Verfügung stehen, nicht erniedrigt. Das heißt, die Umsetzung des Carbonylpolymeren mit dem Dialdehyd über eine Aldol-Kondensationsreaktion bringt.keine Erniedrigung in den Aldehydgruppen mit sich, über die eine Vernetzung auftritt, und die in den Carbonylpolymeren zur Verfügung stehen, wiö dies bei der Vernetzung mit anderen Vernetzungsmitteln der Fall ist, da die Aldehydgruppen des Dialdehyd-Vernetzungsmittels die Carbonylgruppen des Carbonylpolymeren ersetzen, die bei der Vernetzungsumsetzung gebraucht werden. Als Folge davon wird das Polymer vernetzt und die Anzahl an verfügbaren Aldehydgruppen bleibt in dem vernetzten Polymer gleich, wodurch an das Polymer mehr Enzym gebunden werden kann.

Die erfindungsgemä,ßen Mittel enthalten, wie oben kurz ausgeführt wurde, Carbonylpolymere, die mit Dialdehyden der Formel

0 0

Il Il

H-C-CH₂-R-CH₂-C-H

vernetzt sind, worin R eine (CH₂)_X-Gruppe bedeutet, worin χ 0 bis 16 einschließlich bedeutet, oder worin R eine cyclische Alkylengruppe mit 4 bis 8 Kohlenstoffatomen einschließlich oder eine Arylengruppe mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen einschließlich bedeutet.

Die Vernetzungsumsetzung ist eine Umsetzung einer Art einer Aldolkondensation und findet zwischen den reaktiven Gruppen des Carbonylpolymeren und den a-Kohlenstoffatomen des Dialydehyds statt. Die Umsetzung wird unter typischen Aldol* reaktionsbedingungen durchgeführt, wie sie in The Aldol

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Condensation, Nielson et al, Organic Reactions, Band 16, Seiten 1 bis 85, John Wiley and Sons, New York, 1968, beschrieben sind. Im allgemeinen wird die Umsetzung bei einer Temperatur im Bereich von O bis 80°C durchgeführt· Das Reaktionsmedium wird in alkalischem Zustand gehalten, d.h. bei einem pH-V/ert über 7, indem man geeignete, gutbekannte Materialien wie beispielsweise Natriumhydroxyd in Äthanol, Calcium- oder Bariumhydroxyd, Magnesiumhydroxyd, Aluminiumhydroxydι primäre oder sekundäre Amine wie Pyrrolidon, Morpholin, Piperidin, Diäthylamin, Säuren wie Essigsäure, Schwefelsäure, Salze wie Natriumcarbonat, Natriumphosphat, Pyrrolidinium«· und Piperidiniumacetate und ähnliche zufügt.

Das vernetzte, entsprechend diesem Verfahren gebildete Polymer ist unlöslich und fällt daher aus der Lösung aus. Die Gewinnung des Polymeren kann durch Filtration, Zentrifugieren usw. erfolgen.

Die vernetzten erfindungsgemäßen Polymere werden bevorzugt für die anschließende Bindung von katalytisch aktiven Enzymen daran hergestellt. Zu diesem Zweck muß das Carbonylpolymer zuerst in einen Zustand überführt werden, in dem es mit dem Enzym, das anschließend daran gebunden wird, reagiert. Dies wird im Falle der meisten Aldehydpolymere dadurch erreicht, daß man das Polymer mit einem geeigneten Solubilisierungsmittel wie Bisulfit, insbesondere einem Alkalimetall- oder Erdalkalimetall-bisuifit wie Natrium-, Kalium-, Calciumusw.bisulfit umsetzt. Die Umsetzung wird bei einer Temperatur im Bereich von ungefähr 25 bis ungefähr 90⁰C bei Atmosphärendruck durchgeführt, obgleich Überatmosphärendruck oder Unteratmosphärendruck gewünschtenfalls verwendet werden können· Das Verfahren ist in Einzelheiten in der US-Patentschrift 2 657 192 beschrieben.

Nach der Bisulfitbehandlung werden die Aldehydpolymere durch Vernetzung wie oben beschrieben hydrophil gemacht. Der Aus-

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druck "hydrophil", wie er hierin verwendet wird, bedeutet! daß das Polymer in Wasser befeuchtbar oder quellbar ist, daß es aber darin nicht wesentlich löslich ist. Die Zusammen-Setzungen können hydrophobe Verbindungen bzw. Teile oder Anteile enthalten, vorausgesetzt, daß sie ebenfalls hydrophile Teile enthalten, die als solche reagieren, wenn sie in Berührung mit Wasser sind.

Gewünschtenfalls kann die Vernetzungsstufe zuerst durchgeführt werden und die Bisulfitumsetzung danach, . wenn man das vernetzte Polymer verwendet, um ein Enzym daran zu binden« Die einzige Forderung, die besteht, ist die, daß sich das entstehende Produkt in einem solchen Zustand befindet, daß eine Umsetzung davon mit dem Enzym ermöglicht wird.

Das Enzym wird mit dem hydrophilen Polymeren bei einer Temperatur umgesetzt, die unter der ist, bei der das Enzym entaktiviert wird. Die Temperatur, bei der die spezifischen Enzyme entaktiviert werden, ist dem Fachmann geläufig und muß daher nicht gpnannt werden. Es reicht, daß man bemerkt, daß im allgemeinen Temperaturen unter ungefähr 75°C, bevorzugt von ungefähr 5°C bis ungefähr 65°C verwendet werden sollen. Die Umsetzung wird bevorzugt in Anwesenheit von Puffern durchgeführt, um den pH-Wert der Reaktionsmischung bei dem gewünschten Wert zu halten, und unter Rühren, wobei der besondere pH-Wert durch das besondere Enzym, das gebunden werden soll,bestimmt wird, und wobei- man bekannte Verfahren verwendet.

Im Hinblick auf die Ketonpolymere kann man die gleichen Verfahren, wie sie bei den Aldehydpolymeren beschrieben wurdön, verwenden, und man erhält ein vernetztes Ketonpolymer. Verwendet man die Ketonpolymeren als Träger für Enzyme, kann man, wenn die Polymeren selbst nicht ausreichend hydrophil sind, und mit dem Enzym reagieren können, die gleichen Solubilisie-

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rungsverfahren, wie sie erwähnt wurden, verwenden. Das heißt, einige Ketonpolymere wie auch die Aldehydpolymeren sind nicht per se wasserlöslich und da die meisten Enzyme durch organische Lösungsmittel denaturiert werden, muß irgendeine Umsetzung damit in wäßrigem Medium durchgeführt werden. Die Ketonpolymeren müssen daher ebenfalls in hydrophilen Zustand überführt werden, bevor sie mit dem Enzym behandelt werden. Umsetzungen dieser allgemeinen Art werden in der US-Patentschrift 3 271 334 beschrieben.

Wenn die Aldehyd- oder Ketonpolymeren per se wasserlöslich sind, muß die Bisulfitumsetzung nicht durchgeführt werden und die Enzyme können mit dem Polymeren behandelt werden, unmittelbar nachdem dieses durch Vernetzen mit dem Dialdehyd wie zuvor beschrieben in unlöslichen Zustand überführt wui*de. Die Grundforderung, die besteht, wenn das Enzym gebunden werden soll, ist die, daß das fertige Enzym-Polymer-Addukt hydrophil sein muß, damit es bei der enzymatischen Umwandlung von Substraten in deren Umwandlungsprodukte verwendet werden kann.

Beispielsweise wird bei einer besonderen Ausführungsform PoIyacrolein, ein wasserunlösliches Polymer, zuerst mit einem Bisulfit wie Natriurabisulfit behandelt, um es wasserlöslich zu machen. In diesem Zustand kann das Polymer jedoch nicht mit einem Enzym umgesetzt werden, da die Gewinnung von irgendeinem Produkt daraus relativ unmöglich wird. Die Vernetzung des Bisulfit-Polymer-Produkts mit einem Dialdehyd jedoch bedingt, daß es eine gelartige Konsistenz erhält und ausreichend hydrophil ist, so daß es mit dem Enzym umgesetzt werden kann. Das Ergebnis dieser beiden Reaktionen ist das, daß das Bisulfit einen Teil der heterocyclischen Ringe des Polyacroleins aufspaltet und dadurch mehr enzymreaktive Aldehydgruppen daran erzeugt werden, zusätzlich zu einer Reihe von Bisulfitgruppen. Das Dialdehyd reagiert mit einigen dieser Aldehyd- und Bi-

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sulfitgruppen mit der Bildung von -CH=C- Bindungen zwischen

CHO

zwei Polymermolekülen und dabei wird das Polyacrolein vernetzt. Umsetzung mit einem Enzym, beispielsweise mit Invertase, ergibt ein Addukt oder eine kovalente Bindung zwischen dem Enzym, den .Aldehydgruppen der Vernetzungsbindungen und den anderen verfügbaren Aldehydgruppen und ebenfalls über Bisulfitgruppen.

Beispiele von Carbonylpoiymeren, die verwendet werden können, umfassen solche, die entsprechend irgendeinem bekannten Verfahren hergestellt werden aus Aldehydmonomeren wie aus Acrolein, a-Alkylacroleinen, beispielsweise Methacrolein, oc-Propylacrolein, Crotonaldehyden, 2-Methyl-2-butenal, 2,3-Dimethyl-2-butenal, 2-Äthyl-2-hexenal, 2-Decenal, 2-Dodecenal, 2-Methyl-2-pentenal, 2-Tetradedenal u.a., allein oder vermischt mit bis zu 95 Ge\f.%, bezogen auf das Gesaratgewicht der Copolymer en, miteinander und/oder mit anderen copolymerisierbaren Monomeren, von denen bekannt ist, daß sie damit reagieren wie mit ungesättigten Alkoholestern, beispielsweise den Allyl-, Crotyl-, Vinyl-, Butenyl-estern usw., von gesättigten und ungesättigten aliphatischen und aromatischen monobasischen und polybasischen Säuren wie Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure, Valeriansäure, Adipinsäure, Maleinsäure, Furmarsäure, Benzoesäure, Phthalsäure, Terepthalsäure etc., cyclischen Vinylverbindungen (einschließlich der aromatischen Monovinylkohlenwasserstoffe), beispielsweise Styrol, o-, m- und p-Chlorstyrole,-Bromstyrole, -Fluorstyrole, -Methylstyrole, -Äthylstyrole, verschiedene polysubstituierte Styrole, beispielsweise Di-, Tri- und Tetra-chlorstyrole, -bromstyrole etc., Vinylnaphthalin, Vinylchlorid, Divlnylbenzol, Allylbenzol, Vinylpyridin, Diallylbenzol, verschiedene α-substituierte und α-substituierte, ringsubstituierte Styrole, beispielsweise a-Methylstyrol, a-Methyl-p-methylstyrol etc., ungesättigte Äther, beispielsweise Äthylvinyläther etc., Ungesättigte Amide, beispielsweise Acrylamid, Methacrylamid etc.,

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N-substituierte Acrylamide, beispielsweise N-Methylolacrylaraid, N-Allylacrylamid, N-Methylacrylamid etc., Acrylate wie die Methyl-, Äthyl-, Propyl-, Butylacrylate und -methacrylate etc., Nitrile wie Acrylnitril und andere Comonomere, wie sie beispielsweise in der US-Patentschrift 2 657 192, die.zuvor erwähnt wurde, beschrieben sind.

Ähnlich können solche Polymeren wie die Copolymeren aus Äthylen und Kohlenmonoxyd und verschiedene' Glyoxaladduktö , die gut bekannt sind, bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden.

Beispiele anderer Carbonylpolymere, die verwendet werden können, umfassen solche, die entsprechend irgendeinem bekannten Verfahren hergestellt werden und die ähnliche Mengen enthalten, wie es oben im Zusammenhang mit den Aldehydpolymeren angegeben wurde, aus solchen Ketonmonomeren wie Methylvinylketon, Methylallylketon, Äthylvinylketon, Methylisopropenylketon, Äthylallylketon, etc. Phenylvinylketon, p-Tolylvinylketon. Man kann auch Polymere wie Poly-(vinylpyridiniumketone) und Halogenketone, Copolymere der oben erwähnten Aldehydmonomeren und Ketonmonomere mit oder ohne die oben erwähnten copolymerisierbaren Comonomeren, Polyacetal und ähnliche Verbindungen verwenden.

Das Molekulargewicht der verwendeten Polymeren ist nicht kritisch und Polymere, die Molekulargewichte, die so niedrig sind wie 1000, besitzen, können daher verwendet werden.

Als geeignete Dialdehyde können solche Materialien erwähnt werden wie Succinaldehyd, Glutaraldehyd, Adipaldehyd, Pimelaldehyd, Suberaldehyd, Azelaldehyd, Sebacaldehyd, Octadecandial, Oxaldehyd, 1,2- oder 1,3-Cyclobutandiacetaldehyd, 1,2- oder 1,3-Cyclopentandiacetaldehyd, 1,2-, 1,3- oder 1,4-Cyclohexandiacetaldehyd, 1,2-, 1,3- oder 1,4-Cycloheptandi-

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acetaldehyd, 1,2-, 1,3-, 1,4- oder 1,5-Dicyclooctandiacetaldehyd, o-Benzoldiacetaldehyd, m-Benzoldiacetaldehyd, p-Benzoldiacetaldehyd, 1,2-Naphthalindiacetaldehyd usw.; es können auch Verbindungen mit verzweigten Ketten verwendet .werden usw., Dialdehyde sind ebenfalls geeignet.

Beispiele von Enzymen, die zur Herstellung der neuen gebundenen Materialien verwendet werden können, sind beispielsweise proteolytische Enzyme, Hydrolasen, Amylasen, Dehydrogenasen,

Kinasen, Oxydasen, Deaminasen, Amidasen, Antigene, Antikörper, usw. einschließlich von Milchdehydrogenase, Creatin, Phosphokinase, Trypsin, Papaein, Ribonuclease, alk.Phosphatase, Amyloglucosidase, Dextranase, Glucoseoxydase, Amidase, Penicillinamidase, Chymotrypsin, ß-Galactosidase, Pyruvatkinase, Ficin, Pepsin, Carboxypeptidase, Streptokinase, Plasminogen, Urease, Amylsase, Invertase, Alkoholdehydrogenasediastase, ß-Glykosidase, Maltase, Glucoseisomerase-lactase, Amygdalase, Lipase, Steapsin, Erepsin, Rennin, Zymase, Catalase, Melibiase, Pectolase, Protease, Tyrosinase, Cytäse, Cellulase, Adenase', Guanidase, Carboxylase, Inulase, Rindörerythricyt und Pferdeserum-cholinesterase, Essigoxydase, Pectinase, Aldehydase, Rhamnase, Myrosinase, Phytase, Tannase, Carbamase, Nuclease, Guanase, Adenase, Thrombase, Chymase, Cozymase u.a.

Wie oben kurz erwähnt, finden die vernetzten erfindungsgemäßen Produkte Verwendung bei der Herstellung von gebundenen Enzymprodukten, die ihrerseits wieder bei der Umwandlung von enzymatisch umwandelbaren Substraten in ihre UmwandlungsproduKte verwendet werden können. Genauer gesagt, ist es bekannt, daß die Enzyme in ihrer Natur katalytisch wirken und verschiedene Materialien als Substrate in andere Materialien umwandeln* wie dies dem Fachmann bekannt ist. Beispielsweise wandeln Kipase Fett in Glycerin und Fettsäuren, Invertase Saccharose in Invertzucker um und Lactase wirkt auf Lactose usw.

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Die an die Polymeren gebundenen Enzymprodukte sind wasserunlöslich, dadurch kann das Substrat, während es sich in wäßriger Lösung befindet, umgewandelt werden, wobei die katalytische Aktivität des Enzyms erhaltenbleibt. Man kann beispielsweise eine wäßrige Lösung aus Saccharose kontinuierlich mit Invertase, die an ein Polymer gebunden ist, behandelt, wobei die Saccharose in Invertzucker überführt wird· Die katalytische Aktivität der Invertase bleibt für längere Zeitdauer in hohem Maße erhalten. Der Ausdruck "katalytisch aktiv" oder "katalytische Aktivität", wie er hierin verwendet wird, bedeutet die Fähigkeit oder Verfügbarkeit des gebundenen Enzyms, um besondere Substrate in die Umwandlungsprodukte zu überführen.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken. Alle Teile und Prozentgehalte sind, wenn nicht anders angegeben, durch das Gewicht ausgedrückt·

Beispiel 1

4,0 Teile einer 20#igen Glutaraldehydlösung werden langsam unter Rühren zu 40 Teilen einer 1Obigen Lösung aus Polyacrolein-Natriumbisulfit-Addukt (Molekulargew.80 000), dessen pH-Wert zuvor mit 1Obiger Natriumhydroxydlösung auf 10 eingestellt wurde, zugefügt. Die Mischung wird bei 23°C 1 Stunde gerührt und das fast farblose hydrophile Produkt, das sich bildet, wird dann filtriert und gewaschen, bis es neutral reagiert.

Das so erhaltene feuchte hydrophile Addukt wird in 50 Teilen Wasser suspendiert und mit 0,104 Teilen Invertase (zweimalige Umkristallisation), die zuerst in 4 Teilen Wasser gelöst war, umgesetzt. Die Enzymreaktionsmischung (pH 6,5) wird 18 Stunden bei 10⁰C etwas gerührt und das entstehende, hydrophile, kovalent gebundene Enzym-Polymer-Addukt wird dann von nichtumgesetztem Enzym durch Waschen befreit. Eine Untersuchung des hydrophilen Enzym-Polymer-Addukts zeigt eine

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hohe Aktivität in Saccharoselösungen, wobei 4 Gew.# des isolierten, feuchten Kuchens 100 ml einer 1Obigen Saccharoselösung bei pH 4,8 in 15 Minuten bei 42⁰C in 83,0% Invertzucker überführen.

Das .Versuchsverfahren (polarimetrisch), das verwendet wird, wird in H.U.Bergmeyer's Methods of Enzymatic Analysis, Academic Press, New York, N.Y.(1963), Seite 902/3, beschrieben.

Beispiel 2

5 Teile eines Copolymeren aus Acrolein-Styrol (93,8:6,2 Gew.-Verhältnis) werden in 40 Teilen Wasser, das 4,3 Teile Natriummetabisulfit enthält, bei einem pH-Wert von 5,7 suspendiert. Die Mischung wird über Stickstoff bei 65°C während 5 Stunden gerührt, man erhält ein vollständig wasserlösliches Produkt. Zu;diesem Bisulfit-Additionsprodukt fügt man langsam unter Rühren 4,0 Teile einer 20&Lgen Lösung aus Adipaldehyd und dann wird der pH-Wert der Reaktionsmischung auf pH 10,5 mit 1Obiger Natriumhydroxydlösung eingestellt. Die Reaktionsmischung wird bei 20⁰C während 2 Stunden gerührt. Das entstehende, vernetzte, hydrophile Copolymer wird filtriert, biä zum neutralen pH-Wert gewaschen und in 20 Teilen Wasser suspendiert und mit 4 ml k = 0,6 Invertase technischer Qualität bei 18°C während 15 Stunden umgesetzt» Das entstehende, kdvalent gebundene Enzym-Polymer-Addukt wird von nichtgebundenem Enzym mit destilliertem Wasser durch Waschen befreit Und filtriert (8,4 feuchte Teile). Eine Untersuchung von 10 Gew.# des feuchten Produkts mit 100 ml einer 1Obigen Saccharose-· lösung (gleiche Versuchsbedingungen wie oben) zeigt eine 46,0#ige Umwandlung in Invertzucker.

Beispiel 3

10 Teile eines Copolymeren aus Acrolein-Acrylnitril (93,1i6,9 Gew.Verhältnis) werden in 82 Teilen Wasser, das 8,6 Teile Natriummetabisulfit enthält, bei einem pH-Wert von 5,6 sus-

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pendiert. Die Mischung wird bei 60 bis 70⁰C über einer Stickstoff atmosphäre gerührt, bis sie solubilisiert ist. 22 Teile des obigen Bisulfit-Additionsproduktes werden dann mit 4,0 Teilen einer 20%igen Glutaraldehydlösiing, die 3 Teile Pyrrolidin und 2,5 Teile Essigsäure enthält, bei 23⁰C während 4 Stunden umgesetzt. Das entstehende, vernetzte, hydrophile Copolymere wird filtriert und kontinuierlich gewaschen, bis die Waschlösungen neutral reagieren» Der gelartige Rückstand wird in 25 Teilen Wasser suspendiert und mit 4 ml Invertaselösung technischer Qualität (k = 0,6) bei 15⁰C während 16 Stunden unter Rühren umgesetzt. Das kovalent gebundene Invertase-Polymer-Addukt wird wiederholt mit destilliertem Wasser gewaschen, bis es frei von ungebundenem Enzym ist (Gesamtgewicht des feuchten Produktes nach der Filtration: 14,2 Teile). Untersuchung von 10 Gew.% des Adduktes mit 100 ml einer 1Oxigen Saccharoselösung unter Verwendung der gleichen Versuchsbedingungen, wie sie in Beispiel 1 beschrieben sind, ergibt eine 81,2%ige Umwandlung in Invertzucker«

Beispiel 4

10 Teile eines Copolymeren aus Acrolein-Acrylsäure (85:15 Gew,-Verhältnis) werden in 81 Teilen Wasser, das 8,6 Teile Natriummetabisulfit enthält, bei einem pH-Wert von 5»6 suspendiert und 24 Stunden bei 75⁰C in einer StickstoffatmoSphäre erwärmt. Zu 22 Teilen des entstehenden, löslichen Bisulfit-Additionsproduktes fügt man langsam 2,0 Teile 1,2-Cyclohexandiacet·- aldehyd in 10 Teilen Wasser. Die Reaktionsmischung (pH 10,3 mit NaOH) wird bei 25°C 2 Stunden gerührt und das hydrophile Produkt, das gebildet wird, wird abfiltriert und mit Wasser bis zu einem neutralen pH-Wert gewaschen. Der entstehende Feststoff wird in 80,0 Teilen Wasser suspendiert und mit 3 ml Invertase technischer Qualität (k = 0,6) bei 10° C während 17 Stunden umgesetzt. Das entstehende, kovalent gebundene Enzymprodukt wird durch Waschen von nichtgebundener Invertase mit destilliertem Wasser befreit und filtriert (man erhält

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29,2 Teile feucht). Untersuchung von 5 Gew.% des feuchten Produktes mit 100 ml einer 10%igen Saccharoselösung (gleiche Versuchsbedingungen wie in Beispiel 1) ergibt eine 51,2#ige Umwandlung zu Invertzucker.

Be-i spiel 5

15 Teile Polymethacrolein werden mit 100 Teilen Wasser, das 11 Teile Natriummetabisulfit enthält, bei einem pH-Wert von 5,7 bis 65°C während 20 Stunden in einer Stickstoffatmosphäre behandelt. Das entstehende Bisulfitaddukt wird dann mit 5,0 Teilen Suberaldehyd in 20 Teilen Wasser während 1,5 Stunden bei 22°C bei einem pH-Wert von 10,6 behandelt, wobei der pH-Wert mit Natriumhydroxyd eingestellt wurde. Das entstehende, hydrophile, vernetzte Polymer wird dann mit Wasser gewaschen, bis es neutral reagiert, und filtriert. Der feuchte Kuchen wird in 100 Teilen Wasser suspendiert und mit 6 ml Invertase technischer Qualität (k = 0,6) bei 16⁰C während 18 Stunden umgesetzt. Das entstehende, kovalent gebundene Enzym wird von nichtgebundener Invertase durch Waschen mit destilliertem Wasser befreit und' filtriert. Untersuchung von 5 Gew.% des feuchten Kuchens mit 100 ml einer 10%igen Saccharoselösung (vergl. Versuchsdurchführung von Beispiel 1) ergibt eine 58,0#ige Umwandlung in Invertzucker.

Beispiel 6

Das Verfahren von Beispiel 5 wird erneut durchgeführt, mit der Ausnahme, daß ein Methacrolein-Styrol (50:50)-Copolymer (US-Patentschrift 2 945 006) anstelle des in dem Beispiel verwendeten Polymeren verwendet wird und daß man als Dialdehyd Octadecandial verwendet. Die anschließende Addukt* bildung, die Vernetzung und das Waschen ergeben ein System aus Invertase, gebunden an Polymer, das eine 70,0%ige Umwandlung von Saccharose in Invertzucker bewirkt.

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Beispiel 7

10 Teile Poly«(methylvinylketon) werden mit 80 Teilen Wasser, das 8 Teile Natriumbisulfit enthält, bei einem pH-Wert von 5,8 bei 65°C während 18 Stunden Über einer Stickstoffa tmo»· Sphäre behandelt. Das entstehende Bisulfitaddukt wird dann mit" 7,0 Teilen einer Zotigen Lösung aus p-Benzoldiacetaldehyd, gelöst in 16 Teilen Wasser, unter Rühren während 1,5 Stunden bei 15⁰C und einem pH-Wert von 11,0 behandelt. Das hydrophile Polymer wird dann bis zum neutralen pH-Wert gewaschen und filtriert. Der feuchte Kuchen wird in 55 Teilen Wasser suspendiert und mit 4 ml Invertase technischer Qualität (k = 0,6) bei 18°C während 16 Stunden umgesetzt. Das entstehende, kovalt gebundene Enzym-Polymer-Addukt wird von nichtgebundener Invertase durch Waschen mit destilliertem Wasser befreit und filtriert (22,0 g feucht). Untersuchung von 10t Gew.% des feuchten Produkts mit 100 ml einer 1Obigen Saccharoselösung (vergl.Beispiel 1) ergibt eine 46,0%ige Umwandlung in Invertzucker.

Man arbeitet wie in Beispiel 1 oder Beispiel 7 beschrieben, mit der Ausnahme, daß verschiedene Copolymere, andere Homopolymere und Dialdehyde anstelle der in diesen Beispielen verwendeten Polymeren eingesetzt wurden. Es wurden gebundene Invertasezusammensetzungen hergestellt und verwendet, um Zuckerlösungen in Invertzucker zu überführen. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I aufgeführt.

Tabelle I

Bsp. Carbonylpolymer ^Umwandlung in

Nr. Invertzucker

8 Acrolein-Äthylacrylat-Styrol
(25/20/55) mit Succinaldehyd

9 Acrolein-Methylvinylketon(45/55) (Molekulargew.1400) mit Sebacaldehyd

10 Acrolein-Vinylacetat (60/40) mit 1,2-Cyclobutandiacetaldehyd

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11 a-Methylacrolein-Methylmethacrylat(50/50)

mit Glutaraldehyd 47%

12 Acrolein-Allylglykolat(80/20) mit 1,5-Dicyclooctandiacetaldehyd · 84%

13 Poly-(isopropenylmethyIketon) mit

Az&laldehyd ... " ' 58%

14 Acrolein-Glycidylmethacrylat(40/60) mit

" 1,2-Naphthalindiacetaldehyd 41 %

15 Methylvinylketon-Methylmethacrylat(70/30)

mit Glutaraldehyd 61%

16 Methylvinylketon-Vinylacetat(5/95) mit Glutaraldehyd 50%

Beispiel 17

10 Teile feuchter (λ^10% Peststoffe), vernetzter Polyacrolein-Natriumbisulfit-Additionskomplex (hergestellt wie in Beispiel 1) werden in 40 Teilen Wasser bei einem pH-Wert von 7,0 suspendiert und mit 0,110 Teilen kristallinem Trypsinj gelöst in 4 Teilen Wasser, umgesetzt. Die Reaktionsmischung wird 18 Stunden bei 10⁰C gerührt und gegen Ende dieser Zeit wird das entstehende, kovalent gebundene Trypsin-Addukt gewaschen, bis es voji nichtgebundenem Enzym befreit ist. Analyse der Waschlösungen bei 280 m/u zeigt an, daß 81,3% des Enzyms an das Polymer gebunden sind. Der feuchte Polymer-Enzymkuchen wird gefriergetrocknet und man erhält ein Produkt mit 0,091 Teilen Trypsin/Teil Feststoffe. Das Produkt liefert bei der Bestimmung 18,4 Aktivitätseinheiten/mg Enzym (natives Enzym 66 Einheiten/mg). Es besitzt daher 28,0% der ursprünglichen Aktivität. Das analytische Verfahren, das verwendet wird, ist das übliche Standard-pH-Versuchsverfahren (pH 7_f 9), wobei man Benzoylarginin-äthylester(BAEE)-Substrat verwendet.

Beispiel 18

2,5 Teile Poly-(isopropenylmethylketon) werden mit 25 Teilen Wasser, das 2,1 Teile Kaliummetabisulfit enthält, bei einem pH-Wert von 5,8 während 16 Stunden bei 75⁰C in Stickstoffatmosphäre gerührt. Gegen Ende dieser Zeit werden 1,5 Teile

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einer 20#igen Glutaraldehydlösung zu der obigen Reaktions* mischung zugefügt und dann rührt man bei 25⁰C 1 Stunde. Das hydrophile Addukt, das man erhält, wird bis zum neutralen pH-Wert gewaschen und filtriert. Der feuchte. Kuchen wird in 30 Teilen Wasser suspendiert, und mit 0,025 Teilen Glucose* oxydase, gelöst in 2 Teilen Wasser, bei 10°C während 18 Stunden umgesetzt. Das entstehende, kovalt gebundene Enzym wird von nichtgebundener Glucoseoxydase durch Waschen mit kaltem, destilliertem Wasser befreit und filtriert. Untersuchung von 0,556 des gesamten feuchten Kuchens unter Verwendung eines Standard-Verfahrens mit konstantem pH-Wert (pH 6,3) (Substrat: 50 ml einer 1?6igen Glucoselösung mit überschüssigem Sauerstoff), worin die freigesetzte Gluconsäure mit Standard 0,01η NaOH untersucht wird, zeigt, daß die Aktivität des Adduktes 18,6 Einheiten/mg/min beträgt (native Glucoseoxydase ergibt Werte von 20,5 Einheiten/mg/min).

Entsprechend den Verfahren der vorherigen Beispiele wurden verschiedene andere Enzyme kovalent an vernetzte polymere Materialien, die in der vorliegenden Anmeldung beschrieben sind, gebunden, wobei hydrophile Zusammensetzungen erhalten wurden· Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle II aufgeführt.

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Tabelle II

Bsp. Verfahren v. Gebundenes Enzym Ergebnisse Nr. Beispiel

2 9

18

17 17

Glucoseisomerase

oc-Amylase

Tyrosinase

Pectinase

Glucoamylase

überführt Glucose in Fructose

hydrolysiert kontinuierlich Polysaccharide zu Glucose und Maltose

wandelt Tyrosin kontinuierlich in Dihydroxyphenylalanin um

wirkt auf Pectin kontinuierlich, wobei Pectinsäure gebildet wird

wandelt Polysaccharide in Glucose um

Beispiel

Man arbeitet wieder wie in Beispiel 18 beschrieben, mit der Ausnahme, daß kein Kaliummetabisulfit verwendet wird. Verwendet man das gewonnene Polymer bei der Umwandlung von Sucrose in Invertzucker, so beobachtet man ähnliche Ergeb-» nisse.

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Claims (1)

1. - 17 Patentansprüche

   1· Polymer, enthaltend das Reaktionsprodukt aus einem Carbonylpolymeren und einem Dialdehyd der Formel

   O 0
   H-C-CH₂-R-CH₂-C-H

   worin R eine (CH₂)_X-Gruppe bedeutet, worin χ 0 bis 16 und einschließlich '16 bedeutet, eine cyclische aliphatische Gruppe mit 4 bis 8 und einschließlich 8 Kohlenstoffatomen oder eine Arylengruppe mit 6 bis 10 und einschließlich 10 Kohlenstoffatomen bedeutet.

   2. ^N Polymer nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß χ 1 bedeutet.

   3. Polymer nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Carbonylpolymer Polyacrolein verwendet.

   4. Polymer nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R eine Phenylengruppe bedeutet.

   5. Polymer nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Carbonylpolymer ein Polyacrolein-Bisulfit-Addukt verwendet.

   Verfahren zur Herstellung eines Polymeren, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Carbonylpolymer und ein Dialdehyd der Formel

   0 0
   H-C-CH₂-R-CH₂-C-H

   worin R eine (CH₂)_X-Gruppe bedeutet, worin χ 0 bis 16 und einschließlich 16 bedeutet, und R weiterhin eine cyclische aliphatische Gruppe mit 4 bis 8 und einschließlich 8 Kohlenstoffatomen oder eine Arylengruppe mit 6 bis 10 und einschließ-

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   lieh 10 Kohlenstoffatomen bedeutet, unter alkalischen Bedingungen umsetzt und das entstehende Polymer gewinnt.

   7· Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß χ 1 bedeutet.

   8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Carbonylpolymer Polyacrolein verwendet.

   9. · Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Carbonylpolymer ein Polyacrolein-Bisulfit-Addukt verwendet.

   10. Polymer nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es ein katalytisch aktives Enzym kovalent daran gebunden enthält.

   11. Polymer nach Anspruch 5 _r dadurch gekennzeichnet, daß es ein katalytisch aktives Enzym kovalent gebunden daran enthält.

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