DE69205199T2

DE69205199T2 - Biokompatible Affinitätsmatrix mit schwacher Proteinadsorption.

Info

Publication number: DE69205199T2
Application number: DE69205199T
Authority: DE
Inventors: James A Braatz; Aaron H Heifetz
Original assignee: WR Grace and Co
Current assignee: Millipore Investment Holdings Ltd
Priority date: 1991-04-08
Filing date: 1992-04-01
Publication date: 1996-03-07
Anticipated expiration: 2012-04-02
Also published as: JPH07191008A; US5403750A; DE69205199D1; EP0510393A1; EP0510393B1

Description

Die vorliegende Anmeldung ist eine Continuation-in-Part zur am 6. März 1991 eingereichten Anmeldung Nr. 665 498 (Veröffentlichungsnummer US-A-5 169 720).

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft Matrizes zur Verwendung bei der Affinitätschromatographie und der Immobilisierung biologisch aktiver Materialien. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Affinitätsträger basierend auf einer einzigartigen Serie von hydratisierten Polyharnstoff-Polyurethan-Polymeren, welche aktiviert worden sind, um Mittel zur Immobilisierung und Chromatographierung einer großen Vielfalt von Bioaffinitätsmitteln bereitzustellen.
Die Bioaffinitätstrennungen beinhalten im allgemeinen mindestens ein Biomakromolekül wie ein Protein oder eine Nukleinsäure als eine der Komponenten des Bindungspaares. Beispiele für derartige Bioaffinitäts-Bindungspaare schließen ein: Antigen-Antikörper, Substrat-Enzym, Effektor-Enzym, Inhibitor-Enzym, komplementäre Nukleinsäurestränge, Bindungsprotein-Vitamin, Bindungsprotein-Nukleinsäure; reaktiver Farbstoff-Protein, reaktiver Farbstoff-Nukleinsäure; und andere; die Begriffe Ligand und Binder werden vorliegend zur Bezeichnung der beiden Bioaffinitätsmittel spezifischer Bindungspaare verwendet. Mit "Ligand" ist ein Antigen, Hapten, eine Nukleinsäure, ein Vitamin, Farbstoff oder ein kleines organisches Molekül einschließlich Enzymsubstrate, Effektoren, Inhibitoren und dergleichen gemeint. Binder bedeutet ein Antikörper, Enzym, eine Nukleinsäure, ein Bindungsprotein, synthetische Nachahmungen von Bindungsproteinen wie Polylysin und Polyethylenimine oder andere Makromoleküle, welche in der Lage zur spezifischen Bindung, Enzym/Substrat- Interaktionen, etc. sind.
Die erfindungsgemäßen Affinitätsträger basieren auf aktivierten Polymeren, hergestellt aus hochmolekularen, mit Isocyanat endverkappten Präpolymeren, die im wesentlichen aus Ethylenoxideinheiten aufgebaut sind. Die Aktivierung der Polymere erfolgt, indem man zunächst das Präpolymer mit einer reaktiven Verbindung mit einer NCO-reaktiven Gruppe und einer zweiten funktionellen Gruppe derivatisiert. Die derivatisierten oder modifizierten Präpolymere werden mit Wasser polymerisiert, um ein modifiziertes Polyharnstoff-Urethan-Polymer zu erhalten, welches durch die in das Präpolymer eingeführte zweite funktionelle Gruppe gekennzeichnet ist. Das modifizierte, hydratisierte Polyharnstoff-Urethan-Polymer wird sodann aktiviert, indem das Polymer mit einer aktivierenden Verbindung kontaktiert (umgesetzt) wird, um zumindest einige der zweiten funktionellen Gruppen der modifizierenden Verbindung in eine aktive funktionelle Gruppe umzuwandeln, welche in der Lage ist, einen spezifischen Liganden oder einen interessierenden Binder selektiv kovalent zu binden.
Es sind bisher zahlreiche Polyurethanpolymere beschrieben worden, wobei zu diesen sowohl geschäumte als auch ungeschäumte Materialien zählen. Von den ungeschäumten Materialien sind eine Reihe von Hydrogelpolymere, die aus verschiedenen Präpolymeren hergestellt worden sind, hergestellt und für sehr unterschiedliche Anwendungen eingesetzt worden. Typischerweise werden Hydrogele gebildet durch Polymerisierung eines hydrophilen Monomers in einer wäßrigen Lösung unter solchen Bedingungen, daß das Präpolymer vernetzt wird, wobei sich ein dreidimensionales polymeres Netzwerk bildet, welches die Lösung geliert. Polyurethanhydrogele werden gebildet durch Polymerisation von an den Enden mit Isocyanat verkappten Präpolymeren, um Harnstoff- und Urethanbindungen zu schaffen.
Repräsentative Beispiele der zuvor beschriebenen Polyurethanhydrogele schließen die folgenden ein:
In der US-A-4 241 537 (Wood) ist ein Wachstumsmedium für Pflanzen beschrieben, welches eine hydrophile Polyurethangelzusammensetzung umfaßt, welche aus kettenverlängerten Polyolen hergestellt ist; eine statistische Copolymerisation mit bis zu 50 % Propylenoxideinheiten wird bevorzugt, so daß das Präpolymer bei Raumtemperatur eine Flüssigkeit ist. Die US-A-3 939 123 (Matthews) beschreibt leicht vernetzte Polyurethanpolymere aus Isocyanat-terminierten Präpolymeren, die aus Poly(ethylenoxy)glykolen mit bis zu 35 % Poly(propylenoxy)glykol oder Poly(butylenoxy)glykol bestehen. Bei der Herstellung des Matthews- Polymers wird ein organisches Polyamin als Vernetzungsmittel verwendet. Die Matthews-Präpolymere bilden eine vernetzte, dreidimensionale Struktur, wenn sie nach der Lehre des Patentes polymerisiert werden. Die US-A-4 182 827 (Jones) beschreibt eine ähnliche Verwendung von Polyaminen bei der Bildung von Polyurethanhydrogelen.
Mehrere Arten von Verbindungen sind mit Präpolymeren oder mit Matrixbasen umgesetzt worden, um als Abstandshalter- oder Kupplungsverbindungen bei der Anheftung oder Immobilisierung von biologisch aktiven Mitteln zu wirken. Beispielsweise beschreibt die US-A-4 226 935 (Fusee) die Umsetzung einer Aminosäure und/oder eines Proteins mit einem Überschuß eines Urethanpräpolymers, die Vernetzung des resultierenden Produkts zur Bildung einer Polymermatrix, und die Kopplung eines Enzyms daran unter Verwendung eines Carbodiimids. Die US-A-4 177 038 (Biebricher et al.) lehrt die Verwendung von Abstandshaltern, die Diamine, Aminoalkohole oder Diole sein können.
Modifizierte Polyurethanpolymere sind ebenfalls hergestellt worden. Die US-A-4 439 585 (Gould et al.) beschreibt eine Polyurethandiacrylatzusammensetzung, welche durch Umsetzung eines Diacrylats in Gegenwart eines hydrophilen Polyolurethanharzes erhalten wurde. Die US-A-4 485 227 (Fox) beschreibt einen Polyy(ether-urethan-harnstoff), hergestellt durch Kondensationen eines Präpolymers mit primären Diaminen, und anschließend mit einem mit Amin reagierenden Mittel. Die US-A-4 569 981 (Wenzel et al.) offenbart in Wasser dispergierbare Kunststoffvorläufer auf Basis von Isocyanat-terminierten Präpolymeren, welche mit ionischen Gruppen und/oder Ethylenoxidgruppen hydrophil modifiziert worden sind. Die EP-A-0 335 308 betrifft Polyharnstoff- Urethan-Präpolymere und verwandte vernetzte hydratisierte Polymergele, die ausgehend von auf Oxyethylen basierenden Diolen oder Polyolen, die Polyisocyanatkappen tragen, gebildet wurden. Die Präpolymere gemäß EP-A-0 335 308 werden mit Wasser oder einem Kettenabbruchmittel behandelt, um die Kettenverlängerung und die Vernetzung des Polymers auf der Substratoberfläche zu fördern, d.h. diese hydratisierten Polymerbeschichtungen werden kovalent verlängert und vernetzt.
Die Biokompatibilität ist eine zunehmend erwünschte Eigenschaft von polymeren Hydrogelen und hydratisierten Polymeren, die zahlreiche Anwendungen im Bereich der Gesundheitspflege finden würden, wenn die geeigneten Eigenschaften erreicht werden können. Von vielen herkömmlichen Hydrogelen und Polymeren wird jedoch angenommen, daß sie nicht biokompatibel sind. Zusätzlich führt eine Modifikation einer Polymeroberfläche häufig zu einer gesteigerten nicht-spezifischen Bindung unerwünschter Proteine. Da die Affinitätstrennung eine im Laboratorium und der Gesundheitspflege zur Reinigung zahlreicher biologisch aktiver Materialien leistungsstarke Technik darstellt, besteht ein Bedarf für Affinitätsmatrizes, die eine verbesserte Biokompatibilität und eine erhöhte Resistenz gegenüber einer nicht-spezifischen Proteinadsorption aufweisen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Es ist eine neue Klasse von hydrophilen Polyurethan-Präpolymeren und verwandten vernetzten hydratisierten Polymeren zur Verwendung bei der Herstellung von Affinitätsmatrizes gefunden worden, die in einzigartiger Weise durch ihre Biokompatibilität und Resistenz gegenüber unspezifischer Proteinadsorption gekennzeichnet sind. Die Matrizes bestehen aus dem hydratisierten Polymer oder einem mit dem hydratisierten Polymer beschichteten oder imprägnierten Träger, wobei das Polymer aktiviert worden ist, um für einen interessierenden Liganden oder ein Bindermolekül eine spezifische Reaktivität aufzuweisen. Das hydratisierte Polymer ist vorzugsweise von polymeren Monomereinheiten (die Präpolymereinheiten) abgeleitet, wovon mindestens 75 % auf Oxyethylen basierende Diole oder Polyole sind mit durchschnittlichen Molekulargewichten von etwa 7000 bis etwa 30 000, wobei im wesentlichen alle Hydroxylgruppen dieser Diole oder Polyole Polyisocyanatkappen aufweisen. Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeigneten Präpolymere werden hergestellt, indem die ausgewählten Diole oder Polyole mit Polyisocyanat in einem Verhältnis von Isocyanat zu Hydroxyl von etwa 1,8 bis etwa 2,2 derart umgesetzt werden, daß im wesentlichen alle Hydroxylgruppen der Polyole mit Polyisocyanat verkappten sind. Die Polymerisation zum Gelieren der Präpolymerlösung kann durch Kontaktieren mit Wasser erfolgen, um ein Polyharnstoff-Urethan-Polymer zu ergeben, oder mit einem anderen Vernetzungsmittel, um ein Polyurethanpolymer zu erhalten.
Das erfindungsgemäße Polyurethanpolymersystem liefert modifizierte Präpolymere und Polymere mit äußerst wünschenswerten Eigenschaften, die sie insbesondere auf dem Gebiet der Affinitätstrennungen sehr gut geeignet machen. Die hydratisierten Polymere können die Form von in Wasser anschwellbaren, dreidimensionalen Hydrogelen annehmen. Alternativ können sie die Form einer dichten oder dünnen Beschichtung oder Imprägnierung auf einem Substrat annehmen, einschließlich, unter verdünnten Bedingungen, einer monomolekularen oder im wesentlichen monomolekularen Schicht. Die Beschichtungen und Imprägnate der vorliegenden Erfindung werden als Gele oder Hydrogele angesehen und sind von den genannten Begriffen umfaßt, sofern nichts anderes angegeben wird. Die Begriffe Gel oder Hydrogel sollen sich auf Polymere beziehen, die eine ungeschäumte Struktur aufweisen.
Ein Hauptziel der vorliegenden Erfindung liegt in der Bereitstellung von Affinitätsmatrizes, die durch Biokompatibilität und eine einzigartige Oberfläche gekennzeichnet sind, die einer unspezifischen Proteinadsorption widersteht. Ein damit zusammenhängendes Ziel ist die Bereitstellung von auf Polymeren basierenden Affinitätsmatrizes, die sich modifizieren lassen und immer noch deutlich einer unspezifischen Adsorption oder Bindung von Proteinen widerstehen.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung liegt in der Bereitstellung von hydrophilen, biokompatiblen Polymeren, die zur Herstellung von Affinitätsträgermatrizes geeignet sind.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Der erfindungsgemäße Affinitätsträger wird hergestellt aus aktivierten, hydrophilen Polyurethan-Präpolymeren oder Polyharnstoff-Urethan-Polymeren, die auf einzigartige Weise durch eine spezifische Reaktivität gekennzeichnet sind, welche auf die Addition spezifischer funktioneller Gruppen an das Polymermolekül zurückzuführen ist. Die Präpolymere, von denen ausgehend die aktivierten Polymerverbindungen hergestellt werden, sind polymere Monomereinheiten, welche auf Oxyethylen basierende Alkohole sind, die monofunktionelle Alkohole, Diole und Polyole einschließen, bei denen im wesentlichen alle Hydroxylgruppen mit Polyisocyanat verkappt sind. Das Präpolymer wird modifiziert oder derivatisiert durch Umsetzung mit einer Verbindung, die eine erste funktionelle Gruppe aufweist, welche NCO-reaktiv ist. Die Begriffe "modifiziert" und "derivatisiert" werden vorliegend als Synonyme verwendet. Die modifizierende Verbindung besitzt ferner eine zweite funktionelle Gruppe, welche gegenüber den NCO-Gruppen des Präpolymers nicht-reaktiv oder gegenüber den NCOS weniger reaktiv, vorzugsweise wesentlich weniger reaktiv ist, als die NCO-reaktive Gruppe (d.h. als die erste funktionelle Gruppe). Die NCO-reaktive Gruppe kann eine Sulfhydryl (-SH)-, Amino (-NH&sub2;)-, Hydroxyl (-OH)- oder Carboxyl (-COOH)-Gruppe sein.
Die Polymerisation von partiell modifizierten Präpolymeren in Wasser oder einer wäßrigen Lösung bewirkt ein Gelieren der Lösung oder einer aufgetragenen Schicht aus der Zusammensetzung unter Bildung eines modifizierten Polyurethan- oder Polyharnstoff-Urethan-Polymers. Das modifizierte Polymer ist gekennzeichnet durch die zweite funktionelle Gruppe, die in das Präpolymermolekül eingefügt wurde. Um das modifizierte Polymer zu aktivieren, wird das Polymer durch die zweite funktionelle Gruppe mit einer aktivierenden Verbindung umgesetzt. Die aktivierende Verbindung besitzt eine funktionelle Gruppe, welche gegenüber der zweiten funktionellen Gruppe des Polymers reaktiv ist, sowie eine nicht-reaktive Gruppe, welche gegenüber der zweiten funktionellen Gruppe weniger reaktiv, oder wesentlich weniger reaktiv ist, welche jedoch in der Lage ist, einen spezifischen biologischen Liganden oder Binder durch kovalente Bindung selektiv zu binden, d.h. welche in der Lage ist, ein Bioaffinitätsagens kovalent anzulagern.
Im Gegensatz zu den Polymeren der EP-A-0 335 308, die Polyharnstoff-Urethan-Präpolymere und verwandte vernetzte hydratisierte Polymergele betreffen, die aus auf Oxyethylen basierenden Diolen oder Polyolen, verkappt mit Polyisocyanat, gebildet sind, werden die erfindungsgemäßen Polyharnstoff-Polyurethan-Präpolymere in einem ersten Schritt modifiziert durch Umsetzung mit einer modifizierenden Verbindung, die zwei funktionelle Gruppen aufweist, deren NCO-Reaktivität sich wesentlich unterscheidet, wobei die erste von beiden verwendet wird, um das Präpolymer durch Umsetzung mit den NCO-Gruppen des Präpolymers zu derivatisieren oder zu modifizieren. Ein weiteres Umsetzen der zweiten funktionellen Gruppen der modifizierenden Verbindung mit einer aktivierenden Verbindung zur Schaffung einer aktiven funktionellen Gruppe, die in der Lage ist, ein Bioaffinitätsagens kovalent anzulagern, wird von der EP-A-0 335 308 weder offenbart noch nahegelegt. Im Gegensatz zu den erfindungsgemäßen Präpolymeren und Polymeren werden die Präpolymere der EP-A-0 335 308 mit Wasser oder einem Kettenabbruchmittel behandelt, um die Kettenverlängerung und Vernetzung des Polymers auf der Substratoberfläche zu fördern.

Herstellung des Präpolymers

Die zur Herstellung der erfindungsgemäßen Affinitätsmatrizes verwendeten Präpolymere werden aus auf Oxyalkylen basierenden Alkoholen gebildet. Diese können monofunktionelle Alkohole oder Diole oder Polyole, einschließlich Diolen oder Polyolen sein, die aus Ethylenoxidmonomereinheiten aufgebaut sind. Der Anteil an Ethylenoxideinheiten kann variieren und wird nachfolgend detaillierter beschrieben. Präpolymere werden gebildet, wenn Diole und/oder Polyole mit di- oder polyfunktionellen Isocyanaten wie nachfolgend beschrieben an ihren Enden verkappt werden. Bei bestimmten Ausführungsformen (d.h. wenn eine Polymerisation nicht erforderlich ist) können die Enden von monofunktionellen Alkoholen zur erfindungsgemäßen Verwendung mit di- oder polyfunktionellen Isocyanaten verkappt werden. Diese Verbindungen sind streng genommen keine "Präpolymere". Da sie jedoch in analoger Weise hergestellt und verwendet werden, bezieht sich der vorliegend verwendete Begriff "Präpolymer" auf mit Isocyanaten verkappte monofunktionelle Alkohole wie auch auf Diole oder Polyole.
Eine umfangreiche Klasse von hydrophilen, mit Isocyanaten verkappten Urethan-Präpolymeren ist dargelegt im US-Patent Nr. 4 137 200 (Wood et al.), auf deren Lehren hiermit Bezug genommen wird. Die Präpolymere nach Wood et al. sind Mischungen eines monomeren Polyols und Polyoxyalkylenglykol, und die Hydroxylgruppen der Mischung sind mit einem Polyisocyanat verkappt. Das Polyoxyethylenpolyol kann ein durchschnittliches Molekulargewicht von etwa 100 bis etwa 20 000 und vorzugsweise zwischen etwa 600 bis etwa 6000 aufweisen mit einer Hydroxylfunktionalität von etwa 2 oder mehr, vorzugsweise von etwa 2 bis etwa 8. Die Polyole sollten wünschenswerterweise etwa 40 bis etwa 100 Mol-% Ethylenoxidgehalt aufweisen.
Es ist möglich und kann erwünscht sein, verschiedene Mengen eines relativ hydrophoben Comonomers einzuarbeiten. Demgemäß können Comonomere wie Propylenoxid oder Butylenoxid zu einem statistischen Copolymer, Block-Copolymer, oder zu beiden copolymerisiert werden. Es können aliphatische, aromatische oder aliphatisch-aromatische Isocyanate wie die nachfolgend aufgeführten verwendet werden. Wahlweise kann ein Vernetzungsmittel eingeschlossen werden.
Eine Gruppe der mit Isocyanat verkappten Urethan-Präpolymere dieser im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendbaren Klasse umfaßt die mit Isocyanat verkappten Polyester. Derartige Präpolymere können hergestellt werden durch Kondensieren eines mehrwertigen Alkohols mit einer Polycarbonsäure, um einen linearen Polyester zu bilden, welcher anschließend mit einem leichten molaren Überschuß eines Polyisocyanats umgesetzt wird, um ein im wesentlichen lineares Polyurethan bereitzustellen, das terminale Isocyanatgruppen aufweist sowie ein durchschnittliches Molekulargewicht innerhalb des Bereichs von 100 bis 20 000, vorzugsweise zwischen etwa 600 und etwa 6000 besitzt. Zur Herstellung derartiger Präpolymere verwendbare mehrwertige Alkohole schließen die Polyalkylenglykole wie Ethylen-, Propylen- und Butylenglykol und Polymethylenglykole wie Tetramethylen- und Hexamethylenglykole ein. Eine andere Gruppe von mit Isocyanat verkappten Urethan-Präpolymeren, die im Rahmen der Erfindung verwendet werden kann, umfaßt die mit Isocyanat verkappten Polyether. Diese Präpolymere können hergestellt werden, indem zum Beispiel Polyalkylenglykole mit Diisocyanaten des nachfolgend aufgeführten Typs umgesetzt werden, um ein Polyurethan zu schaffen, welches über terminale Isocyanatgruppen verfügt und ein durchschnittliches Molekulargewicht innerhalb des Bereichs von 100 bis 20 000, vorzugsweise zwischen etwa 600 und etwa 6000 aufweist. Als spezifische Beispiele dieser Präpolymere ist die von Grace Specialty Chemicals Co., W.R. Grace & Co.-Conn., erhältliche HYPOL -Polyurethanpräpolymer-Serie geeignet.
Eine zweite zur Verwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignete Klasse von Präpolymeren umfaßt Polyoxyalkylendiole oder -polyole, die im allgemeinen ein höheres Molekulargewicht aufweisen und vorwiegend oder ausschließlich aus Ethylenoxidmonomereinheiten gebildet sind. Diese zweite Klasse ist zur erfindungsgemäßen Verwendung in gewisser Weise bevorzugter. Vorzugsweise sollten mindestens 75 %, noch bevorzugter mindestens 90 %, und am bevorzugtesten mindestens 95 % bis etwa 100 % der Monomereinheiten Ethylenoxid sein. Als spezifische Beispiele für diese Klasse von Präpolymeren sind die von Grace Specialty Chemicals Co., W.R. Grace & Co.-Conn., erhältlichen Präpolymere der BLOPOL -Polyurethanpräpolymer-Serie besonders geeignet. Diese Präpolymere bilden Hydrogele, wenn sie wie nachfolgend beschrieben partiell modifiziert werden.
Hochmolekulare, auf Ethylenoxid basierende Diole und Polyole werden verwendet zur Herstellung dieser zweiten Klasse von Präpolymeren, derivatisierten Präpolymeren und hydratisierten Polymeren der vorliegenden Erfindung. Das Molekulargewicht des Diols oder des Polyols vor der Verkappung mit Polyisocyanat sollte vorzugsweise mindestens etwa 7000 bis 8000 MW, bevorzugter etwa 10 000 bis etwa 30 000 MG betragen. Es ist bevorzugt, Trihydroxyverbindungen (Triole) bei der Herstellung der Polyole zu verwenden, die die Vorläufer der erfindungsgemäßen Präpolymere, derivatisierten Präpolymere und hydratisierten Polymere sind. Beispielsweise ist Glycerin ein bevorzugtes Triol. Trimethylolpropan (TMOP), Trimethylolethan und Triethanolamin sind andere geeignete Triole. Zusätzlich können Tetrole wie Pentaerythritol zur Herstellung erfindungsgemäß verwendbarer Polyole eingesetzt werden. Auf Triolen oder Tretrolen basierende Polyole werden mit nachfolgend beschriebenen difunktionellen oder polyfunktionellen Isocyanatverbindungen verkappt, um das Präpolymer zu bilden.
Alternativ können Diole mit geeignetem Molekulargewicht als Vorläufer für die erfindungsgemäßen Präpolymere verwendet werden. Diole mit geeignetem Molekulargewicht werden wie nachfolgend beschrieben mit polyfunktionellen Isocyanaten verkappt, um die Präpolymere zu bilden. Hochmolekulare Polyethylenglykole sind besonders geeignet. Bei dieser Ausführungsform besonders wünschenswert sind Polyethylenglykole der Formel H(OCH&sub2;CH&sub2;)xOH, wobei x ein solcher Durchschnittswert ist, daß das Glykol ein durchschnittliches Molekulargewicht von mindestens etwa 7000, vorzugsweise etwa 10 000 bis etwa 30 000 aufweist. Alternativ können Diole mit Diisocyanaten verkappt und zusammen mit vernetzenden Verbindungen verwendet werden, um die vorliegend beschriebenen hydratisierten Polymere zu bilden. Für diesen Zweck geeignete vernetzende Verbindungen schließen polyfunktionelle Amine und polyfunktionelle Isocyanate ein. Bei noch einer anderen alternativen Ausführungsform können Diole mit Polyolen gemischt und die resultierende Mischung mit Isocyanaten umgesetzt werden, um das erfindungsgemäße Präpolymer herzustellen.
Monofunktionelle Alkohole können als "Präpolymer"-Grundeinheit ausgewählt werden, wenn vollständig modifizierte Präpolymereinheiten beabsichtigt sind. Beispielsweise kann Monomethoxypoly(ethylenglykol) verwendet werden. Bei dieser Ausführungsform wird der monofunktionelle Alkohol an seinem Ende mit Polyisocyanat verkappt und anschließend erfindungsgemäß modifiziert.
Diese modifizierten Verbindungen werden nicht zur Polymerisation befähigt sein. Vielmehr führen sie zu kleinen, vollständig modifizierten Präpolymereinheiten, die in Wasser löslich sind.
Die Präpolymere dieser zweiten Klasse werden gebildet durch Umsetzung der Hydroxylgruppen der oben beschriebenen Diole oder Polyole mit Polyisocyanaten. Der vorliegend verwendete Begriff "Polyisocyanat" soll sich in passender Weise sowohl auf Diisocyanate als auch auf Polyisocyanate beziehen, sofern nicht durch spezielle Angaben die Verwendung von difunktionellen oder polyfunktionellen Isocyanaten angegeben ist. Es werden an den Enden mit Isocyanat verkappte (d.h. Isocyanat-terminierte) Präpolymere gebildet.
Der gewählte Vorläufer des Präpolymers beeinflußt die Auswahl eines Polyisocyanats in der Weise, daß die Präpolymerstruktur sich für eine ausreichende Vernetzung eignen muß, um eine wäßrige Präpolymerlösung zu gelieren oder eine vernetzte polymere Beschichtung zu bilden, wenn diese Eigenschaften erwünscht sind. Bei derjenigen Ausführungsform, bei der die Vorläufer für die Präpolymere Polyole sind (d.h. auf Triolen oder Tetrolen basieren), werden difunktionelle Isocyanate bevorzugt. Gewünschtenfalls können polyfunktionelle Isocyanatverbindungen auch mit Polyolen verwendet werden. Mischungen von geeigneten Isocyanaten können ebenfalls berücksichtigt werden.
Im Falle der Verwendung von Diolen als Vorläufer für die Präpolymere können sie mit polyfunktionellen Isocyanatverbindungen umgesetzt werden, um die erfindungsgemäßen Präpolymere zu bilden. Diese Kombination ergibt Präpolymere mit ausreichend funktionellen Gruppen für die Vernetzung bei der Bildung des hydratisierten Polymers. Nach einer alternativen Ausführungsform unter Verwendung von Diolen als Vorläufer für die Präpolymere können die Diole mit einem difunktionellen Isocyanat verkappt sein. Um in dem von diesen difunktionellen Präpolymeren hergestellten hydratisierten Polymer eine ausreichende Vernetzung zu erreichen, werden sie zusammen mit einer vernetzenden Verbindung verwendet. Das bevorzugte Vernetzungsmittel ist Trimethylolpropan ("TMOP"), obgleich andere wie z.B. Glycerin, Triethylolethan, Pentaerythritol, Triethanolamin, polyfunktionelle Amine, polyfunktionelle Isocyanate und dergleichen verwendet werden können.
Bei jeder der oben genannten Ausführungsformen können aromatische, aliphatische oder cycloaliphatische Polyisocyanate verwendet werden. Die Verwendung von aliphatischen Polyisocyanaten ermöglicht ein größeres Maß der Handhabung und/oder Formgebung, da mit aliphatischem Isocyanat verkappte Präpolymere typischerweise etwa 20 bis 90 Minuten benötigen, um zu einem hydratisierten polymeren Zustand zu gelieren. Demgegenüber gelieren mit aromatischen Polyisocyanaten verkappte Präpolymere schneller, in etwa 30 bis 60 Sekunden. Außerdem werden aliphatische Polyisocyanate aufgrund geringerer toxikologischer Bedenken bevorzugt, wenn das hydratisierte Polymer bei medizinischen Anwendungen eingesetzt werden soll. Hydratisierte Polymere, die unter Verwendung von aromatischen Polyisocyanaten im Präpolymer hergestellt wurden, sind jedoch auch nützlich und für die meisten industriellen Anwendungen geeignet.
Durch Verwendung von aliphatischen Polyisocyanaten bei der Herstellung der Präpolymere kann die Biokompatibilität des modifizierten Polymerprodukts weiter gesteigert werden, da die potentiellen Abbauprodukte der aliphatischen Polyisocyanate Berichten zufolge in signifikanter Weise weniger karzinogen sind als solche von aromatischen Isocyanaten. Wenn aromatische Polyisocyanate verwendet werden, genügen jedoch im allgemeinen sorgfältiges Waschen oder andere Mittel zur Entfernung jeglicher nicht umgesetzter Isocyanate und verwandter aminhaltiger Nebenprodukte um das modifizierte Polymer biokompatibel zu machen.
Beispiele für geeignete di- und polyfunktionelle Isocyanate können der nachfolgenden Liste entnommen werden:
Toluol-2,4-diisocyanat
Toluol-2,6-diisocyanat
handelsübliche Mischungen von Toluol-2,4- und -2,6-diisocyanaten
Isophorondiisocyanat
Ethylendiisocyanat
Ethylidendiisocyanat
Propylen-1,2-diisocyanat
Cyclohexylen-1,2-diisocyanat
Cyclohexylen-1,4-diisocyanat
m-Phenylendiisocyanat
3,3'-Diphenyl-4,4'-biphenylendiisocyanat
4,4'-Biphenylendiisocyanat
4,4'-Diphenylmethandiisocyanat
3,3'-Dichlor-4,4'-biphenylendiisocyanat
1,6-Hexamethylendiisocyanat
1,4-Tetramethylendiisocyanat
1,10-Decamethylendiisocyanat
Cumol-2,4-diisocyanat
1,5-Naphthalindiisocyanat
Methylendicyclohexyldiisocyanat
1,4-Cyclohexylendiisocyanat
p-Tetramethylxylylendiisocyanat
p-Phenylendiisocyanat
4-Methoxy-1,3-phenylendiisocyanat
4-Chlor-1,3-phenylendiisocyanat
4-Brom-1,3-phenylendiisocyanat
4-Ethoxy-1,3-phenylendiisocyanat
2,4-Dimethyl-1,3-phenylendiisocyanat
5,6-Dimethyl-1,3-phenylendiisocyanat
2,4-Diisocyanatodiphenylether
4,4'-Diisocyanatodiphenylether
Benzidindiisocyanat
4,6-Dimethyl-1,3-phenylendiisocyanat
9,10-Anthracendiisocyanat
4,4'-Diisocyanatodibenzyl
3,3'-Dimethyl-4,4'-diisocyanatodiphenylmethan
2,6-Dimethyl-4,4'-diisocyanatodiphenyl
2,4-Diisocyanatostilben
3,3'-Dimethoxy-4,4'-diisocyanatodiphenyl
1,4-Anthracendiisocyanat
2,5-Fluorendiisocyanat
1,8-Naphthalindiisocyanat
2,6-Diisocyanatobenzfuran
2,4,6-Toluoltriisocyanat
p,p',p"-Triphenylmethantriisocyanat
trifunktionelles Trimer (Isocyanurat) von Isophorondiisocyanat
trifunktionelles Biuret von Hexamethylendiisocyanat
trifunktionelles Trimer (Isocyanurat) von Hexamethylendiisocyanat
polymeres 4,4'-Diphenylmethandiisocyanat
Das Verkappen der ausgewählten Diole oder Polyole mit Polyisocyanaten zur Bildung der erfindungsgemäßen Präpolymere erfolgt unter Verwendung stöchiometrischer Mengen der Reaktanten. Das Verhältnis von Isocyanat-zu-Hydroxylgruppe sollte vorzugsweise zwischen etwa 1,8 und etwa 2,2 betragen. Höhere Verhältnisse können angewendet werden, sind aber nicht bevorzugt, da sie zu Problemen führen können, die mit einem übermäßigen Vorhandensein von Monomeren in den Endprodukten zusammenhängen. Die Reaktion zur Verkappung kann nach jeder geeigneten Methode oder Vorgehensweise erfolgen. Beispielsweise kann die Reaktion etwa 2 Stunden bis etwa 14 Tagen lang bei etwa 20 bis etwa 150 ºC unter trockenem Stickstoff durchgeführt werden, vorzugsweise in Abwesenheit eines Katalysators. Die Reaktion wild beendet, wenn die Isocyanatkonzentration sich den theoretischen Werten nähert. Die Zeitdauer ist eine Funktion des verwendeten Polyisocyanats und der Temperatur, bei der die Reaktion durchgeführt wird.
Es ist bevorzugt, die Verwendung eines Überschusses an Polyisocyanat bei der Herstellung des Präpolymers zu vermeiden. Vorzugsweise wird ein Verhältnis von Isocyanat-zu-Hydroxylgruppe von 2 : 1 (z.B. ein Diisocyanatmolekül pro Hydroxylgruppe des Polyols) eingesetzt, um eine vollständige Verkappung der Enden des Polyols sicherzustellen. Eine vollständige Verkappung der Enden beseitigt eine übermäßig hohe Viskosität im Präpolymer, indem ein ungewöhnliches Ausmaß an Kettenverlängerung vermieden wird. Es kann jedoch ein leichter Überschuß an Isocyanat, d.h. bis zu etwa 10 %, eingesetzt werden.
Es ist für dieses zweite Polymersystem kennzeichnend, daß der Isocyanatgehalt des Präpolymers sehr gering ist. Dies wird erreicht durch den Einsatz hochmolekularer Polyole und durch Vermeidung übermäßiger Mengen an Isocyanat bei der Reaktion der Endverkappung, so daß es unwahrscheinlich ist, daß freie Isocyanatmonomere vorhanden sind. Die Isocyanatkonzentration im Präpolymer sollte etwa 0,1 bis etwa 0,43 Milliäquivalente pro Gramm bei Präpolymeren betragen, die aus Diolen oder Polyolen mit einem Molekulargewicht von etwa 7000 bis 30 000 MG gebildet worden sind.
Ungeachtet einer Bevorzugung eines geringen Isocyanatgehalts bietet das vorliegend beschriebene Polymersystem in diesem Zusammenhang ein größeres Maß an Flexibilität als herkömmliche Systeme. Die Anwesenheit eines organischen Lösungsmittels bei der Herstellung und Handhabung des Präpolymers beugt einer übermäßigen Viskosität vor, die aus der Verwendung von Polyolen mit höherem Molekulargewicht oder erhöhtem EO-Gehalt, oder von der Verwendung von unzureichenden Mengen an Isocyanat für eine vollständige Verkappung der Enden des Diols oder Polyols herrührt. Dies bedeutet, daß das organische Lösungsmittel die Verwendung von weniger als den stöchiometrischen (2 : 1) Mengen des Isocyanatmonomers ermöglicht. Die aus einer unvollständigen Verkappung der Enden resultierende Kettenverlängerung führt typischerweise zu einer erhöhten Viskosität, durch die das Hantieren des Präpolymers schwierig oder unmöglich werden kann. Im Gegensatz dazu neigt das erfindungsgemäße System nicht dazu, negativ von einer erhöhten Viskosität aufgrund einer Kettenverlängerung oder aus anderen Gründen beeinflußt zu werden, da das Lösungsmittel dazu dient, die Viskosität innerhalb eines Bereiches zu halten, der für eine praktische Handhabung des Präpolymers geeignet ist.
Das zur Herstellung des Präpolymers verwendete organische Lösungsmittel muß mit den Reaktanten und mit der für das hydratisierte Polymer gewünschten Zweckbestimmung kompatibel sein. In erster Linie muß das Lösungsmittel ein solches sein, in dem das Diol oder Polyol und/oder Präpolymer einfach gelöst werden kann, vorzugsweise bei Raumtemperatur. Geeignete Lösungsmittel zur Herstellung des Präpolymers schließen Acetonitril, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Tetrahydrofuran, Dioxan, Dichlormethan, Aceton und Methylethylketon oder Mischungen davon ein. Acetonitril ist bevorzugt.
Bei einer Ausführungsform unter Verwendung eines organischen Lösungsmittels wird das Diol oder Polyol selbst in dem Lösungsmittel gelöst und in der Lösung mit Polyisocyanat umgesetzt, um das an den Enden mit Isocyanat verkappte Präpolymer zu erhalten. Diese Ausführungsform ist insbesondere bevorzugt, wenn das Diol oder Polyol bei Raumtemperatur fest oder kristallin ist, d.h. bei Diolen oder Polyolen, die im wesentlichen oder ausschließlich aus Ethylenoxideinheiten bestehen, und bei hochmolekularen Diolen oder Polyolen. Auf diese Weise können selbst kristalline Diole oder Polyole einfach gehandhabt werden, ohne sie auf ihre jeweiligen Schmelzpunkte zu erhitzen. Selbst wenn die Reaktion zur Bildung des Präpolymers bei erhöhten Temperaturen durchgeführt wird, wird eine gute Umsetzung und die Bildung des Präpolymers sichergestellt durch Verwendung eines organischen Lösungsmittels, um das Diol oder Polyol zunächst in den flüssigen Zustand zu bringen.
Bei einer anderen Ausführungsform unter Verwendung eines organischen Lösungsmittels wird das an den Enden mit Isocyanat verkappte Präpolymer zunächst hergestellt und anschließend in einem organischen Lösungsmittel gelöst. Diese Ausführungsform wird dort geeignet sein, wo das Diol oder Polyol bei Raumtemperaturen bereits flüssig oder pastös ist und keiner Auflösung bedarf, um das Präpolymer herzustellen. Beispielsweise können Diole oder Polyole mit geringerem Molekulargewicht oder höherem Propylenoxid- oder Butylenoxidgehalt auf diese Weise behandelt werden. Die Verwendung eines Lösungsmittels im Präpolymerzustand ist dort vorteilhaft, wo es aufgrund einer Kettenverlängerung von an den Enden unvollständig verkappten Diolen oder Polyolen zu einer erhöhten Viskosität kommt.
Es kann erwünscht sein, ein Antioxidationsmittel zuzugeben, was vorzugsweise vor der Herstellung des Präpolymers erfolgt. Antioxidantien sind nicht erforderlich, um die erfindungsgemäßen Präpolymer oder Polymere herzustellen oder zu verwenden. Die Eigenschaften während der Aufbewahrung und der Hantierung können jedoch durch eine solche Zugabe verbessert werden, da ein oxidativen Abbau des Polymers oder seiner Vorläufer verhindert wird. Geeignete Antioxidantien schließen die gehinderten phenolischen Verbindungen ein. Spezifische Beispiele sind IRGANOX (Ciba-Geigy Corp.) und SANTONOX (Monsanto Chemical Co.). Das Antioxidationsmittel kann in Mengen von etwa 0,01 bis etwa 1,0 %, vorzugsweise etwa 0,02 bis etwa 0,1 % zugegeben werden, wobei sich die Werte auf das Gewicht des Polyols oder des Vorläufers zu dem Präpolymer beziehen.

Modifizierende Verbindungen

Die Affinitätsmatrix wird hergestellt, indem die oben beschriebenen Präpolymere zunächst modifiziert werden. Die Präpolymere werden modifiziert oder derivatisiert, um der herzustellenden polymeren Grundverbindung eine spezifische Reaktivität zu verleihen. Die spezifische Funktionalität und Reaktivität kann einem ansonsten unreaktiven, biokompatiblen Polymer auf diese Weise verliehen werden. Beispielsweise kann die Oberfläche des Polymers in Ausführungsformen, bei denen eine polymerisierte Struktur gebildet wird, im allgemeinen nicht-adsorptiv und unreaktiv sein mit Ausnahme der erwünschten Funktionalität, die in das Polymer durch das vorliegend beschriebene Verfahren eingeführt worden ist.
Das Präpolymer wird modifiziert, indem es mit einer Verbindung umgesetzt wird, die eine erste funktionelle Gruppe, welche gegenüber Tsocyanat reaktiv ist, und eine zweite funktionelle Gruppe enthält, welche dem modifizierten Präpolymer die gewünschte spezifische Reaktivität verleiht. Die zweite funktionelle Gruppe ist gegenüber Isocyanat nicht reaktiv oder ist wesentlich weniger reaktiv gegenüber Isocyanaten als die erste funktionelle Gruppe. Die gegenüber Isocyanat reaktive funktionelle Gruppe ist eine Sulfhydryl (-SH)-, Amino (-NH&sub2;-), Hydroxyl (-OH)- oder Carboxyl (-COOH)-Gruppe. Die Geschwindigkeit und das Ausmaß der Modifizierung ist teilweise von der ersten funktionellen Gruppe der modifizierenden Verbindung (d.h. der NCO-reaktiven Gruppe) und teilweise von den relativen molaren Mengen des Präpolymers und der modifizierenden Verbindung abhängig. Wenn die erste funktionelle Gruppe eine in einer Diamin- oder Polyaminverbindung enthaltene Aminogruppe oder eine Carboxylgruppe ist, wird ein großer molarer überschuß der modifizierenden Verbindung eingesetzt, so daß im wesentlichen alle Isocyanatgruppen des Präpolymers modifiziert werden.
Im allgemeinen reagieren Sulfhydrylgruppen bevorzugt und schnell mit den Isocyanat ("NCO")-Gruppen der Präpolymere unter Bedingungen, die zur oben beschriebenen Bildung des Thiolations (-S&supmin;) führen. Das Thiolation reagiert mit den Isocyanatgruppen des Präpolymers unter Bildung modifizierter Präpolymere, die selbst bei Anwesenheit von amino-, hydroxyl- oder carboxylfunktionellen Gruppen -NHC(O)S-(Thiourethan)-Bindungen enthalten.
Die mit Isocyanat verkappten Präpolymere reagieren jedoch wesentlich schneller mit Sulfhydrylgruppen enthaltenden Verbindungen als mit den Verbindungen, welche die anderen aufgeführten Gruppen enthalten, jedoch nur dann, wenn sie unter Bedingungen umgesetzt werden, bei denen das Thiolatanion (-S&supmin;) als aktive Spezies gebildet wird. Umgekehrt wird die Reaktion zur Modifizierung des Präpolymers unter Bedingungen, bei denen eine Sulfhydrylgruppe enthaltende Verbindung nicht rasch die reaktive Thiolatgruppe bildet, sehr langsam voranschreiten und es kann sein, daß sie nicht in genügendem Ausmaß erfolgt. Dies bedeutet, daß die Anwesenheit der Sulfhydrylgruppe allein für die Modifizierungsreaktion in Abwesenheit geeigneter Bedingungen zur Bildung des Thiolations nicht ausreicht. Beispielsweise wird eine Umsetzung von Präpolymer und Ethantiol (C&sub2;H&sub5;SH) in Acetonitril als Lösungsmittel nicht in Abwesenheit eines Katalysators zur Ionisierung der Sulfhydrylgruppe des Ethanthiols ablaufen.
Das Thiolatanion kann durch Zugabe eines extramolekularen Katalysators katalytisch gebildet werden. Geeignete Katalysatoren würden Basenkatalysatoren (vorzugsweise ein tertiäres Amin wie Triethylamin oder N-Methylimidazol) oder Reduktionsmittel wie Natriumborhydrid einschließen. In bestimmten Fällen kann intramolekulare oder Eigenkatalyse auftreten, um die Bildung des Thiolations zu bewirken.
Ein Beispiel für eine Verbindung, die eine intramolekulare Katalyse durchläuft, ist Cysteamin, gebildet durch Behandlung von Cystamin ((NH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;)&sub2;S&sub2;) mit einem Reduktionsmittel. Insbesondere in Anwesenheit von Mercaptoethanol oder einem anderen Reduktionsmittel wird die Disulfidbindung des Cystamins unter Bildung von Cysteamin (NH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;SH) reduziert, welches sowohl eine freie Amino- als auch eine freie Sulfhydrylgruppe enthält. Die Amino- und Sulfhydrylgruppen des Cysteaminmoleküls interagieren, um die Bildung des Thiolations durch intramolekulare Katalyse zu verursachen. Die NCO-Gruppen des Präpolymers reagieren bevorzugt mit der Thiolatgruppe des eigenkatalysierten Cysteaminmoleküls und führen zu einem Präpolymer, welches über das Thiolat so modifiziert ist, daß es eine freie Aminogruppe als zweite funktionelle Gruppe aufweist.
Alternativ kann Cystamin selbst mit dem Präpolymer vor der Reduktion der Disulfidbindung umgesetzt werden. In diesem Fall reagieren die NCO-Gruppen des Präpolymers mit den freien Aminogruppen des Cystaminmoleküls, wobei die zweite funktionelle Gruppe durch die Disulfidbindung blockiert ist. Im Anschluß an die Cystaminmodifizierung des Präpolymers wird ein Reduktionsmittel wie Mercaptoethanol zugegeben, um die Disulfidbindung zu reduzieren, wodurch die Sulfhydrylgruppe entsteht, welche die zweite funktionelle Gruppe in dieser Ausführungsform ist.
Demgegenüber ist die Umsetzung von NCO-verkappten Präpolymeren mit Verbindungen, die eine Aminogruppe als erste funktionelle Gruppe enthalten, vergleichsweise langsamer als die Umsetzung mit Thiolat enthaltenden Verbindungen, obgleich eine Reaktion immer noch einigermaßen rasch verläuft. Die Amino-NCO-Reaktion bildet modifizierte Präpolymere, die -NHC(O)NH- (Harnstoff)- Bindungen enthalten. Die Reaktionsraten zwischen dem Präpolymer und den modifizierenden Verbindungen, die Aminogruppen enthalten, variieren mit dem pH-Wert. Für schnellere Reaktionszeiten werden unprotonierte Amine bevorzugt.
Wenn Diamine oder Polyamine als modifizierende Verbindung eingesetzt werden, sollten sie in großen Überschußmengen verwendet werden, um die Modifizierung des Präpolymers herbeizuführen. Mit "großen Überschußmengen" ist ein Molverhältnis von -NH&sub2;zu -NCO-Gruppen von mehr als 1 : 1, vorzugsweise mehr als 2 : 1 und am meisten bevorzugt zwischen etwa 2 : 1 und etwa 5 : 1 gemeint. Es sollte beachtet werden, daß eine Verwendung von geringen Mengen an primären oder sekundären Diaminen oder Polyaminen der Vernetzung des modifizierten Präpolymers durch Umsetzung mit den NCO-Gruppen von multiplen Präpolymermolekülen dient. Dies wird in vorhergehenden Patenten wie dem oben beschriebenen von Matthews et al. gelehrt. Wenn sie in großen Überschußmengen verwendet werden, erfüllen die Diamine und Polyamine jedoch nicht die Vernetzungsfunktion, da es unwahrscheinlich ist, daß irgendein Polyaminmolekül mit NCO-Gruppen von mehr als einem Präpolymermolekül reagieren wird. Vielmehr dient die Reaktion der Derivatisierung des Präpolymers in erfindungsgemäßer Weise. Monoamine können in jeder gewünschten relativen Menge umgesetzt werden.
Die Reaktion von NCO-verkappten versehenen Präpolymeren mit Verbindungen, die Hydroxylgruppen enthalten, ist noch langsamer, und es werden modifizierte Präpolymere gebildet, die -NHC(O)O(Urethan)-Bindungen enthalten. Unter Bedingungen, bei denen die Hydroxylgruppe beibehalten wird, erfolgt die Umsetzung ziemlich langsam. Beispiele schließen Methanol, Ethanol, Ethylenglykol etc. ein. Das Methanol reagiert mit dem Präpolymer unter Bildung eines modifizierten Präpolymers, welches eine Methylgruppe als zweite funktionelle Gruppe aufweist. Die Reaktion kann jedoch sehr schnell verlaufen, wenn das -O-(Alkoxid)-Ion gebildet wird.
Beispielsweise wären Methoxid oder Ethylalkoxid geeignete modifizierende Verbindungen und würden reaktiv sein.
Die vierte Kategorie der zur Bildung der erfindungsgemäßen modifizierten Präpolymere und Polymere geeigneten ersten funktionellen Gruppen schließt Verbindungen ein, die Carboxyl (-COOH)-Gruppen aufweisen. Es können Verbindungen mit aliphatischen oder aromatischen Carboxylgruppen eingesetzt werden. Beispielsweise könnten bestimmte mit Aminogruppen geschützte Aminosäuren und Peptide mit dem Präpolymer über die Carboxylgruppe umgesetzt werden. Als weiteres Beispiel kann 2,2-Dithiodiethansäure als modifizierende Verbindung eingesetzt werden. Die Umsetzung der Präpolymer-NCO-Gruppen mit einer Carbonsäure verläuft jedoch sehr langsam. Die Reaktionsgeschwindigkeit kann durch Zugabe einer Base (z.B. Triethylamin, N-Methylimidazol etc.) zur Ionisierung der Carboxylgruppe beschleunigt werden. Die modifizierten Präpolymere enthalten Anhydrid- oder Amidbindungen.
Wie bei den Diamin- oder Polyamin-modifizierenden Verbindungen sollten Verbindungen, die Carboxylgruppen enthalten, in großen Überschußmengen verwendet werden, um das Präpolymer zu modifizieren. Mit "große Überschußmengen" ist ein Molverhältnis von -COOH- zu -NCO-Gruppen von mehr als 1 : 1, vorzugsweise mehr als 2 : 1 und am meisten bevorzugt zwischen etwa 2 : 1 und etwa 5 : 1 gemeint. Im Falle der Verwendung dieser großen Überschußmengen kommt es zu einer vollständigen oder im wesentlichen vollständigen Modifizierung der NCO-Gruppen des Präpolymers.
Die ursprüngliche Resistenz des Präpolymers gegenüber einer unspezifischen Proteinbindung kann während der erfindungsgemäßen Reaktion zur Modifizierung aufrechterhalten werden. Sollte es sich hierbei um eine gewünschte Eigenschaft handeln, sollte die Auswahl einer modifizierenden Verbindung, welche selbst nicht zu einer unspezifischen Proteinbindung imstande ist, sorgfältig erfolgen. Beispielsweise wäre es erwünscht, ungeladene hydrophile modifizierende Verbindungen wie Ethanolamin zu verwenden. Modifizierende Verbindungen, die für eine unspezifische Proteinbindung anfällig sind (beispielsweise solche, die stark geladene Gruppen aufweisen) sollten vermieden werden, wenn eine unspezifische Proteinbindung problematisch sein sollte.
Bei erwünschter Biokompatibilität sollte die modifizierende Verbindung ungiftig sein. Auf der anderen Seite kann es erwünscht sein, das Polymer für bestimmte Zwecke toxisch zu machen, und diesbezügliche modifizierende Verbindungen können ausgewählt werden. Beispielsweise könnten Präpolymere mit bioziden Verbindungen oder dergleichen modifiziert werden.
Beispiele für geeignete modifizierende Verbindungen, mit denen das Präpolymer erfindungsgemäß umgesetzt werden kann, schließen die folgenden ein:
2-Aminoethanol (Ethanolamin)
Aminoethylhydrogensulfat
Aminoethansulfonsäure (Taurin)
4-Aminosulfonyl-1-hydroxy-2-naphthoesäure
Glucosamin
5-(Aminosulfonyl)-N-((1-ethyl-2-pyrrolinidyl) methyl)-2-methoxybenzamid
Sulfamylphenyl-D-glycosylamin
4-Carboxybenzolsulfonamid
Sulfanilamid
cyclisches AMP
2-Aminoethylphosphonsäure
Tyrosin
Tyramin
Dibutylamin
L- oder DL-Cystein (α-Amino-β-thiolpropionsäure)
L- oder DL-Cysteinethylester
L- oder DL-Cystindimethylester
L- oder DL-Cystin (Di(α-amino-β-thiol-propionsäure)
L- oder DL-Cysteinsulfonsäure
L- oder DL-Cysteinsäure
Cystamin (2,2-Dithiobis(ethylamin))
2-Mercaptoethanol
Ethanthiol
Glutathion
3-Amino-1,2-propandiol
3-Amino-1-propansulfonsäure
3-Aminophenylboronsäure
2-Amino-2-desoxy-D-galactose (Galactosamin)
1-Amino-1-desoxy-D-galactose
p-Aminophenyl-α-D-glucose
p-Aminophenyl-1-thio-β-D-galactose
Penicillamin.
Zusätzlich zu diesen spezifischen Beispielen können Verbindungen der folgenden Gruppen verwendet werden:
Peptide mit Sulfhydrylgruppen
Peptide mit freien Aminogruppen
tierische Hormone
Polysaccharide
Lipide
Nukleinsäuren
Aminozucker
Aminosäuren
Amin-Tenside
Diamine und Polyamine.
Es kann erwünscht sein, die zweite funktionelle Gruppe der modifizierenden Verbindung zeitweilig zu blockieren, um sicherzustellen, daß die Modifizierung des Präpolymers über die erste funktionelle Gruppe erfolgt. Dies ermöglicht die Herstellung des gewünschten modifizierten Präpolymers ohne Verunreinigung aus konkurrierenden Modifizierungsreaktionen. Beispielsweise kann es in den Fällen, bei denen eine modifizierende Verbindung sowohl Amino- als auch Carboxylgruppen enthält, erwünscht sein, die Aminogruppen zu blockieren, um eine Modifizierung über die Carboxylgruppen zu ermöglichen. Verfahren zum Blockieren verschiedener funktioneller Gruppen sind gut bekannt. Im Anschluß an die Modifizierung des Präpolymers wird die zweite funktionelle Gruppe deblockiert, was wiederum durch gut bekannte Verfahren erfolgt.

Reaktion zur Modifizierung des Präpolymers

Die Reaktion zwischen dem Präpolymer und der modifizierenden Verbindung kann auf vielfältige Weise durchgeführt werden, indem die Reihenfolge der Zugabe wie auch die Umgebung, in der die Reaktion durchgeführt wird (d.h. wäßrig oder nicht-wäßrig) geändert wird. Zusätzlich kann das Ausmaß der Modifizierung des Präpolymers durch die relativen molaren Mengen der Komponenten kontrolliert werden.
Bei einer gegebenen Reihenfolge der Zugabe kann die Reaktion durch Zugabe der modifizierenden Verbindung zu dem Präpolymer gestartet werden. Vorzugsweise wird die modifizierende Verbindung in einer nicht-wäßrigen Lösung eingesetzt. Dies führt zu einem relativ geringen Ausmaß der Modifizierung des Präpolymers, obgleich das Ausmaß der Modifizierung auch durch die molaren Konzentrationen beeinflußt wird. Es ist bevorzugt, diese Abfolge der Zugabe anzuwenden, wenn lediglich ein geringes Ausmaß der Modifizierung gewünscht wird. Beispielsweise ist sie am meisten bevorzugt, wenn die modifizierende Verbindung ein Diamin oder ein Polyamin ist oder eine Carboxylgruppe enthält. Darüber hinaus ist diese Reihenfolge insbesondere dort nicht bevorzugt, wo die modifizierende Verbindung ein Diamin oder ein Polyamin ist, da die Vernetzung die vorherrschende Reaktion wäre, wie es von Matthews et al., a.a.O., beschrieben wird. Im Falle der Verwendung von Diaminen oder Polyaminen ist es vielmehr bevorzugt, diese in erster Linie oder ausschließlich als modifizierende Verbindungen zu verwenden. In ähnlicher Weise ist diese Reihenfolge der Zugabe nicht bevorzugt bei der Verwendung von modifizierenden Verbindungen, die Carboxylgruppen enthalten, da lediglich ein geringes Ausmaß der Modifizierung erzielt wird. Eine extensive bis vollständige Modifizierung wird sichergestellt durch Verwendung der nachfolgend beschriebenen zweiten bevorzugten Reihenfolge der Zugabe sowie durch Verwendung großer molarer Überschüsse der modifizierenden Verbindung, wenn diese Verbindung ein Diamin oder ein Polyamin ist oder Carboxylgruppen enthält.
Bei der zweiten bevorzugten Reihenfolge der Zugabe wird das Präpolymer einer nicht-wäßrigen Lösung der modifizierenden Verbindung zugegeben. Vorzugsweise wird ein großer molarer Überschuß der modifizierenden Verbindung eingesetzt, wenn eine extensive oder vollständige Modifizierung erwünscht ist. Diese Reihenfolge der Zugabe ist besonders bevorzugt bei Verwendung von Diaminen, Polyaminen und von Verbindungen, die Carboxylgruppen als erste funktionelle Gruppe enthalten, so daß die Reaktion zur Modifizierung erfolgte bevor ein signifikantes Ausmaß an Polymerisation stattfindet. Sofern eine Vernetzung oder Polymerisation eines modifizierten Präpolymers dieser Klassen erwünscht ist, sollte dies auf dem Wege der alternativen Chemie durchgeführt werden.
Die Verwendung einer nicht-wäßrigen Umgebung ist wichtig für die obige Ausführungsform, um eine gleichzeitige Polymerisation zu vermeiden. Diese Ausführungsform ist insbesondere dort bevorzugt, wo ein erhöhtes Ausmaß an Modifizierung gewünscht wird. Beispielsweise ist sie am meisten bevorzugt, wenn die modifizierende Verbindung ein Diamin oder Polyamin ist oder eine Carboxylgruppe enthält. Sie wird ebenfalls bevorzugt, wenn das Präpolymer auf monofunktionellem Alkohol basiert. Darüber hinaus kann durch Kontrollieren der Molverhältnisse eine größere Kontrolle ausgeübt werden, um die besonderen Prozentgehalte des Präpolymers zu modifizieren.
Es können Lösungsmittel verwendet werden, wie sie oben zur Herstellung des Präpolymers angegeben sind. Zusätzlich können Lösungsmittel wie Toluol, 2-Propanol, Methanol, Ethanol, Pyridin und andere Lösungsmittel, vorzugsweise aprotische Lösungsmittel verwendet werden. Das Lösungsmittel sollte vor der Verwendung getrocknet werden, wie zum Beispiel durch Trocknung über Molekularsiebe. Im Falle der Verwendung von Methanol oder Ethanol sollte große Sorgfalt aufgewendet werden, um das Lösungsmittel gründlich zu trocknen, und eine Lagerung vor der Verwendung sollte vermieden werden. Das Isocyanat des Präpolymers kann mit im Lösungsmittel vorhandenen Wasser eher reagieren als mit der modifizierenden Verbindung. In diesem Ausmaß wird das Präpolymer eher eine Polymerisation als eine Derivatisierung durchlaufen.
Bei dieser Ausführungsform (Modifizierung des Präpolymers in einem trockenen, nicht-wäßrigen Lösungsmittel) werden das Präpolyiner und die modifizierende Verbindung in dem Lösungsmittel unter Umgebungsbedingungen in Kontakt gebracht. Die Konzentration des Präpolymers kann in starkem Umfang variieren, von nahezu 0 bis nahezu 100 %, aber vorzugsweise werden zwischen etwa 5,0 und etwa 50,0 % (Gew./Gew.) Präpolymer verwendet. Obgleich es möglich ist, das Präpolymer in Raumatmosphäre zu derivatisieren, ist es bevorzugt, die Reaktion in einer trockenen, inerten Atmosphäre wie trockenem Stickstoff durchzuführen, um die Isocyanatgruppen zu konservieren. Bei Umgebungstemperaturen wird die Reaktion zur Derivatisierung typischerweise in bis zu etwa 1 Stunde abgeschlossen sein. Es ist jedoch bevorzugt, diesen Schritt für eine längere Zeitdauer (d.h. etwa 4 bis 24 Stunden) ablaufen zu lassen, um sicherzustellen, daß die Reaktion vollständig erfolgt ist.
Bei einem anderen Verfahren zur produktiven Modifizierung des Präpolymers erfolgt die Modifizierung gleichzeitig mit der Polymerisation, indem das Präpolymer und die modifizierende Verbindung in Gegenwart von Wasser oder einem anderen Vernetzungsmittel kontaktiert werden. Beispielsweise kann eine wäßrige Lösung der modifizierenden Verbindung eingesetzt werden. Das Präpolymer wird derivatisiert und außerdem in gewissem Ausmaß polymerisiert aufgrund der Reaktion einiger der Isocyanatgruppen mit der modifizierenden Verbindung und einiger mit Wasser. Das Ausmaß der Modifizierung wird durch die Menge der vorhandenen modifizierenden Verbindung in Beziehung zum Präpolymer sowie durch die Menge an vorhandenem Wasser kontrolliert. Es wird deutlich, daß diese Ausführungsform dort sinnvoll ist, wo eine partielle Modifizierung erfolgen soll und wo es gewünscht ist, daß das Endprodukt eine dreidimensionale modifizierte polymere Struktur aufweist. Diese Ausführungsform ist ebenfalls für solche Fälle geeignet, bei denen die modifizierende Verbindung in nicht-wäßrigen Lösungsmitteln unlöslich ist. Die einstufige Reaktion zur Modifizierung dieser Ausführungsform kann auch bei Verfahren zur Eliminierung vorteilhaft sein.
Das Ausmaß der Modifizierung gegenüber demjenigen der Polymerisation kann kontrolliert werden durch Ausbalancieren der relativen molaren Konzentrationen an modifizierender Verbindung, Präpolymer und Wasser. Dies bedeutet, daß das Präpolymer und die modifizierende Verbindung in ausreichenden Mengen umgesetzt werden, um eine Umsetzung des gewünschten Anteils der Isocyanatgruppen des Präpolymers zu ermöglichen. Diese Einstellungen sind dem Fachmann geläufig. Für die Reaktion zur Modifizierung nach dieser Ausführungsform können Umgebungsbedingungen angewendet werden. Der beabsichtigte Endzweck des modifizierten Polymers bestimmt das erwünschte Ausmaß der Derivatisierung der Isocyanatgruppen des Präpolymers durch Umsetzung mit der modifizierenden Verbindung. Irgendwo bis 100 % der Isocyanatgruppen können erfindungsgemäß modifiziert werden.
Eine Modifizierung von bis zu etwa 15 % bis zu 30 % der NCO- Gruppen führt zu einem modifizierten Präpolymer, welches zur signifikanten Polymerisation und nachfolgenden Aktivierung befähigt ist. Eine Modifizierung im mittleren Bereich, d.h. von mehr als etwa 15 % bis 30 % und weniger als etwa 50 % der Isocyanatgruppen des Präpolymers, führt wahrscheinlich nicht zur Bildung eines stabilen Gels. Bei diesem Ausmaß der Modifizierung ist das modifizierte Polymer oder Präpolymer typischerweise eher durch die Löslichkeit als durch die Reaktivität gegenüber Wasser gekennzeichnet, obgleich es am unteren Ende des Modifizierungsbereichs zu einer gewissen Gelbildung oder Schäumung kommen wird. Im allgemeinen erfolgt die Gelbildung lediglich dann, wenn weniger als etwa 1/3 der terminalen NCO-Gruppen des Präpolymers modifiziert sind.

Polymerisation

Wie bereits ausgeführt, kann die Polymerisation in den Fällen, bei denen bis zu etwa 1/3 der Isocyanatgruppen des Präpolymers modifiziert sind, durch Zugabe eines stöchiometrischen Überschusses an Wasser oder wäßriger Lösung relativ zur Gesamtmenge an verbleibenden verfügbaren Isocyanatgruppen erfolgen. Wenn das Präpolymer in einem größeren Ausmaß modifiziert worden ist, ist "Polymerisation" in gewisser Weise ein falscher Eindruck, obgleich die Zusammensetzung durch Endbehandlung des modifizierten Präpolymers mit Wasser oder einer wäßrigen Lösung gehärtet werden kann. In diesem Fall werden die verbleibenden Isocyanatgruppen an dem modifizierten Präpolymer mit Wasser umgesetzt, um die modifizierte Zusammensetzung auszuhärten, obgleich es aufgrund des hohen Prozentgehaltes von NCO-Gruppen, die eine Umsetzung mit der modifizierenden Verbindung durchlaufen haben, nur zu einer geringen oder keiner Polymerisation kommt. Alle verbleibenden NCO-Gruppen reagieren mit dem Wasser. Alternativ könnten die verbleibenden NCO-Gruppen verwendet werden, um das modifizierte Präpolymer an eine Oberfläche oder an eine andere Verbindung zu koppeln.
Eine wäßrige Lösung des modifiziertes Präpolymers kann mit oder ohne ein organisches Lösungsmittel hergestellt werden, um die Polymerisation und das Aushärten zu initiieren. Wenn die Lösung erst einmal vollständig vermischt ist, sollte man sie ungerührt belassen, um das Eintreten des Vernetzens zu ermöglichen. Sowie die Polymerisation beginnt, kommt es zur Gelbildung. In der Gelbildungsstufe bindet das modifizierte Polymer ab und nimmt die physikalische Form des ausgehärteten Endprodukts an, wobei eine halbfeste elastische Matrix gebildet wird. Die Abbindezeit kann im Bereich von etwa 30 Sekunden bis zu etwa 1 Stunde betragen. In dieser Stufe werden nicht umgesetzte Isocyanatgruppen immer noch anwesend sein. Eine gelbildende Polymermischung verliert ihre Fähigkeit zu fließen und wird eine gallertartige feste oder halbfeste Masse. Alternativ kann die Lösung des modifizierten Präpolymers in organischem Lösungsmittel auf das gewünschte Substrat aufgetragen und nachfolgend mit Wasser oder einer wäßrigen Lösung kontaktiert werden, um eine Polymerisation und ein Aushärten zu initiieren.
Vorzugsweise wird für die Polymerisation und das Aushärten Wasser allein verwendet, aber es können gewünschtenfalls gelöste Stoffe oder Feststoffteilchen anwesend sein. Die gelösten Stoffe, welche mit den Isocyanatgruppen reagieren, werden zu einem integrierten Bestandteil des Hydrogels. Derartige gelöste Teilchen sollten vorsichtig gehandhabt werden, da eine zu hohe Konzentration zu einem übermäßigen Verkappung der Enden des Präpolymers in solch einem Ausmaß führen kann, daß eine Polymerisation ausgeschlossen ist. Allgemein wird man es bevorzugen, die Verwendung von anderen gegenüber Isocyanat reaktiven Verbindungen als die modifizierende Verbindung zu vermeiden.
Bei der Herstellung einer wäßrigen Lösung, welche das modifizierte Präpolymer enthält, sollte das Verhältnis von modifiziertem Präpolymer zu Wasser etwa 1 : 1 bis etwa 1 : 20, vorzugsweise etwa 1 : 5 bis etwa 1 : 15 betragen. Die Abbindezeit verlängert sich mit sinkendem Anteil des modifizierten Präpolymers in der wäßrigen Lösung. Die Lösung sollte bis zur vollständigen Mischung gerührt oder geschüttelt und anschließend stehengelassen werden, so daß sich eine dreidimensionale Struktur des modifizierten Polymers ausbilden kann.
Die Polymerisation tritt bei Kontakt der unmodifizierten Isocyanatgruppen mit Wasser unter Bildung von Harnstoff spontan ein. Katalysatoren oder Vernetzungsmittel sind nicht erforderlich, werden aber als optional betrachtet und können gewünschtenfalls verwendet werden. Geeignete Katalysatoren schließen organische Zinnsalze (z.B. Dibutylzinndilaurat) und tertiäre Amine ein. Geeignete Vernetzungsmittel schließen primäre und sekundäre Polyamine und polyfunktionelle Isocyanate ein.
Das Aushärten des Polymers schreitet fort, bis die chemische Reaktion sämtlicher verbleibender Isocyanatgruppen mit Wasser abgeschlossen ist oder beinahe abgeschlossen ist. Eine vollständige Reaktion zum Aushärten kann Stunden, Tage oder Wochen in Anspruch nehmen und ist von den angewendeten Bedingungen und dem verwendeten Polyisocyanat abhängig, obgleich sie im wesentlichen nach etwa 4 bis 24 Stunden abgeschlossen ist. Die Aushärtungszeit kann verkürzt werden durch Zugabe von Mitteln zum Kettenabbruch oder zur Inaktivierung, wie Ethanolamin, welches zu einer Verkappung der Enden ohne Kettenverlängerung führt. Das fertige modifizierte Polymerprodukt ist ein Polyharnstoff-Urethan.
Wenn ein Hydrogel gebildet werden soll, ist lediglich ein Abbinden (d.h. Gelieren) erforderlich, um die Gestalt des modifizierten Polymers vorzugeben. Ein vollständiges oder im wesentlichen vollständiges Aushärten ist jedoch erforderlich, um ein biokompatibles hydratisiertes Polymer herzustellen, welches einer unspezifischen Proteinbindung widersteht. Eine vollständige Isocyanatreaktion kann sichergestellt werden, indem man das Polymer in Wasser einweicht, um die Verfügbarkeit verbleibender Isocyanatgruppen zu reduzieren oder zu eliminieren, oder indem man Mittel zum Kettenabbruch wie oben beschrieben einsetzt. Hierdurch werden verbleibende Isocyanatgruppen, die Proteine binden können, welche in Kontakt mit dem hydratisierten Polymer geraten, eliminiert.
Die Abbinde- und Aushärtungszeit variiert und ist teilweise abhängig von der Konzentration des Präpolymers, welches in der Lösung vorhanden ist, aus der das Polymer gebildet wird. Die Abbindezeit nimmt mit höheren Präpolymerkonzentrationen ab. Zusätzlich wird die Abbindezeit abhängen von dem Typ des zur Herstellung des Präpolymers verwendeten Polyisocyanats. Mit aromatischem Polyisocyanat endverkappte Präpolymere werden schnell abbinden, gewöhnlich in weniger als 1 Minute reagieren, obgleich die Härtungszeit länger sein kann. Präpolymere, die mit aliphatischen Polyisocyanaten verkappt sind, weisen eine längere Abbindezeit auf, typischerweise etwa 20 bis 90 Minuten, und können zum vollständigen Aushärten mehrere Stunden bis mehrere Wochen in Anspruch nehmen. Gewunschtenfalls kann das Polymer einem Trocknungsschritt unterworfen werden.
Wenn das erfindungsgemäße modifizierte Polymer als Beschichtung in Form eines dünnen Films oder einer monomolekularen oder im wesentlichen monomolekularen Schicht hergestellt ist, ist ein Unterschied zwischen dem Abbinden und dem Aushärten weniger deutlich. In dieser Ausführungsform wird die Lösung des modifizierten Präpolymers in organischem Lösungsmittel auf einem Substrat abgelagert und überschüssiges organisches Lösungsmittel wird entfernt. Die Luftfeuchtigkeit kann zur Polymerisation der Gelschicht oder -beschichtung ausreichen. Wasser wird hinzugegeben, um die Kettenverlängerung und das Vernetzen des modifizierten Polymers auf der Substratoberfläche zu fördern. Diese Vernetzung ist erforderlich für die Stabilisierung der Beschichtung, welche andernfalls unter bestimmten Bedingungen wie beispielsweise hohen Wasserfließraten oder hohen oder niedrigen pH- Werten abgewaschen werden würde. Die Beschichtung wird dieser Wasserbehandlung für eine Zeitdauer von etwa 15 Minuten bis etwa 24 Stunden oder länger unterworfen, um eine vollständige oder im wesentlichen vollständige Reaktion der Isocyanatgruppen sicherzustellen. Gewünschtenfalls kann die Beschichtung mit einem Kettenabbruchmittel wie Ethanolamin behandelt werden, um eine Reaktion der verbleibenden Isocyanatgruppen sicherzustellen.
Organische Lösungsmittel können bei der Herstellung erfindungsgemäßer hydratisierter Polymere (d.h. Hydrogele) geeignet sein. Während der Polymerisation ermöglicht es die Anwesenheit eines Lösungsmittels dem System, höhere Mengen an überschüssigem Isocyanat (mehr als stöchiometrische Mengen) zu tolerieren, ohne eine Unterbrechung der Bildung des hydratisierten Polymers zu verursachen. Das durch Reaktion von überschüssigem Isocyanatmonomer mit Wasser gebildete Kohlendioxid effervesziert eher einfach aufgrund der geringen Viskosität des Systems, als daß es eingeschlossen wird, um eine Schaumbildung auszulösen. Wenn Schäume gewünscht sind, würde man die Polymerisation natürlich in Abwesenheit oder mit sehr viel geringeren Mengen an Lösungsmittel durchführen. Die oben zur Verwendung bei der Herstellung des Präpolymers als geeignet aufgeführten Lösungsmittel können auch hier verwendet werden. Zusätzlich können Methanol, Ethanol, 2-Propanol und Dichlormethan oder Mischungen davon eingesetzt werden.
Wenn bei der Herstellung des Präpolymers, des modifizierten Präpolymers oder des modifizierten Polymers ein organisches Lösungsmittel verwendet wird, wird es in den meisten Fällen vor der Verwendung des Polymers entfernt. Wenn Methanol ausgewählt wird, muß es sofort (d.h. innerhalb von ein paar Minuten bis zu mehreren Stunden) entfernt werden, um ein übermäßiges Endverkappen der Isocyanatendgruppen, die die Polymerisation verhindern, zu vermeiden. Man kann das Lösungsmittel von dem modifizierten Präpolymer vor dem Aushärten entfernen oder man kann es während der Ablagerung oder der Beschichtung des modifizierten Präpolymers auf ein gewünschtes überziehbares Substrat oder der Formung des modifizierten Präpolymers zu der gewünschten Gestalt verdampfen lassen. Wenn eine dünne polymere Beschichtung gewünscht ist, kann das modifizierte Präpolymer alternativ direkt aus der Lösungsmittel lösung auf ein Substrat adsorbiert werden, wonach das gesamte beschichtete Substrat dem Lösungsmittel entnommen werden kann. In den meisten Fällen, wo das Aushärten in Gegenwart des Lösungsmittels durchgeführt wird, wird das Lösungsmittel von dem modifizierten Polymer nach dem Aushärten entfernt, was entweder durch Verdampfen oder durch Waschen mit Wasser geschieht. In diesen Fällen ist es erforderlich, ein Lösungsmittel zu verwenden, welches in Wasser löslich ist. Die Lösung des modifizierten Präpolymers in dem organischen Lösungsmittel wird dann kompatibel mit der wäßrigen Lösung sein, in der das Polymer gebildet wird, was zu einer wäßrigen Lösung des modifizierten Präpolymers, nicht aber zu einer Emulsion oder Dispersion führt.

Polymeraktivierung

Das modifizierte Polyharnstoff-Polyurethan- oder Polyurethanpolymer, abhängig von dem verwendeten Präpolymer, ist gekennzeichnet durch die spezifische Reaktivität, die durch die zweite funktionelle Gruppe der modifizierenden Verbindungen bereitgestellt wird. Um das modifizierte Polymer zu aktivieren, wird das Polymer mit einer geeigneten aktivierenden Verbindung über die zweite funktionelle Gruppe umgesetzt. Diese Reaktion dient der Umwandlung der zweiten funktionellen Gruppe zu einer reaktiven Spezies, die in der Lage ist, einen interessierenden Liganden oder ein Bindermolekül selektiv kovalent zu binden.
Die Aktivierung des modifizierten Polymers kann unter Verwendung einer großen Bandbreite von aktivierenden Verbindungen erfolgen. Der Begriff "aktivierenden Verbindung" wird vorliegend verwendet, um bifunktionelle oder polyfunktionelle Verbindungen zu bezeichnen, die mit der zweiten funktionellen Gruppe reagieren, um verbleibende reaktive Gruppen für die kovalente Kopplung eines gewünschten Liganden oder Bindermoleküls zur Verfügung zu stellen. Aktivierende Verbindungen dieses Typs sind auf dem Gebiet der Affinitätstrennung gut bekannt und variieren in Abhängigkeit der Beschaffenheit der zweiten funktionellen Gruppe und des zu bindenden Liganden oder Bindermoleküls. Geeignete aktivierende Verbindungen schließen p-Nitrophenylchlorformiat; N-Hydroxysuccinimidchlorformiat; 1,1'-Carbonyldiimidazol; 2,2,2- Trifluorethansulfonylchlorid; Toluolsulfonylchlorid und dergleichen ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Andere aktivierende Verbindungen schließen Sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat; Pyridyldisulfid, 1-Ethyl-3-(3- dimethylaminopropyl)carbodiimid; Glutaraldehyd und dergleichen ein. Die Aktivierungsmittel können homobifunktionelle Vernetzungsmittel wie homobifunktionelle N-Hydroxysuccinimidester oder Imidoester, oder heterofunktionelle Vernetzungsmittel wie N- Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)-propionat, Succinimidyl 4-(N- maleimidoethyl)cyclohexan-1-carboxylat und dergleichen sein. Vernetzungsmittel, die photoaktivierte Gruppen wie Nitrene oder Carbene enthalten, sind zur Verwendung als Aktivierungsmittel ebenfalls geeignet.
Das Ausmaß der Aktivierung des modifizierten Polymers wird durch das Ausmaß der Modifizierung des Präpolymers und des Polymers und teilweise durch die relativen molaren Mengen der aktivierenden Verbindung kontrolliert. Eine Modifizierung von etwa 15 % bis etwa 30 % der NCO-Gruppen des Präpolymers ist bevorzugt. Ein großer molarer Überschuß der aktivierenden Verbindung wird mit dem Polymer kontaktiert, so daß im wesentlichen sämtliche der zweiten funktionellen Gruppen des Polymers umgesetzt sind. Vorzugsweise wird ein Molverhältnis von aktivierender Verbindung zum Polymer von mehr als 1 : 1, am meisten bevorzugt von etwa 2 : 1 bis etwa 5 : 1 angewendet.
Im allgemeinen wird das modifizierte Polymer oder ein Substrat mit einem dünnen Film oder einer monomolekularen oder im wesentlichen monomolekularen Schicht des modifizierten Polymers darauf mit der aktivierenden Verbindung in Gegenwart eines Lösungsmittels kontaktiert. Das Lösungsmittel kann wäßrig oder nicht-wäßrig sein, was von der verwendeten aktivierenden Verbindung abhängt. Wenn das modifizierte Polymer auf einen Träger aufgezogen wird, sollte ein Lösungsmittel sorgsam ausgewählt werden, welches nicht erodiert oder in anderer Weise das Substrat beschädigt.
Die aktivierende Verbindung wird mit dem modifizierten Polymer für eine Zeitdauer von etwa 2 bis 17 Stunden oder länger kontaktiert, um eine vollständige oder im wesentlichen vollständige Reaktion sämtlicher zweiten funktionellen Gruppen des modifizierten Polymers sicherzustellen. Es ist offensichtlich, daß die Reaktionsbedingungen, z.B. Temperatur- und Atmosphärenbedingungen etc..., in Abhängigkeit der eingesetzten aktivierenden Verbindung und des Polymers variieren werden. Das Lösungsmittel wird anschließend entfernt, z.B. durch Filtration oder Verdampfung, und der Rückstand wird getrocknet, um die aktivierte Polyurethan- oder Polyharnstoff-Polyurethan-Polymermatrix bereitzustellen. Die Matrix kann anschließend mit einem Bioaffinitätsmittel in einem wäßrigen oder nicht-wäßrigen Medium umgesetzt werden, um das gewünschte Mittel an den Träger kovalent anzuheften.

Affinitätsmatrix

Die erfindungsgemäßen Trägermatrizes schließen das aktivierte, hydratisierte Polyharnstoff-Polyurethan oder Polyurethan- Polymer ein, oder sind alternativ gekennzeichnet durch einen Träger, der mit dem aktivierten hydratisierten Polymer beschichtet ist. Der Träger kann in Form einer mikroporösen oder nichtgewebten Membran, eines partikulären porösen oder nichtporösen Mediums, oder einer nichtporösen Vorrichtung wie einer Mikrotiterplatte vorliegen.
Mikroporöse Materialien, wie sie derzeit für Diagnostika benutzt werden, sind geeignet. Nylonmembranen werden häufig verwendet. Alternativ können Membranen oder Polypropylen, verschiedene Polyester, Polyvinylfluorid, Teflon (Warenzeichen, E.I. DuPoint de Nemours & Co.) oder Cellulose verwendet werden. Die Membranen aus gewebten oder nichtgewebten Materialien können eine geeignete Oberfläche aufweisen, so daß die Testflüssigkeit und jegliche darin enthaltenen gelösten Stoffe die Oberfläche benetzen und den Träger passieren können oder auch nicht. Typischerweise werden Membranen verwendet mit Porengrößen von etwa 0,05 oder weniger bis etwa 5,0 um oder größer. Das Membranmaterial muß in den Lösungsmitteln, die sowohl bei der Herstellung der Assay-Trägermatrix als auch bei der Durchführung des Assays verwendet werden, unlöslich sein.
Alternativ können poröse oder nichtporöse partikuläre Träger verwendet werden. Beispielsweise wären anorganische Partikel, z.B. Kieselgel, und organische Partikel, z.B. Holzkohlen-, Polystyrol- und Polyaminpartikel geeignet. Die Partikelgröße wird entsprechend dem Format ausgewählt, in dem die Trägermatrix verwendet werden wird. Beispielsweise müssen die Partikel für den Fall, daß die Matrix in einer Säule oder einer Füllkörperbett-Konfiguration vorliegen wird, eine ausreichende Größe aufweisen, um das Durchfließen der Testflüssigkeit und der Reagenslösungen durch das Bett zu ermöglichen. Kügelchen von 1 um können zur Verwendung in dieser Ausführungsform gewünscht sein. Auch hier sollte das ausgewählte Material in den bei der Herstellung des erfindungsgemäß eingesetzten Matrix- und Polymer- Systems verwendeten Lösungsmitteln unlöslich sein.
Nach einer anderen alternativen Ausführungsform kann der Träger eine nichtporöse Assay-Vorrichtung wie eine Mikrotiterplatte sein. Vorrichtung wie diese sind typischerweise zusammengesetzt aus Materialien wie Polystyrol, Polypropylen, Polyvinylchlorid und dergleichen. Bei der Herstellung von Trägermatrizes dieser Ausführungsform sollte genau beachtet werden, daß man entweder Lösungsmittel auswählt, welche die Integrität des Substrats nicht beeinträchtigen, oder es sollte das Lösungsmittel nach dem Beschichtungsschritt schnell entfernt werden, bevor das Substrat erodiert oder in anderer Weise geschädigt werden kann.

Eigenschaften der Affinitätsmatrix

Die erfindungsgemäßen Affinitätsmatrizes sind einzigartig und bieten gegenüber herkömmlichen Affinitätsmatrizes signifikante Vorteile. In der DE-OS 39 00 272 werden Materialien offenbart, die zur Chromatographie verwendet oder zur Affinitätschromatographie durch jede geeignete Derivatisierung eingesetzt werden können. Die erfindungsgemäßen Affinitätsmatrizes sind Affinitätsmatrizes des Standes der Technik überlegen, da die erfindungsgemäßen Produkte in hohem Maße biokompatibel sind, d.h. die hydratisierten Polyharnstoff-Polyurethan-Polymere interagieren nicht mit physiologischen Oberflächen. Die erfindungsgemäßen Affinitätsmatrizes sind gegenüber einer unspezifischen Proteinadsorption resistent. Lediglich beabsichtigte Proteine werden an die Trägermatrix über darauf befindliche spezifische Bindungsstellen gebunden. Demgemäß werden eine Einwirkung von in der Umgebung vorhandenen anderen Proteinen wie auch die mögliche Mehrdeutigkeit von erwünschten Ergebnissen infolge einer nicht unterscheidbaren Bindung von unerwünschten Proteinen eliminiert.
Die Affinitätsmatrix ist gekennzeichnet durch eine spezifische Reaktivität, die durch die verbleibenden funktionellen Gruppen der aktivierenden Verbindung geliefert wird, oder durch einzigartige Bindungsstellen in Assoziation mit einem daran gebundenen Bioaffinitätsmittel. Eine Modifizierung lediglich einer begrenzten Anzahl von Präpolymergruppen ermöglicht die Einführung von funktionellen oder reaktiven Gruppen in die Polymermatrix, während die Biokompatibilität des ursprünglichen Präpolymers aufrechterhalten bleibt. Die ursprüngliche Resistenz des Präpolymers gegenüber einer unspezifischen Proteinbindung wird in der erfindungsgemäßen Matrix ebenfalls aufrechterhalten. Die Auswahl von modifizierenden und aktivierenden Verbindungen, die ihrerseits nicht für eine unspezifische Proteinbindung anfällig sind, kann jedoch erwünscht sein, um die Nicht-Protein- Adsorptionseigenschaften der Matrix zu steigern.
Wenn Biokompatibilität gewünscht wird, sollten die modifizierenden und aktivierenden Verbindungen nicht toxisch sein. Auf der anderen Seite kann es erwünscht sein, die Polymermatrix für bestimmte Zwecke toxisch zu machen. Diesbezüglich können modifizierende und aktivierende Verbindungen ausgewählt werden. Der vorliegend verwendete Begriff Biokompatibilität bezieht sich auf die Resistenz gegenüber einer Adsorption von Proteinen und auf den Mangel an der Fähigkeit zur Wechselwirkung mit physiologischen Oberflächen, wie oben ausgeführt wurde.

Verwendung der Affinitätsmatrix

Die erfindungsgemäßen Affinitätsmatrizes sind geeignet zur Verwendung in vielfältigen medizinischen und Laborvorrichtungen und Verfahren, bei denen ein Kontakt mit Blut oder anderen proteinhaltigen Flüssigkeiten oder Körpergeweben wahrscheinlich ist. Die erfindungsgemäße Matrix kann als Affinitätsmatrix eingesetzt werden, um ein zielgerichtetes Bioaffinitätsmittel für vielfältige wirtschaftliche und forschungsbedingte Zwecke durch kovalente Anheftung selektiv zu binden. Die Affinitätsmatrizes können direkt im Anschluß an eine Immobilisierung des Bioaffinitätsmittels verwendet werden, ohne das Erfordernis eines Blokkierungsschrittes zur Vermeidung einer Bindung von unerwünschten Proteinen.
Die erfindungsgemäße Affinitätsmatrix ist geeignet für vielfältige biomedizinische Anwendungen zur Reinigung, Isolierung und/oder Quantifizierung eines gewünschten Liganden oder Bindermoleküls. Beispielsweise kann mit dem erfindungsgemäßen aktivierten Polymer beschichtetes Siliciumdioxid als chromatographischer Träger zur Immobilisierung eines Antikörpers verwendet werden. Der Siliciumdioxid/aktiviertes Polymer-Träger, auf dem der Antikörper immobilisiert ist, wird anschließend verwendet, um ein für den Antikörper spezifisches Antigen aus z.B. einem rohen Zellextrakt oder der extrazellulären Flüssigkeit einer Zelle, die das Antigen in natürlicher Weise oder als Ergebnis rekombinanter Techniken bildet, zu isolieren und/oder zu reinigen.
Die erfindungsgemäßen Affinitätsmatrizes sind insbesondere geeignet für biomedizinische Anwendungen wie extrakorporale Vorrichtungen für therapeutische Zwecke. Beispielsweise weisen Nierendialysepatienten hohe Werte für das Protein Beta-2-Mikroglobulin auf, welches sich in den Handgelenken ablagert und schwerwiegende klinische Probleme verursacht. Die erfindungsgemäße Affinitätsmatrix mit einem darauf immobilisierten Antikörper gegen Beta-2-Mikroglobulin kann eingesetzt werden, um das Protein aus dem Blut von Patienten während einer Nierendialyse zu entfernen. Auf ähnliche Weise können toxische Metalle aus dem Blut von Patienten entfernt werden, die an zu starker Belastung mit Eisen leiden, indem das Blut mit einer erfindungsgemäßen Affinitätsmatrix kontaktiert wird, auf der ein Antikörper gegen das Eisen bindende Protein Ferritin immobilisiert worden ist. Bei der Krebstherapie können Chemotherapeutika, die in toxischen Mengen verabreicht worden sind, aus dem Blut von Krebspatienten entfernt werden, indem eine erfindungsgemäße Affinitätsmatrix verwendet wird, auf der ein geeigneter Ligand oder ein geeignetes Bindermoleküle immobilisiert ist.
Die erfindungsgemäße Affinitätsmatrix ist für die Verwendung bei einer extrakorporalen therapeutischen Vorrichtung in idealer Weise geeignet, um die Low density lipoprotein Cholesterin (nachfolgend "LDL-C")-Werte im Vollblut zu reduzieren. Bei dieser Ausführungsform wird eine gemäß obiger Darlegung hergestellte Affinitätsmatrix einer Reaktion ausgesetzt, um darauf ein Bioaffinitätsmittel zu immobilisieren, welches in der Lage ist, LDL-C aus den Plasmabestandteilen von Vollblut selektiv zu entfernen. Geeignete Bioaffinitätsmittel, die auf der Affinitätsmatrix immobilisiert werden können, schließen Proteine, z.B. Heparin, Polyacrylsäure, Dextransulfat sowie für Low density lipoproteine spezifische Antikörper ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Die erfindungsgemäßen Matrizes ermöglichen die selektive Verminderung der LDL-C-Werte im Vollblut ohne störende Einflußnahme durch die Bindung unerwünschter Proteine.
Die erfindungsgemäße Affinitätsmatrix ist ebenfalls zur Verwendung bei diagnostischen Assays geeignet, um die Anwesenheit eines Target-Liganden oder -Bindermoleküls in einer Testflüssigkeit nachzuweisen. Beispielsweise kann eine mit dem erfindungsgemäßen aktivierten Polymersystem behandelte mikroporöse Membran verwendet werden, um ein Bioaffinitätsmittel für einen Target-Liganden oder -Bindermolekül kovalent zu binden und zu immobilisieren. Typischerweise läßt man die Testflüssigkeiten und Reagenslösungen durch die behandelte Trägermembran passieren, und die Anwesenheit oder Abwesenheit eines beobachteten Farbwechsels dient der Bestimmung eines positiven oder negativen Ergebnisses hinsichtlich des Target-Liganden oder -Bindermoleküls. Auch die erfindungsgemäß hergestellten partikulären Affinitätsmatrizes können in ähnlicher Weise verwendet werden.
Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung und sollen die vorliegend beschriebene Erfindung nicht einschränken. Die folgenden Abkürzungen sind bei der Beschreibung der Erfindung verwendet worden.
A - Angström
ºC - Grad Celsius
cm - Zentimeter
cps - Centipoise
DMEM - Dulbecco's Modified Eagle's Medium
DI - entionisiert
F12 - F12-Zellkulturmedium
g - Gramm
Hg - Quecksilber
IDPI - Isophorondiisocyanat
IU - Internationale Einheit(en)
M - molar
m² - Quadratmeter
meq - Milliäquivalent(e)
mg - Milligramm
min - Minute(n)
ml - Milliliter
mm - Millimeter
mmol - Millimol
ug - Mikrogramm
um - Mikrometer
umol - Mikromol
MG - Molekulargewicht
N - normal
NCO - Isocyanat
ng - Nanogramm
PBS - phosphatgepufferte Saline
ppm - Teile auf eine Million
% - Prozent
- Warenzeichen
UV - ultraviolett
Vol. - Volumen
Gew. - Gewicht

BEISPIEL I

(Herstellung von Präpolymer A)

Das zur Herstellung der erfindungsgemäßen Präpolymere verwendete Polyol Pluracol V7 (BASF), ein Triolcopolymer aus Ethylenoxid (75 %) und Propylenoxid (25 %) mit einem MG von 7000 wurde entionisiert und getrocknet. Im Anschluß an diese Entionisierung wurden 1687,46 g Pluracol V7 mit 165,0 g Isophorondiisocyanat (IDPI) und 0,93 g SANTONOX R (Monsanto Chemical Co.) vermischt und unter trockenem Stickstoff auf 70 ºC erhitzt. Die Isocyanatmengen wurden bestimmt durch Zugabe von Dibutylamin und Rücktitration mit Standardsäure. Es wurden 14 Tage benötigt, um die Konzentration an Isocyanat von 0,47 meq/g (0,39 mq/g = theoretisch) zu erreichen. Das mit Präpolymer A bezeichnete resultierende Präpolymer war bei Raumtemperatur flüssig.

BEISPIEL II

(Herstellung von Präpolymer B)

Durch Vermischen von 300,0 g entionisiertem und getrocknetem TPEG10000 (Union Carbide Corp.) mit 22,0 g IPDI und 0,16 g SANTONOX R wurde ein Präpolymer gebildet. Das TPEG10000 ist ein aus 100 % homopolymerem Ethylenoxid hergestelltes Triol mit einem MG von 10 000. Die Mischung wurde unter trockenem Stickstoff wie in Beispiel 1 auf 70 ºC erhitzt, bis die Isocyanatwerte 0,36 meq/g (theoretisch = 0,28 meq/g) erreichten. Dieses mit Präpolymer B bezeichnete Präpolymer bildete bei Abkühlung auf Raumtemperatur einen Feststoff.

BEISPIEL III

(Herstellung von Präpolymer C)

Durch Auflösen von 50,0 g (0,0125 Equiv. Hydroxyl) Polyethylenglykol (MG 8000) (Sigma Chemical Co.) in 100 ml (78,2 g) Acetonitril wurde ein Präpolymer hergestellt. Diesem wurden 3,06 g (0,0275 Equiv. Isocyanat) Isophorondiisocyanat und 0,03 g SANTONOX R zugegeben. Die Lösung wurde unter trockenem Stickstoff in einem trockenen, mit Säure gewaschenen Glaskolben 14 Tage lang auf 70 ºC erhitzt. Der Isocyanatwert sank am Tag 14 auf 0,10 meq/g (theoretisch = 0,11 meq/g) ab. Das gebildete Präpolymer wurde mit Präpolymer C bezeichnet und als 25%ige Lösung in Acetonitril aufbewahrt.

BEISPIEL IV

(Herstellung von Präpolymer D)

Durch Auflösen von 50,0 g (0,0263 Equiv. Hydroxyl) Polyethylenglykolmonomethylether (MG 1900) (Polysciences, Inc.) in 100 ml (79,2 g) Acetonitril wurde ein Präpolymer hergestellt. Dieser Lösung wurden 6,43 g (0,0578 Equiv. Isocyanat) Isophorondiisocyanat und 0,03 g SANTONOX R zugegeben. Die Lösung wurde unter trockenem stickstoff in einem mit Säure gewaschenen Glaskolben 8 Tage lang auf 70 ºC erhitzt, wobei der Isocyanatgehalt zu diesem Zeitpunkt 0,15 meq/g (theoretisch = 0,23 meq/g) betrug. Dieses mit Präpolymer D bezeichnete Präpolymer wurde als 42%ige Lösung in Acetonitril aufbewahrt.

BEISPIEL V

(Herstellung von Präpolymer E)

Durch Vermischen von 848,8 g entionisiertem und getrocknetem Polyol BASF 1123 (BASF) mit 91,6 g Isophorondiisocyanat in einer 1 Liter Polyethylenflasche bei Raumtemperatur mit mechanischem Rühren für eine Zeitdauer von 30 Minuten wurde ein Präpolymer hergestellt. Über die Mischung wurde trockener Stickstoff geführt, und die Flasche wurde mit einer Schraubkappe verschlossen und in einen elektrischen Ofen bei 85 ºC überführt. Nach 11 Tagen war die Reaktion abgeschlossen. Das Produkt wies einen Isocyanatwert von 0,43 meq/g und eine Viskosität von 62 000 cps bei 25ºC auf. Dieses Präpolymer wurde mit Präpolymer E (niedrige Temperatur) bezeichnet. Ein Präpolymer wurde in identischer Weise hergestellt mit der Ausnahme, daß es 2 Tage lang in einem elektrischen Ofen bei 125 ºC inkubiert wurde. Dieses Präpolymer wurde mit Präpolymer E (hohe Temperatur) bezeichnet.

BEISPIEL VI

Herstellung von Präpolymer F)

Monomethoxypoly ( ethylenglykol) mit einem Molekulargewicht von 550 (160 g, 0,291 Mol) wurde mit Isophorondiisocyanat (69,0 g, 0,310 Mol) in einer Polyethylenflasche vermischt und mit trockenem Stickstoff gereinigt. Die Probe wurde in einen Ofen überführt, und die Temperatur wurde 20 Stunden lang auf 70 ºC gehalten. Zu diesem Zeitpunkt wurde die Probe entfernt, und die Bestimmung des Isocyanatwertes ergab 1,32 meq/g. Dieses Produkt wurde mit Präpolymer F bezeichnet.

BEISPIEL VII

(Herstellung von Präpolymer G)

Es wurde ein Polyetherdiol erhalten, welches 84 % Ethylenoxid und 16 % Propylenoxid umfaßte und ein Molekulargewicht von 2200 aufwies (Takeda). Dieses Diol (800 g, 0,36 Mol) wurde mit IPDI (163,4 g, 0,74 Mol) vermischt und in eine Polyethylenflasche unter trockenem Stickstoff überführt. Die Probe wurde 10 Tage lang auf 70 ºC erhitzt, wobei der Isocyanatwert zu diesem Zeitpunkt 0,75 meq/g betrug. Die Reaktion wurde zu diesem Zeitpunkt abgebrochen, und das Produkt wurde unter trockenem Stickstoff gerührt. Das Produkt wurde mit Präpolymer G bezeichnet.

BEISPIEL VIII

(Herstellung von mit modifiziertem hydratisierten Polymer beschichtetem Siliciumdioxidträger)

Bei diesem Beispiel wurden 10,0 g (0,40 meq NCO/g) des Präpolymers E (hohe Temperatur) in 20 ml trockenem Methylenchlorid aufgelöst. Hierzu wurde eine zu 15 % des Isocyanats im Präpolymer äquivalente Menge an Ethanolamin (0,037 g, 0,60 meq) zugegeben. Diesen Ansatz ließ man mindestens 1 Stunde lang reagieren, bevor man der Lösung 20 g Siliciumdioxid (Matrex Silica Si, Amicon Corporation, Danvers, MA) zugab. Dieses Siliciumdioxid besitzt eine Partikelgröße von 20-45 uM und eine Porengröße von 500 Å. Die Suspension wurde 18 Stunden lang auf einem Orbitalschüttler bei Raumtemperatur geschüttelt, durch eine 40 uM Glasfritte filtriert und anschließend mit 200 ml Wasser 8 Stunden lang zur Aushärtung des Polymers vermischt. Nach dem Filtrieren und Waschen mit Acetonitril wurde das beschichtete Siliciumdioxid unter Vakuum bei 40 ºC getrocknet. Eine Wärmegewichtsanalyse ergab eine Beschichtung von 30 % (Gew./Gew.), weshalb sich im wesentlichen alle zugesetzten Polymere auf dem Siliciumdioxid abgesetzt hatten.

BEISPIEL IX

(Herstellung von mit aktiviertem hydratisierten Polymer beschichtetem Siliciumdioxidträger)

Das Präpolymer E (hohe Temperatur) wurde mit Ethanolamin partiell derivatisiert und im wesentlichen gemäß Darlegung in Beispiel VIII auf Siliciumdioxid aufgezogen. Der beschichtete Siliciumdioxidträger (10,0 g) wurde in 40 ml Aceton enthaltend 0,8 g Pyridin und 0,8 g p-Nitrophenylchloroformiat 40 Minuten lang bei 4 ºC suspendiert. Das beschichtete Siliciumdioxid wurde filtriert, gewaschen und unter Vakuum getrocknet. Es wurde bis zur Verwendung bei 4 ºC aufbewahrt. Das Ausmaß der Aktivierung wurde gemessen durch Behandlung einer Probe des aktivierten Trägers mit 0,2 N NaOH und Messung der Absorption des freigesetzten Nitrophenols bei 400 nm. Durch dieses Verfahren wurde ein Wert von 22 umol/g erhalten, welcher derselbe ist wie der Wert von Hydroxylgruppen, die zur Aktivierung zur Verfügung stehen.

BEISPIEL X

(Bindung von alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm an aktivierten Träger)

Es wurde eine Lösung von alkalischer Phosphatase hergestellt mit einer Konzentration von 15mg/ml in 0,1M Glycin, pH- Wert 8,0, enthaltend 1 mM MgCl&sub2; und 1mM ZnCl&sub2;. Zu 5,0 ml dieser Lösung in einem 15 ml Schraubkappenröhrchen wurden 0,50 g von dem mit aktiviertem hydratisierten Polymer beschichtetem Siliciumdioxid aus Beispiel IX zugegeben. Die Suspension wurde bei Raumtemperatur für 4 Stunden, anschließend bei 4 ºC für 17 Stunden geschüttelt. Die mengenmäßige Bestimmung von verbleibendem ungebundenen Protein im Überstand erfolgte unter Anwendung des Biorad-Protein-Assay-Reagens. Anhand dieser Analyse wurde ermittelt, daß der aktivierte hydratisierte Polyuter/Siliciumdioxidträger 67,5 mg Protein pro Gramm Träger gebunden hatte.

BEISPIEL XI

(Demonstration der enzymatischen Aktivität nach Bindung von alkalischer Phosphatase an aktivierten Träger)

Es wurde ein Bindungsexperiment durchgeführt gemäß Darlegung in Beispiel X unter Verwendung des aktivierten hydratisierten Polymers/Siliciumdioxidträgers gemäß Darlegung in Beispiel IX. Zusätzlich wurde eine Kontrolle durchgeführt, bei der ein mit Ethanolamin derivatisiertes hydratisiertes Polymer-beschichtetes Siliciumdioxid nicht mit p-Nitrophenylchloroformiat aktiviert worden war. Die an den Trägern gebundenen Enzymmengen waren wie folgt: TABELLE I Probe # Träger mg alkalische Phosphatase gebunden pro g Träger Beschichtetes Siliciumdioxid, nicht aktiviert Beschichtetes Siliciumdioxid, aktiviert
In einem gesonderten Experiment wurde demonstriert, daß eine Behandlung von unbeschichtetem, rohen Siliciumdioxid mit einer äquivalenten Menge an alkalischer Phosphatase zu unspezifischer Adsorption des Enzyms in einem Ausmaß von > 150 mg Protein pro g rohen Siliciumdioxids führte. Wie oben in Tabelle I dargestellt, wurde diese unspezifische Adsorption durch Beschichtung des Siliciumdioxids mit dem erfindungsgemäßen hydratisierten Polymer vollständig beseitigt. Ferner führte eine Aktivierung des Polymers zu eine Immobilisierung des Enzyms.
Um festzustellen, ob das an den Träger gebundene Enzym aktiv war, wurden je 10 mg der in Tabelle I beschriebenen Träger mit p-Nitrophenylphosphat unter Standard-Assay-Bedingungen inkubiert. Die beobachtete Veränderung der Absorption, wie sie in der folgenden Tabelle II dargestellt ist, zeigte, daß das Enzym, welches von dem aktivierten hydratisierten Polymer/Siliciumdioxidträger gebunden war, seine enzymatische Aktivität beibehielt: TABELLE II Probe # Veränderung der Absorption bei 405 nm über 20 min

BEISPIEL XII

(Affinitätsreinigung von Thrombospondin unter Verwendung von mit modifiziertem hydratisierten Polymer beschichtetem Siliciumdioxidträger)

Das Präpolymer E (hohe Temperatur) wurde mit Ethanolamin derivatisiert, auf Siliciumdioxid aufgezogen und anschließend mit p-Nitrophenylchloroformiat wie oben in Beispiel IX beschrieben aktiviert. 1,0 g des aktivierten Trägers wurden 2 ml einer Lösung von Fibrinogen enthaltend 12,5 mg/ml (25 mg gesamt) Fibrinogen in PBS (0,01 M Natriumphosphat, pH-Wert 7,4, 0,15 M Natriumchlorid) zugegeben. Nach einer Inkubation für 17 Stunden bei 4 ºC wurde der Überstand durch Größenausschluß-Hochdruckflüssigkeitschromatographie analysiert und durch Differenzbildung wurde gefunden, daß 23,7 mg Thrombospondin an den Träger gebunden hatten.
Ein Blutplättchenextrakt wurde 10 Minuten lang bei 10 000 x g zentrifugiert und anschließend 1 : 2 mit 20 mM Bis-Tris-Propan, pH-Wert 6,0, verdünnt, um die Salzkonzentration auf 0,05 M abzusenken. Diese Lösung wurde mit einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml/min auf den Fibrinogenträger aufgetragen und anschließend mit demselben Puffer gewaschen, bis kein weiteres Protein eluierte. Das gebundene Protein wurde anschließend unter Verwendung von 20 mM Bis-Tris-Propan, pH-Wert 6,0, enthaltend 0,5 M NaCl, revers eluiert. Die Protein enthaltende Fraktion, welche aus der Säule eluierte, enthielt 2,77 mg Thrombospondin.

Claims

1. Affinitätsmatrix zur Chromatographie und Immobilisierung von biologisch aktiven Materialien, umfassend einen Träger mit einer Beschichtung eines hydratisierten Polyharnstoff-Polyurethan-Polymers darauf, wobei das hydratisierte Polymer hergestellt ist aus Präpolymereinheiten von auf Oxyethylen basierenden Diolen und Polyolen mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von etwa 7000 bis 30 000, und bei denen im wesentlichen alle der Hydroxylgruppen verkappt sind mit einer aliphatischen oder cycloaliphatischen Polyisocyanatgruppe, die mit einer modifizierenden Verbindung umgesetzt wird, welche eine erste NCO-reaktive Gruppe, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Thiolat, Amino, Hydroxyl, Sulfhydryl oder Carboxyl, und eine zweite funktionelle Gruppe aufweist, welche eine wesentlich geringere NCO-Reaktivität als die erste NCO-reaktive Gruppe besitzt, und wobei das hydratisierte Polymer mit einer aktivierenden Verbindung umgesetzt worden ist, um mindestens einige der zweiten funktionellen Gruppen der modifizierenden Verbindung in eine aktive funktionelle Gruppe umzuwandeln, welche in der Lage ist, ein Bioaffinitätsmittel kovalent anzulagern, wobei die Matrix durch eine Oberfläche gekennzeichnet ist, welche biokompatibel und für Proteine nicht-adsorptiv ist.

2. Matrix nach Anspruch 1, bei der das Polyisocyanat Isophorondiisocyanat oder Methylenbis(cyclohexyldiisocyanat) ist.

3. Matrix nach Anspruch 1, bei der von etwa 15 % bis etwa 30 % der Isocyanatgruppen des Präpolymers mit der modifizierenden Verbindung umgesetzt sind.

4. Matrix nach Anspruch 1, bei der das hydratisierte Polymer mit der aktivierenden Verbindung umgesetzt worden ist, um im wesentlichen alle der zweiten funktionellen Gruppen in eine aktive funktionelle Gruppe umzuwandeln, welche in der Lage ist, ein Bioaffinitätsmittel kovalent anzulagern.

5. Matrix nach Anspruch 1, bei der die Matrix im wesentlichen aus dem hydratisierten Polymer besteht und in Form eines partikulären Mediums vorliegt.

6. Matrix nach Anspruch 1, bei der der Träger die Form einer mikroporösen Membran oder eines partikulären Mediums aufweist.

7. Matrix nach Anspruch 6, bei der der Träger ein aus Silikagel oder Holzkohle ausgewähltes partikuläres Medium ist.

8. Verfahren zur Herstellung einer Affinitätsmatrix zur Chromatographie oder Immobilisierung von biologischen Materialien, wobei die Matrix gekennzeichnet ist durch eine biokompatible Oberfläche, welche gegenüber einer Proteinadsorption resistent ist, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

a) Herstellung eines Präpolymers, dessen Einheiten auf Oxyethylen basierende Alkohole sind, wobei im wesentlichen alle der Hydroxylgruppen mit einem aliphatischen oder cycloaliphatischen Polyisocyanat verkappt sind;

b) Umsetzung des mit Polyisocyanat verkappten Präpolymers mit einer modifizierenden Verbindung, die eine erste NCO-reaktive Gruppe, ausgewählt aus Thiolat, Amino, Hydroxyl, Sulfhydryl oder Carboxyl, und eine zweite funktionelle Gruppe aufweist, welche wesentlich weniger NCO-reaktiv ist als die erste NCO-reaktive Gruppe, um ein modifiziertes Präpolymer zu bilden;

c) Aufziehen des modifizierten Präpolymers auf einen Träger;

d) Aushärten des modifizierten Präpolymers mit Wasser, um ein modifiziertes hydratisiertes Polyharnstoff-Polyurethan-Polymer zu bilden, welches durch die in das Präpolymer eingeführte zweite funktionelle Gruppe gekennzeichnet ist; und

e) Umsetzung des modifizierten hydratisierten Polyharnstoff-Polyurethan-Polymers mit einer aktivierenden Verbindung, um die zweite funktionelle Gruppe des Polymers in eine aktive funktionelle Gruppe umzuwandeln, die in der Lage ist, ein Bioaffinitätsmittel kovalent anzulagern.

9. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem ein großer molarer Überschuß der aktivierenden Verbindung verwendet wird.

10. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem im wesentlichen alle der zweiten funktionellen Gruppen des modifizierten hydratisierten Polyharnstoff-Polyurethan-Polymers in eine aktive funktionelle Gruppe, welche in der Lage ist, einen Liganden oder ein Bindermolekül kovalent anzulagern, umgewandelt sind.

11. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem das modifizierte hydratisierte Polyharnstoff-Polyurethan-Polymer mit der aktivierenden Verbindung in einer nicht-wäßrigen Umgebung umgesetzt wird.

12. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem etwa 15 % bis etwa 30 % der Isocyanatgruppen des Präpolymers modifiziert werden.

13. Affinitätschromatographievorrichtung, bestehend aus der Matrix gemäß Anspruch 1 oder 7.

14. Immobilisiertes Bioaffinitätsmittel, umfassend ein an die Matrix gemäß Anspruch 1 oder 7 kovalent angelagertes Bioaffinitätsmittel.

15. Extrakorporale therapeutische Vorrichtung, bestehend aus dem immobilisierten Bioaffinitätsmittel gemäß Anspruch 14.

16. Reinigungs- oder Isolierungssystem für einen biologisch aktiven Liganden oder ein Bindermolekül, wobei das System das immobilisierte Bioaffinitätsmittel gemäß Anspruch 14 umfaßt, wobei das Bioaffinitätsmittel in der Lage ist, den Liganden oder das Bindermolekül selektiv zu binden.

17. Diagnostisches Assaysystem, umfassend die Affinitätsmatrix gemäß Anspruch 1 mit einem daran kovalent angelagerten Bioaffinitätsmittel, und ferner umfassend einen Halter für die Matrix.