DE2714629A1

DE2714629A1 - Verfahren zur herstellung immobilisierter enzymmischungen

Info

Publication number: DE2714629A1
Application number: DE19772714629
Authority: DE
Inventors: Yoskhiaki Ishimatsu; Shoji Kimura; Tokio Machida; Shigeki Shigesada; Hiroyasu Suzuki; Naoyuki Yamada
Original assignee: Denki Kagaku Kogyo KK
Current assignee: Denka Co Ltd
Priority date: 1976-03-31
Filing date: 1977-03-30
Publication date: 1977-10-13
Also published as: FR2346365A1; FR2346365B1; NL7703435A; NL172873C; NL172873B; GB1551518A; IT1075589B; DE2714629C2

Description

UtXKÜLL * STOLBERÜ PATENTANWÄLTE

2 HAMBURG 52 2714623

BESELERSTRASSE 4

DR. J-D. FRHR. woo UEXKÜLt"«'

- DR. ULRICH GRAF STOLBERG

DIPL-ING. JÜRGEN SUCHANTKE

DENKI KAGAKU KOGYO (Prio: 31. März 1976

KABUSHIKI KAISHA · _{JA 3547}'_1/1976f 35468/1976 -

No. 1-4-1, Yuraku-cho, 13899)

Chiyoda-ku, Tokio / Japan ~

Hamburg,"den 29. März 197 7

Verfahren zur Herstellung immobilisierter Enzymmischungen

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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung immobilisierter Enzymmischungen, die für industrielle Anwendungszwecke geeignet sind.

Die Immobilisierung von Enzymen ist für industrielle Anwendungszwecke oft sehr vorteilhaft. So können immobilisierte Enzyme z.B. in einen Säulenreaktor gepackt werden und ermöglichen auf diese Weise eine kontinuierliche Enzymreaktion über einen langen Zeitraum.

Für die Immobilisierung von Enzymen sind verschiedene Verfahren vorgeschlagen worden, insbesondere im Hinblick auf Glucose-Isomerase, die im immobilisierten Zustand industriell von großer Bedeutung ist. Derartige Verfahren sind beispielsweise in der US-PS 3 821 086, der US-Patentanmeldung Serial No. 501 292 (Anmeldetag 28. August 1974) und der US-PS 3 915 beschrieben. 709841/09 23

27U629 • f.

Der Erfindung liegt nun die Aufgabe zugrunde, ein gegenüber den bekannten Verfahren verbessertes Immobilisierungsverfahren und insbesondere ein Verfahren zur Herstellung immobilisierter Enzymmischungen mit einer ausgezeichneten physikalischen Festigkeit, mit einer herausragend hohen enzymatischen Aktivität und einer vernünftigen Stabilität zu liefern. Außerdem sollen die hergestellten immobilisierten Enzymmischungen im Vergleich zu bekannten immobilisierten Enzymen eine zufriedenstellende Flüssigkeitspenetration aufweisen, wenn sie in einen Reaktor von industriellem Maßstab gepackt werden.

Zur Lösung dieser Aufgabe wird ein Verfahren zur Herstellung immobilisierter Enzymmischungen vorgeschlagen, bei dem ein Enzym und/oder enzymhaltigen Mikroorganismenzellen zwecks Koagulation und Immobilisierung mit einem einen quaternären Pyridinring im Molekül enthaltenden hochmolekularen Anionenaustauscher umgesetzt werden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Reaktionsprodukte zu geformten Körpern extrudiert.

Die Erfindung geht zurück auf eine frühere Erfindung der Anmelderin, nach der ein immobilisiertes Enzym mit hoher enzymatischer Aktivität und ausgezeichneter Stabilität hergestellt werden kann, indem ein Enzym und/oder enzymhaltige Mikroorganismen in einem hochmolekularen Anionenaustauscher immobilisiert werden, der einen quaternären Pyridinring im Molekül enthält, d.h. ein reaktives hochmolekulares, in Wasser unlösliches aber hydrophiles Polymeres, hergestellt durch Qua-

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ternisierung eines Vinylpyridincopolymeren. Das erfindungsgemäße Verfahren führt zu einer Verbesserung der physikalischen Festigkeit der immobilisierten Enzyme, was ein schwerwiegender Nachteil der früheren Erfindung gewesen ist.

Die Verbesserung der physikalischen Festigkeit der erfindungsgemäß hergestellten immobilisierten Enzymmischungen beruht darauf, daß man das Enzym und/oder enzymhaltige Mikroorganismen nach erfolgter Reaktion mit dem oben beschriebenen hochpolymeren Anionenaustauscher unter bestimmten Feuchtigkeitsbedingungen in einem Extruder extrudiert, falls erforderlich, in einer KrUmelmaschine zu Pellets verarbeitet und dann unter bestimmten Temperaturbedingungen zu immobilisierten Enzympellets mit einer Größe von 100 ,u bis 2 mm trocknet. Die chemische Reaktion zwischen dem hochpolymeren Anionenaustauscher und dem Enzym und/ oder den enzymhaltigen Mikroorganismen kann durch die obige Trockenbehandlung beschleunigt werden und führt zur Herstellung eines Katalysators mit ausgezeichneter physikalischer Festigkeit. Außerdem kann das Herstellen von Pellets vor dem Trocknen die Trocknungseffektivität beträchtlich erhöhen und so die erforderliche Wärmemenge für die chemische Reaktion auf ein Minimum senken, wodurch eine übermäßige Wärmezufuhr vermieden wird, die sich nachteilig auf die enzymatische Aktivität auswirken kann.

Außerdem tritt bei großen industriellen Reaktoren oder bei Reaktoren, in denen industrielle Materialien hoher Dichte und Viskosität wie für die Hydrolyse und Isomerisation von Dextrose

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verwendet werden, oft ein großer Druckverlust auf. Deshalb sollen in solchen Reaktoren eingesetzte Katalysatoren fest genug
sein, um einen solchen Druckverlust zu unterdrücken. Diesbezüglich besonders vorteilhaft sind immobilisierte Enzymmischungen, die nach einer bevorzugten Ausfuhrungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens hergestellt sind, wobei der Reaktionsmischung ein
bifunktionales Vernetzungsmittel zugesetzt wird, das in der Lage ist, mit dem hochpolymeren Anionenaustauscher oder dem Enzym
zu reagieren.

Das oben genannte Vernetzungsmittel kann wirksam in jeder Verfahrensstufe des erfindungsgemäßen Verfahrens zugesetzt werden. Der Zusatz wirkt sich aber besonders positiv aus, wenn man während des Trocknens Wärme zuführt, wodurch sowohl die physikalische Festigkeit des Katalysators, d.h. der immobilisierten Enzymmischungen, als auch die Stabilität der enzymatischen Aktivität stark verbessert werden kann und für industrielle Zwecke ausgezeichnet geeignete Katalysatoren erhalten werden.

Die vorteilhaften Merkmale der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten immobilisierten Enzymmischungen (Katalysatoren) können wie folgt zusammengefaßt werden:

Da die erfindungsgemäß hergestellten Mischungen im wesentlichen aus Enzymen bestehen, ergeben sie eine maximale enzymatische
Aktivität. Darüber hinaus können pelletisierte Katalysatoren
jeder beliebigen Form und Größe durch mechanisches Formen her-

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gestellt werden, indem die Bedingungen beim mechanischen Formen in geeigneter Weise eingestellt werden.

Dadurch kann die Reaktion auf einer zufriedenstellend hohen Reaktionsgeschwindigkeit gehalten werden, indem man einen mit den erfindungsgemäß hergestellten Enzymen gepackten Reaktor industriellen Maßstabs unter hoher Zugabegeschwindigkeit mit Einsatzmaterial beschickt. Da der Katalysator chemisch vernetzt und mechanisch geformt ist, besitzt er darüber hinaus eine hohe physikalische Festigkeit und ergibt eine ausgezeichnete Penetration durch die durch den Reaktor strömende Flüssigkeit, so daß die Druckverluste geringer sind und ein stabiles Arbeiten sichergestellt ist.

Da das mechanische Formen und die chemische Vernetzung die chemische Stabilität verbessern, können darüber hinaus im Vergleich zu bekannten Verfahren verschiedene andere Vorteile erreicht werden, wie z.B. eine geringere Desaktivierung des Enzyms auch be.i langer kontinuierlicher Verwendung und geringerer Effekte durch Verunreinigungen.

Weiterhin eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren nicht nur zur Immobilisierung eines einzelnen Enzyms und/oder individueller enzymhaltiger Mikroorganismen, sondern auch zur Immobilisierung von Kombinationen einer Vielzahl von Enzymen und/oder enzymhaltigen Mikroorganismen und ermöglicht dadurch eine weite Anwendbarkeit.

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1. Enzyme und Mikroorganismen

Beim erfindungsgemäßen Verfahren kann man Enzyme und/oder enzymhaltige Mikroorganismen u.a. in folgender Weise verwenden: Enzym (A) oder enzymhaltige Mikroorganismen (C) allein; Enzym (A) + Enzym (B); Enzym (A) + enzymhaltige Mikroorganismen (C) + enzymhaltige Mikroorganismen (D).

Beispiele für beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendbare Enzyme sind u.a. Glucose-Isomerase, Lactase, Aminoacylase, Penicillinamidase, Glucoseoxydase, Urease, Phenoloxydase, Katalase, Invertase, Alkoholdehydrogenase, Lysozym, Steroiddehydrogenase, Steroidhydroxylase, Lactatdehydrogenase, Aminosäureoxydase, Tyrosinase, Ribonuclease, Lipase, Cellulase, ^ -Amyläse, Glycoamilase, Mellibiase, Asparaginase, ß-Amylase, Maltase, Cyclodextranase und ähnliche sowie diese enthaltende Mikroorganismen.

2. Träger

Das erfindungsgemäß als Träger verwendete einen quaternären Pyridinring im Molekül enthaltende Anionenaustauschharz ist ein wasserunlösliches aber hoch hydrophiles, reaktives, hochmolekulares Polymeres, das hergestellt wird, indem Vinylpyridin oder ein Derivat davon mit einem oder mehreren damit copolymerisierbaren Monomeren copolymerisiert wird und mit einem Reagenz zur Reaktion gebracht wird, das in der Lage ist, das Stickstoffatom im Pyridinring zu quaternisieren. Für die Copolymerisation geeignete Monomere sind aromatische Vinylverbindungen, ungesättigte äthylenische Verbindungen und ungesättigte Diene.

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Erfindungsgemäß geeignete Anionenaustauschharze sind solche mit einem quaternären Pyridinring im Molekül, die beispielsweise durch Umsetzen eines quaternisierenden Reagenzes wie Alkylhalogenid oder Alkyldihalogenid mit Vinylpyridin-styrol-divinylbenzolcopolymerem, Vinylpyridin-methylmethacrylat-divinylbenzolcopolymerem, Vinylpyridin-polyäthylenglykol-dimethacrylatcopolymerem, Vinylpyridin-styrolblockcopolymerem, Vinylpyridin-methylmethacrylatblockcopolymerem und ähnlichen Copolymeren erhalten werden.

3. Vernetzungsmittel

Die erfindungsgemäß bevorzugten polyfunktionalen Vernetzungsmittel sind solche Verbindungen, die in der Lage sind, mit funktioneilen reaktiven Gruppen wie quaternären Pyridingruppen und Pyridingruppen im Träger und Hydroxylgruppen, Carboxylgruppen, Phenolgruppen, Aminogruppen, Mercaptogruppen oder ähnlichen in den Enzymen und/oder den enzymhaltigen Mikroorganismen zu reagieren. Zu diesen Verbindungen gehören Aldehyde, Säureanhydride, Epoxide, Halogenide, Isocyanate und ähnliche und insbesondere Dialdehydstärke, Glutaraldehyd, Harnstofformaldehydverbindungen, Bernsteinsäureanhydrid, Maleinsaureanhydridcopolymere, Epichlorhydrin, Epoxyharze, s-Chlortriazin, Aminodichlortriazin, Toluoldiisocyanat, Dichlorbuten, Woodward-Reagenz und ähnliche. Von den genannten Verbindungen ist u.a. Dialdehydstärke besonders wirksam.

Da die meisten Vernetzungsmittel im allgemeinen mit den reaktiven Gruppen in den Enzymen unter Verringerung der enzymatischen

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Aktivität reagieren, wenngleich sie dabei die physikalische Fe stigkeit der Enzyme verbessern können, ist bei der Verwendung von hochreaktiven Vernetzungsmittel bei der Herstellung immobilisierter Enzyme Vorsicht geboten. Die Verwendung von Dialde hydstärke in Kombination mit einem qu ternären Pyridinring ent haltenden Trägern kann jedoch die Katalysatorfestigkeit verbes sern, ohne die enzymatische Aktivität wesentlich zu verringern.

Herstellung von immobilisierten Enzymkatalysatoren

1. Koagulationsreaktion zwischen Enzymen und/oder enzymhaltigen Mikroorganismen und Trägern

Die Reaktion zwischen den Enzymen und/oder enzymhaltigen Mikroorganismen und den Trägern wird vorteilhafterweise als Flüssigphasereaktion durchgeführt, wobei eine wäßrige Dispersion des Trägers mit dem Enzym und/oder den enzymhaltigen Mikroorganismen gelöst oder dispergiert in Wasser unter Einhaltung des optimalen pH-Bereiches vermischt wird, so daß das Enzym und/oder die enzymhaltigen Mikroorganismen durch Koagulation immobilisiert werden.

Eine Reaktion in koagulierter Phase ist dann erwünscht, wenn die wäßrige Dispersion des Trägers mit einem getrockneten Enzym und/ oder getrockneten enzymhaltigen Mikroorganismen vermischt wird.

Erfindungsgemäß bevorzugt verwendete Träger sind feinteilige Pulver mit einer Teilchengröße von weniger als 0,01 mm, die man durch Pulverisieren während der Herstellung oder durch Pulverisieren der fertigen Träger in einer Zerkleinerungsmaschine oder

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einer Kugelmühle herstellt. Da die Träger stark sauer sind, verwendet man vorzugsweise eine auf einen pH-Wert im Bereich von 5,0 bis 9,0 eingestellte wäßrige Dispersion der Träger.

Ein geeignetes Zugabeverhältnis von Enzymen und/oder enzymhaltigen Mikroorganismen zu Träger ist 1 : 0,005 bis 1 : 0,5 und vorzugsweise 1 : 0,05 bis 1 : 0,2, jeweils bezogen auf die Trockengewichte. Bei Nichteinhaltung dieser Verhältnisse kann die Immobilisierungsreaktion unvollständig sein oder überschüssige Träger können unerwünschte Effekte auf die enzymatische Aktivität haben.

Die, wie oben beschrieben, durch Koagulation bewirkte Immobilisierung wird im Hinblick auf die Zersetzung der Enzyme oder ähnliche Auswirkungen vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen O und 3O°C durchgeführt.

Die immobilisierten Enzyme und/oder immobilisierten Mikroorganismen werden, eine gewisse Menge Wasser enthaltend, im nassen Zustand in einer Formmaschine geformt. Vorzugsweise wird der Wassergehalt der nassen immobilisierten Produkte auf 2 5 bis 80 % eingestellt, was durch Regulierung der mechanischen Bedingungen bei Verwendung einer Zentrifuge oder einer Filterpresse geschehen kann, wenn die Immobilisierung durch Koagulation in flüssiger Phase erfolge, oder einfach durch Zusatz einer gewünschten Menge an Wasser vor dem Formen, wenn die Reaktion in einer koagulierten Phase durchgeführt wurde.

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2. Formen der nassen immobilisierten Produkte Das Formen der nassen immobilisierten Produkte erfolgt in einer Formmaschine, wobei das Produkt zu der für den fertigen Katalysator gewünschten Form geformt wird.

Der fertige Katalysator hat vorzugsweise die Form eines Ellipsoids oder einer Kugel und eine Dicke oder einen Durchmesser von etwa 1 ,ubis 10 mm, vorzugsweise 100 ,u bis 2 mm. Bei den Abmessungen der Katalysatorteilchen ist die gut ausgeglichene Kombination von anfänglicher enzymatischer Aktivität und Penetration durch die Flüssigkeit zu berücksichtigen. Bei einem erfindungsgemäß bevorzugten Formverfahren werden die immobilisierten Produkte in einem Extruder mit einem 0,1 bis 2 mm Sieb geformt. Für das Extrudieren ist kein besonderer Extruder erforderlich, und ein herkömmlicher Extrudertyp kann den obigen Zweck zufriedenstellend erfüllen.

Zum weiteren Pelletisieren der geformten Produkte kann vorteilhafterweise eine Rotationskrümelmaschine (rotary pelleting machine) verwendet werden. Durch optimale Einstellung der Rotationsgeschwindigkeit und der Behandlungszeit kann der Katalysator in eine erfindungsgemäß geeignete Form und Größe gebracht werden. Weiterhin soll das Formen des Katalysators möglichst schnell und bei möglichst niedriger Temperatur (0 bis 25°C) erfolgen, um den Abbau des Katalysators so gut wie möglich zu vermeiden.

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Um die Extrudiereigenschaften und die Form- und Größestabilität der geformten Pellets zu verbessern sowie den Katalysator eine gute Porosität zu verleihen, ist es von Vorteil, beim Extrudieren verschiedene Füllstoffe wie anorganische Substanzen, z.B. Diatomenerde und Siliciumoxid und wäßrige Dispersionen von Stärke, Dextrin, Natriumalginat, Carboxymethylzellulose, Polyvinylalkohol, Zelluloseacetat, Äthylen-vinylacetatcopolymerem, Natriumpolyacrylat oder ähnlichen Verbindungen zuzusetzen.

3. Trocknen der geformten Produkte

Die wie oben beschrieben geformten Produkte sollen schnell getrocknet werden. Das Trocknen kann durch 15 Minuten bis 20 Stunden langes Blasen von Luft mit einer Temperatur von 40 bis 80⁰C erfolgen. Es kann entweder in einem fachartigen Trockner in einem stationären Zustand oder in einem Wirbelbetttrockner in einem fluidisierten Zustand durchgeführt werden, über einen langen Zeitraum andauerndes Trocknen bei einer höheren Temperatur führt zu einer erheblichen Verringerung der enzymatischen Aktivität, und ein sehr viel länger dauerndes Trocknen bei niedrigerer Temperatur führt zu einem Abbau des Enzyms und/oder der enzymhaltigen Mikroorganismen.

4. Vernetzen des Katalysators

Die Vernetzungsreaktion für die Enzyme und/oder enzymhaltigen Mikroorganismen kann in jeder Verfahrensstufe des erfindungs-

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gemäßen Herstellungsverfahrens erfolgen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Vernetzungsmittel in Form einer Lösung mit jeder beliebigen für das Mittel geeigneten Dichte zugesetzt, wenn die Enzyme und/oder die enzymhaltigen Mikroorganismen mit den Trägern umgesetzt werden und die Immobilisierung durch Koagulation stattfindet.

Wenn Dialdehydstärke als Vernetzungsmittel verwendet wird, wird es vorzugsweise als eine 1 bis 20 %-ige wäßrige Lösung zugesetzt, so daß, bezogen auf den Feststoffgehalt der Enzyme und/oder der enzymhaltigen Mikroorganismen, 0,01 bis 10 Gew.% Dialdehydstärke vorhanden sind.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird die Vernetzungsmittellösung beim Formen der nassen durch Koagulation immobilisierten Produkte in einer Formmaschine zugesetzt.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die nassen in einer Formmaschine geformten Produkte mit der Lösung des Vernetzungsmittels in Kontakt gebracht.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Vernetzungsmittellösung mit den geformten Produkten in Kontakt gebracht, nachdem diese zuvor getrocknet worden sind.

Wenn Dialdehydstärke als Vernetzungsmittel verwendet wird, werden die getrockneten geformten Produkte vorzugsweise 5 Minuten bis 5 Stunden lang mit einer 0,5 bis 20 %-igen wäßrigen Lösung von

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Dialdehydstärke in Kontakt gebracht. In diesem Fall kann die Festigkeit und Stabilität der Katalysatoren weiter verbessert werden, indem sie nach beendeter Vernetzungsreaktion in der oben beschriebenen Weise getrocknet werden.

Das Lösungsmittel für das Vernetzungsmittel wird je nach Löslichkeit des Vernetzungsmittels gewählt. Wenn ein in Wasser unlösliches Vernetzungsmittel verwendet wird, wird es in einer Mischung eines nicht wäßrigen organischen Lösungsmittels und Wasser gelöst. Ein solches gemischtes Lösungsmittel aus nicht wäßrigem organischem Lösungsmittel und Wasser wird auch dann für ein wasserlösliches Vernetzungsmittel verwendet, wenn dieses hochreaktiv ist, um die Reaktivität des Vernetzungsmittels zu verringern, da es sonst möglicherweise die aktiven Gruppen in den Enzymen angreifen und eine Desaktivierung bewirken könnte.

Beispiele für bevorzugte nicht wäßrige, organische Lösungsmittel sind u.a. Aceton, Methanol, Äthanol, Propanol, Isopropanol, Tetrahydrofuran, Dioxan, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Glycerin und Polyäthylenglykol.

Die Menge und die Konzentration des Vernetzungsmittels für die Enzyme und/oder enzymhaltigen Mikroorganismen unterliegen keinen besonderen Einschränkungen, da sie sowohl in Abhängigkeit von der Löslichkeit und Reaktivität des Vernetzungsmittels als auch der gewünschten Aktivität und Festigkeit des Katalysators variiert werden.

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Der pH-Wert der Vernetzungsmittellösung bestimmt sich nach der enzymatischen Aktivität und der Vernetzungseffektivität und soll geeigneterweise auf 4,0 bis 9,0 und vorzugsweise auf etwa 7 eingestellt werden.

Die Vernetzungsreaktion soll bei möglichst niedriger Temperatur und in möglichst kurzer Zeit erfolgen, um den Abbau der Enzyme möglichst auf ein Minimum zu beschränken.

Da die so hergestellten immobilisierten Enzymkatalysatoren im wesentlichen aus den Enzymen und/oder enzymhaltigen Mikroorganismen und einer geringen Menge an Träger bestehen, besitzen sie eine maximale enzymatische Aktivität je Gewichtseinheit. Da die Katalysatoren durch das mechanische Formen und das chemische Vernetzen eine dichte und verfestigte Struktur besitzen, ist ferner die Penetration durch die Flüssigkeit ausgezeichnet, und ein Druckverlust durch Abbau des Katalysators wird während der gesamten Reaktion nicht beobachtet.

Aufgrund der verfestigten Struktur und der chemischen Vernetzung besitzen die Enzyme eine verbesserte Stabilität, erleiden auch bei kontinuierlicher langzeitiger Verwendung nur eine minimale Abnahme der enzymatischen Aktivität und liefern so Katalysatoren mit ausgezeichneten Eigenschaften und Vorteilen für die industrielle Verwendung.

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Beispiel 1

1. Herstellung eines immobilisierten Katalysators Eine Monomermischung aus 48 Mol.% Styrol, 50 Mol.% 2-Vinylpyridin und 2 Mol.% Divinylbenzol wurde zu Wasser gegeben, das 5 % Polyoxyäthylenalkylphenoläthersulfat (Nissantrax K) als Emulgiermittel enthielt. Das Volumenverhältnis von Monomermischung zu Wasser betrug 1 : 1/2. Die Monomermischung wurde im Wasser emulgiert und anschließend unter Verwendung von Kaliumpersulfat als Katalysator bei 60°C polymerisiert.

10 Stunden nach der Reaktion wurde ein Überschuß Aceton zur Reaktionslösung gegeben, um das resultierende Polymere pulverförmig auszufällen. Der Niederschlag wurde mehrere Male mit warmem Wasser gewaschen und dann getrocknet. Der Polymerisationsgrad betrug 95 %.

Das so erhaltene Copolymere wurde unter Druck bei 80 C mit Methylbromid als Quaternisierungsraittel quaternisiert. 50 g des quaternisierten statistischen Styrol-2-vinylpyridin-divinylbenzolcopolymeren (Anionenaustauschkapazität 3,2 mäq/g) wurden in 250 ml Wasser zu einer Suspension dispergiert, und der pH-Wert wurde mit 0,1 η NaOH auf 7,O eingestellt.

Dann wurde eine wäßrige Dispersion von im Handel erhältlichen Mikroorganismenzellen mit Glucose-Isomerase-Aktivitat, die aus Streptomyces (enzymatische Aktivität 1600 GIU/g; Feststoffgehalt etwa 40 %) hergestellt wurden, beschallt (sonificated). Anschlie-

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ßend wurde die überstehende Flüssigkeit kondensiert und dann gefriergetrocknet. 50 cm der, wie oben beschrieben, hergestellten Trägerdispersion wurden zu 100 g der Glucose-Isomerase (Aktivität 15 000 GIU/g) gegeben und gut vermischt, um koagulierte immobilisierte Produkte herzustellen.

Die erhaltenen koagulierten, immobilisierten Produkte wurden dann mit 50 ml 50 %-iger wäßriger Dialdehydstärkelösung versetzt und bei Raumtemperatur gut vermischt. Die Dialdehydstärke wurde durch Behandlung von Stärke mit Perjodsäure (Gehalt an Natriumsulfit, bezogen auf den Feststoffgehalt 10 %; pH 6,0) hergestellt.

Die vermischten Produkte wurden bei Raumtemperatur extrudiert. Dies geschah in einem Einwellenextruder mit einer 1,0 mm 0 Düse. Die 2 bis 10 cm breiten Extrudatstreifen wurden zu 1 mm langen Stücken zerschnitten und dann in einem Wirbelbetttrockner 1 Stunde bei 60°C getrocknet. Der so erhaltene immobilisierte Enzymkatalysator besaß eine Glucose-Isomerease-Aktivität von 4800 Glü/g (siehe Anmerkung Tabelle 1).

2. Kontinuierliche Enzymreaktion

100 g wie unter 1 beschrieben hergestellte immobilisierte Enzyme wurden in einen 1 1 Wasser enthaltenden Becher gegeben und 1 Stunde quellen gelassen. Dann wurden sie in eine 80 cm hohe Glassäule mit einem Durchmesser von 2,5 cm gepackt, die mittels eines Heizmantels auf 60°C gehalten wurde. Sofort danach wurde die

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Säule über Kopf kontinuierlich mit einer wäßrigen 59 Gew.%-igen Lösung von Glucose (pH: 8,0; Gehalt an MgS( beschickt. Der Durchsatz betrug 1500 ml/h.

Lösung von Glucose (pH: 8,0; Gehalt an MgSO₄^H₃O: 5 χ 10 ³ M/l)

Zur Messung der Druckdifferenz befanden sich am oberen und am unteren Ende der Säule Druckmeßgeräte. Die umgesetzte Lösung wurde am unteren Ende der Säule abgenommen. Die Isomerisationsrate wurde durch Bestimmung der gebildeten Fructosemenge mit Hilfe eines Polariskops bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 wiedergegeben.

	Durchsatz (l/h)	Tabelle 1	Druckverlust (kg/cm )
age	1500	Ausbeute an Fructose (% - Feststoffgehalt)	0,03
2	1500	44,5	0,03
5	1500	47,3	0,03
10	15OO	45,4	O,O3
2O	1500	46,1	0,03
30	1500	43,0	0,03
40	1500	42,2	0,03
50	41 ,0

Anmerkung 1: Die enzymatische Aktivität von Glucose-Isomerase wurde nach der Methode von Takasaki (Agrucultural Biological Chemistry, Vol. 30, 1248 (1966)) bestimmt, wobei die Aktivitätseinheit 1 GIU/g die Erzeugung von 1 mg Fructose aus 1 g einer vorgegebenen enzymatischen Mischung in einem Zeitraum von 10 Minuten und bei einer Temperatur von 70 C bedeutet.

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Beispiel 2

1 . Herstellung eines immobilisierten Katalysators Zu 1000 g der Mikroorganismenzellen gemäß Beispiel 1 wurden 250 ml einer wäßrigen Lösung gegeben, die 50 g desselben statistischen quaternisierten Styrol-2-vinylpyridin-diphenylbenzolcopolymeren, wie in Beispiel 1 beschrieben, enthielt (pH 7,0). Das Vermischen erfolgte in einer Knetmaschine, wobei die wäßrige Lösung des Copolymeren von oben zugegeben wurde. Nach etwa 15-minütigem Vermischen bei Raumtemperatur (25 C) wurden 25 ml einer 10 %-igen wäßrigen Lösung von Dialdehydstärke (pH 6,0) gemäß Beispiel 1 zugesetzt, und das Vermischen wurde weitere 15 Minuten lang forgesetzt.

Die nassen immobilisierten Mikroorganismen wurden dann in einem horizontalen Zweiwellenextruder mit einer 0,5 mm 0 Düse extrudiert. Das Extrudat wurde in einer Rotationskrümelmaschine (rotary pelletizer) pelletisiert (750 U/Min; 30 Sekunden/Charge). Die resultierenden Pellets wurden 1 Stunde lang bei 60°C in einem Wirbelbetttrockner getrocknet. Der erhaltene Katalysator besaß eine Aktivität von 1030 GIU/g.

2. Kontinuierliche Enzymreaktion

Unter Verwendung von 100 g des, wie unter 1. beschrieben, hergestellten Katalysators wurde wie in Beispiel 1 - (2) eine Glucoseisomerisation durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 wiedergegeben.

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Die erhaltenen Produkte waren farblos und von hoher Qualität.

Darüber hinaus ist das Verfahren aufgrund des extrem geringen Druckverlustes sehr sicher.

	Durchsatz (ml/h)	Tabelle 2
age	480	Ausbeute an Fructose (% - Feststoffgehalt)
2	500	41,5
5	470	42,5
10	470	42,7
20	470	40,5
30	470	38,3
40	470	37,0
50	36,0

Beispiel 3

1. Herstellung eines immobilisierten Katalysators 50 g statistisches quaternisiertes Styrol-2-vinylpyridin-divinylbenzolcopolymeres gemäß Beispiel 1 (1) wurden in 5 ml Wasser zu einer Suspension dispergiert, und der pH-Wert wurde mit 0,1 η NaOH auf 7,0 eingestellt.

Dann wurden 1000 g der gleichen Mikroorganismen wie in Beispiel 1 (1) in 10 1 Wasser suspendiert. Zu dieser Suspension wurde unter Rühren bei Raumtemperatur (20 bis 25°C) die gesamte oben beschriebene Dispersion des Copolymeren gegeben. Nach 30-minütigem

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Rühren wurde zentrifugiert, um immobilisierte nasse Mikroorganismen zu erhalten. Die Ausbeute betrug 1250 g (Wassergehalt 68 %) .

Dazu wurden 200 ml einer 2 %-igen wäßrigen Lösung von Carboxymethylzellulose (im Handel als Nahrungsmittelzusatz erhältlich) gegeben. Es wurde gründlich durchgemischt, und der Wassergehalt betrug 72,5 %.

Die so hergestellten nassen immobilisierten Mikroorganismen wurden dann in einem horizontalen Zweiwellenextruder mit einer 0,8 mm 0 Düse extrudiert. Das Extrudat wurde in einer Krümelmaschine pelletisiert (500 U/Min.; 6O Sekunden/Charge). Das resultierende nasse, pelletisierte Produkt wurde bei 50⁰C 20 Stunden lang in einem Gebläsetrockner getrocknet.

100 g der getrockneten Pellets wurden bei 5 C zu 100 ml einer 2 %-igen wäßrigen Lösung (pH 6,0) derselben Dialdehydstärke wie in Beispiel 1 (1) gegeben und 30 Minuten reagieren gelassen. Danach wurde die Festsubstanz abfiltriert, mit reinem Wasser gewaschen und dann 1 Stunde bei 60°C in einem Wirbelbetttrockner getrocknet. Der erhaltene Katalysator besaß eine Aktivität von 980 GIU/g.

2. Kontinuierliche Enzymreaktion

Mit 100 g des wie oben beschrieben hergestellten Katalysators wurde nach der gleichen Verfahrensweise wie in Beispiel 1 (2)

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beschrieben eine Glucoseisomerisation durchgeführt. Der Durchsatz betrug 450 ml/h. Am Beginn wurde eine Fructoseausbeute von 43,5 % (Prozent des Feststoffgehalts) erhalten. Nach 30 Tagen betrug die Ausbeute 40,3 %. Während der gesamten Reaktionsdurchführung wurde weder ein Druckverlust noch ein Zusammenbruch des Katalysators beobachtet.

Beispiel 4

1 . Herstellung eines immobilisierten Katalysators Ein statistisches quaternisiertes MMA-2-vinylpyridin-divinylbenzolcopolymeres (Aniönenaustauscherkapazität: 3,0 mäq/g) wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt mit dem Unterschied, daß anstelle von Styrol Methylmethacrylat (MMA) verwendet wurde.

1000 g der Mikroorganismen gemäß Beispiel 1 (1) wurden in einer Knetmaschine geknetet und dabei mit 250 ml einer wäßrigen Dispersion (pH 7,0) versetzt, die 50 g des oben beschriebenen Trägers enthielt. Nach beendeter Zugabe wurde das Kneten weitere 15 Minuten bei Raumtemperatur (25°C) fortgesetzt.

Dann wurden die nassen immobilisierten Mikroorganismen wie in Beispiel 3 (1) beschrieben zu einem getrockneten, pelletisieren Produkt verarbeitet. 100 g dieser Pellets wurden zu 500 ml einer Mischung aus Wasser und Aceton (pH 7,0; Volumenverhältnis Wasser/ Aceton = 1:4) gegeben, die 5 % (Gewicht/Vol.) Glutaraldehyd

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enthielt. Nach 30 Minuten bei 5°C wurde abfiltriert, die abfil trierten Produkte wurden mehrere Male mit Aceton gewaschen und 2 Stunden bei 60 C im Luftstrom getrocknet, lysator besaß eine Aktivität von 730 GIU/g.

2 Stunden bei 60 C im Luftstrom getrocknet. Der erhaltene Kata

2. Kontinuierliche Enzymreaktion

Mit 100 g des wie oben beschrieben hergestellten Katalysators wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 (2) eine Glucoseisomerisation durchgeführt.

Der Durchsatz betrug 380 ml/h. Die Fructoseausbeute (Prozent des Festgehaltes) betrug am Anfang 45,3 %, nach 30 Tagen 42,5 % und nach 60 Tagen 41 %. Während der gesamten Reaktionsführung wurde weder ein Druckverlust noch ein Zusammenbruch des Katalysators beobachtet.

Beispiel 5

1. Herstellung eines immobilisierten Katalysators 50 g des statistischen quaternisierten MMA-2-vinylpyridin-divinylbenzolcopolymeren gemäß Beispiel 4 (1) wurden in 250 ml Wasser zu einer Suspension dispergiert, und der pH-Wert wurde auf 7,0 eingestellt.

Dann wurden 100 ml der obigen Trägerdispersion gut mit 100 g im Handel erhältlicher Glucoamylase (Aktivität 30 000 U/g) vermischt, um ein koaguliertes immobilisiertes Produkt herzustellen.

709841/092 3

~ **~ 27U629

Das immobilisierte Produkt wurde dann in einem Einwellenextruder mit einer 1,0 mm 0 Düse bei Raumtemperatur extrudiert. Das resultierende Extrudat wurde zu 1 mm langen Stücken zerschnitten und anschließend 1 Stunde bei 60°C in einem Wirbelbetttrockner getrocknet. Dann wurden 100 g des pelletisieren Produkts unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 4 (1) mit Glutaraldehyd behandelt und getrocknet. Der erhaltene Katalysator besaß eine Aktivität von 2500 U/g (siehe Tabelle 3, Anmerkung 2).

2. Kontinuierliche Enzymreaktion

100 g des immobilisierten Enzymkatalysators wurden etwa 1 Stunde in Wasser quellen gelassen und dann in eine 80 cm hohe Glassäule mit einem Durchmesser von 2,5 cm gepackt, die mittels eines Heizmantels auf 40°C gehalten wurde. Sofort anschließend wurde die Säule über Kopf mit einer 35 %-igen Lösung von verflüssigter Kartoffelstärke (pH 4,8; DE 13) beschickt. Der Durchsatz betrug 1OOO ml/h. In bestimmten Zeitintervallen wurden am Boden der Säule Proben entnommen. In diesen Proben wurden die Glucoseausbeuten nach der Glucostatmethode bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 wiedergegeben.

	Tabelle	Durchsatz (ml/h)	3	Ausbeute an Glucose (% des Feststoffgehalts)
age	10OO	97,0
2	1000	95,2
5	10OO	94,6
10	10OO	94,0
15	1OOO	93,6
20	10OO	92,8
30	8OO 709841/ 8OO	0923 ⁹⁵'° 94,3
40 50

27H629

Anmerkung 2; Glucoamylaseaktivität: Die Ausbeute des reduzierenden Zuckers wurde unter Verwendung einer 1,2 %-igen Lösung von löslicher Stärke (pH 4,5) als Basisreaktant und gemäß der Somogyi-Nelson-Methode (experimental methods in biochemistry, "Method for determination of reducing sugar", Seite 10, veröffentlicht von der Tokyo University Publushing Association) bestimmt. Als Aktivitätseinheit (1 Einheit/g) gilt die von 1 g der Enzympellets in 1 Minute freigesetzte jeweils 100 ,ug Glucose entsprechende Reduktionskraft .

Beispiel 6

1. Herstellung eines immobilisierten Katalysators 100 g im Handel erhältlicher Glucoamylase (Aktivität: 30 000 U/g) wurden in 100 ml Wasser gelöst. Zu dieser Lösung wurden unter Rühren langsam 200 ml einer 10 %-igen Maleinsäureanhydrid/Vinylacetat-Copolymer (1:1)-Lösung in Aceton gegeben, und der pH-Wert wurde mit 0,1 η NaOH auf 7,0 bis 8,0 eingestellt. Die Reaktion wurde bei 5 bis 10⁰C durchgeführt. Nachdem die gesamte Copolymerlösung zugesetzt worden war, wurde weitere 10 Minuten lang gerührt und dann gefriergetrocknet.

Zu dem erhaltenen Produkt wurden 50 ml der gleichen Trägerdispersion wie in Beispiel 5 (1) gegeben, und es wurde gut durchgemischt. Diese Mischung wurde ferner gründlich mit 50 ml einer wäßrigen Lösung der gleichen Dialdehydstärke wie in Beispiel 1 (1) bei Raumtemperatur (25 C) vermischt. Die nassen immobilisierten Produkte wurden dann geformt und getrocknet wie in Beispiel 4 (1) beschrieben. Der erhaltene Katalysator besaß eine Aktivität von

709841/0923

28OO U/g.

\ 27U629

2. Kontinuierliche Enzymreaktion

Unter Verwendung des in 1. erhaltenen immobilisierten Enzymkatalysators wurde eine kontinuierliche Verzuckerung von Stärke durchgeführt. Dies geschah in der gleichen Weise und unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 5 (2). Die Reaktion wurde 50 Tage lang bei einem Durchsatz von 10OO ml/h durchgeführt. Die erhaltene Glucoseausbeute betrug mehr als 94 %.

Beispiel 7

1. Herstellung eines immobilisierten Katalysators Aminoamylase enthaltende Mikroorganismenzellen einer Kultur von Aspergillus oryzae wurden sprühgetrocknet. 100 g der getrockneten Mikroorganismenzellen wurden für die Immobilisierung und Katalysatorherstellung verwendet. Die Herstellung des immobilisierten Enzymkatalysators erfolgte in der in Beispiel 1 (1) beschriebenen Weise.

2. Kontinuierliche Enzymreaktion

1OO g des oben hergestellten Katalysators wurden 1 Stunde lang in Wasser quellen gelassen und dann in eine 80 cm hohe Glassäule mit einem Durchmesser von 2,5 cm gegeben, die mit Hilfe eines Heizmantels auf 50°C gehalten wurde. Die Säule wurde über Kopf mit einer N-Acetyl-DL-methioninlösung (0,2 Mol; pH 7,0; CoCl₂-

— 4
Konzentration 5,0 χ 10 Mol) beschickt. Der Durchsatz betrug 1000 ml/h. Von der am unteren Ende der Säule austretenden Lösung wurden in bestimmten Zeitintervallen Proben entnommen, um den

709841/0923

~.^.~ 27U629

Gehalt an L-Methionin durch Ninhydrincolorimetrie zu bestimmen Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 wiedergegeben.

	Tabelle 4	Durchsatz (ml/h)
age	1000
2	1000
5	1000
10	1000
15	1000
20	1OOO
30	970
40	9 7O
50	950
60

Ausbeute an L-Methionin (% bezogen auf N-Acetyl-L-methionin)

100,0 100,0 100,0

99,6

99,4

99,0 100,0

99,5 100,0

Beispiel 8

1 . Herstellung eines immobilisierten Katalysators 100 g im Handel erhältlicher Aminoamylase (Aktivität: 25 000 U/g) wurden zur Herstellung eines immobilisierten Aminoamylasekatalysators verwendet. Die Herstellung erfolgte in der gleichen Weise und unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 5 (1) .

2. Kontinuierliche Enzymreaktion

Unter Verwendung von 100 g des obigen Katalysators wurde die kontinuierliche Herstellung von L-Methionin in der gleichen Weise und unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 7 (2)

709841/0923

-.£_- 27K629

durchgeführt. Die Reaktion wurde kontinuierlich 60 Tage lang durchgeführt, wobei der Durchsatz 4 l/h betrug. Die Ausbeute an L-Methionin (bezogen auf N-Acetyl-D-methionin) betrug mehr als 99,5.

Beispiel 9

1. Herstellung eines immobilisierten Katalysators Eine Monomermischung aus 48 Mol.% Styrol, 50 Mol.% 2-Vinylpyridin und 2 Mol.% Divinylbenzol wurde zu einer wäßrigen 5 %-igen Lösung von Polyoxyäthylenalkylphenoläther (Nissantrax K, ein Emulgiermittel) gegeben. Das Mischungsverhältnis von Monomerenmischung zu Emulgiermittellösung betrug 1:2. Nach dem Emulgieren wurde die resultierende Emulsion unter Verwendung von Kaliumpersulfat als Katalysator bei 60°C polymerisiert. Nach über 10-stündiger Reaktionsdauer wurde ein Überschuß an Aceton zugesetzt, um das Polymere in Form kleiner Teilchen auszufällen. Das ausgefällte Polymere wurde mehrere Male mit warmem Wasser gewaschen und getrocknet, Der Polymerisationsgrad betrug 95 %.

Das so erhaltene Copolymere wurde unter Druck bei 80 C mit Methylbromid als Quaternisierungsmittel quaternisiert. 50 g des quaternisierten statistischen Styrol-2-vinylpyridin-divinylbenzolcopolymeren (Anionenaustauschkapazität: 3,2 mäq/g) wurden in 5 1 Wasser dispergiert, und der pH-Wert wurde durch Zusatz von 0,1 η NaOH auf 7,0 eingestellt.

709841/0923

\^M ₃;. 27H629

Anschließend wurden 1000 g im Handel erhältlicher Mikroorganismenzellen mit Glucose-Isomerase-Aktivität (hergestellt aus Actinomycetus; enzymatische Aktivität: 1600 GIU/g; Feststoffgehalt etwa 40 %) in 10 1 Wasser suspendiert. Zu dieser Suspension wurde unter Rühren bei Raumtemperatur die gesamte oben beschriebene Trägerdispersion zugesetzt.

Nach 30-minütigem Rühren wurde die Mischung durch Zentrifugieren entwässert, und es wurden 1370 g nasses immobilisiertes Produkt mit einem Wassergehalt von 73 % erhalten.

Das so erhaltene immobilisierte Produkt wurde bei Raumtemperatur mittels eines horizontalen Zweiwellenextruders mit einer Düse von 1,0 mm 0 zu 2 bis 10 cm langen Streifen extrudiert. Die extrudierten Streifen wurden in einer Rotationskrümelmaschine pelletisiert (500 U/Min.; 60 Sekunden/Charge). Die resultierenden nassen Pellets wurden 20 Stunden bei 50 C in einem Gebläsetrockner getrocknet.

Es wurden schließlich 370 g immobilisierter Katalysator mit einer Glucose-Isomerase-Aktivität von 1250 GIU/g erhalten.

2. Kontinuierliche Enzymreaktion

300 g des in (1) hergestellten immobilisierten Katalysators wurden in ein 3 1 destilliertes Wasser enthaltendes Becherglas gegeben und etwa 1 Stunde quellen gelassen. Dabei wurde von Zeit zu Zeit umgerührt, um Luft vom Katalysator zu entfernen.

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. ^. 27U629

Die gesamte so vorbehandelte, gequollene und entlüftete Katalysatormasse wurde in eine 80 cm hohe Glassäule mit einem Durchmesser von 5 cm gepackt, die mit einem Heizmantel versehen war. Sofort anschließend wurde die Säule über Kopf mit einer 50 Gew.%-igen wäßrigen Lösung von Glucose (pH-Wert 8,0; Gehalt an MgSO..7H„0: 5 χ 10~ M/l)beschickt. Der Durchsatz betrug 1500 cm³/h.

Zur Beobachtung des Druckunterschiedes waren am oberen und unteren Ende der Säule Druckmeßgeräte angebracht. Der Isomerisationsgrad der am unteren Ende der Säule austretenden Lösung wurde mittels eines Polariskops anhand der produzierten Fructose bestimmt.

Am Beginn der Reaktion enthielt die umgesetzte Lösung, bezogen auf die eingesetzte Glucosemenge, etwa 50 % Fructose (Isomerisationsgrad: 50 %). Nach 40-tägigem kontinuierlichem Betrieb enthielt die aus der Säule austretende Lösung immer noch, bezogen auf die eingesetzte Glucose, 45 % Fructose (Isoraerisationsgrad: 45 %). Es konnte also über einen langen Zeitraum ein hoher Isomerisationsgrad aufrechterhalten werden, und das resultierende Produkt war völlig farblos und von hoher Qualität.

Das tatsächliche Volumen der Katalysatorfüllung im Reaktor betrug 1020 ml bei einer SV von etwa 1,47/h. Die Reaktionszeit wurde also erheblich verkürzt. Außerdem betrug der Druckunterschied

während der gesamten Reaktion konstant 0,05 kg/cm . Der Druckverlust war extrem gering und erlaubte einen zuverlässigen stabilen Betrieb.

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V 27H629

Beispiel 10

1. Herstellung eines immobilisierten Katalysators 50 g quaternisiertes statistisches Styrol-2-vinylpyridin-divinylbenzolcopolymeres gemäß Beispiel 9 (1) wurde in 500 ml Wasser dispergiert, und der pH-Wert der Dispersion wurde durch Zusatz von O,1 η NaOH auf 7,0 eingestellt.

Dann wurden 1000 g derselben im Handel erhältlichen Mikroorganismenzellen wie in Beispiel 9 (1) mit einer enzymatischen Aktivität von 1600 GIU und einem Feststoffgehalt von etwa 40 % in einer Knetmaschine geknetet. Dabei wurde die gesamte oben beschriebene Trägerdispersion zugegeben. Nach weiterem 30-minütigem Kneten bei Raumtemperatur (25°C) wurden 1530 g nasses immobilisiertes Produkt mit einem Wassergehalt von 71 % erhalten.

Das so erhaltene nasse, immobilisierte Produkt wurde bei Raumtemperatur in einem horizontalen Zweiwellenextruder mit einer Düse von 0,5 mm 0 extrudiert. Das resultierende Extrudat wurde in einer Krümelmaschine (750 U/Min.; 30 Sekunden/Charge) pelletisiert. Die erhaltenen Pellets wurden in einem Wirbelbetttrockner (MD-B400 von Fuji Powtal) 1 Stunde bei 60 C getrocknet.

Es wurden schließlich 430 g immobilisierter Katalysator mit einer Glucose-Isomerase-Aktivität von 1100 GIU/g erhalten.

709841/0923

"^_n" . 27U629

2. Kontinuierliche Enzymreaktion

300 g der nach (1) hergestellten immobilisierten Katalysators wurden in ein 300 g destilliertes Wasser enthaltendes Becherglas gegeben und etwa 1 Stunde lang quellen gelassen. Dabei wurde zur Entfernung von Luft von Zeit zu Zeit umgerührt.

Der gesamte so erhaltene Katalysator wurde in eine 80 cm hohe Glassäule mit einem Durchmesser von 5 cm gegeben, die mit einem Heizmantel versehen war. Sofort anschließend wurde die Säule über Kopf mit einer 50 Gew.%-igen wäßrigen Lösung von technisch reiner Glucose (Glucosegehalt 92 %, Gehalt an anderen Zuckern 8 %) kontinuierlich beschickt. Die wäßrige Lösung hatte einen pH-Wert von 8,0 und enthielt 5 χ 1O~³ M/l MgSO₄₁TH₃O. Das Volumen der Katalysatorfüllung in dem Reaktor betrug 960 ml.

Die Reaktion wurde kontinuierlich durchgeführt, indem die Zugabegeschwindigkeit des Rohmaterials so eingestellt wurde, daß der Fructosegehalt (gemessen mit einem Polariskop) in der umgesetzten Lösung auf 42 % gehalten wurde (gegenüber dem gesamten Feststoffgehalt).

Die Ergebnisse des 45-tägigen kontinuierlichen Betriebes sind in Tabelle 5 wiedergegeben.

ORIGINAL INSPECTEO 709841/0923

"Γ 27U629

	Durchsatz (l/h)	Tabelle 5	Druckverlust Ucg/cin )
Tage	1 ,50	Ausbeute an Fructose (% des Feststoffgehalts)	1 ,56
1	1 ,50	41,0	1,56
5	1,45	42,3	1,51
10	1,36	42,7	1,42
15	1,25	42,8	1,3O
20	1 ,10	41,5	1,15
25	1 ,OO	42,5	1,04
30	0,92	42,0	0,96
35	0,80	41,9	0,83
4O	0,74	42,8	0,77
45	42,5

Das obige Verfahren ergab ein vollständig farbloses Produkt hoher Qualität und verlief ohne Störungen bei nur extrem geringem Druckverlust.

Beispiel 11

1. Herstellung eines immobilisierten Katalysators

50 g statistisches quaternisiertes Styrol-2-vinylpyridin-divinylbenzolcopolymeres gemäß Beispiel 9 (1) wurden in 5 1 Wa&ser dis-

pergiert. Der pH-Wert der Dispersion wurde durch Zusatz von 0,1 η NaOH auf 7,0 eingestellt.

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ORIGINAL INSPECTED

~ ** ~ 27U629

Die gesarate so erhaltene Trägerdispersion wurde unter Rühren zu 50 1 reiner Kulturlösung von Glucose-Isomerase-Mikroorganismen (hergestellt aus Actinomycetus; enzymatische Aktivität 1800 GIU/g) gegeben. Die Kulturlösung enthielt 1,5 Gew.% Mikroorganismen (nasse Zellen).

Nach 30-minütigem Rühren bei Raumtemperatur (25°C) wurde die Mischung mittels einer Filterpresse entwässert, und es wurden 950 g nasses immobilisiertes Produkt mit einem Wassergehalt von 67 % erhalten.

Das gesamte nasse immobilisierte Produkt wurde gemäß Beispiel 10 (1) zu einem trocknen immobilisierten Katalysator verarbeitet. Es wurden schließlich 300 g Katalysator mit einer enzymatischen Aktivität von 1400 GIU/g erhalten.

2. Kontinuierliche Enzymreaktion

300 g des unter (1) hergestellten immobilisierten Katalysators wurden unter den gleichen Reaktionsbedingungen wie in Beispiel 10 (2) eingesetzt. Das Volumen der Katalysatorfüllung im Reaktor betrug 1050 ml. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle wiedergegeben.

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"*!" 27U629

	Durchsatz (l/h)	Tabelle 6	Druckverlust (kg/cm )
age	1,95	Ausbeute an Fructose (% des Feststoffgehalts)	1,86
1	1 ,90	41,5	1 ,81
5	1 ,80	42,0	1,71
10	1 ,65	42,3	1,57
15	1 ,50	42,1	1,43
20	1,35	42,8	1 ,29
25	1 ,20	42,3	1,14
30	42,0

Es wurde ein vollständig farbloses Produkt hoher Qualität erhalten, und der Betrieb verlief ohne Störungen bei nur extrem geringem Druckverlust.

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Claims

27H629 Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung immobilisierter Enzymmischungen, bei dem ein Enzym und/oder enzymhaltige Mikroorganismenzellen zwecks Koagulation und Immobilisierung mit einem einen quaternären Pyridinring im Molekül enthaltenden hochmolekularen Anionenaustauscher umgesetzt werden, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktionsprodukte zu geformten Körpern extrudiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Reaktionsprodukten vor, während oder nach dem Extrudieren zu geformten Körpern ein Vernetzungsmittel zusetzt, das gegenüber den Reaktionsprodukten reaktiv ist und mit diesen chemische Bindungen eingeht.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man den Wassergehalt der Reaktionsprodukte auf 25 bis 8O Gew.% einstellt.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das Extrudieren der Reaktionsprodukte zu geformten Körpern bei einer Temperatur von 0 bis 25°C durchführt.

5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Vernetzungsmittel Glutaraldehyd, Formaldehyd/Harnstoff-Kondensationsprodukte, Bernsteinsäureanhydrid, Maleinsäure-

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~ 27Hb29

anhydrxdcopolymeres, Dialdehydstärke, Epichlorhydrin, Epoxyharz, Cyanursäurechlorid, Aminodichlortriazin, Toluoldiisocyanat, Dichlorbuten oder Woodward's Reagenz verwendet.

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