DE2839580A1

DE2839580A1 - Traeger mit immobilisierten mikroorganismen

Info

Publication number: DE2839580A1
Application number: DE19782839580
Authority: DE
Inventors: Ralph Allan Messing; Robert Arthur Oppermann
Original assignee: Corning Glass Works
Current assignee: Corning Glass Works
Priority date: 1977-09-14
Filing date: 1978-09-12
Publication date: 1979-03-29
Also published as: FR2403384A1; FR2403384B1; GB2004300B; JPS5495785A; JPS6215198B2; GB2004300A

Description

Die Erfindung "betrifft ein Kompositum aus einem porösen, anorganischen Träger mit geregelter Mikroorganismenbesetzung und ein Verfahren zu seiner Herstellung.

Seit langem werden Mikroorganismen (Bakterien, Hefezellen, Pilze usw.) auf einem Träger gezüchtet und zur Stoffumwandlung verwendet. Auf geeigneten Trägern werden die Organismen als dünne Schleimschicht gezüchtet, und die so erhaltene Biomasse verwendet. In der altbekannten Eilterfermentierung werden Holzsägespäne in ein Paß gefüllt durch das eine Ansatzflüssigkeit gepumpt wird, wobei je nach Luftzutritt aerobe oder anaerobe Biomassen angesammelt werden, die zur anaeroben Fermentierung von Zucker zu Alkohol, oder zur Essigherstellung durch aerobe Umwandlung von Alkohol zu Essig eingesetzt werden.

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Es sind auch, zahlreiche Verbesserungen dieser sogenannten Schüetzenbach-Generatoren bekannt. Die US-PS 454,586 beschreibt ein Durchlaufsystem mit poröser Packung und stellt eine schnellere Vermehrung der auf dem Packungsmaterial befindlichen als der frei schwebenden "Keime" fest. Als Trägermaterial werden von der US-PS 2,440,545 Sägemehl, Alfaifahäcksel, Strohhäcksel, Glasperlen, Kies und dergleichen, vorgeschlagen. Das Verfahren der US-PS 3,402,105 verwendet Sand zur Abwasserklärung. Nach der US-PS 3,402,103 wachsen Bakterienschichten auf Niederschlagsblechen in Durchlaufkolonnen. Die Indische-PS 43542 benützt poröse Bimspartikel als Träger für Hefezellen. Allgemein werden hiernach poröse, anorganische, großflächige Träger als günstig angesehen.

Die Erfindung hat ein Kompositum aus Träger und auf diesem immobilisierten Mikroorganismen zur Aufgabe, welche bei Großer "Oberfläche aber kleinem Volumen eine große Biomasse ergeben.

Diese Aufgabe wird durch ein Kompositum nach Anspruch 1 gelöst. Sie ergeben eine vergleichsweise große Oberfläche mit Biomasse, bei vergleichsweise kleinem Volumen.

Nach bevorzugter Ausgestaltung bestehen die Mikroorganismen aus jeweils nur einer Art (Spezies) und der anorganische Träger besteht aus einem Material, dessen Porengrößenverteilung leicht und rationell geregelt werden kann, wie z.B. amorphen Stoffen wie Glas, Glasfritten, oder kristallinen Stoffen wie cordieritartigem

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Material und dergleichen, deren durchschnittliche Porendurchmesser z.B. bei Besetzung mit Bakterien etwa 0,8 - 220/um, oder 1 - 140/um bei Besetzung mit Hefezellen betragen.

Das Kompositum kann vorteilhaft in der Weise hergestellt werden, daß der Träger in sterilisiertem Zustand einer wässerigen Suspension einer geregelten Bevölkerung von Mikroorganismen unter eine Bindung wenigstens einiger derselben an die Poreninnenflächen ergebenden Bedingungen ausgesetzt wird.

In den Zeichnungen zeigen die Figuren 1 - 12 Schaubilder zur Erläuterung des Verhältnisses verschiedener anorganischer, poröser Träger und verschiedener immobilisierter Mikroorganismen, anhand von Kennlinien, welche den Einfluß durchschnittlicher Porendurchmesser auf die Ansammlung von Biomasse der jeweiligen Mikroorganismen zeigen.

Die Bedeutung der Ansammlung einer großen Biomassenfläche in einem begrenzten Reaktionsvolumen erhellt aus einigen praktischen Anwendungen immobilisierter Mikroorganismen. Bekanntlich kann durch bloße Multiplikation von Mikrobenzellen rasch Protein erzeugt werden. Unter Umständen können die angesammelten Zellen zur Gewinnung ihres Proteingehaltes verarbeitet werden, wenn optimale Bedingungen für die Zellenvermehrung auf kontinuierlicher Basis geschaffen werden können. Hierin findet die sogenannte Einzellenproteir-echnik (SCP, single cell proteintechnology) ihre Grundlage. Sie arbeitet mit chemostatischen und

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turbidostatischen , kontinuierlichen Anlagen, in denen jedoch, abgesehen von minimalen Wandeffekten, die Masser der sich vermenrenden Zellen in der Nährlösung frei schwebend bzw. suspendiert vorliegt. Der Durchsatz und damit die Proteinerzeugung wird hierbei durch den sogenannten Auswascheffekt der Mikroorganismenansätze begrenzt, d.h. bei den hohen Durchsätzen der Nährlösungen ist der Verlust an Mikroben im Reaktor größe* als der Zuwachs durch Zellenvermehrung. Bei dieser Sachlage wird klar, warum eine große Biomassenfläche pro Volumeneinheit nützlich ist: der Auswascheffekt bei hohem Durchsatz ist sehr viel kleiner als in chemostatischen oder turbidostatischen Systemen, sodaß eine rationelle Produktion möglich erscheint, wenn die übrigen Bedingungen wie Nährstoffe, Entfernung von Ausscheidungsprodukten, pH, Sauerstoffversorgung usw. erfüllt werden.

Eine große Biomasse bei kleinem Volumen ist auch für die Erzeugung sekundärer Metaboliten durch Fermentierung von Bedeutung. Da diese meist in der stationären Phase des Lebensablaufs der Mikroorganismen erzeugt werden und ihre Gesamtmenge von der sie kontinuierlich abgebenden, verfügbaren Biomassenfläche abhängt, ist es vorteilhaft, die stationäre Phase einer großen Biomassenfläche tunlichst zu verlängern. Wie im Falle der Einzellenproteinerzeugung ist ein höherer Nahrmitteldurchsatz durch große Biomassenflächen kleinen Volumens günstig, die eine rasche Entfernung der Stoffwechselprodukte und der gewünschten nützlichen Produkte gestatten. Das erfindungsgemäße Kompositum kann auch zur Erzeugung primärer Metaboliten eingesetzt werden.

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Ein weiteres Anwendungsgebiet besteht im Bereich der analytischen Mikrobiologie wegen der Fähigkeit des Kompositums der Erfindung zu einer Besetzung großer Mikroorganismenmengen pro Volumeneinheit, die z.B. als Vergleichsstandard dienen können. Die Erfindung "beruht auf der überraschenden Feststellung eines einzigartigen physikalischen Verhältnisses zwischen Mikroorganismen, insbesondere Organismen die sich durch Spaltung vermehren wie Bakterien, Organismen die sich durch Sprossung vermehren, insbesondere wie Hefezellen, und Fungus-artigen Organismen mit Mycelienwachstum und Sporenvermehrung einerseits, und einem porösen Trägermaterial für deren Immobilisierung andererseits, welches eine maximale Biomassenfläche bei minimalem immobilisierten Mikroorganismenvolumen ermöglicht.

In gewissem Sinne, wenn auch mit starken Einschränkungen, entspricht dies etwa der für immobilisierte Enzyme gemachten Beobachtung der zur Besetzung eines porösen Trägers gegebenen Gewichts oder Volumens geeigneten aktiven Enzymmenge, die nach der US-PS 3,850,751 für optimale Porengrößen von 100 - 1000 S gilt.

Als Träger für das Kompositum der Erfindung kommen anorganische, nicht organische Stoffe in Betracht. Erstere haben organischen Stoffen gegenüber eine Reihe entscheidender Vorteile, wie der Freiheit von Mikroorganismenbefall und Befall der von letzteren erzeugten, extra zellularen Enzyme, deren Nahrungs- bzwo Rohstoffbedürfnisse Kohlenstoff und Stickstoff verlangen. Bei zunehmen-der

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- 6r~

Zerstörung des Trägers nimmt die Ansammlung von Mikroorganismen ab. Außer größerer Dauerhaftigkeit sind anorganische Träger in ihrer Abmessung beständiger als die meisten organischen Träger. Indem sie ihre Porenmorphologie unter den verschiedensten Druck- und Strömungsbedingungen beibehalten, schützen sie die Mikroorganismen vor Verformung und Lösung bzw. Herauslösung. Auch dies wirkt zugunsten einer größtmöglichen Biomasse. Fernerhin haben anorganische Träger größere Dichten, nämlich meist über 2, im Vergleich zu 1 oder weniger der organischen Stoffe, und infolgedessen bei gleicher Porösität kleinere Volumen, bei gleichem Volumen größere Biomassen. Außerdem verursachen Träger größerer Dichte geringere Druckabfälle in Durchlaufkolonnen. Schließlich sind sie in Fluidbettreaktoren günstiger, weil sie nicht zur Oberfläche treiben und flottieren, sondern in der Lösung turbulent bleiben.

Für das Kompositum der Erfindung ist als weiterer Vorzug anorganischer Träger die Fähigkeit zur Einstellung geregelter Porösität in einfacher und rationeller Weise und mit leicht verfügbaren Ausgangsstoffen zu nennen.

Obwohl der Wissensstand über die Bildung von Mikroorganismenschichten auf Trägerflächen erheblich ist, sind die bisherigen Kenntnisse der eigentlichen Bindungsvorgänge und -ablaufe gering. Bekannt ist jedenfalls, daß sich die meisten Mikroorganismen auf nicht toxischen Trägern festlegen lassen und sich dort auch vermehren. Der Ausdruck "Bindung" wird hier im weitesten Sinne

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gebraucht und umfaßt alle Arten der chemischen wie auch physikalischen "Bindung¹¹ oder Festlegung. In einigen Ausführungsbeispielen (nachstehend) erfolgte die Bindung durch einfache Adsorption. In anderen Fällen wurden die Träger zunächst mit Kopplungsmitteln, wie den Resten von Polysocyanaten oder Silankopplern überzogen und die Mikroorganismen über diese chemisch gebunden bzw. gekoppelt. Die Zellen können z.B. auch durch Yerkettung über oder auf den Trägerflächen gebunden werden»

Die geregelte Mikroorganismenbevölkerung besteht z.B. an Organis·= men einer Art des gleichen Größenbereichs wie auch Ansammlungen anderer Arten ähnlicher Größen dergestalt, daß wenigstens 70 % der Poren des Trägers Porendurchmesser in Größen zur leichten Aufnahme aller Bevölkermngsarten haben₉ raid worin ferner zur Sicherung der größtmöglichen Nutzfläche und zum Schuts gegen Auswaschung die im Anspruch 1 angegebenen Größenverhältnisse bezüglich der drei Mikroorganismengruppen (Bakterien = Hefe zellen - algen- oder pilzähnliche) eingehalten sind_o

Die Mindest- und Höchstabmessungen der meisten Mikroorganismen sind in der Literatur greifbar, oder können, durch bekannte Methoden ermittelt werden. Ebenfalls in bekannter Weise, z.B«, nach dem Quecksilbereindringungsverfahren kann festgestellt werden, ob wenigstens 70 96 der Poren eines gegebenen anorganischen Trägers den erwähnten Größenanforderungen entsprechen. Als "großflächig" wird hier ein Träger mit einer etwa 0,01 qm/g übersteigender Trägerfläche angesehen.

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Die Erkenntnisse einer optimalen Porengrößenverteilung eines gegebenen anorganischen Trägers für eine bestimmte Mikroorganismenbevölkerung erhält noch klarere Bedeutung durch Auswertung der experimentellen Ergebnisse im Lichte theoretisch-physikalischer Erwägungen.

Obwohl einige Mikroorganismen mit Spaltungsvermehrung, insbesondere Bakterien, Breiten (kleinere Abmessungen) bis au 5/um und einige Arten sogar bis zu 40 /um haben,, liegen diese Abmessungen für die Mehrzahl der ©!bakterien bei 0^3 - 1,5/um. Je nach der Mikroorganismenklasse beträgt die größte Eauptmessimg (Länge, im G-egsnsatz zur Breite) ein Mehrfaches dieser Größenordnung bzw« dieses GrößenbereiehSj, wobei Abweichungen je nach Alter, Wachstumsstadium, fypj liahrung usii_o auftreten. Im Regelfall reichen die kleinsten bis größten Hauptabmessungen der meisten sich durch Spaltunng vermehrenden Bakterien von etwa 0,5 - 3/ue_o

Hat beispielsweise ein Bakterium eine größte Hauptabmessung von 1 /um, so wird diese während des Spaltungsprozesses annähernd 2/um. Erfahren zwei auf gegenüberliegenden Seiten der Poreninnenfläche gebundene Mikroben gleichzeitig eine Spaltung, so muß die Porenweite bei dieser maximalen Ausnutzung der verfügbaren Fläche wenigstens 4/um betragen. TSm. einer weiteren Mikrobe von einem tiefer in der Pore gelegenen Punkt bis au einem Punkt außerhalb der Pore den Durchgang zwischen den sich spaltenden Mikroben zu gestatten muß der Porendurchmesser um mindestens 1/um größer sein (insgesamt 5/um).

909813/0826 . ₉ .

Während also der Mindestdurchmesser der Pore mindestens so groß wie die kleinst Hauptabmessung der Mikrobe sein muß, um ihr den Eintritt in die Porenöffnung zu ermöglichen, beträgt die die rationellste Ausnutzung der Oberfläche pro Trägervolumenseinheit gewährleistende obere Grenze der Porengröße für Mikroorganismen, welche sich durch Spaltung vermehren etwa das fünffache der größten Hauptabmessung des jeweils gebundenen Organismus.

Für den Fall der Bindung fungus-artiger Mikrobenorganismen genügt die Berücksichtigung einer Dimension, nämlich des Durchmessers der durchweg kugeligen Sporen. Während des Eeimens entwickeln die Sporen lange Fasern (Mycelien), die als vegetative Körper für die Entwicklung sekundärer Metaboliten und weiterer Sporen verantwortlich sind. Ihre Hauptabmessung ist wesentlich größer als die der Sporen. Um ihnen den genügenden Entwicklungsraum zu geben, wird daher ein wesentlich größerer Porenraum als nur für die Spore benötigt. Die obere Porengrenze ist in den Beispielen weiter unten erläutert.

Während der Porendurchmesser des Trägers wenigstens so groß wie die kleinste Spore sein muß, wird eine rationellere Ausnutzung der Besetzungsflächen erreicht, wenn die Poren etwas größer sind. Als obere, im Regelfall die rationellste Ausnutzung der Oberfläche pro Volumeneinheit gewährleistende G-renze der Porengröße wurde etwa das Sechzehnfache der größten Sporenabmessung des jeweils gebundenen, fungus-artigen Mikroorganismen gefunden.

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-/fa-Mr die Bindung von Hefezellen hängt das Verhältnis der Porenmorphologie und der Ansammlung einer größeren Biomasse von der Vermehrungsart des Organismus ab. Für die sich durch Sprossung vermehrenden Hefen kann als Anleitung folgendes Beispiel dienen. S. cerevisiae hat durchschnittliche Abmessungen von 2,5 - 6,5 mal 4,5 - 9,5/um; vgl.: The Yeasts, a Taxonomic Study, herausgegeben von J. Lodder, 2. Auflage 1971, Amsterdam - London. Wenn Zellen auf beiden Porenseiten zu sprossen beginnen, nimmt ihre Länge um etwa 1/4 - 1/2 der ursprünglichen Länge zu. Die entstehenden Zellen benötigen daher Poren von etwa dreifachem der Gesamtlänge der Zelle. Eine dritte Zelle benötigt für ihren Durchgan; zwischen den an der Wand fi eierten Zellen einen Kanal von etwa einer größeren Zelldimension. Um somit Hefezellen in jedem Entwicklungsstadium durchzulassen und zu immobilisieren, müssen die Poren etwa das Vierfache der größten Abmessung der jeweils eingesetzten Hefezellen betragen. Innerhalb einer Spezies bestehen biologische Varianten verschiedener Größe. Daher zeigen die Beispiele weiter unten Abweichungen innerhalb einzelner Kulturen mit verschiedenen optimalen Spitzen der optimalen Beschickung für den jeweiligen Bevölkerungsausschnitt.

Während der Porendurchmesser des Trägers wenigstens so groß sein muß wie die kleinste Abmessung der Hefezelle, wird eine stärkere Besetzung und rationellere Ausnutzung der Innenflächen der Poren erreicht, wenn diese etwas größer als die zur Aufnahme einer Zelle erforderliche Mindestgröße sind. Es wurde gefunden, daß die obere, die rationellste Ausnutzung der Oberfläche pro Volumeneinheit

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gewährleistende Grenze der Porengröße etwa das Vierfache der größten Hauptabmessung der jeweils gebundenen Hefezellen beträgt.

Ist die Organismenvermehrung als solche nicht der Hauptzweck, sondern z.B. die eine relativ konstante stationäre Phase erheischende Erzeugung sekundärer Metaboliten, so wird eine rationellere Ausnutzung der Innenflächen erzielt, wenn die überwiegende Mehrzahl der Poren Größen näher an der kleinsten Haupt abmessung der Mikroorganismen besitzen. Je nach dem Einsatzzweck der zu immobilisierenden Mikroorganismen wird die rationellste Flächennutzung für die Bindung der jeweiligen Organismenart erreicht, wenn eine Mehrheit (wenigstens 70 %) der Poren des anorganischen Trägers Porengrößen von einer Größe gleich der kleinsten Hauptabmessung des Mikroorganismus (oder der Spore) bis zum fünffachen bzw. vierfachen bzw. sechzehnfachen der größten Hauptabmessung haben. Wie aus den Beispielen weiter unten hervorgeht, wurde ein Spitzenwert für die Biomassenflächenansammiung gefunden, wenn sich die Porengrößen des Trägers in diesem Bereich bewegten. Die optimale Besetzung wurde erzielt, wenn wenigstens 70 % der Poren Porendurchmesser von etwa dem Fünffachen der kleinsten Hauptabmessung des Mikroorganismus im Falle von Bakterien (Spaltungsvermehrung), dem 2 - 13-fachen im Falle von fungus-artigen Organismen, und dem 3 - 4-fachen im Falle von Hefezellen hatten.

Vergleichsversuche zeigen die Wichtigkeit der Regelung der Porengrößenverteilung der anorganischen Träger. Sie bestätigen, daß wenigstens 70 % der Poren in den erwähnten Größenbereich fallen

sollten.

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In den folgenden Beispielen wurden als Träger Stoffe mit bekannter, und einigermaßen geregelten Porösität gewählt, wie verschiedene G-lasfritten und cordieritartige kristalline Träger. In den Beispielen I - IT (Tabellen I - YII) fielen wenigstens 70 % der Poren der G-lasfritten und cordieritartigen Träger in den geforderten Bereich (77 - 100 % der G-lasfritten, 76 - 100 % des AlpO^-Cordieritträgers). Die Porengrößenbereiche, und (in Klammern) die durchschnittlichen Porengrößen der Träger waren: G-lasfritten 0,8 - 1,8 (1,1), 1,5 - 4 (3,1), 3-6 (4,5), 8 - 20 (13), 13 - 60 (32), 170 - 220 (195); Cordieritartige Träger 2-9 (4,5), 1,5 - 20 (10), 4,5 - 100 (18).

Im Beispiel V, Tabellen VIII und IX, hatten die Besten der als Träger verwendeten G-lasfritten und cordieritartigen Stoffe ebenfalls 70 % ihrer Porengrößen im geforderten Bereich (77 - 100 % der Glasfritten, 76 - 100 % des AlgO^-Cordierits). Die Porengrößenbereiche und (in Klammern) die durchschnittlichen Porengrößen betragen hier:

G-lasfritten 1,5 - 4,5 (3,5), 3-6 (4,5), 8-20 (13), 18 (40), 170 - 220 (195); cordieritartige 1,5 - 6 (3), 2-9 (10); Spinel-Zirkoniumoxid 17 - 35 (19).

In den Beispielen VI - VIII, Tabellen X - XIII lagen ebenfalls die besten G-lasfritten und kristallinen Träger mit wenigstens 70 % im geforderten Bereich (75 - 100 % G-lasfritten, 100 % Spinel-Zirkonoxid, 71 - 100 % Cordierit). Die Porengrößenbereiche und die durchschnittlichen Porengrößen sind in den Tabellen X, XII, XIII

angegeben.

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Da die Ermittlung der Besetzung mit Biomasse eine Messung der Anzahl gebundener Mikroorganismen in den Poren verlangte, konnte die übliche Platt.enzählung nicht vorgenommen werden. Es wurde daher ein Biometer (Du Pont Modell 760) zur Bestimmung des ATP-(Adenosintriphosphat) Gehalts in folgender Weise eingesetzt. Etwa 10 - 20 mg des Kompositum wurden 0,5 ml 90 %-iges DMSO (Dimethylschwefeloxid) in Wasser zugesetzt, und die Suspension 10 Sek. kräftig durchmischt. Die Suspension wurden 20 Min. stehen gelassen, dann mit 4 ml 0,01 M Morpholinpropansulfonsäure, (MOPS), pH 7,4 als Puffer versetzt, kräftig gemischt und bis zur Auswertung im Biometer in Eis gesetzt. 10/ul dieser Lösung wurden in eine bereits in den Biometer eingesetzte und die Lueiferin-Luciferasemischung enthaltende Küvette gegeben. Die Reaktion des extrahierten ATP mit der Enzymmischung erzeugt Licht, das quantitativ meßbar und der ATP-Menge proportional ist.

Die Zuverlässigkeit dieser Meßergebnisse beträgt 20 %, (YgI. Instruction Manual, 760 - Luminescence - Biometer, E.I. Du Pont De Nemours & Co. Wilmington Delaware, USA, Dezember 1970)

Soweit nicht anders angegeben, hatten die Träger in den Beispielen Partikelgrößen von 18-25 mesh = 0,71 - 1 mm.

Beispiel I Einfluß der Porengröße auf die Bindung von Escherichia coli

Proben von E.coli mit Hauptabmessungen von 1 - 6 /um wurden auf den angegebenen Träger unter sterilen Bedingungen durch einfache

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Adsorption sowie mit Silankopplern gebunden* Die Bindung durch Adsorption erfolgte durch Umsetzung von 3 g Abschnitten von Partikeln der Größen 18-25 mesh, der angegebenen Träger während 3 Std. bei 22⁰C mit 20 ml einer Suspension der E. coli Zellen. Die Bindung mit Silankopplern erfolgte durch Umsetzung von 2 g Abschnitten von 18-25 mesh = 0,71 - 1 mm großen Partikeln mit 20 ml einer 10 %-igen Lösung von Gamma-Aminopropyltriethoxysilan in Wasser während 2 Std. bei 100⁰C. Die so silanisierten Oberflächen wurden getrocknet und zur Bindung der Mikroorganismen über Nacht bei 22⁰C mit 20 ml einer Suspension der E. coli Zellen umgesetzt. Die Bakterienbesetzung (No./g Träger) wurden etwa 18 Std. nach der Bereitung des Präparats über ATP Messung aufgezeichnet. Die Tabelle I enthält die Ergebnisse. Der Prozentsatz der gesamten Poren mit Porendurchmessern im Bereich von einmal der kleinsten Hauptabmessung und fünfmal der größten Hauptabmessung ist nach der Angabe des durchschnittlichen Porendurchmessers in Klammern angegeben,,

	L E	I	Träger	durchschnittl. Poren u. % im Bereich 1-5x	Bindung Adsorption	X	10⁹	Silankoppler	X	10⁹
TABEL		Glasfritte	1,1 (81 96)	1,92	X	10⁹	1,62	X	10⁹
Bakterienzahl pro £ Kompositum	I!	3,1 (100 96)	1,96	X	10⁹	1,65	X	10⁹
Il	4,5 (100 %)	2,60	X	10⁸	2,46	X	10⁸
Il	13 (100 %)	8,68	X	10⁸	6,27	X	10⁸
Il	32 (33 96)	4,91	X	10⁸	1,21	X	10⁸
Il	195 (0 96)	3₉83	X	10⁷	2₉63	X	10?
Borsilikat glas	unporös (0 %)	1,98	g		3,25
se? (18-25° ^S	:" 909813/	082
=0,71-1mm)	Lw ο Xi.

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Aus diesen, in der Figur 1 abgetragenen Angaben ist ersichtlich, daß die größte Oberflächen-Biomasse pro yolumeneinheit mit [Trägern der durchschnittlichen Porendurchmesser von etwa 4,5/um erzielt wurde, vgl. Figur 2. Die gesamte Spitze der Kennlinie der Figur liegt innerhalb des Bereichs von einmal der kleinsten Hauptabmessung und fünfmal der größten Hauptabmessung der Mikroorganismen E. coli, also etwa 30 /um.

Beispiel II Bindung von Serratia Marcescens

Das Bakterium S. marcescens mit Hauptabmessungen von 0,6 - 2/um wurde mit einem Koppler aus Polyisocyanat (PAPI 901) auf der Oberfläche des Trägers aus dem Beispiel 1 ähnlichen gefritteten Glas gebunden. Die Tabelle II und die Figur 3 zeigen die durch die Kopplung erzielte und mit dem Biometer (ATP Analyse) gemessene Besetzung. Die Kopplung wurde folgendermaßen vorgenommen: 0,5 g Träger wurden in einen Kolben (Mikro-Fernbachkolben, von 50 ml) und 10 ml einer 0,5 96-igen Lösung von PAPI 901 in Azeton als Kopplungsmittel gegeben. Nach erreichter Kopplung wurde die PAPI 901 Lösung abgegossen und durch 10 ml einer 3 x 10 Zellen S.marcescens/ml enthaltenden Lösung ersetzt. Die Zellen und der Träger wurden 3 Std. umsetzen gelassen, dann die überschüssigen Zellen abgegossen und der Träger dreimal mit 0,1 N Phosphatpuffer bei pH 7,2 gewaschen.

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NAOHCSRaKSHT

TABELLE II

Besetzung von S.marcescens und Porendurchmesser

Träger

durchschnitti. Porendurchmesser (/um) und % im Bereich ' 1-5x

Glasfritte	1,1 (100 96)
Il	3,1 (100 %)
It	4,5 (100 96)
Il	13 (18 % )
Il	32 (0 96 )
η	195 (0 96 )
Borsilikatglai	3 unporös (0 96)

Zellen/g

1,64	X	10
20,2	X	10
7,5	X	10⁸
5,56	X	10
2,93	X	10
0,40	X	10
1,96	X	10

Die Figur 3 zeigt, daß die Besetzungsspitze bei G-las der Partikelgröße 3,1/um, etwa 5 x dem kleinsten verzeichneten Wert erfolgt und die hohe Biomasse gerade noch sichtbar bei 13/um, also mehr als dem fünffachen der größten verzeichneten Abmessung ist.

Beispiel III Bindung von Bacillus Subtilis

Der Versuch entsprach im wesentlichen dem vorigen Beispiel, jedoch wurde das Bakterium auf dem Träger nicht gekoppelt, sondern adsorbiert. Bergey's Manual, 8. Auflage, S. 533 gibt als Größe von B. subtilis 0,7-0,8x2- 3/um. Die unter dem Mikroskop klassierte

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Kultur hatte Durchschnittsgrößen von 1 χ 3 - 4/um, mit einigen längeren Doppelzellen von 7/um.

Als Träger wurde die nach Porengrößen klassierte G-lasfritte verwendet. Sie wurde im Autoklav getrocknet und zur Vermeidung einer Kondensation auf 37°C gehalten.

Die B. subtilis Zellen wurden in 1 Itr. einer Gehirn-Herζ-Infusionsbrühe gezüchtet, zentrifugiert und zweimal mit sterilem Phosphatpuffer gewaschen. 10 ml der gewaschenen Zellensuspension wurden in jeden 0,5 g Trägermaterial enthaltenden Korben gegeben. Nach 3 Std. Kontaktdauer wurden die Träger dreimal gewaschen und über Na.iht bei 8⁰C aufbewahrt.

Die Anzahl der Zeilen auf den Trägern wurde durch ATP Messung mit einem Du Pont Biometer ermittelt. Jfür Doppelverluste wurde der Durchschnitt gewählt.

TABELLE III

	Besetzung von B, subtilis und	Porendurchmesser
Träger	durchschnittl. Porendurchmesser (/um) und 96 im Bereich ' 1-5x	Durchschnitt zahl Zellen pro g Träger
Glasfritte'	1,1 (0 96)	2,4 x 10⁷ +)
It	3,1 (77 96)	9,5 x 10⁷
η	4,5 (100 96)	1,54 x 10⁸
η	13 (100 96)	3,27 x 10⁷
η	32 (56 96)	■ 1,56 χ 10⁷ +)
Il	195 (0 96)	1,12 χ 10⁶ +)
Borsilikatglas unporös (O %)	1,13 x 10⁶ ψ)
+)Originalzählwert des % »ome{ ws m>■/· Mr³	der unteren

Meßgrenze des Biometers.

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Die Kurvenspitze liegt zwischen 3,1 und 13/U, also im Bereich 1-5 mal der kleinsten bis größten Hauptabmessung der Mikroorganismen. Wie in den anderen Beispielen wurde die Besetzung sehr viel kleiner, wenn weniger als etwa 70 % der Poren außerhalb des 1-5 Bereichs lagen.
Die mit kreuzchen markierten Tabellenwerte wurden unter Zugrunde-

legung einer Höhe von 1O^ errechnet, obwohl in Wirklichkeit die

4- 3

Höhe auch 10 oder 10 sein konnte. Jedenfalls sind die Werte unterhalb 10 Zellen/g niedriger, was den kleinen, optimalen Porengrößenbereich für B. subtilis unterstreicht.

Beispiel IV Bindung von Ehodospirillum rubrum

Dieses Bakterium hat Abmessungen von 0,8 - 7 - 10/um, in einigen Fällen auch Maximalgrößen von nur 3/um. Sie wurden durch einfache Adsorption auf mehreren Trägern der angegebenen Porengrößen gebunden, indem eine 10 ml Suspension der R. rubrum Zellen/ml mit 0,5 g Proben der Träger während 3 Std. bei 22⁰C in Kontakt gebracht wurden. Die Zellenbesetzungen wurden dann durch ATP mit dem Biometer ermittelt.

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TABELLE IV Besetzung von R. rubrum und Porendurchmesser

Träger durchschnittl. Zellen/g

Porendurchmesser (/u) und % im Bereich ' 1-5x

Glasfritte 4,5 (100 %) 6,25 x 1O⁹

Cordierit _Q

(18-25 mesh) 4,5 (86 %) 5,7 x 10^y

» 10 (90 %) 2,7 x 10⁹

Glasfritte 13 (100 %) 1,21 χ

Cordierit 18 (76 96)- 9,6 χ 10⁸

Glasfritte 32 (89 %) 1,29 χ

" 195 (0 %) 1,7 χ 10⁸

Borsilikatglas unporös (0 %) 9x10

In weiteren Versuchen konnten auch die Bakterien Clostridium butylicum (3 - 7/um) und Flavobacterium (1 - 3/um) in großen Mengen in den Trägerporen gebunden werden.

Die Bedeutung einer geregelten Porengrößenverteilung wurde durch Vergleich eines anorganischen Trägers bekannter, geregelter Porösität (20 % Al₂O₃ - 80 % Cordierit mit durchschnittlichen Porengrößen von 2 - 9/um mit einem porösen anorganischen Träger ungeregelter Porösität (Bimsstein) nachgewiesen werden. Das Bakterium E. coli K-12 wurde auf beiden porösen Trägern auf die in den obigen Beispielen 'beschriebene Weise gebunden und dann in Durchlaufkolonnen mit einer Nährlösung gegeben.

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Der in diesen Versuchen -verwandte Bimsstein wurde in Form größerer Stücke von etwa 2-4 inch = 5 - 10 cm Durchmesser bezogen. Die Brocken wurden im Mörser zerbrocnen und auf Größen von 18-25 mesh = 0,71 - 1 mm gesiebt.

Alle Träger und Gefäße wurden vor Gebrauch sterilisiert. Nach der Immobilisierung der Bakterien wurden die Träger 3-4 mal mit sterilem Phosphatpuffer, pH 7_f2 gewaschen, die schlammigen immobilisierten Zellen auf ihren einzelnen Trägern in Kolonnen gebracht und als Zellengeneratoren geprüft.

Die Anzahl der Mikroorganismen in der abfließenden Lösung wurde durch Plattenzählung in Nähragar bestimmt. Die Figuren 4 und 5 zeigen die Porösitätskennlinien für AlpO^-Cordierit und Bims und zeigen den sehr breiten Porenbereich des Bimssteins, während der AlpO^-Cordieritträger einen sehr scharf definierten Porenbereich mit einem Durchschnitt von etwa 5/um zeigt. Die Oberflächenmessung ergab 0,3800 qm/g für AlgO^-Cordierit und 0,2100 qm/g für Bims.

Das Volumen von 2 g Bims war etwa das Doppelte eines gleichen Gewichts AlpO-z-Cordierit. Während der Versuchsdauer nahm das mit Bims beschickte Kolonnenvolumen leicht ab, während im Falle von AIpO,-Cordierit die Verluste wesentlich geringer waren, s. die Tabelle V.

Für die Immobilisierung wurden je 2 g Träger verwendet. Die auf AlgO^-Cordierit immobilisierten E.coli K-12 wurden dann in die eine von zwei Kolonnen, die auf Bims immobilisierten in die zweite

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Kolonne gegeben. Beide Kolonnen liefen gleichzeitig, in den meisten Fällen wurden sie mit dem gleichen Medium versorgt. Die Tabellen IV und Y zeigen das Ergebnis der Plattenzählung. Wie beide Tabellen zeigen, besaß in den meisten Fällen der AlpO^-Cordieritträger eine größere Anzahl Zellen als der Bimsträger. Die Ergebnisse des zweiten Versuchs waren zwar nicht ganz so deutlich, zeigen aber immerhin eine größere Produktion für den Träger geregelter Porösität als Bims.

Eine besonders interessante Beobachtung konnte für den Fall einer Durchflußsteigerung für beide Träger gemacht werden. Es trat ein plötzlicher und sehr starker Abfall der Zählwerte ein. Eine genauere Untersuchung der erstellten Schaubilder ergibt eine raschere Reaktion des AIpCU Trägers als des Bimsträgers, die möglicherweise auf dem kleineren Bettvolumen des Al₂CU-Cordieritträgers beruht.

TABELLE V

Volumenverlust beim Trägereinsatz in Mikroorganismengeneratoren Versuch

Zeit in Tagen	Kolonnenhöhe in cm	Al₂0,-Cordierit
	Bims	3,4
O	6,6	3,3
1	6,55	3,3
2	6,3	3,0
O	5,85	2,9
1	5,6	2,9
2	5,5

- 22 -

909813/0826

TABELLE VI

Zellenanzahl im Ablauf von E. coli Kolonnen mit AlpO^-Cordierit und Bims als Träger

	Zellen/r- ml χ 10°	Erster	9098	Versuch	Zellen/_fi ml χ 10°	Al₂O₅- Cord. Durch satz ml/Std.	Zellen/_Q Std.x1O^y
Zeit in Std.	0,05	Bims Durchsatz ml/Std.	Zellen/ _Q Std. χ 10^y	1,0	50	0,05
0,25	0,03	50	0,002	1,0	50	0,05
1,5	0,02	50	0,002	4,0	50	0,2
3,75	0,02	50	0,001	2,0	95	0,2
4,75	2,0	106	0,002	100,0	95	9,5
20,75	2,0	106	0,21	20,0	240	4,8
21,75	2,0	253	0,51	90,0	240	21,6
22,75	3,0	253	0,51	140,0	240	34,0
23,75	9,0	253	0,76	75_sO	240	18,0
24,75	17,0	253	2,3	85,0	240	204,0
25,75	2,0	253	4,3	2,5	502	1,0
25,90	9,0	490	1,0	57,0	502	27,0
26,75	13,0	490	4,4	0,6	502	0,30
27,75	17,0	490	6,4	290,0	502	146,0
28,75	24,0	490	8,3	410,0	502	206,0
45,00	11,0	490	11,8	460,0	980	451,0
45,75	28,0	996	11,0	75O_sO	980	735,0
46,75	27,0	996	28,0	210,0	980	206,0
47,75	12,0	996	26,0	59O_sO	980	578,0
48,75	28,0	996	12,0	90,0	980	88,0
49,25	30,0	996	28,0	120_s0	980	118,0
51,25	29,0	996	30,0	120,0	980	118,0
52,50		996	29,0			- 23 -
	13/0826

-SiS-

TiBEIlE YII

Zellenanzanl im Ablauf von E.	als Träger	coli Kolonnen mit	9 0	Zellen/ _Q Std. χ 10^y	Zelle ml χ	6	ΑΙρΟ,-Cordierit	Zellen/ _Q Std. χ 10^y
und Bims			0,00814	1,5		0,04
	Zellen/,- ml χ 10°	Zweiter Versuch	0,003	3,6		0,09
Zeit in Std.	0,37	Bims Durchsatz ml/Std.	0,5	41,0	n/_fi Al₉O,- ^Ίυ Cord. Durch satz ml/Std.	2,0
0,25	1,3	22	0,03	26,0	24	1,3
1,25	1,1	22	0,03	4,5	24	0,2
1,75	0,7	48	0,03	2,6	49	0,3
2,25	0,6	48	0,004	1,6	49	0,2
2,75	0,6	48	0,22	30,0	49	3,0
3,75	0,05	48	0,04	4,8	49	1,2
4,75	2,2	98,5	0,1	6,5	99,5	1,6
20,75	0,2	98,5	0,45	17,0	99,5	4,2
21,25	0,4	247,5	1,9	12,0	249	5,0
22,75	1,8	247,5	1,9	51,0	249	21,4
23,75	4,4	247,5	0,26	10,0	249	4,2
25,75	4,4	438	4,2	25,0	420	10,5
27,00	0,6	438	19,7	60,0	420	25,2
27,75	9,6	438	14,1	6,2	420	5,6
28,75	45,0	438	34,3	15,0	420	13,5
44,75	16,0	438	15,0	23,0	420	2o,7
46,25	39,0	880	23,8	41,0	900	36,9
46,75	17,0	880	30,8	34,0	900	30,6
47,85	27,0	880	43,1	65,0	900	58,5
49,75	35,0	880	29,9	33,0	900	29,7
50,75	49,0	880	9813/082	900	- 24 -
51,75	34,0	880		900
52,80		880		900

Die unterschiedliche Anzahl der mit den Trägern erzeugten Zellen war in den ersten 20 - 24 Std. der Versuche sogar mit dem bloßen Auge erkennbar. Der Ablauf der Al₂0,-Cordierit enthaltenden Kolonne war bei niedrigem Durchsatz (bis 500 ml/std.) deutlich getrübt, während der Ablauf der Bimsträger klar blieb. In dem ersten Versuch wurde die Trübung in beiden lallen annähernd gleich, als der Durchsatz 1 Ltr./Std. erreicht hatte, im zweiten Versuch war dies bei 500 ml/std. der lall.

Die vorigen Beispiele zeigen klar die größere Wirksamkeit der AlpO^-Cordieritträger mit ihrer geregelten Porosität im Vergleich zu dem Bimsträger ungeregelter Porosität.

In den folgenden Beispielen konnte die kritische Bedeutung bestimmter Trägerporengrößen für Mikroorganismen, die sich durch Sprossung vermehren, insbesondere für Hefezellen, nachgewiesen werden.

Beispiel V

Die Hefezellen wurden in Kolben in 1 % Dextrose enthaltenden Nährlösungen 36 - 40 Std. bei Zimmertemperatur gezüchtet. Die Zellensuspension wurde zentrifugiert und dreimal mit einem Natrium-Kaliumphosphatpuffer, pH 7,2, gewaschen, als konzentrierte Suspension zu dem Träger gegeben und während 3 Std. Kontaktdauer durch Schütteln gemischt.

- 25 909813/0826

Zur Adsorption wurde der anorganische Träger auf 18-25 mesh = 0,71 - 1 mm gemahlen, trocken sterilisiert und über Nacht "bei 37 C in einen Inkubator gebracht. Jeweils 0,5 g dieses Trägers wurden in 50 ml Mikro-Fernbachkolben mit je 10 ml der konzentrierten Hefezellensuspension versetzt. Nach 3 Std. Kontaktdauer wurden die überschüssigen Zellen abgegossen, der Träger dreimal mit Phosphatpuffer gewaschen und im Kühlschrank aufbewahrt.

Zur Kopplung wurden jeweils 0,5 g Träger in einen 50 ml Mikro-Pernbachkolben eingeführt, trocken autoklav!ert und zur Trocknung des Trägers über Nacht bei 37⁰C in einen Inkubator gesetzt. 10 ml einer 0,5 %-igen PAPI 901 lösung (im Handel erhältliches Polyisocyanat) in Azeton wurden jedem Kolben zugesetzt. Die Kolben wurden 3/4- Std. gescbüttelc vnd die J^JAPI Lös .ig abgegossen. 10 ml konzentrierte Hefe-•sellensuspension wurden jedem Kolben zugesetzt und der Kolben während 3 Std. Kontaktdauer geschüttelt, dann die überschüssigen Zellen abgegossen und der Träger dreimal mit Phosphatpuffer gewaschen. Alle Kolben wurden über Nacht bei Kühlschranktemperatur aufbewahrt.

Die Anzahl der Hefezellen auf dem Träger wurde mit einem DuPont Biometer über die ATP Messung bestimmt, wobei das ATP der Hefezellen auf dem Träger durch Einbringen in einen ATP Löser extrahiert wurde, und kleine Mengen des Extrakts für die Messung mit dem Biometer entnommen wurden. Nach Aufstellen einer Verhältnisgleichung zwischen der ATP Menge in einer Hefezelle und der gesamten, durch Plattenzählung erhaltenen Zellenanzahl wurde die Gesamtzahl der Zellen auf dem Träger errechnet.

- 26 909813/0326

- TtiT-

2838580

Die Ergebnisse der ersten Versuchsreihe mit adsorbierten Zellen sind in der Tabelle YIII enthalten.

TABELLE VIII

Auf verschiedenen Trägern	Porenver teilung in /U	durch Adsorption :	Immobilisierte	19	Anzahl der Zellen/g Träger 1)
Saccharomyces cerevisiae	1,5-6			0	2,1 χ 10⁷
durchschnittl. Porengröße in/u	1,5-4,5	Zusammen setzung des Trägers	durchschnitti. Prozentsatz der Poren im Bereich 1-4x	0	2,7 x 10⁶
3,0	3-6	Cordierit	74		2,7 x 10⁷
3,5	2-19	Glasfritte	81		4,3 x 10⁷
4,5	8-20	π	100	7,0 χ 10⁶
10	17-35	Cordierit	74	2,3 x 10⁷
13	18-100	Glasfritte	95	4,9 x 10⁶
19	170-220	Spinel-Zirkonium- 100 oxid	1,1 χ 10^β
40	—	G-lasfritte	1,9 x 10^β
195	tt
unporös	Borsilikatglas

1) Mit dem Biometer gemessen und als Hefezellen
berechnet.

Wie das Schaubild der Figur 8 zeigt, ergeben diese Daten eine ziemlich breite, von 3 - 40 /um mit zwei Spitzen reichende Kennlinie„ Dies stimmt sehr gut mit der Beobachtung überein, daß die durchschnittlichen Zellenabmessungen 4 - 4,5 /um (2,5 - 4 mal 4-7)

909813/0826

- 27 -

-20-

betragen, während 20 % der Zellen längen von 4,5 - 7/um haben. Die Yariabilität innerhalb einer Kultur erklärt die breite Doppelspitze. Der scharfe Abfall bei 3,5 /inn. wird nicht durch die Größe der durchschnittlichen Pore, sondern durch den kleineren Porenbereich in diesem Träger verursacht, der hier 1,5 - 4,5/um beträgt, während der 3/um Träger einen Bereich von 1,5 - 6/um hat. Die entsprechenden Daten für chemisch gekoppelte Hefezellen sind in der Tabelle IX wiedergegeben.

Die Ergebnisse für gekoppelte Zellen befinden sich in der Tabelle IX.

TABEIIE IX

Durch Ko]3plung_	immobilisierte S. amurcae	Zusammen setzung des Trägers	durchschnittl. Prozentsatz der Poren im Bereich 1-4x	Anzahl der Zellen/g Träger 1)
durchschnittl. Porengröße in/U	Porenver teilung in /U	G-lasf ritte	69	6,5 x 10⁴
3,5	1,5-4,5	It	100	1,8 χ 10⁶
4,5	3-6	Il	100	1,2 χ 10⁶
13	8-20	Spinel-Zirkonium- oxid	100	1,7 x 10⁶
19	17-35	Glasfritte	81	5,5 x 10⁶
40	18-100	Il	0	3,6 χ 10⁵
195	170-220	Borsilikatglas	0	9,0 χ 10³h)
unporös	—

1) Mit dem Biometer gemessen und als Hefezellen berechnet.

+) Zunächst als 10 Einheiten ATP gemessen (untere Biometergrenze).

909813/0826

- 28 -

Da diese zweiphasige Kultur kleine Einzelzellen und große, sich verdoppelnde Zellen enthielt, zeigt das Schaubild der Figur 9 eine Kennlinie mit doppelter Spitze. Die Hauptspitze liegt im Bereich 13-40 plus /um. Dies stimmt gut mit der Beobachtung von Größen der kleinen Einzelzellen von durchschnittlich 5,5 - 7/um ( 3 - 7 χ 6-9) und der etwa 75 % der Gesamtbevölkerung ausmachenden großen Zellen von 6 -8x13 -18 /um Länge überein.

Beide Versuche beweisen den optimalen Porengrößenbereich für sich durch Sprossung vermehrende Mikroorganismen von 1 mal der kleineren Abmessung bis 3-4 mal der größten Abmessung der Zelle.

B eispiel YI

Sporen von Aspergillus niger (3 - 5/vm) wurden aus einer reifen Kultur in einer Blake'sehen !"lasche mit einem sterilen Phosphatpuffer herausgelöst und die Suspension mit dem Puffer auf 100 ml ergänzt. 10 ml dieser Suspension wurden in 50 ml Mikro-Fernbachkolben gegeben, welche zuvor mit 1 g Träger über Nacht im Autoklav getrocknet worden waren. Nach 3 Std. Schütteln bei Zimmertemperatur wurden die überschüssigen Sporen abgegossen, der Träger dreimal mit Phosphatpuffer gewaschen und über Nacht bei 8⁰C aufbewahrt. Die adsorbierten Sporenmengen wurden mit dem Biometer über die ATP Messung bestimmt, s. die Tabelle X.

- 29 -

909813/0826

TABELLE X

durchschnittl. Porengröße in /U	Porenver teilung in /U	Zusammen setzung des Trägers	durchschnittl. Prozentsatz der Poren im Bereich 1-4x	ATP f g pro g Träger	+) l —ι
3,5	1,5-4	Glasfritte	75	4,8 χ	10⁸
4,5	3-6	It	100	3,8 χ	10⁷
10	2-19	Cordierit	93	6,0 χ	10⁷
13	8-20	Glasfritte	100	1,3 x	10⁸
19	17-35	Spinel-Zirkonium- oxi d	100	9,7 χ	10⁷
40	18-100	Glasfritte	91	3,1 x	10?
195	170-220	tt	0	3,1 x	10⁷
unporös	_	Borsilikatglas	0	3,4 χ	10⁷

+) fg - Femtogramm (1O~ g), Biometereinstellung für Standard ATP Lösung &. 2,44 x 10⁸.

Nach Beobachtungen "beträgt die Größe der durchschnittlichen Spore von Aspergillus niger 4/um, bei einer Sporenverteilung im Bereich 3 - 5/um.

Zur Bestimmung des optimalen Porendurchmesserbereichs für das Mycelienwachstum wurden 0,5 g jedes Trägers mit den immobilisierten Sporen in Dextrosebrühe auf Zimmertemperatur gegeben. Nach 27 Std. im Schüttelkolben wurde je eine Probe entnommen und die Menge des ATP als Maßstab für das Mycelienwachstum bestimmt. Die Tabelle XI enthält die Ergebnisse.

909813/0826 ~⁵°

TABELLE XI

Mycelienwachstum von A.	Porenver teilung in/u	niger auf verschiedenen Trägern	durchschnittl. Prozentsatz der Poren im Bereich 1-4x	91	ATP f g pro g Träger	10⁹
durchschnittl Porengröße in/u	1,5-4	Zusammen setzung des Trägers	75	0	2,6 χ	10⁹
3,5	3-6	G-lasf ritte	100	is O	7,5 x	10¹⁰
4,5	2-19	Il	93		1,9 x	10⁹
10	8-20	Cordierit	100	9,3 x	10¹⁰
13	17-35	Glasfritte	Spinel-Zirkonium- 100 oxid	1,3 x	10¹⁰
19	18-100	G-lasf ritte	2,0 χ	10⁹
40	170-220		1,5 x	10⁸
195		Borsilikatgli	2.1 χ
unporös

Die Figur 10 zeigt das entsprechende Schaubild für die Ergebnisse der Tabelle XI.

Obwohl die größte Sporenmenge in den kleinsten Poren (3,5 /um) immobilisiert waren, war diese Porenweite für größeres Mycelienwachstum zu klein. Das größe Mycelienwachstum vrarde in Trägern mit durchschnittlichen Porenweiten von 40 /um und 91 % der Poren im Bereich von 1 mal dem kleinsten Sporendurchmesser (3/um) bis 16 mal dem größten Sporendurchmesser (5/um) gefunden.

- 31 -

909813/0828

Obwohl die Sporenimmobilisierungskennlinie etwa die gleiche Sporenzahl für die 40 /um Träger wie für unporöses Glas zeigt, wurde eine erhebliche Steigerung des Mycelienwachstums für das 40 /um Glas gegenüber dem 195/um Glas oder dem unporösen Glas festgestellt.

Da eine ununterbrochene Kennlinie vom 40 /um zum 195/um Glas für eine durchschnittliche Pore von 80 /um ein dem bei 13/um beobachteten Wachstum entsprechendes Wachstum ergibt, ist klar, daß 80 /um die obere Grenze der Porengröße ist; und das ist das 16-fache des größten Sporendurchmessers (5/um).

Die beiden folgenden Beispiele für zwei weitere, fungusartige Mikroorganismen belegen dies ebenfalls. Untersucht wurden Streptomyces olivochromogenes mit Sporen von 1 - 2,5/um großen Durchmessern, und Penicillium chrysogenum, mit Sporen von 2,5 - 4,5/um im Durchmesser.

Beide Sporenarten können durch Adsorption auf anorganischen Trägern immobilisiert und die Sporenmenge durch Proteinanalyse bestimmt werden. Nach der Adsorption wurde ein Mycelienwachstum in den Trägerporen gefördert, und dieses Wachstum durch Proteinanalyse nach Wachstumsperioden von 24 und 48 Std. gemessen. Es gelangten neun Träger mit sehr unterschiedlichen Zusammensetzungen zum Ein·* satz.

- 32 909813/0826

Beispiel VII Streptomyces olivochromogenes

Gleiche Sporenmengen in Phosphatpuffern wurde je 0,5 g Träger zugegeben und über Nacht 48 Std. umsetzen gelassen. Die nicht reagierenden Sporenanteile und der Träger dreimal mit je 2 ml sterilem Phosphatpuffer gewaschen. Die nicht reagierten Sporen und die Waschlösungen wurden gesammelt, ihr Tolumen" gemessen und auf Proteingehalt analysiert. Die vom Träger adsorbierte Proteinmenge wurde als Differenz zwischen dem Anfangsproteingehalt in dem umgesetzten sporenhaltigen Volumen und dem der nicht reagierenden Sporen plus Waschlösung errechnet.

Der die Sporen enthaltende gewaschene Träger wurde in einen 50 ml Emerson'sches Nährmittel enthaltenden Kolben gegeben und nach Inkubation das Mycelienwachstum (nach 24 bzw 48 Std. bei Zimmertemperatur und Schütteln) bestimmt.

Nach der Inkubation wurde der Träger abzentrifugiert und dreimal mit 10 ml Phosphatpuffer bei pH 7 gewaschen. Die gesamte Trägermenge wurde mit 3 ml Phosphatpuffer extrahiert, dann 3 ml 1N NaOH zugesetzt, die Temperatur auf 60⁰C erhöht und 1 Std. zur Hydrolyse der Mycelien gehalten, wodurch eine quantitative Proteinabgabe durch das Mycelium erreicht wurde.

Zur weiteren Proteinextraktion wurden 3 ml Äthylalkohol zugesetzt und die entstehende Mischung 0,5 Std. auf Zimmertemperatur gehalten.

009813/0826

Nach Zentrifugation wurden die Mischungen abgegossen und die Proteinmenge mit Min's Reagens bestimmt (s. Davies-Pritchard-Byron, Estimation MierοOrganismus in Petroleum Products, Journal of the Institute of Petroleum, 53, S. 275, 524 (1967) und Hauschka, Quantitative Determination of Ob-carboxyglutamie Acis in Proteins, in Analytical Biochemistry, 80, S. 212 (1977). Die adsorbierten Sporenmengen und das Mycelienwachstum sind in der Tabelle XII verzeichnet.

909813/0826

	3	TABEL	L E XII	% Poren im optimalen Bereich	Sporenadsorption ( ^ Protein) +) pro g Träger	Mycelienwachstum ( yProtein) pro g Träger 2* Std. 48 Std.	12,8 r 10⁵	2839580	jji
	3,5		100	7	86	13 x 10⁵		OO
	10 13	Sporenadsorption und Mycelienwachstum von	100	4	456	14,3 x 10⁵ 14,6 χ 10⁵
	1b	S. olivochromogenes	100 100	11 7	44 246	14 χ 10⁵
	19	Zusammen setzung des Trägers	71	10	10	13,4 x 10^:"
	40	Cordierit	100	13	260	11,3 χ 10⁵
Träger durch- Porenbereich schnittl. /um Poren- ' größe in/um	195	Glasfritte	53	6	48	-
1,5-6	-	Cordierit Glasfritte	0	7	52	0
1,5-4,5	jedem Träger in	Oordierit	0	0	0
to ο 2-13 CO ⁰⁰ 8-20	Spinel-Zirkonium- oxid		Kontakt gelangende Proteinmenge betrug 25 /g.
^ 3-100	Glasfritte
Si7-35 K)	Il
18-100	Borsilikat
170-220
unporös
+) Die mit

Die Meßwerte der Tabelle XII sind im Schaubild der Figur 11 abgetragen, das °.inen erheblichen Oberflächeneffekt der verschiedenen anorganischen Träger auf die SOorenadsop-otion und das Mycelienwachstum zeigt. Dieser Effekt ist möglicherweise spezifisch für S. olivechromo<?pnes, da er in den weiteren Beist>ielen für A₀ niger und P.chrysogenum nicht beobachtet wurde. So adsorbiert die negativere Glasfritte wenisrer Snoren, aber ermöglicht stärkeres Nycelienwachstum, während der ersten 24 Std. als die wenierer star> neerative Oberfläche des cnrdieritartigen, Vristallinen Träfrermateri als.

Nach dem Versuchsersebnis der Tabelle XIT bewirkt das kristalline Spinel-Zirkoniumoxid-Trägermaterial offenbar eine stärkere Ansammlung von Biomasse als Gordierit oder G-las. Dieser Obenfläch en effekt ist aber nicht von Dauer, sondern verschwindet Oraktisch nach 48 Std, Dieses Phänomen ist nicht ganz unerwartet und läßt sich so erklären. Die erste monozellulare Schicht wird naturgemäß durch den unmittelbaren Kontakt mit der Trägeroberfläche beeinflußt. Bei dem fortschreitenden Wachstum in zunehmender Entfernung von der Trägeroberfläche üben die Abmessungen der Trägerporen eine größere Wirkung auf die Biomassenansammlung aus, als die Oberfläche.

Wie erwähnt liegen die Abmessungen dieser Sporen im Bereich 1 - 2,5 /um. Eine Untersuchung der das Mycelienwachstum auf G-lasfritte nach einem Zeitraum von 24- Std. darstellenden Kennlinie und der dieses Wachstum nach 48 Std. wiedergebenden Kennlinie zeigt deutlich, daß eine hohe Biomassenansammlung beim 16-fachen der größten Sporenabmessung nämlich 16 χ 2,5 = 40 /um auftritt. Trotzdem muß festgestellt werden,

909813/0826 - 36 -

daß in Glasfritten mit einer durchschnittlichen Porengröße von 40 /um nur 53 % der Poren, und nicht die für praktisch brauchbare Träger geforderten 70 %, eine 1 - 40 /tun betragende Größe aufweisen. Festzuhalten ist auch, daß unter diesen Umständen sich die Ansammlung von Biomasse nicht wesentlich von der bei Verwendung von Glasfritten mit einer durchschnittlichen Porengröße von 195/um und keinen in den Bereich von 1 - 40/um fallenden Poren erreichten Biomasse unterscheidet.

Beispiel VIII Penicillium chrysogenum

Nach Beispiel VII wurden die Sporen auf dem Träger immobilisiert, dieser gewaschen und der Proteingehalt bestimmt. Zur Förderung des Mycelienwaehstums wurden anstatt der im Beispiel VII verwendeten Emerson'sehen Nährlösung 50 ml einer wässerigen lösung, pH 6,3, folgenden Inhalts benützt:

2 % Lactose, 1 % Glucose, 0,2 % IH₂PO₄, 0,125 % NH₄UO₃, 0,05 % Na₂SO₄, 0,025 % MgSO₄, 0,002 % MnSO₄, 0,00025 % GuSO₄, 0,002 % ZnSO₄.

Nur eine Inkubationszeitspanne von 48 Std. wurde angewendet. Ferner wurden statt 3 ml 2 ml Äthylalkohol zur Proteinextraktion verwendet. Im übrigen wurde nach Beispiel VII vorgegangen. Die Tabelle XIII und das Schaubild der Figur 12 zeigen die Ergebnisse.

- 37 909813/0826

TABELLE XIII

Sporenadsorption "und Mycelienwachstttm. von P. ChrysoRenum

Träger durch-Porenbereich schnittl. um Porengröße in /um

Zusammen setzung des Trägers	% Poren im optimalen Bereich
Gordierit	71
Glasfritte	83
Cordierit	98
Glasfritte	100
Cordierit	91
Spinell-Zirkonium oxid	100
Glasfritte	85
Il	0
Borsilikat	0

Sporenadsorption ( .^Protein) +) pro g Träger

Mycelienwachstum ( yProtein) pro g Träger 48 Std.

1,5-6
1,5-4,5
2-13
« 8-20
tj 3-100

S 17-35
ro

18-100
170-220
unporös

3,5 10 13 18 19

40 195 16,66 16,66 16,66 16,66 16,66 16,66

16,66 3,22 4,66

2052

168

1563

80

1026 2640

23,2 23,2 0

UO

(Ο

+) Der mit dem Träger in Kontakt gelangende Proteingehalt der Sporen betrug 16,66 yProtein/g Träger.

co co cn

Wie aus der Tabelle XIII zu entnehmen ist, wurde im Gegensatz zu dem für die Sporen von S.olivochromogenes festgestellten Verhalten kein Unterschied des Oberflächeneffekts bei Immobilisierung von P. chrysogenum auf verschiedenen Trägern beobachtet. Interessanterweise schien jedoch P.chrysogenum nach 48 Std. Mycelienwachstum das weniger stark negativ geladene Cordierit gegenüber der sehr negativ geladenen Glasfritte zu bevorzugen. Dies steht im scharfen Gegensatz zu der für S. olivochromogenes gemachten Feststellung.

Während die in der Figur 12 dargestellte Kennlinie des Mycelienwachstums auf der Glasfritte als Träger sich bei einem Porendurchmesser von etwa 40/um im wesentlichen abflacht, liegen nur 85 % dieser Poren im Bereich 2,5 - 72/um (1 mal die kleinste und 16 mal die größte Sporenabmessung).

Trotzdem rechtfertigt eine genauere Untersuchung der Sporenadsorption und des Mycelienwachsturns auf dem Cordieritträger auch Porendurchmesser bis zu 72 /um, denn die Kennlinie der Sporenadsorption nach Figur 3 zeigt einen scharfen Abfall zwischen 40 - 195/um, und die Kennlinie des Mycelienwachstums scheint der entsprechenden Kennlinie für Glasfrittenträger parallel zu laufen, ist aber sehr viel höher.

- 39 -

909813/0826

Leerseite

Claims

Patentansprüche

1. Kompositum aus einem porösen, großflächigen, anorganischen Träger und einer immobilisierten Bevölkerung von Mikroorganismenarten, die sich durch Spaltung vermehren, Bakterien und dergleichen, Hefezellen oder pilzartigen Organismen, die sich durch Sporen vermehren und durch Mycelienbildung wachsen, dadurch gekennzeichnet, daß die Poren des wasserunlöslichen, für die Mikroorganismen ungiftigen [Prägers, an deren Innenflächen die Mikroorganismen gebunden sind, zu wenigstens 70 % auf Grundlage der Porengrößenstreuung bemessene Porendurchmesser aufweisen, welche im Falle der sich durch Spaltung vermehrenden Organismen, Bakterien und dergleichen, Größen wenigstens so groß wie die kleinste Hauptabmessung bis weniger als das fünffache der größten Hauptabmessung dieser Organismen haben, im Falle von Hefezellen Größen von mindestens der kleinsten Abmessung dieser Zellen bis zu weniger als dem vierfachen ihrer größten Abmessung haben, und im Falle von pilzartigen Organismen Größen von wenigstens der Größe der kleinsten Abmessung der Sporen dieser Organismen bis weniger als dem sechzehnfachen der größten Abmessung der Sporen aufweisen.

2. Kompositum nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroorganismenbevölkerung aus einer einzigen Spezies besteht.

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3. Kompositum nach Aaspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der durchschnittliche Porendurchmesser im Falle der sich durch Spaltung Vermehrenden im Größenbereich 0,8 - 220/um, und im Falle der Hefezellen im Größenbereich 1 - 140/um liegt.

4. Kompositum nach Ansprüchen 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger aus amorphen Stoffen, aus Glasfritte, aus kristallinen Stoffen, aus cordieritartigen Stoffen oder aus kristallinem Spinell-Zirkoniumoxid besteht.

5. Kompositum nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen dem Träger und den Organismen ein Überzug, bestehend aus den Resten von Polyisocyanaten oder Silankopplern angebracht ist.

6. Verfahren zur Herstellung des Kompositums nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß der sterilisierte Träger einer wässerigen Suspension der Mikroorganismen unter die Bindung wenigstens eines Teils der jeweiligen Organismen an die Poreninnenflächen erzielenden Bedingungen ausgesetzt wird.

7. Verfahren nach Aaspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Porenflächen vor dem Kontakt mit der Suspension mit Polyisocyanaten oder Silankoppler überzogen werden.

8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindung der Mikroorganismen an die Poreninnenflächen durch Adsorption

erfolgt.

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