DE2603698A1 - Verfahren zum immobilisieren von enzymen - Google Patents
Verfahren zum immobilisieren von enzymenInfo
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ZUSTELI-trNGSANSCHRIFT: 2000 HAMBURG 36 · NEUER WAXI. 41
T„„ox
<O4O) 3β 74 28 UND 36 4118
.TEIiKGR. NlOlDiPlTBNT HJLMBIJRO
TKLKFON (Ο8Θ) 5 38 05 86
P.O^ BOX 1035 IHIOR. NXOKDAPATKNT MUNCHKN
Toledo, Ohio 43666/USA
Hamburg, 28 Januar 1976
Verfahren zum Immobilisieren von Enzymen
Enzyme sind biologisch aktive Proteine, die spezielle Reaktionen
katalysieren, Enzyme werden in Industrie und Forschung für eine große Vielzahl von Zwecken verwendet, insbesondere bei Fermentationsprozessen,
bei der Herstellung von Arzneimitteln, in der medizinischen Forschung und bei der Lebensmittelherstellung m Sie
sind hochspezifisch in ihrer biologischen Aktivität und erzeugen gewöhnlich keine signifikanten Mengen unerwünschter Nebenprodukte(
Neuerdings ist im Hinblick auf rationelle Rückgewinnung und Wiederverwendung
versucht worden, Enzyme auf verschiedenen Trägermaterialien chemisch oder physikalisch zu immobilisieren. In der
Vergangenheit wurden Enzyme immobilisiert, indem sie durch kovalente
Bildung, Adsorption und ionische Bindung an organische Trägerstrukturen angeheftet wurden. Besonders intensiv hat man sich
dabei mit der kovalenten Fixierung an wasserunlösliche Träger beschäftigt
m Die meisten der untersuchten Trägermaterialien waren
organische Polymere, obwohl auch neuere Berichte vorliegen, nach denen Koppelungsmittel dazu verwendet wurden, um Enzyme an kera-
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mische Materialien zu binden. Z.Bt beschreibt die US-PS
3 519 538 die Verwendung eines Silan-Kupplungsmittels zum
Fixieren von Enzymen an anorganische Träger wie Glas oder Aluminiumoxid .
3 519 538 die Verwendung eines Silan-Kupplungsmittels zum
Fixieren von Enzymen an anorganische Träger wie Glas oder Aluminiumoxid .
Die Adsorption von Enzymen an wasserunlösliche Träger, seien sie organischer oder anorganischer Natur, war die einfachste Technik
des Unlöslichmachens. Diese Technik fand Interesse, weil bei ihr
lediglich erforderlich ist, die Enzyme in Lösung dem Trägermaterial auszusetzen. Der Leichtigkeit der Adsorption steht jedoch
eine entsprechende Leichtigkeit der Desorption gegenüber. Die
US-Patentschriften 3 556 945 und 3 850 751 offenbaren Techniken
zur Adsorption von Enzymen an porösen anorganischen Trägern.
eine entsprechende Leichtigkeit der Desorption gegenüber. Die
US-Patentschriften 3 556 945 und 3 850 751 offenbaren Techniken
zur Adsorption von Enzymen an porösen anorganischen Trägern.
Nach einer weiteren Technik v/erden die Enzyme an den Träger in Gegenwart
eines Substrates gebunden, das anscheinend die aktiven
Stellen der Enzyme blockiert, um eine Reaktion dieser Stellen
mit dem Träger zu verhindern. Nach der US-Patentschrift Nr.
3 666 627 finden für diesen Zweck Glaspulver und Aluminiumoxidpulver Verwendung.
Stellen der Enzyme blockiert, um eine Reaktion dieser Stellen
mit dem Träger zu verhindern. Nach der US-Patentschrift Nr.
3 666 627 finden für diesen Zweck Glaspulver und Aluminiumoxidpulver Verwendung.
Weitere Einzelheiten solcher bekannter Techniken sind in dem Buch "Biochemical Aspects of Reactions on Solid Supports",
herausgegeben von George R. Stark, Academic Press, New York, 1971, mitgeteilt, sowie in dem Aufsatz "Enzymes Immobilized
on Inorganic Carriers" von H.H. Weetall, erschienen in Research/Development, Dezember 1971, in dem Aufsatz "The
Potential Applications of Molecular Inclusion to Beer Processing" von R. A. Messing, erschienen in der Dezember-
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Ausgabe 1971 des "Brewer's Digest", und in den US-Patentschriften Nr.-3512 987 und 3 167 485.
Obwohl diese bekannten Techniken für viele Anwendungen geeignet sind, besteht ein Bedarf nach einem einfachen, wirksamen
und wirtschaftlichen Verfahren zum chemischen Immobilisieren von Enzymen, um eine enzymatisch aktive Verbindung zu schaffen,
die einen relativ hohen Anteil ihrer Anfangsaktivität selbst nach längerem Lagern oder Gebrauch behält.
Um die Ziele der vorliegenden Erfindung zu erreichen, besteht ein Merkmal in der Immobilisierung eines Enzyms auf einem Träger,
wobei ein Enzymträger und ein chemisch immobilisierendes Agens bei einer Temperatur und über einen Zeitraum, die ausreichen,
um das Enzym chemisch zu immobilisieren, in Kontakt gehalten werden und wobei das chemisch immobilisierende Agens eine
vorgebildete Reaktionslösung eines Alkandihalogenids und eines
Alkandiamins enthält.
Der Ausdruck "Alkandihalogenid", wie er hier verwendet wird, bezeichnet ein Alkan, das zwei Halogengruppen wie z.B. Brom,
Jod, Chlor oder Mischungen daraus in seiner molekularen Struktur enthält. Der Ausdruck "Alkandiamin" bezeichnet eine Alkanzusammensetzung,
die zwei Aminogruppen in ihrer molekularen Struktur enthält. Bei der üblichen Arbeitsweise der vorliegenden Erfindung
werden Alkangruppen mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise
1 bis 6 Kohlenstoffatomen, verwendet, um die Bildung der Reaktionslösung zu erleichtern. Es wurde beobachtet, daß die Lös-
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lichkeit der Alkandihalogenide in wässrigen Lösungen mit zunehmender
Anzahl der Kohlenstoffatome in der Alkangruppe abnimmt.
Zu derartigen Alkandiaminen gehören verzweigte und geradkettige Alkandiamine einschließlich Diaminoinethan, Diaminoäthan, Diaminopropan,
Diaminobutan, Diaminopentan, Diaminoisooktan, Diaminohexan/
Diaminoheptan, Diaminooktan, Diaminoisobutan, und Diaminoisohexan.
Die Stellung der Aminogruppen innerhalb der Alkangruppe erwies sich für die Praxis der vorliegenden Erfindung
nicht als kritisch.
Zu den geeigneten Alkandihalogeniden gehören verzweigte und geradkettige
Dibrom-, Dijod- und Dichlor-Alkandihalogenide wie Dibrommethan,
Dibromäthan, Dibrompropan, Dijodpropan, Dibrompentan,
Dichloräthan, Dibrombutan, Dijodpentan, Dijodmethan, Dichlormethan
und andere Dihalogenalkane, die zwischen 1 und 10 Kohlen7
stoffatome besitzen. Die Stellung der Halogenidgruppe in der
Alkangruppe erwies sich in der Praxis der vorliegenden Erfindung als nicht kritisch.
In der üblichen Verwendung der vorliegenden Erfindung haben
die Alkangruppen 1 bis 10 Kohlenstof fatome und vorzugsweise 1 bis 6 Kohlenstof fatome, um die Bildung der Reaktions lösung
zu erleichtern. Es wurde beobachtet, daß die Löslichkeit der Alkandihalogenide in wässriger Lösung um so kleiner zu sein
scheint je höher die Anzahl der Kohlenstof fatome in der Alkan-.gruppe ist.
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Enzyme sind komplexe Polypeptide und besitzen Amino- und
Karboxylfunktionen in ihrer molekularen Struktur und können unter drei Hauptgruppen klassifiziert werden: hydrolytische
Enzyme, Kedoxe.nzyme und Transferase~enzyiRe^ Die erste Gruppe,
hydrolytische Enzyme, schließt proteolytische Enzyme ein, die Proteine hydrolysieren, zB, Papain, Ficin, Pepsin, Trypsin,
Chymotrypsin, Bromelin, Keratinase/ Carbohydrasen, die Kohlehydrate
hydrolysieren, wie z,Bt Celluloase, Amylase, Maltase,
Pectinase, Chitinase; Esterasen, die Ester hydrolysieren, z.B.
Lipase, Cholinesterase, Lecithinase, alkalische und saure
Phosphatasen; Nukleasen, die nukleide Säuren hydrolysieren, z.B. Ribonukleas«, Desoxiribonuclease; und Amidasen, die Amine
hydrolysieren, z.B. Arginase, Asparaginase, Glutamine,
Histidase und urease. Die zweite Gruppe sind Redoxenzyme, die
Oxidations- oder Reduktionsreaktionen katalysieren. Dazu gehören Glukoseoxidase, Xanthinoxidase, Katalse, Peroxidase,
Lipoxidase und Cytochromreduktase. In der dritten Gruppe befinden
sich Transferase-e'nzyme, die Gruppen von einem Molekül
zu einem anderen transferieren. Beispiele davon sind Glutamin-
Transaminase
Brenztrauben- / , Glutamin-Oxalacetic-Transaninase, Transmethylffie, Phospho-Brenztrauben-Transphosphorylase. Es sollte festgehalten werden, daß die Enzyme allein oder in Kombination mit anderen Enzymen in der Praxis der vorliegenden Erfindung verwendet werden können.
Brenztrauben- / , Glutamin-Oxalacetic-Transaninase, Transmethylffie, Phospho-Brenztrauben-Transphosphorylase. Es sollte festgehalten werden, daß die Enzyme allein oder in Kombination mit anderen Enzymen in der Praxis der vorliegenden Erfindung verwendet werden können.
Die Zusammensetzung des Trägermaterials ist nicht besonders
kritisch, solange es in inert und dimensionsmäßig stabil ist
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und über eine genügend große Oberfläche zur Retention der
Enzyme verfügt. Das Trägermaterial kann eine poröse, für ein
Strömungsmittel permeable Membran wie in dem US-Patent
3 839 175 oder poröses, in Partikeln auftretendes Material
wie in der- US-Patentschrift 3 850 751. sein m Wenn poröse Träger materialien verwendet v/erden, sollten sie ausreichend porös und saugfähig genug sein, um genügend Enzyme zurückzuhalten,
um eine biologisch aktive Zusammensetzung zu bilden. In der
kommerziell bedeutenden Ausführung der vorliegenden Erfindung weist die immobilisierte Enzym/Trägermaterial-Zusamirensetzung mindestens etwa 0,001 internationale Einheiten (International Units, I. U.) an Aktivität pro Kubikzenti-meter der Zusammensetzung auf.
Enzyme verfügt. Das Trägermaterial kann eine poröse, für ein
Strömungsmittel permeable Membran wie in dem US-Patent
3 839 175 oder poröses, in Partikeln auftretendes Material
wie in der- US-Patentschrift 3 850 751. sein m Wenn poröse Träger materialien verwendet v/erden, sollten sie ausreichend porös und saugfähig genug sein, um genügend Enzyme zurückzuhalten,
um eine biologisch aktive Zusammensetzung zu bilden. In der
kommerziell bedeutenden Ausführung der vorliegenden Erfindung weist die immobilisierte Enzym/Trägermaterial-Zusamirensetzung mindestens etwa 0,001 internationale Einheiten (International Units, I. U.) an Aktivität pro Kubikzenti-meter der Zusammensetzung auf.
Eine Internationale Einheit (I.U.) der biologischen Aktivität
ist definiert als die Menge von aktiven Enzymen, die das Substrat zu einem Produkt bei der Rate von einem Mikromol pro
Minute konvertiert.
Minute konvertiert.
Es wurde herausgefunden, daß poröses Grundmaterial mit einer
Volumenporosität in dem Bereich von 10 % bis 80 % und vorzugsweise in dem Bereich von 15 bis 50 % für die hier geforderten Zwecke geeignet ist. Die Porengrcße des. Trägermaterials ist
insofern kritisch, als sie nicht so klein sein sollte, daß sie die Immobilisierung der Enzyme daran hindern kann. Durchschnittsporendurchmesser sowohl in der für Strömungsmittel
permeablen Membrane sowie in dem in porösen Partikeln vorliegendem Stoff in dem Bereich von 0,01 Mikrometer bis 1O Mikro-
Volumenporosität in dem Bereich von 10 % bis 80 % und vorzugsweise in dem Bereich von 15 bis 50 % für die hier geforderten Zwecke geeignet ist. Die Porengrcße des. Trägermaterials ist
insofern kritisch, als sie nicht so klein sein sollte, daß sie die Immobilisierung der Enzyme daran hindern kann. Durchschnittsporendurchmesser sowohl in der für Strömungsmittel
permeablen Membrane sowie in dem in porösen Partikeln vorliegendem Stoff in dem Bereich von 0,01 Mikrometer bis 1O Mikro-
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meter sind für die meisten Anwendungen geeignet, wobei 0,01
bis 2 Mikrometer wegen der Wirksamkeit und der Wirtschaftlichkeit bevorzugt werden.
Das poröse, in Partikeln vorliegende Trägermaterial kann feuerbeständiges
Keramikoxidpulver wie z.B. Aluminiumoxidpulver, Zirkoniumoxidpulver, Magnesiapulver, Siliciumoxidpulver, Thoriumoxidpulver, Glaspulver, pulverförmiger Ton, pulverförmiges
Talkum und ähnliches sein. Die Teilchengröße des porösen in Partikeln vorliegenden Stoffes ist nicht kritisch, obwohl eine
Größe in dem Bereich von minus 5 mesh bis plus 400 mesh zweckmäßig ist. Wegen der Wirksamkeit und Wirtschaftlichkeit wird
gewöhnlich eine Größe zwischen minus 20 und plus 100 mesh (U1S. Sieve) verwendet.
Poröse, inerte, feste und dimensionsmäßig stabile feuerfeste,
für ein Strömungsmittel permeable Membranträger können hergestellt .werden, indem solche feuerfesten Oxidpulver gepresst
werden, um einen "grünenPressling" der gewünschten Konfiguration
zu bilden. Diegrünen Presslinge werden dann für eine Zeit und auf eine Temperatur erhitzt, ausreichend zur Sinterung, um
einen porösen, inerten, festen, dimensionsmäßig stabilen, für ein Strömungsmittel perrceablen feuerfesten Träger zu erhalten.
Das Sintern sollte nicht bei einer Temperatur und für eine Zeit stattfinden, die ein Zusammenfallen oder Zusammenschmelzen der
Teilchen hervorrufen könnte, so daß ein nichtporöser Körper gebildet würde. Eine· geeignete Anzeige für den Sinterungsgrad
ist ein Vergleich der tatsächlichen Dichte des erhitzten Press-
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lings mit der theoretischen Dichte der Oxide, die erhitzt
wurden. Von den vielen Oxiden, die für die vorliegenden Zwecke verwendet werden können, wird Aluminiumoxid wegen seiner chemischen
Beständigkeit und der leichten Verarbeitung bevorzugt.
Beim Herstellen des Trägers aus dem pulverformigen feuerbeständigen
Oxid wird die Pulverteilchengröße so ausgesucht, daß ein gesinterter Pressling hergestellt wird, der eine Porosität
und Porengröße in dem oben angegebenen Bereich besitzt. Die Techniken zum Pressen und zur Sinterung des porösen Trägers
sind dem Fachmann bekannt und bilden keinen Teil der vorliegenden Erfindung. Es genügt zu sagen, daß Pressdruck in dem
Bereich von 1000 p.s.i. bis 10 000 p.s.i. (70,303 Kp pro cm
bis 703,08 kp pro cm ) und Sinterteirperaturen im Bereich von
1 300°C bis 1 700°C betriebsmäßig angemessen sind. Zusätzliche Einzelheiten in Pressen und in der Sinterung von feuerbeständigen
Oxiden können aus dem Buch "Oxide Ceramics" von E. Ryshkewitch, veröffentlicht 1960 von Academic Press, New York, entnommen
werden
Das poröse Grundmaterial kann auch aus einem porösen Metall
wie z#B. poröses Silber oder poröser rostfreier Stahl hergestellt
v/erden.
Das poröse Grundmaterial kann in einer beliebigen geometrischen Form wie runde Zylinderscheiben, Platten, Barren, Blocks und
dergleichen sein.
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Andere -geeignete Trägermaterialien können in der Form von natürlichen
oder synthetischen Fäden sein, wie z.B. Polypropylen, Polyäthylen, Baumwolle oder Wolle, Nylon, Reyon, Polyester
oder Akrylfasern. Der Träger kann auch eine Mischung
von natürlichen und synthetischen Fasern sein oder er kann aus anorganischen Fäden bestehen, hergestellt aus Kohlenstoff,
Asbest, Glas oder ähnlichen fadenförmigen Keramiken, wie z.B. Aluminiumsilikat. Auch können Fäden aus Metall wie z#B# Kupfer
oder rostfreier Stahl Verwendung finden. Die Trägerfaserndurchmesser können von etwa 0,001 bis etwa 0,25 inch (0,025 mm bis
6 mm) reichen. Solche faserartigen Materialien sind bei der Her stellungen Filtereinsätzen wie z.B# nach US-Patent 3 828
für Filtrations-Prozeßstufei geeignet, ' wobei die Filtration
die Behandlung mit immobilisierenden-Enzymen in einem Arbeitsgang
durchgeführt werden. Dies ist besonders nützlich bei der Kaltsterilisierung von Bier.
In der üblichen Verwendung wird die vorgefertigte Reaktionslösung durch eine Mischung der Alkandihalogenide und Alkandiamine
in einer wässrigen Lösung gebildet, bis die . Komponenten sorgfältig aufgelöst sind bis an die Grenze ihrer
Lösbarkeit. In einigen Fällen kann eine organische Phase zusätzlich zu der vorgefertigten Reaktionslösung vorliegen. Dieses
ist gewöhnlich nicht erwünscht, wenn die restliche organische Phase eine Tendenz zur Denaturierung des Enzyms oder Beeinträchtigung
seine.s Verhaltens aufweist.
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In einigen Fällen kann ein wasserlöslicher organischer Losungsmittelanteil
(z.B. 0,1 % bis 90 % des Gewichts) wie Alkohole (z.B. Methanol, Äthanol oder Propanol) oder Ketone
(ζ.Bβ Azeton oder Methylethylketon) hinzugefügt werden, um
die Löslichkeit des Alkandihalogenids und des Alkandiamins in
der wässrigen Lösung zu verbessern. In einigen Fällen können organische Lösungsmittel bei Bildung der Reaktionslösung ohne
die Gegenwart von Wasser Verwendung finden, solange solche Lösungsmittel die Enzyme nicht denaturieren. Die Konzentration
jeder dieser beiden Alkankomponenten in der Reaktionslösung
ist nicht besonders kritisch für die vorliegende Erfindung, und Anteile im Bereich von 0,001 Gew-% bis 5 Gew.-% jeder der Komponenten
werden für die meisten Anwendungen als geeignet angesehen, wobei die Lösbarkeitsgrenze gewöhnlich den oberen Bereich
der Konzentration vorschreibt.
Sobald die Komponenten gelöst sind, ist die Reaktionslcsimg für
die Verwendung zur Enzymimmobilisierung fertig. Solche Auflösung findet gewöhnlich bei Temperaturen zwischen 200C (d.h. Raumtemperatur)
bis zum Siedepunkt der Mischung und in Zeiträumen von einigen Sekunden bis zu einer Stunde oder länger statt. Temperaturen
in dem Bereich von etwa 200C bis 50°C für eine Zeitdauer
von etwa 1 Minute bis ungefähr einer halben Stunde sind passend und geeignet.
Das molare Verhältnis der Alkandiamine zu den Alkandihalogeniden
erwies sich in der Anwendung der vorliegenden Erfindung als nicht
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kritisch. Empirische Beobachtungen haben bestätigt, daß ein
Molarverhältnis von Alkandiaminen zu Alkandihalogeniden über
dem Bereich von 0,005 zu 1 bis 1000:1 zufriedenstellende Resultate
liefert, wobei ein Verhältnis in den Bereich von 0,1 zu 20 zv/eckmäßig für viele Anwendungen ist. Der pH der erhaltenen
vorgefertigten Reaktionslösung ist nicht besonders kritisch, obwohl ein pH in dem Bereich von 2,5 bis 11 zweckmäßig
ist, abhängig von den Enzymen, die verwendet werden und dem pH, den die Endlösung besitzt. Natürlich kann die Beschaffenheit
des Trägermaterials oder Aktivitätscharakteristik der speziellen Enzyme einen höheren oder niedrigeren pH bei einigen
Anwendungen erfordern.
Es ist gegenwärtig noch nicht bekannt, ob eine vollständige chemische Reaktion zwischen den Alkandihalogeniclen und den
Alkandiaminen stattfindet. Es ist bekannt, daß diese Komponenten miteinander zur Bildung von komplexen Polyalkylenverbindungen
reagieren können, wie in der US-Patentschrift 2 696 504 beschrieben, Es ist nicht bekannt, daß diese Reaktion bei Verwendung
der vorliegenden Erfindung eintritt, und die Bildung und Isolierung solcher intermediären Verbindungen stellt keinen
Teil der vorliegenden Erfindung dar . In dieser Hinsicht ist der Ausdruck "vorgebildete Reaktionslösung" verwendet
worden, um anzuzeigen, daß die Alkandihalogenide und Alkandiamine in einer Lösung gemischt sind, bevor sie sowohl mit
dem Enzym als auch mit dem Träger in Berührung kommen.
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Beim Durchführen des Prozesses der vorliegenden Erfindung werden
das Enzym, die vorgebildete Reaktionslösung und das Trägermaterial
für einen Zeitraum und bei einer Temperatur ausreichend zur·chemischen Immobilisierung der Enzyme an Ort und
Stelle auf dem Träger in Berührung miteinander gebracht. Dies
erfordert gewöhnlich einen Zeitraum in einem Bereich von wenigen Minuten bis zu einigen (z.B. 100) Stunden, abhängig von der
Temperatur, Konzentration und anderen Faktoren. Die Temperatur wird gewöhnlich unterhalb etwa 20 bis 30 C und üblicherweise
bei etwa 0°C bis 1O°C gehalten, um eine Denaturierung der Enzyme zu verhindern.
Bei- der Durchführung dieser Berührung kann das Enzym erst in dem Träger gelagert (z.B^ sorbiert oder aufgesogen) werden und
dann mit der vorgebildeten Reaktionslösung zur chemischen Immobilisierung
des Enzyms in Kontakt gebracht werden. Der Ausdruck "sorbiert" wird verwendet, um Adsorption und Absorption auszudrücken
. In einer weiteren Verwendung kann erst der Träger mit der vorgebildeten Reaktionslösung in Kontakt gebracht werden
und dann das Enzym in Berührung damit m In noch einer weiteren
Durchführung können erst das Enzym und die vorgebildete Reaktionslösung miteinander zusammen- und dann mit dem Trägermaterial
in Berührung gebracht werden. Von diesen Möglichkeiten wird das erste Verfahren wegen seiner Wirksamkeit und Wirtschaftlichkeit
so bevorzugt, daß das Enzym erst abgelagert auf oder eingeweicht in dem Trägermaterial wird, um eine maximale
"Durchfeuchtung" des Trägers mit dem Enzym zu erreichen
sowie eine an Ort und Stelle verknüpfende "Verankerung" oder
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Verbindung des Enzyms in dieser Stellung, um hohe Aktivität und verlängerte Haltbarkeit zu sichern.
Die Immobilisationstechniken der vorliegenden Erfindung sind besonders nützlich bei der Immobilisierung von Glukoseoxidase
bei der Analyse von Glukose gemäß der US-Patentanmeldung S.N. 477 922 vom 10. Juni 1974; und in der Immobilisierung von
Urease in der Harnstoffanalyse gemäß der US-Patentanmeldung SJH. 427 322 vom 21. Dezember 1973; in der Immobilisierung von
Papain und anderen Enzymen beiir Kaltsterilisieren von Bier, und
Amylasen zur Hydrolyse von Stärke. Zur Vereinfachung der Offenbarung sind alle die hier genannten Patente und Bezugnahmen als
Bezug mit eingeschlossen.
In den jetzt folgenden Beispielen sind alle Teile Gewichtsteile, alle Prozentangaben Gewichtsprozente und alle Temperaturen
in C, wenn nicht anders bezeichnet.
Beispiel 1 Teil A
Jmmobilisierte Glukoseoxidase auf pulverförmiger?. Aluminiumoxid
ISin Gramm von in Partikeln vorliegendem Aluminiumoxid wird sorgfältig
mit destilliertem Wasser gewaschen. Das in Partikeln vorliegende Aluminiumoxid besitzt eine Teilchengröße in dem Bereich
von minus 40 bis plus 70 mesh (U.S Sieb raster) und einen durchschnittlichen
Porendurchmesser von 0,1 bis 0,2 Mikrometer.
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50 Milligramm Glukoseoxidase (bezogen von der Worthington
Biochemical Corporation mit einer angegebenen Aktivität w 140 Internationalen Einheiten pro Milligramm) wird zu dem
feuchten/·in Partikeln vorliegenden Aluminiumoxid in 40 !Milliliter
einer wässrigen Lösung, die auf einen pH von 5,5 mit einem
üblichen Puffer gepuffert ist, der eine Mischung vom Kaliumdihydrogenphosphat
und Dinatriumhydrogenphosphat enthält» hinzugefügt. Die erhaltene Mischung wird vorsichtig für eJnne halbe
Stunde bei 6 bis 8 C zur Sorbierung der Enzyme umgerührt,.
Zu dieser Mischung wird eine vorgefertigte, vernetzende Reaktionslösung hinzugefügt, die aus einer Mischung von 2O mü.
Methanol, 10 ml destilliertem Kasser, 0,15 ml konzentrierter;
Salzsäure, 0,08 ml Diaminpropan und 0,02 ml Dibromäthan !bei.
Raumtemperatur für ungefähr 15 Minuten zur Herstellung einer Lösung gebildet wird . Dies entspricht einem Molverhältnis von
Diaminpropan zu Dibromäthan von etwa 4:1. Das zusamnengeifebene
Aluminiumoxid, die Glukoseoxidase und vernetzende Reak—
tionslösung werden vorsichtig mit einem Magnetrührer bea. 6 Bis 8 C über Nacht gerührt, um die Glukoseoxidase auf dem Altuiöfrsiumoxid
zu immobilisieren. Die entstandene immobilisierte oxidase - Aluminiumoxid-zusammensetzung wird mit etwa 2 3- dtestüiertem
Wasser ausgewaschen und in destilliertem Wasser gjespeichert.
.
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Teil B
Untersuchung der immobilisierten Glukoseoxidase-Aluminiumoxidzusammensetzung
Die katalytische Aktivität der immobilisierten Glukoseoxidase-Aluminiumoxidzusammensetzung
von Teil A wird aus der gemessenen Rate der Oxidation von β r-D-Glukose zu Glukonsäure durch Para-Benzo
chinon in der Gegenwart der Glukoseoxidase-Aluminiumoxidzusammensetzung ermittelt. Die Reaktion wird dargestellt durch:
ß -D-Glukose+p-Benzc chinon+H90 Glukon5äure
Hydro chinon
Dieser Reaktion folgt eine potentiometrische Messung der zeitlichen
Hydro cninonkonzentrationsänderung. Eine Platindetektorelektrode
(Beckman Modell 39273) wird mit einer Doppe Ir e-f er en ζ elektrode
aus Kalomel-Silber/Silberchlorid (Orion Modell 90-20-00)
verwendet. Standardlösungen zur Eichung des Elektrodensystems
werden aus Hydrochinon mit wenigstens einem 100 Mol-Überschuß
von p-Benzo chinon, auch vorliegend in den wässrigen Lösungen oder in gepufferter Lösung mit einen pH von 5,5, hergestellt.
Die Konzentration des p-BenzochLnonSist 0,01 m. EireEichkurve
wird durch das Aufzeichnen der Hydro chiinonkonzentration gegen
die Millivoltanzeige des Potentiometers aufgestellt.
Das Reaktionsmedium, in dem die Oxidation der Glukose stattfindet,
ist eine wässrige Lösung von 0,1 Mol Dextrose und 0,01 Mol Phosphatpuffer bei einem pH von 5,5. Es wird über
Nacht umgerührt, um sieherzugehen, daß ein Gleichgewicht zwi-
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sehenden oc- und /3 -Glukoseformen erreicht wird. Es wird genügend
p-Benzochinon und Hydrochinon hinzugefügt, um die End-
-2 -4
lösung 10 irolar und 10 molar in diesen beiden letzten
Komponenten zu machen. Ein Teil der Glukoseoxidase-Aluminiumoxidzusammensetzung
wird zu einem bestimmten Volumen des Reaktionsmediums
hinzugefügt, und die zeitliche Änderung in dem Potential der in die Lösung getauchten Elektrode wird unter
Verwendung des oben beschriebenen Elektrodensystem verfolgt. Aus der Millivolt-Angabe wird die entsprechende Konzentration
von Hydrochinon aus der Eichkurve bestimmt, und es wird in
einer Kurve die Konzentration der Testlösung gegen die Zeit aufgetragen. Die Anfangssteilheit dieser Kurve repräsentiert die
Oxidationsrate der β -D-Glukose, die von dem immobilisierten
Enzym katalysiert wird. Die Aktivität wird aus folgender Beziehung berechnet:
Aktivität =
Aluminiumoxidvolumen
Bei Verwendung dieses UntersuchungsVerfahrens wurde für die
Glukoseoxidase-Aluminiumoxid-Zusammensetzung von Teil A eine Aktivität von 1 χ 10 Internationalen Einheiten von GIukoseoxidase
pro cm der Glukoseoxidase-Aluminiumoxid-Zusammensetzung ermittelt m Zehn Tage später nach einer Aufbewahrung
in destilliertem Wasser bei 4°C beträgt die Aktivität
2
8,3 χ 10 Internationale Einheiten der Glukoseoxidase pro cm Glukoseoxidase-Aluminiumoxidzusammensetzung.
8,3 χ 10 Internationale Einheiten der Glukoseoxidase pro cm Glukoseoxidase-Aluminiumoxidzusammensetzung.
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Eine Internationale Einheit der biologischen Aktivität v/urde
definiert als die Menge der aktiven Enzyme, die das Subtrat
zu einem Produkt mit einer Rate von einem Mikromol pro Minute
umwandelt.
bei Die Glukoseoxidase-Aluminiuir.oxid-Zusairmensetzung wurde/der
Analyse von Glukose wie in Beispiel 1 der US-Patentanmeldung 477 922 vom 1O# Juni 1974 verwendet, und es wurden hinsichtlich der Genauigkeit, der Präzision und der Lebensdauer gute
Ergebnisse erzielt^
.Gleiche Ergebnisse wurden erhalten, wenn Diaminbutan und
Methylendi Jodid für Diaminpropan und Dibromäthan auf molarer
Basis in den obigen Verfahren eingesetzt werden#
Gleiche Ergebnisse werden auch erzielt, wenn für Diaminpropan und Dibromäthan auf molarer Basis in obigen Verfahren Diaminpentan
und Diaminpropan eingesetzt werden»
Beispiel 2 Herstellung der immobilisierten Glukoseoxidase
Fünf Gramm von in Partikeln vorliegendem Aluminiumoxid mit
einer Teilchengröße im Bereich von -60 bis +70 mesh (U- Sm
Siebraster) und einem durchschnittlichen Porendurchmesser von 0,1 bis 0,2 Mikrometer werden auf 1150°C für zwei Stunden erhitzt^ Nach der Abkühlung wird das in Teilchen vorliegende Alu
miniumoxid in "1,0η HCl über Nacht eingeweicht. Dann wird es mit
60 9840/107 5
- 18 -
destilliertem Wasser gewaschen und in ein Becherglas mit.
50 ml eines 0,001 Phosphatpuffers (pH 6,0) für eine halbe
Stunde gefüllt, dann werden 25 ml einer Glukoseoxidaselössang
hinzugefügt m Die Glukoseoxidase (Asperilligus niger) wird von
der Pierce Chemical Company in einer gepufferten Lösung CpE 4,0)
bezogen und besitzt eine angegebene Aktivität von 1000 Internationalen
Einheiten pro Milliliter . Die so erhaltene Gluk©seoxidase/Aluminiumoxidmischung
wird vorsichtig für eine halbe Stunde bei 3 bis 8°C umgerührt^
Eine vernetzende Reaktionslösung wird durch eine Mischung
von 20 ml Methanol, 0,01 ml Diaminopropan, 0,15 ml konzemtarierte
Salzsäure, 0,03 ml Dibromäthan und 10 ml Wasser bei Rasaiiitemperatur
für etwa 15 Minuten hergestellt.
Das Molverhältnis von Diaminpropan zu Dibromäthan ist etwa 0,3:1,
Die vorgefertigte Reaktionslösung wird mit einer Rate 0,15 bis
0,20 ml pro Minute zu der Glukoseoxidase/Aluminiumoxidmisdhung hinzugefügt, wobei vorsichtig mit einei1 Magnetr führer ,gerührt.
wird und eine Temperatur von 3 bis 8°C 16 bis 20 Stunden eingehalten wird. Die erhaltene iirmobilisierte Glukoseoxidase/aiuirdniumoxidzusammensetzung
wird mit 2 1 destilliertem Wasser gewaschen und in destilliertem Wasser bis zur Untersuchung aufbewahrt
m
Das untersuchungsverfahren ist das gleiche wie im Beispiel 1«
Die Aktivität der Probe ist 2,3 χ 1O+3 Internationale Einheiten
pro Milliliter immobilisierte Glukose/Aluminiumoxidzusammeiisetzung
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Die Glukoseoxidase/Aluminiumoxidzusammensetzung wird in der
Analyse von Glukose wie im Beispiel 3 der Anmeldung S,N. 477 922
vom 10.. Juni 1974 verwendet, und bezüglich Genauigkeit, Präzision
und,Lebensdauer werden gute Resultate erzielt.
Beispiel 3 Teil A
(sorbierte Urease)
Urease (Jack-Bohnenmehl, vertrieben von der Worthington Biochemical Corporation mit einer Anfangsaktivität von 63 I.U./mg)
wird auf einem in Partikeln vorliegenden porösen Aluminiumoxidträgermaterial immobilisiert dtmch eine Mischung von 100 mg Urease
und 1,0 g von in Partikeln vorliegendem Aluminiumoxid in 200 ml von 0,o1 m Tris (Hydroximethyl) Aminomethan (eingestellt und gehalten
bei einem pH-iJert von 8,2 durch verdünnte Salzsäure oder
verdünnte Natronlauge) bei 40 C und'einer Rührzeit von 1 Stunde.
Das in Partikeln vorliegende Aluminiumoxid besitzt eine Teilchengröße in dem Bereich von -50 bis 100 mesh (U3-Siebraster)
und einen durchschnittlichen P.orendurchmesser von etwa 0,1 bis
0,2 Mikrometer. Das immobilisierte Urease/Aluminiumoxidreaktionsprodukt wird über Nachfbei O0C stehengelassen.
Das immobilisierte Urease-Reaktionsprodukt wird dann in einem
gesinterten Glastrichter gefiltert und erst mit 500 ml einer 0,5 m Natriumchloridlösung, gefolgt von einer Waschung mit
1 bis 2 1 von destilliertem Wasser, ausgewaschen. Das ausgewaschene immobilisierte Ureasereaktionsprodukt wird in 10 bis 20 ml
eines 0,01 m tris (Hydroxymethyl) Aminomethanpuffeis aufbewahrt,
609840/1075
- 20 -
bis es fertig zum Gebrauch ist. Die Anfangsaktivität des immobilisierten
Urease/Aluminiumoxidproduktes wird auf 1,5 χ 10
I.U./cm durch das Verfahren, wie es in der US-Anmeldung
S.N. 427*322 vom 21. Dezember 1973 beschrieben ist, bestimmt.
Nach einer Lagerung von 11 Tagen wird das Produkt in einen
und kontinuierlich fließenden Puffer für einen Tag eingebracht/die
Aktivität auf 61 i.U./cm bestimmt.
Teil B
C Vernetzt pjt Alkandihalogeniden)
Eine Lösung von 1,2-Dibromäthan wird durch Verdünnen von 0,25 ml
1,2-Dibromathan in 20 ml Methanol hergestellt. Diese Dibromäthän-Lösung
wird zu 200 ml einer bei einem pH-Wert von 8,2 gepufferten 0,01 molaren tris (Hydroximethyl) Aminomethan-Lösung hinzugegeben.
Der pH der so erhaltenen Lösung wird auf 8,2 eingestellt und auf diesem Wert durch die tropfenweise Hinzufügung
von verdünnter Salzsäure oder verdünnter Natronlauge, je nach Erfordernis, gehalten.
100 mg Urease und 1,0 g poröses Aluminiuiroxidpulver ( das
gleiche pulverförmige Aluminiumoxid, das in Teil A verwendet
wurde) werden langsam zu der gepufferten Dibrommethanlösung unter Umrührung bei einer TemperatureinhaItung von 40°C hinzugegeben.
Diese Reaktionsmischung wird für 1 Stunde bei 400C umgerührt und dann über Nacht bei O0C stehengelassen Nach dem
die
Filtern und Waschen wird immobilisierte Urease-Aluminiumoxid-Zusammensetzung
untersucht und die Anfangsaktivität auf 6,2 χ
609840/107B
- 21 -
2 3
10 I.U./cm bestiirmt. Nach einer Lagerung für 11 Tage v/ird
das Produkt für einen Tag einem Fluß unter den Bedingungen wie
2 3
im Teil A ausgesetzt und die Aktivität auf 4,7 χ 10 I.ü./cm
gemessen.
Teil C (Vernetzt
mit Alkandiamin)
Die Verfahren gemäß Teil B werden durchgeführt mit der Änderung, daß anstelle der Dibromäthan-Lösung von Teil B 0,75 ml
1/3-Dianinpropan verwendet werden. Die Anfangsaktivität des
immobilisierten Urease/Aluminiumoxid-Produktes v/ird nach dem Verfahren, wie es in S. N. 427 322 vom 21. Dezember 1973 beschrieben
ist, auf 1,4 χ 10 I.U./cm bestimmt. Nach einer Lagerung von 11 Tagen wird das Produkt für einen Tag in einen
fließenden Puffer gebracht und dann die Aktivität zu 4,7 χ
2 3
10 I.U./cm gemessen.
Teil D
(. Vernetzt mit einer vorbereiteten Lösung von Alkandiamin und Alkandihalogeniden)
Die Verfahren von Teil B werden wiederholt mit der Ausnahme, daß eine vorbereitete Reaktionslösung von 0,02 ml 1,2-Dibromäthan
und 0,08 ml 1,3-Diaminpropan in 20 ml Methanol anstelle
der DibromäthanrLösung verwendet wird ^ Ebenso werden 5 g Aluminiumoxid
und 250 ml Urease, bezogen über Worthington Biochemical Corporation, mit einer Aktivität von ungefähr 160 I.U./mg
verwendet. Es werden deshalb 50 mg Urease pro Grarm Aluminiumoxid
609840/1075
- 22 -
verwendet, verglichen mit 100 mg der weniger aktiven Urease
pro Gramm Aluminiumoxid in den Teilen A, B und C. Jedoch sollte festgehalten werden, daß die Quantität der aktiven Ureasepro
Gramm Aluminiumoxid fast die gleiche in allen vier Teilen ist.
Alle Lösungen v/erden bei Raumtemperatur vorbereitet, während die Immobilisierungsreaktion über Nacht bei einer Temperatur
von 0 bis 5 C stattfindet. Die Anfangsaktivität dieser immobilisierten Urease/Aluminiumoxid-Zusammensetzung ist 1,2 χ 10 I.U./ml.
Eine Woche später wird die Aktivität auf 962 I.U./ml Aluminiumoxid
gemessen.
Nach dieser Aktivitätsmessung wird eine Kolonne unter Verwendung dieses Materials hergestellt und zur Harnstoffanalyse wie
in S.N. 427 322 vom 21. 12. 1973 verwendet. Nach der Verwendung in diesem nahezu kontinuierlichen Flußsystem über 22 Tage konnte
kein Verlust in der Aktivität festgestellt v/erden, 775 Proben, von denen 452 Serumproben waren, wurden mit guten Resultaten
bezüglich Präzision und Genauigkeit während dieser drei Wochen analysiert. Im Gegensatz zu der Stabilität der immobilisierten
Urease, die gemäß dem Verfahren in Teil D hergestellt wurden, befrtffldie
Aktivität der Proben A, b und C 28, bzw; 93 bzw. 4, wenn
sie den gleichen Bedingungen ausgesetzt wurden.
In diesem Experiment wird nichtporöses Aluminiumoxid als Trägermaterial
verwendet Das Aluminiumoxid ist ein nichtporöses
609840/1075
- 23 -
minus 100 mesh Pulver, das ir.it einer Säure gewaschen wurde.
Eine Probe von 400 mg Urease mit einer Aktivität von 162 I.Ü./ mg wird in 200 ml Wasser gelöst und zentrifugiert, um eine klare
überstehende Lösung zu ergeben. Diese Lösung wird zu etwa 3 g
des obigen Aluminiumoxids hinzugefügt, und die so erhaltene Mischung
wird für 12 Stunden umgerührt und dabei auf einer Temperatur
von etwa 2°C gehalten.
Eine chemische Immobilisationsreagenzmischung wird durch das
Zusammengeben von 0,1 ml 1,2-Dibromäthan, 0,1 ml von 1,3-Diaminpropan,
20 ml Methanol und 30 ml destilliertem Wasser und durch das Einstellen der so erhaltenen Mischung auf einen pH
von 7,25 mit Salzsäure hergestellt. Dies entspricht einem Molverhältnis zwischen Diaminpropan und Dibromäthan von 1:1. Diese
Reagenzmischung wird zu der Urease/Aluiriniunoxidmischung hinzugefügt
und die so erhaltene Zusammensetzung wird für zusätzliche 12 Stunden auf einer Temperatur von 2°C gehalten. Die
erhaltene Urease/Aluminiumoxid-Zusammensetzung wird zuerst mit
0,4 m NaCl gewaschen, dann mit 0,oo1 m Beta-Mercaptoäthanol,
und dann mit destilliertem Wasser.
Eine Untersuchung des gewaschenen Urease-Aluminiumzusammensetzungs
produktes ergibt eine Aktivität von 137 I.ü./ml#"
Eine 2O g-Probe von Aluminiumoxid wie in Beispiel 1 mit einer
Teilchengröße zwischen minus 40 und plus 50 mesh (US. Standaaä-
609840/107 5
- 24 -
Sieb) wird sorgfältig mit 4 1 destilliertem Wasser gewaschen.
Dieses Aluminiumoxid wird in einen Vakuumkolben gefüllt, und hinzugegeben v/erden 400 ml eines 2 χ 10 m Trisroaleatpuffer
bei einem- pH-Wert von 8,9 JTris (Hydroximethyl) Aminomethan
und Ilaleinsäure in einem 1:1 Mol-Verhältnis mit ausreichend
NaOK oder HCl zur Einstellung des pH-WertesJ . Es wird mit einer
Wasserstrahlpumpe evakuiert und der Kolben periodisch für eine halbe Stunde geschüttelt. Dann wird die Pufferlösung abgefüllt,
ausgeschieden und frische 300 ml der gleichen Pufferlösung hinzugefügt.
Ein Gramm Urease wird in 120 ml der Trismaleatpufferlösung gelöst
und mit einer Beschleunigung von 8000 g für 20 Minuten zentrifugiert. Die Ureaselösung wird zu der Aluminiumoxidpufferlösung
hinzugegeben, und die Mischung wird für eine halbe Stunde bei einer Temperatur zwischen 0 und 6°C heftig geschüttelt.
Eine vernetzende Reaktionslösung wird durch Auflösen
von 0,08 ml 1,2-Dibromäthan und 0,32 ml 1,3-Diaminpropan in 80 ml
Methanol und 40 ml destilliertem Wasser hergestellt, Dies entspricht
in etwa einem Mol-Verhältnis zwischen Diamonopropan und Dibromäthan von 4:1, Diese Reaktionsmischung wird für eine halbe
Stunde gerührt und/Sann der pH-Wert auf etwa 8 vermittels Salzsäure
eingestellt. Die vernetzende " Reaktions lösung wird dann langsam zu der Urease-Aluminiumoxid-Zusammensetzungsmischung un-
- 25 -
6098A n/1075
ter vorsichtiger Bewegung hinzugefügt, während die Temperatur
zwischen O und 6°C gehalten wird. Diese Temperatur- und Behandlungsbedingungen
werden für etwa 15 Stunden eingehalten.
Am Ende dieses Zeitraumes wird die Urease/Aluminiuiroxid-Zusam-
mensetzung gefiltert und mit 1 bis 2 Litern einer 2,0 χ 10 m Trismaleatpufferlösung, pH 7,0, gewaschen, die 1,0 m in NaCl
und 5,0 χ 10 m in EDTA ist. Die frischgewaschene Urease/Aluminiumoxidzusanmensetzung
besitzt eine Anfangsaktivität von 2,2 χ 102 I.U./ml.
Dieses gerade beschriebene Verfahren wird in einer Reihe von 15 Experimenten wiederholt. In dieser Reihe wird die Partikelgröße
des Aluminiumoxids über den Bereich von ungefähr 40 mesh bis etwa 100 mesh variiert, und Urease mit einem Bereich an
enzymatischer Aktivität von 50 bis 160 I.U./mg, erhalten von
verschiedenen unterschiedlichen Bezugsquellen, findet Verwendung. Die Anfangsaktivitäten der erhaltenen ürease/Aluminium-Zusammensetzungen
aus diesen 15 Experimenten lieg zwischen etwa
— 3 3 ' '
100 ITJ./cm bis etwa 750 I.U./cm, mit einem niedrigen Wert,
52 I^U./ml, und einem hohen Wert, 1370 I.U./ml.
In den obigen Experimenten ist es manchmal wüschenswert, das Aluminiumoxid auf etwa 1O5O°C bis 11OO°C für einige Stunden zu
erhitzen, um das Aluminiumoxid chemisch beständiger zu inachen.
Jedoch kann diese starke Erhitzung bei diesen Temperaturen die Porosität reduzieren und die durchschnittliche Porengröße
verändern.
G09840/107S
- 26 -
Dieses Beispiel verdeutlicht auf eine sehr praktische Art die Effektivität der vernetzenden Methoden, wie sie in den
vorigen Beispielen beschrieben ist, und die Stabilität, die für die Urease/Aluminiumoxidzusammensetzung erreicht
Ein Teil der Urease/Aluminiuiroxidzusarnmensetzung, hergestellt
wie in Beispiel 3 Teil D, der eine Anfangsaktivität von 137o
3
^^ besitzt, wird in ein Rohr gefüllt, um eine Grundlage
zu bilden. Die Kolonne ist 75 mm ID Borsilikatglasrohr mit einem inneren Durchmesser von 2,8 irm und einem äußeren Durchmesser
von 6 mm# Ein 400 mesh-Nylonsieb ist an einem Ende der Kolonne
angebracht, um die. Enzymkomponenten zurückzuhalten.
Diese Kolonne wird in den Harnstoffanalysenappat, wie er in Fig. 1 der Anmeldung S.N# 427 322 vom 21# 12. 1973 beschrieben
ist, eingebracht und verwendet diesen m Ein gepuffertes Verdünnungsmittel
aus 0,01 M Tris (Hydroximethyl) Aminomethan, das 1O~3 m in Dinatriumäthylendiamintetr2Pssi9" säure mit 0,09 m
NaCl, 10 m NH^Cl ist, v/ird durch das System mit einer Rate von 1,3 ml pro Minute gepumpt. Der Basisfluß besteht aus einer
0,03 η Natriumhydroxidlösung, die ebenfalls eine Flußrate von
1,3 ml pro Minute besitztβ Mehrfache 20 Mikroliterproben von
HarnstoffStandardlösungen, 14 und 70 mg Harnstoff/100 ml, werden
in den Pufferfluß an der Spitze der Enzymkolonne eingebracht. Das Elektrodenverhalten wird aufgezeichnet und der elektronische
Detektor wird geeicht.
609840/107 5
- 27 -
Über den Verlauf von ungefähr 3 Wochen wurden insgesamt 1215
Proben in diese Kolonne eingebracht; 700 waren Serumproben und 515 v/aren wässrige Har ns toff proben. Die Kolonne war während
dieser Zeit immer Zimmertemperatur ausgesetzt^ Die Wirksamkeit
der vernetzenden Eigenschaften in dem Urease/ Alumirtiumoxidprodukt kann aus der Tatsache ersehen werden,
daß am Ende dieser Experimentenreihe eine 10 Mikroliterprobe aus 100 mg Harnstoff pro 100 ml Standardlösung in die Kolonne
eingebracht wurde und eine 100 mg Harnstoff pro 100 ml-Anzeige innerhalb der Fehlergrenzen durch den Detektor angezeigt wurde.
Es ist also selbst nach diesem langen Gebrauch die Aktivität des Kolonnenmaterials noch ausreichend, um den Harnstoff in
dieser Probe vollständig zu hydrolysieren.
Drei Urease/Aluminiumoxidzusarmensetzungen, die in einer gleichen
Weise wie oben in Beispiel 5 beschrieben (mit der Ausnahme, daß das Aluminiumoxid eine Porengröße in dem Bereich
zwischen 0,002 bis 0,5 Mikrometer besitzt) hergestellt wurden, wurden untersucht und dann verwendet, um Kolonnen zur Vervrendung
in der Harnstoffanalyse gemäß der S. N. 427 322 vom 21 12 1973 vorzubereiten Mehrere Proben von wässriaer Harnstofflösung
(bekannte Konzentration) und Serum wurden in das obere Ende der Kolonne über einen Zeitraum von ungefähr 1 bis
2 Wochen eingebracht. Die Kolonne wurde auf Raumtemperatur gehalten in einem Puffer von 0,01 m Tris (Hydroximethyl) Aminomethan,
pH 7,0, der etwa 10 π in Dinatriumsalz der Äthylen-
6 0 9 8 4 0 / 1 Π 7 B - 28 -
diamintetra essig säure ist, wenn er nicht im tatsächlichen Gebrauch
sich befindet.
Die Wirksamkeit der Enzymzusammensetzungen wurde bestimmt durch
die Festsetzung der maximalen Konzentration an Harnstoff, der durch die Kolonne bei 100 % iger Konversion passieren kann.
Die Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle gezeigt^
- 29 -
609840/107B
Probe
Anfangsaktivität der Anzahl der Pro-Enzymzusammensetzung ben mit je 20
Zeitdauer der Kolonnenverwendung
Harnstoffkonzentration für 100 % Hydrolyse
506 I.U./cc
392 wässriger Harnstoff 180 Serum Tage
mg Harnstoff ml
O CO CO
309
717
363 wässriger Harnstoff 482 Serum
300 Serum Tage
Tage
mg Harnstoff ml
mg Harnstoff ml
K5 CO
G CO CD CO CX)
- 30 -
Dieses Beispiel beschreibt eine Versuchsreihe ., die den Effekt einer Änderung des molaren Verhältnisses zwischen Diaminopropari
und Diaminoäthan in der Reagenzmischung, die zur Immobilisierung von Glukoseoxidase aus Aluminiumoxid verwendet
wird, verdeutlicht . Die Experimente werden auf eine im wesentlichen
gleiche Art durchgeführt m Ein Gramm Aluminiumoxid mit einer
Teilchengröße von -60 bis +70 mesh und einem durchschnittlichen Porendurchmesser von 0,14 Mikrometer wird entgast, indem
es in einen Kolben zusammen mit 25 bis 30 ml einer 1,0 η HCl
Lösung gefüllt wird und ein Strahlpumpenvakuum für eine halbe Stunde an den Kolben angelegt wird ^ Die KCl wird von dem Aluminiumoxid
abgegossen, und etwa 20 bis 30 ml destilliertes deionisiertes Wasser v/ird verwendet, um das Aluminiumoxidpulver in einen
50 ml Becher zu bringen m
Etwa 25 mg Glukoseoxidase v/erden in 25 ml eines tr is (Hydroxymethyl)
Aminomethanpuffeiß, der auf einen pH von 7,0 mit HCl eingestellt
ist, gelöst^ Diese Enzymlösung wird in das Becherglas, das das Aluminiumoxid enthält, hinzugefügt, und die so entstandene
Mischung wird vorsichtig für eine halbe Stunde bei Raumtemperatur gerührt.
Eine vorbereitete Reaktionslösung wird (mit einer unten aufgezeigten
Ausnahme) durch ein Zusammengehen von 0,08 ml 1,3-Diaminopropan,
der gewünschten Menge von 1,2-Dibromäthan (siehe Ta-
6Ö9840/1075 . " 31 "
belle 2),. 10 ml Methanol, 5 ml Wasser und ο,15 ml konzentrierter
Salzsäure hergestellt. Diese Reagenzmischung wird aufpinmal
zu der obigen Enzym/Aluminiumoxidmischung hinzugefügt, und die so erhaltene" Mischung wird vorsichtig über Nacht bei Raumtemperatur
gerührt.
In einem Fall, Experiment 7A, wird eine Zwei schicht- m
gebildet, indem 8,27 ml Dibromäthan, 0,08 ml Diaminopropan, 10 ml H2O und 10 ml Methanol zusammengegeben werden, um die vorbereitete
Reaktionslösung zu bilden . 10 ml der Losung in etwa 20 ml organischer Grundlage finden Verwendung. Dazu werden O,15 ml konzentrierter
HCl hinzugegeben, diese Mischung wird dann zu der Enzym-Aluminiumoxidprobe wie oben gegeben und über Nacht bei Raumtemperatur
gerührt. Die Signifikanz dieses Experimentes (7A) kann insofern Gegenstand weiterer Interpretation sein, als die Reaktionslösung
in der organischen Phase vorzuliegen scheint. Es ist jedoch aus den Daten in Tabelle 2 deutlich, daß optimale Ergebnisse
nicht erhalten werden.
In einigen anderen Experimenten werden auch zusätzlich zu der vorbereiteten Reaktionslösung in wässriger Mischung kleine Anteile
an organischer Phase beobachtet, offensichtlich herrührend von der Löslichkeitsgrenze des Dibromäthans. Jedoch wurden alle
der Materialien in die Enzym/Aluminiumoxidmischung gebracht, und
keine nachteiligen Effekte konnten mit der Gegenwart dieser organischen Phase in Verbindung gebracht werden.
609840/1075
- 32 -
In jedem Experiment wird die Enzym/Aluminiumoxidzusairiiiensetzung
mit 1 b'is 2 1 von deionisiertem Wasser gewaschen und in 5 ml desti^'
liertem deionisiert ein Wasser bei O bis 5 C aufbewahrt,
bis sie untersucht wird.
bis sie untersucht wird.
Die Aktivitäten der immobilisierten Enzym/Aluminiumoxidzusammensetzungen
werden wie in Teil B von Beispiel 1 beschrieben, gemessen.
Die folgende Tabelle zeigt den Effekt in der änderung des Verhältnisses
zwischen Diamin und Dihalogenid in der Anfangsaktivität der Zusammensetzung und, was noch wichtiger ist, die zurückbehaltene
Aktivität nach 2 Monaten in deionisiertem destilliertem Wasser, s
Experiment Molverhältnis Anfangsakti- Aktivität % an zurück-
Nr m Diaminopropan vität der Su- nach behaltener
Dibromäthan sammensetzung 2 Monaten Aktivität
χ 1CT
χ 1CT
ο. | 01 | 2 | /6 |
0, | 1 | 1 | ,4 |
1 | 1 | /6 | |
10 | 1 | /1 | |
100 | 1 | /3 | |
1000 | 1 | /7 |
23 I.U./ml 9 %
56 41
36 22
26 23
43 . 34
33 19
609840/1075
- 33 -
Das Trägermaterial ist eine Polyesterfaser, die von der
Commercial Filters Corporation als Standard Honeycomb gewundene Filterpatrone bezogen wird. Die Faser ist auf einen hohlen
zylindrischen Kunststoffkern gewickelt, um eine Filterpatrone zu bilden. Die Patrone ist etwa 10 Zoll (25 cm) lang mit einem
inneren Durchmesser von einem Zoll (2,5 cm) und einem äußeren Durchmesser von 2,5 Zoll (6,25 cm) . Die Dicke der Faserwand ist
demgemäß ungefähr 0,75 Zoll (1,9 cm). Dieses Filter ist so hergestellt, daß es 95 % der Teilchen mit 5 Mikrometer oder mehr
aus einem fließenden Medium zurückhält.
Filterrohre dieser Art werden vielfach in der chemischen Industrie
verwendet. Perry's Chemical Engineer's Handbook (5. Ausgabe, Kapitel 19, Seite 83-5) beschreibt Filtersysteme mit solchen
Filterrohren.
Papain wird von der Worthington Biocheitdcal Corporation bezogen,
es weist nach den Messungen eine Aktivität von 2,9 I^U./mg gegenüber
dem Substrat Casein auf.
Das Filterrohr wird mit einer v/ässrigen Lösung eines Detergen3
gewaschen. Das Rohr wird in einen 2 1-Messzylinder hineingehängt
und die Detergens-lösung mit einem magnetischen Rührer für etwa 15 bis 18 Stunden (über Nacht) gerührt. Die Spülung wird vervollständigt,
indem die Detergens^^ösung weggegossen wird; etwa
destilliertes Wasser wird dazugegeben und für 20 bis 30 Minuten umgerührt. Dieses Verfahren wird mit 6 v/eiteren Teilen von destdl·-
6098AO/1075
liertem Wasser wiederholt.
In ähnlicher Weise wird das Filterrohr darauffolgend mit 800 ml
von dreimolarem Natriumchlorid für eine Stunde gewaschen und dreimal mit destilliertem Wasser gespült. Schließlich wird das
Filterrohr zweimal mit einer Lösung von 0,002 m Lactatpuffer,
pH 3,5, der 0,01 m Zinksulfat enthält, gewaschen.
Diese Lactatzinksulfatpufferlösung wird hergestellt, indem erst
2,12 g einer 85 %igen Lösung an Milchsäure in 500 ml destilliertem
Wasser gelöst werden und dann der pE auf 3,5 mit 0,1 m Natriumhydroxid eingestellt wird. Diese Lösung wird dann weiter
auf ein Gesamtvolumen von einem Liter verdünnt. Ein 100 ml-Bruchteil
der Lactatlösung wird mit 100 ml einer 0,1 m-Zinksulfatlösung gemischt und diese Mischung auf einen Liter verdünnt,
um die endgültige Lactatzinksulfatpufferlösung zu liefern.
Das Filterrohr wird in dem Zylinder angebracht und 500 ml der frischen Pufferlösung hinzugefügt. Nach dem Abkühlen auf etwa
5 0C werden 500 mg Papain in kleinen Mengen hinzugefügt, v/ährend
beständig umgerührt wird. Das Rühren v/ird für 15 Minuten bei dieser Temperatur fortgesetzt.
Eine Enzymimmobilisationsreaktionslösung v/ird durch die Auflegung
von 0,01 ml von 1,3-Diaminopropan und 1,8 ml von 1,2-Difaromäthan
in einem Lösun Attel hergestellt, das aus 40 ml Wasser und 160 ml
Spektral reinem Methanol besteht. Das Molverhältnis von Diaminpropan
zu Dibromäthan ist 0,01:1,der pH-Wert wird auf 4,0 - 0,5 mit
609840/1075
konzentrierter Salzsäure eingestellt.
Das obige Enzymfilterrohrpuffersystem, wird genügend abgekühlt,
um die Temperatur des Puffers im Bereich zwischen O und 5°C zu
halten, und mit einem magnetischen Rührer umgerührt. Die sich auf Raumtemperatur befindende Reagenzlösung zur chemischen Immobilisierung
der Enzyme wird'dann in einer Rate von 1 ml pro Minute
hinzugefügt. Das umrühren wird für 15 bis 18 Stunden (über Nacht) bei O bis 5°C aufrechterhalten. Der pH ist 3,6.
Das Filterrohr wird zweimal bei Raumtemperatur mit Hilfe der oben beschriebenen Technik mit 800 ml einer Lösung aus 0,01 m Trismaleatpuffer,
der 0,001 m in Zinksulfat und 3,O m in Natriumchlorid
ist, gewaschen. Der pH des Puffers ist 6,0. Das Filterrohr wird in dieser Lösung bei 0 bis 5 C aufbewahrt, bis es analysiert oder
in der Substratkonversionsreaktion verwendet wird.
Das Filterrohr wird aus der Lösung, in der es gelagert wurde, entnommen und für 15 Minuten mit einer Lösung aus 800 nl 0,05 m
K2HPO4, 8,O ml 0,1m Dithiothreitol (DTT) und 8,0 ml von 0,1m
Sthylendiamintetraessigsäure (EDTA) gewaschen. Die Bestimmungsmethode
^entspricnt ie w. der von weissler und Garza in Am. Soc.
Brewing Chemists, Proc, Seite 225 bis 238 (1965) beschrieben211
Methode.
Eine Caseinsubstratlösung wird gemäß der Referenzirethode hergestellt,
und zu 800 ml dieser Lösung werden 8,0 ml .. 0,1m
DTT und 8,0 ml 0,1 m EDTA hinzugefügt. Diese Lösung wird bei
609840/ 1075
- 36 -
Raumtemperatur gehalten^ und das gewaschene.Filterrohr, das das
immobilisierte Papain enthält, wird in sie eingebracht. Die Lösung
wird mit einem magnetischen Rührer gerührt. Bruchteile von 5 ml der Substratlösung, in Kontakt mit dem Filterrohr, werden in
1, 5, 10, 20, 30 und 60 Minuten-Intervaltei entnommen. Zu jedem
Bruchteil werden 3 ml einer 30 %igen Lösung aus Trichlor ess j-CT_
säure und 2 ml Wasser hinzugefügt. Die Proben werden für 30 Minuten auf 40 °C erhitzt und durch ein 2 Mikrometer-Filter gefiltert.
Die optische Dichte der Filtrate wird bei einer Wellenlänge von 277 nm gemessen, und die Konzentration des Tyrosin enthaltenden
Hydrolyseproduktes von Casein wird mit Hilfe de r Eiclfcurve
bestimmt. Ein Auftragen der Tyrosinkonζentration der Probe gegen
die Zeit liefert eine gerade Linie, deren Steigung ein Maß für die Rate der Hydrolysierung des Caseins durch das immobilisierte
Papain liefert. Das Resultat wird in Internationalen Einheiten pro Filter ausgedrückt; die Internationale Einheit ist hier definiert
als äquivalente Mikromole Tyrosin, hergestellt pro Minute. Für das Filterrohr, das oben beschrieben wurde, beträgt die Aktivität
19,3 Internationale Einheiten.
Die Verfahren .und Mengen von Beispiel 8 finden wieder Verwendung,
mit der Ausnahme, daß der pH des Lactatpuffers auf 4,5 eingestellt
wird und die Papainlösung für eine halbe Stunde in Gegenwart des Filterrohres vor der Zugabe des Diaminpropan/Dibromäthanreaktionsgemisches
gerührt wird. Die Anfangsaktivität der immobilisierten
- 37 -
609840/1075
26Ü3698
Enzymfilterrohrzusammensetzung ist 38,5 Internationale Einheiten.
Nach einer Aufbewahrung im Puffer von 4 Tagen bei einer Temperatur
von O bis 5 °C beträgt die Aktivität 18,6 Internationale
Einheiten pro Filter.
Das Enzymträgermaterial ist ein Filterrohr identisch dem, das im Beispiel 8 beschrieben wurde, mit der Abänderung, daß die Fasern
aus Orion, einem Polymer auf Acryl nitrilbasis hergestellt werden .
Das Filterrohr wird in 3n HCl über Nacht eingeweicht, um Leim
und andere Oberflächenbehandlungen zu entfernen. Das Filterrohr wird dann viermal mit destilliertem Wasser gewaschen und dann
in eine umgerührte Lösung von 3,0 m NaCl für eine Stunde eingebracht. Dann wird es wieder mit 4 Teilen destilliertem Wasser
gewaschen und schließlich zweimal mit einem Lactat/Zinksulfatpuffer
mit einem pH von 4,5.
Das Filterrohr wird in 800 ml des Puffers eingebracht, der dann auf 0 bis 5°C abgekühlt wird, und 8,0 g Wallerstein Papain
(0,055 I.U./mg) wird in kleinen Gaben hinzugefügt. Das erhaltene Gemisch wird für eine halbe Stunde gerührt und dann eine
chemische Immobilisierungsreaktions lösung mit einer Rate von 1,0 ml pro Minute unter kontinuierlichem Rühren und unter Einhalten der
Temperatur des Systems bei 0 bis 5°C hinzugegeben. Die Reaktions-
60 9 840/1075 - 38 -
lösung besteht aus 0,01 ml 1,3-Diaminpropan, 1,8 ml 1,2-Dibromäthan,
40 ml destilliertem Wasser und 160 ml zur Spektroskopie
geeignete«!!!ethanol. Dies entspricht einem Molverhältnis von
Diaminpropan zu Dibromäthan von 0,01:1. Man läßt die Reaktion
15 bis 18 Stunden (über Nacht) ablaufen. Der pH-Wert der Reaktionslösung nach diesem Zeitraum ist 5,0,
Die immobilisierte Enzym/Filterrohrzusairmensetzung wird gewaschen
und wie in Beispiel 8 beschrieben untersucht. Die Anfangsaktivität beträgt 38 I .U. Nach einer Lagerung von 30 Tagen im Puffer bei
0 bis 5 C beträgt sie 11,6 Internationale Einheiten.
Das Enzymträgerir.aterial ist ein aus Fasern gewundenes Filterrohr,
das die Gestalt und die Maße des in Beispiel 8 beschriebenen besitzt mit der Abänderung, daß Fasern aus einem Copolymer aus
Vinylchlorid und Acrylnitril hergestellt sind. Das Filterrohr wird in 3 η HCl über Nacht eingeweicht, um Leimstoffe und andere
Oberflächenbehandlungen zu entfernen.
Nach einer zweimaligen Waschung mit einem Lactat/Zinksulfatpuffer (pK 4 bis 5), wieer oben in Beispiel 8 beschrieben wurde, wird
das Filterrohr in diese Pufferlösung eingebracht und eine chemische Immobilisationsreaktionslösung hinzugefügt. Das Enzymimmobilisationsverfahren
und die nachfolgende Auswertung werden wie im Beispiel 9 durchgeführt mit der Änderung, daß die Papainlösung
für 2 Stunden in Berührung mit dem Filterrohr gerührt wird,
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- 39 -
bevor di*e Immobilisationsreaktionslösung hinzugefügt wird. Die
Aktivität des Filterrohres beträgt 30,4 Internationale Einheiten. Mach 24 Tagen beträgt die Aktivität des Filterrohres 2,9 Internationale
Einheiten. 21 Tage danach, 45 Tage nach der Herstellung, beträgt die Aktivität 5,7 Internationale Einheiten. Die
•immobilisierte Enzym/Filterrohrzusammensetzung wird in einem
Puffer bei O bis 5 C zwischen den Analysen gelagert.
Dieses Beispiel beschreibt die Immobilisation von gereinigtem Papain in Abwesenheit eines Lactatpufferε. Eine 20 g Probe von
Kaliers te in-P apain 90 wird in 200 ml einer 0,01 ia Zinksulfatlösung,
pH 4,5, dispergiert^ Diese Dispersion wird für eine halbe Stunde bei 1O 400 g zentrifugiert und der sich bildende Niederschlag
ausgeschieden. Su dem Überschuß werden langsam 62,6 g natriumchlorid bei langsamem Rühren bei Raumtemperatur hinzugegeben
. Nach 2 Stunden wird das Gemisch für 20 Minuten bei 10 000 g
zentrifugiert. Der Überschuß wird ausgeschieden und das niedergeschlagene
Papain in 800 ml O7OI τη Zinksnlfat, eingestellt auf einen
pH von 4,5 mit verdünnter Salzsäure gelöst.
Die Papainlösung wird auf 0 bis 5 0C abgekühlt, und ein Filterrohr
wie das in Beispiel 11 hergestellte wird unter einem Rühren von
45 Minuten darin eingebracht. Die Dibromäthan-Diaminpropanreaktionslösung,
die gleiche wie in Beispiel 10, wird zu den Papain-Filtersystem
mit einer Rate von 1,0 ml pro Minute hinzugefügt, und das
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- 40 -
Rühren wird über Nacht aufrechterhalten. Die immobilisierte
Enzym-Filterrohrzusammensetzung wird gewaschen und wie in Beispiel
8 beschrieben ausgewertet. Die Aktivität beträgt 58, 6 Internationale Einheiten. Nach 6 Tagen Aufbewahrung wird sie
wieder gemessen und zu 39 Internationale Einheiten bestimmt.
Eine 50 g Probe Wallerstein-Papain 400 wird in 400 ml einer 0,01 molaren Sinksulfatlösung ir>it einem pH von 4,5 dispergiert#
Sie wird für eine halbe Stunde bei 16 300 g "zentrifugiert und der gebildete Niederschlag wird ausgeschieden. Zu dem
Überschuß werden langsam 125,2 g Natriumchlorid hinzugegeben,
und das so erhaltene Gemisch wird bei Raumtemperatur für 2 Stunden
stehengelassen. Es wird dann bei 16.300 g für 40 Minuten zentrifugiert, der Überschuß wird abgeschieden und der Papainnieder
schlag in 800 ml der obigen Zinksulfatlösung aufgelöst.
Ein Filterrohr aus einem Copolymer aus Vinylchlorid und Acrylnitril
wird in HCl wie in Beispiel 11 eingeweicht und mit einer 0,01 molaren Zinksulfatlösung mit einem pH von 4,5 für eine
Stunde gewaschen. Dann wird es in die oben beschriebene Papainlösung, die auf 0 bis 5 0C abgekühlt ist, eingebracht.
Der pH wird auf 4,3 mit 1 η Natriumhydroxid eingestellt. Die Papainlösung
wird für 45 Minuten gerührt und eine Reaktionslösung mit einer Rate von 1,0 ml pro Minute hinzugefügt. Die Reaktionslösung besteht aus 0,01 ml 1,3-Diaminpropan, 1,8 ml 1,2-Dibromäthan,
40 ml einer 0,OQS Eio^ar^en^Ült^säure, und 160 ml zur
Spektroskopie geeignetem Methanol, eingestellt auf pH.
3,3 mit HCl.
Das Diaminpropan zu Dibromäthan-Molverhältnis beträgt 0,01:1.
Nach etwa 15 bis 18 Stunden (über !lacht) wird die irir.obilisierte
Enzyir./Filterrohrzusammensetzung für 25 Minuten 800 ml einer 0,01 m
Tris-Maleatpufferlüsung, die 0,001 m in Zinksulfat und 1,0 m in
Natriumchlorid, pH 6,0, ist, gewaschen. Dann wird sie zweimal
mehr für 15 bis 30 Minuten gewaschen, jedesmal in einem gleichen, aber fiatriuir.chloridfreien Puffer. Sie wird in diesem Puffer bei
0 bis 5 0C bis zur Auswertung aufbewahrt. Bei der Auswertung gemäß
dem Verfahren ron Beispiel 8 wird die Aktivität des Filterrohres
auf 109 Internationale Einheiten b stimmt. Nach einer Aufbewahrung
von einem Monat in dem Puffer beträgt die Aktivität 94 Internationale Einheiten.
Das Enzymträgermaterial ist ein Filterrohr wie das in Beispiel 8
beschriebene mit der Abänderung, daß die Fasern aus Orion sind. Das Filterrohr wird erst mit einer Reinigungslösung und dann in
3 η HCl für 2 Tage gewaschen, d. h., das Filterrohr wird in eine gerührte Lösung von HCl eingebracht. Nach einer Spülung mit mehreren
Gängen von destilliertem deionisiertem Wasser läßt man das Filter/für etwa 1 1/2 Stunden in einer 0>01 m Zinksulfatlösung bei
0 bis 5 0C stehen.
- 42 609840/1075
Eine Enzymlösung wird hergestellt, indem man erst 50 g V7allerstein-Papain
400 rekristallisieren läßt. Dies geschieht durch ein Verbinden des Enzymes in 400 ml 0,01 m Zinksulfat und Zentrifugieren
für eine halbe Stunde bei einer Beschleunigung von 14 000 g. Zu dem Überschuß werden langsam 125,2 g UaCl hinzugefügt,
und das Gemisch wird bei Raumtemperatur für 2 Stunden vor einer erneuten Zentrifugierung stehengelassen. Der Niederschlag
v/ird in 800 ml 0,01 m Zinksulfat gelöst, das mit 3 η HCl auf einen
pPI von 4,8 eingestellt ist, und das Filterrohr v/ird darin
eingetaucht. Der pH wird wieder auf, wenn nötig, 4,8 eingestellt, und das System wird in einem Kühlbad für 45 Minuten bei O bis 5 C
gehalten_
Eine Enzyir-Immobilisations lösung wird durch das Hinzufügen von
3,9 ml Dibrommethan, 40 ml 0,005 m wässriger Lösung von Milchsäure,
0,03 ml 1,3-Diaminpropan und genügend Salzsäure, um den
pH auf 3,2 einzustellen, zu 160 ir.l Methanol hergestellt. Das
Molverhältnis zwischen Diaminpropan und Dibromäthan beträgt
0,0064:1. Diese Lösung v/ird mit einer Rate von 1,0 ml pro Minute zu dem Filterrohr/Enzymsysteir, das oben beschrieben wurde, hinzugefügt.
Nach der Zugabe des Reagenz v/ird das Rühren und Abkühlen über Nacht beibehalten. Der pH wird am nächsten Tage zu 4,5 bestimmt
4
Das Filterrohr wird mit 800 ml jeder der folgenden Waschlösungen gewaschen: 1) 0,01 m Tris-Maleatpuffer, der 0,001-molar in Zinksulfat
und 1,0-ntolar in Natriumchlorid ist und 2) 2 Teile eines
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- 43 -
OfO1 m Tris-Ilaleatpuffers, der 0,001 m in Zinksulfat ist.
Das Filterrohr wird in 3 bis 4 1 einer frischen Lösung aufbewahrt,
die dieselbe -Zusammensetzung wie die letzte Waschlösung besitzt.
Es wird auf 0 bis 5 0C bis zur Auswertung gehalten.
Das Filterrohr wird ausgewertet wie in Eeispiel 8 und die Aktivität
auf 51 Internationale Einheiten bestimmt.
Eine 3 g Probe von -70 bis +So mesh poröses Aluminiumoxid wird bei i05o°C für 45 Minuten erhitzt. Nach Abkühlung wird eine
wässrige Aufschlämining des Pulvers mit destilliertem Wasser hergestellt
und in eine Kolonne gebracht, die 30,5 cm lang ist und einen Durchmesser von 2,0 mm besitzt.
400 mg Urease wird mit 200 ml Wasser zusammengegeben und zentrifugiert,
um irgendwelches eingebrachtes unlösliches Material zu entfernen. Der klare überstand, pH 5,6, wird auf 2 abgekühlt und
zum fluieren der.Kolonne mit Hilfe einer Peristaltikpumpe
verwendet, während das System auf niedriger Temperatur gehalten
wird. Die Urease-Lösung «ludert die Kolonne mit einer Rate
von O,9 ml pro Minute.
Chemische Immobilisation der sorbierten urease wird durch eine
darauffolgende Eluievurxg durch die Kolonne mit einer vorbereiteten
Reaktionslösung erreicht, die aus 0,1 ml 1,2-Dibromäthan
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- 44 -
0,4 ml 1-, 3-Diaminopropan, 20 ml Methanol, 30 ml Uasser und
genügend konzentrierter HCl zur Einstellung des pH auf 7,25
besteht. Das Diarainpropan zu Dibromäthan-Molverhältnis beträgt 4:1. Dieses Gemisch wird langsam durch die Kolonne über einen
Zeitraum von 5 Stunden bei Raumtemperatur geleitet-
genügend konzentrierter HCl zur Einstellung des pH auf 7,25
besteht. Das Diarainpropan zu Dibromäthan-Molverhältnis beträgt 4:1. Dieses Gemisch wird langsam durch die Kolonne über einen
Zeitraum von 5 Stunden bei Raumtemperatur geleitet-
Schließlich wird die Kolonne gewaschen, zuerst mit 40 ml 0,5 m NaCl, dann mit 10 ml 0,001 m Beta-Mercaptoäthanol, und schließlich
ir.it 50 ml Wasser.
Eine Erstuntersuchung der Kolonne zeigte eine Aktivität von mehr als 1000 I.U./cm von immobilisierter Enzyr-zusammensetzung an.
Zwei Tage später, nach Aufbewahrung in destilliertem I7asser, wird
die Kolonne wieder gemessen. Sie wird ir.it einer Lösung, die 0,001-molar
sowohl in Beta-Mercaptoäthanol als auch in Äthylendiarr.intetraessioj
säure als auch in Hatriumacid ist, gewaschen und in deren Gegenwart untersucht. Die Aktivität übertrifft noch 1000
I.U./cm immobilisierte Enzyirzusainnensetzung.
6098 4 Π/107 5
- 45 -
Claims (15)
- Ansprüche(Λ J Verfahren zur Immobilisierung eines Enzyns auf einem Trilger, wobei ein Enzym, ein Träger und ein chemisches Immobilisierungsagens in Kontakt bei einer Temperatur und für einen Zeitraum gehalten werden, ausreichend, um das Enzyn chemisch zu immobilisieren, dadurch gekennzeichnet, daß das chemisch immobilisierende Agens eine vorbereitete Reaktionslösung aus einem Alkandiamin und einem Alkandihalogenid enthält.
- 2. Das Verfahren ger.äß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das liolverhältnis zwischen Alkandiamin und Alkandihalogenid in dem Bereich zwischen etwa 0,005:1 bis etwa 10OO:1 liegt.
- 3. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung eine wässrige Lösung ist.
- 4. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym auf dem Träger niedergeschlagen ist, bevor es in Kontakt mit der Lösung kommt.
- 5. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel enthält.
- 6. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß609840/107 5 46der Träger ein poröses Grundmaterial ist, das durch Verfestigen und Sintern feuerfesten Oxidpulvers gebildet wird.
- 7. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger Faserform besitzt#
- 8. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Alkandihalogenid 1 bis 10 Kohlenstoffatome enthält.
- 9^ Das Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Alkandiamin 1 bis 10 Kohlenstoffatome enthält.
- 10. Das Verfahren zur chemischen Immobilisierung eines Enzymes auf einem Träger, gekennzeichnet durch folgende Schritte: Lagerung des Enzyms auf dem Träger, um eine Enzym/Trägerzusammensetzung zu bilden,das Inkontaktbringen der Zusammensetzung mit einer vorbereiteten Reaktionslösung aus einem Alkandihalogenid und einem Alkandiamin,das Inkontakthalten der Zusammensetzung und der Reaktionslösung bei einer Temperatur und für einen Zeitraum, ausreichend, das Enzym chemisch zu immobilisieren.
- 11. Das Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym Glukoseoxidase ist.- 47 609840/1075
- 12. Das Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet/ daß das Enzym Urease ist.
- 13. Das Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym Papain ist.
- 14. Das Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung eine v/ässrige Lösung ist.
- 15. Das Verfahren ger.äß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Alkandihalogenid und das Alkandiarcin jeweils 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthalten.609840/ 1075
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