SE450834B - Sett att binda ett protein till en berare innehallande hydroxylgrupper - Google Patents

Description

15 20 25 30 35 450 834 för bindningen. Hydroxylgrupper på polymerer är mycket inerta och måste angripas av ganska agäressiva reagenser för att användas såsom länkgrupper. Detta har givetvis inneburit att endast mycket starkt reaktionsbenägna grupper kunnat deltaga i bindningsreaktionen. Enzymer, som skall bindas, hanteras vanligen i form av buffrade utspädda vattenhaltiga lösningar. Det leder till risken att sådana grupper förbrukas i sidoreaktioner med det närvarande stora överskottet på vatten.

Enligt den kända tekniken har man därför varit tvingad att finna en metod att uppväga en sådan naturligt uppkommen låg reaktionseffektivitet. I synnerhet i samband med bärare innehållande hydroxylgrupper, exempelvis polysackarider, har detta åstadkommits genom någon form av aktivering av hydroxylgrupperna.

Den hitintills vanligaste formen för aktivering har varit med hjälp av bromcyan, såsom beskrivs i Axén, Ernbäck: European J. Biochem. 1971, 18, 351. Även om denna aktiveringsform gjort det möjligt att lösa det ovannämnda problemet har metoden likväl inneburit allvarliga nackdelar och risker.

Såsom framgår av reaktionsschemat 2 i nämnda referens är bindningarna inte särskilt stabila. Speciellt framgår att liganderna kan avspjälkas från bäraren antingen hydrolytiskt eller i synnerhet ammonolytiskt.

Vidare kanförorenandecyanidjoner från nämnda brom- cyan negativt påverka enzymaktiviteten genom blockering av centrala metallatomer. Jämför exempelvis K. Pommerening et al, J. Pol.Sci.:Polymer Symp. 66, 185-188 (l979).

Cyanhalogenidexrär i sig giftiga och väl jämförbara med blåsyran i detta avseende. Användningen av den starkt toxiska och lättflyktiga (kp 6l°C) bromcyanen enligt den kända tekniken erfordrar därför speciella säkerhetsåtgärder, speciellt i samband med industriella processer.

Vissa enzymer kräver av steriska skäl en förankring till bäraren via en långkedjig bindelänk (“spacer"). För att åstadkomma en sådan förankring enligt den kända BrCN- 10 15 20 25 30 35 450 834 metoden har man därför behövt tillgripa ett separat andra 7 reaktionssteg, dvs först binda en spacer och slutligen binda proteinet till denna spacer.

Slutligen kan nämnas att den kända bromcyan-metoden i samband med bärare på basis av cellulosa krävt att cellulosan först genomgått en alkalisk vattenbehandling, dvs merceriserats. Jämför exempelvis J.A. Jackson et al: J. Pharm. + Exp. Therapeutics, vol. 209, 2 (1979), s. 271. Ändamålet med föreliggande uppfinning är därför att åstadkomma ett nytt sätt att binda proteiner till en bärare innehållande hydroxylgrupper, varigenom de ovan uppräknade nackdelarna och riskerna hos den kända tekniken undvikes.

Enligt uppfinningen uppnås detta ändamål därigenom att man i stället för att tillgripa en aktivering av bärarens hydroxylgrupper använder sig av ett ämne med förmåga att katalysera bildandet av en mot hydrolys eller ammonolys stabil uretanbindning. Genom att välja ett icke- toxiskt ämne med denna förmåga och en isocyanat med hög kokpunkt eller en icke-flyktig isocyanatförpolymer und- viker man inte bara det separata aktiveringssteget utan framför allt de toxiska riskerna som är ofrånkomliga i samband med den kända halogencyan-metoden (BrCN). Cyanid- joner är inte närvarande, en mercerisering av bäraren är inte nödvändig för denna metod.

BESKRIVNING AV UPPFINNINGEN Enligt föreliggande uppfinning åstadkommes således ett sätt att binda ett protein till en bärare innehållande hydroxylgrupper, varvid en isocyanatförening innehållande åtminstone två isocyanatgrupper i närvaro av ett ämne med förmåga att katalysera uretanbildning bindes till bäraren, och proteinet därefter bindes till den så bundna isocyanat- föreningen. Sättet enligt uppfinningen kännetecknas därav, att såsom nämnda ämne med förmåga att katalysera uretan- bildning användes ett icke-toxiskt ämne på titanbas, före- trädesvis en ortotitansyraester. l0 15 20 25 30 35 450 834 Exempel på sådana icke-toxiska ämnen enligt uppfin- ningen är ortotitansyraestrar innehållande lågmolekylära alkylgrupper såsom metyl, etyl, n-propyl, i-propyl, n-butyl och isomerer av dessa, företrädesvis tetrabutyltitanat (TBT).

(NIOSH:Registry of toxic effects of chemical substances, 1977, vol. II, s. 912, TXDS (oral rat):LD503l22 mg/kg).

Företrädesvis används nämnda ortotitansyraestrar i löst form i ett lågkokande lösningsmedel, t ex eter, aceton, diklormetan eller frigen.

Valet av isocyanatförening enligt uppfinningen kan variera och bestäms främst av den steriska karaktären hos det protein, som skall bindas. Efter behov kan man således välja bland såväl långkedjiga som kortkedjiga isocyanatföreningar beroende på vilket avstånd från bärarens yta som är det mest lämpliga. Exempelvis kan sådana isocyanatföreningar vara diisocyanater eller poly- isocyanater med ökande antal kolatomer i beroende av efter- strävat ökande avstånd. Typiska exempel på isocyanat- föreningar enligt uppfinningen är hexametylendiisocyanat och trimetylhexametylendiisocyanat, toluendiisocyanat (TDI) eller metylendifenyldiisocyanat (MDI) och förpolymerer baserade därpå.

Företrädesvis används nämnda isocyanatförening i löst form i ett aprotiskt lösningsmedel, t ex diklormetan, aceton, eter eller frigen.

Nämnda isocyanatlösning kan tillsättas antingen separat eller i kombination med lösningen för det kata- lyserande ämnet enligt uppfinningen.

Beträffande valet av bärare innehållande hydroxyl- grupper kan även detta variera inom vida gränser. Lämp- ligen väljes dock bäraren bland polysackarider, såsom” cellulosa, stärkelse, dextran och alginater, företrädesvis cellulosa. Även andra typer av bärare kan utnyttjas, såsom proteiner, t ex kollagen, och syntetiska polymerer, t ex polyvinylalkohol och hydroxietylmetakrylat (HEMA). 10 15 20 25 30 450 834 Även blandningar eller flerskiktsstrukturer är lämpliga, t ex hydroxylgruppinnehållande ytöverdrag.

Uppfinningen kommer i det följande att belysas närmare med konkreta utföringsexempel.

EXEMPEL l I detta exempel användes cellulosa i form av Cupro- phanR-hålfibrer, inneslutna i en GambroR LundiaR fiber- dialysator, såsom bärare för ureas.

Fyra separata försök att binda en isocyanatförening till bäraren genomfördes med användning av tetrabutyl- titanat (TBT) såsom katalysator för uretanbildning och med hexametylendiisocyanat såsom exempel på isocyanat- förening.

Försök l - 150 ml av en TBT-lösning innehållande lg TBT per 200 ml eter recirkulerades (50 ml/min) genom CuprophanR-hålfibrerna för impregnering av fibrernas innerväggar under 5 min. De första 50 millilitrarna bort- kastades. Därefter sköljdes med 100 ml av en sköljlösning (280 ml eter + 130 ml diklormetan). 20 g hexametylendiisocyanat i 400 ml lösningsmedel (280 ml eter + 130 ml diklormetan) recirkulerades (50 ml/min) genom de så sköljda hålfibrerna under 5 min för att binda diisocyanatet till de med TBT-lösning impregnerade inner- väggarna hos dessa fibrer, varefter fibrerna sköljdes med 200 ml av ovannämnda sköljlösning.

Försök 2 - Samma som försök 1, men med recirkulering av hexametylendiisocyanatlösning under 10 min.

Försök 3 - 150 ml av en TBT-lösning innehållande 2 g TBT/200 ml frigen recirkulerades (50 ml/min) genom CuprophanR-hålfibrerna för impregnering av fibrernas inner- väggar under 5 min. De första millilitrarna bortkastades. 40 g hexametylendiisocyanat i 330 ml lösningsmedel (200 ml frigen + 130 ml diklormetan) recirkulerades 10 15 20 25 30 35 45o_ss4 (50 ml/min) genom de med TBT-lösning impregnerade Cupro- ,phanR-hålfibrerna under 10 min för att binda diisocyanatet till innerväggarna hos dessa fibrer. Därefter sköljdes med 200 ml av en sköljlösning (200 ml frigen + 130 ml CH2Cl2). §§r§§k_4 - Samma som försök 3, men med 10 min impreg- nering med TBT-lösning och med 20 min recirkulering av diisocyanatlösningen.

Efter bindningen av diisocyanatet enligt försök 1-4 och sköljning med respektive lösningsmedel torkades dialysatorerna under vakuum l timme i exikator. Därefter bands enzymet ureas (Boehringer 174 882) till det så bundna diisocyanatet enligt följande.

A. Single pass (dialysatorerna från försök l och 2). 3000-5000 U ureas i 250 ml fosfatbuffert (pH = 7) pumpades (10 ml/min) genom de enligt försök l och 2 diisocyanatbehandlade dialysatorerna för att binda ureaset till nämnda diisocyanat. Respektive slutlösning uppsamlades.

Aktivitetsbestämningar enligt H.U. Bergmeier, Methoden der enzymatischen Analyse, Vol. l (1974), genomfördes därefter på såväl de ursprungliga som de uppsamlade ureaslösningarna. Slutlösningarnas volym återställes dock före aktivitetsbestämningen till den ursprungliga volymen på 250 ml genom uppsamling av de första millilitrarna av en fosfatbuffertlösning (pH = 7) som spolades genom dialysatorerna. (Den uppkomna volymförlusten berodde på svällning av CuprophanR-hålfibrerna.) Resultaten återges i Tabell l.

B. Recirkulering (dialysatorerna från försök 3 och 4). 3000-5000 U ureas i 250 ml fosfatbuffert (pH = 7) recirkulerades (10 ml/min) under 1 timme genom de enligt försök 3 respektive 4 diisocyanatbehandlade dialysatorerna för att binda ureaset till nämnda diisocyanat. På samma sätt som enligt A. ovan genomfördes därefter aktivitets- bestämningar. Resultaten återges i Tabell l. 450 834 Slutligen bestämdes aktiviteten hos det enligt A. respektive B. bundna ureaset enligt Berthelot-metoden, varvid man förfor på följande sätt: 18 l dialysat, utgângskoncentration ca 250 mg% urea, pumpades (100 ml/min, single-pass) genom respektive dialysatorer. Prover uttogs från respektive slutlösning efter 3 timmar för ureasbestämning. Resultaten anges i Tabell l. 450 834 ~Hu~mu\awmHHw aHa ON :Ha OH wøm @=HHwHøxnHuw» qwmHHH *NH wH H ~HuN=u\nwmHnH cHa OH :Ha m W Qmv mqHHwHøHHHuwH awmHum *NH HH M wmmm ~Hu~mu\~wHw :Ha CH qHa m W www mHmnHm »www Hm wm.@ N m W mmmm NHUNmUXUHwuw nä: m :HE m »mm @HmnHm Hwpw wm æm_o H W sm fmE umcmæoomflflw Hmm. m .OGflQHQWMEONÜ-ÜHD OSA.. SUCH QWMÜHD HÜU GEwOGHQw DH .UGE OCH HUCMSQQHÜM MßwHßh H .HAMN/NB 10 15 20 25 30 35 450 834 Av Tabell l framgår att aktiviteten hos bundet ureas (återspeglad genom ureaomsättning) fördubblades genom fördubblad tid för påverkan av TBT och diisocyanat, jämför försök 3 och 4.

Exempel l visar följaktligen att det på sättet enligt uppfinningen är möjligt att binda enzymet ureas till en bärare innehållande hydroxylgrupper med relativt hög aktivitet hos det så bundna ureaset (900 mg urea hydro- lyseras inom 3 timmar).

EXEMPEL 2 I detta exempel användes cellulosa i form av Cupro- phanR-stansspill från en GambroR LundiaR High-flux dialy- sator såsom bärare för ureas. Detta ÖuprophanR-spill hade en yta av ca 200 cmz/g. 27 olika försök att binda en isocyanatförening till bäraren genomfördes med användning av TBT såsom kata- lysator för uretanbildning och med hexametylendiisocyanat (försök 5-25) respektive trimetylhexametylendiisocyanat (försök 26-31) såsom exempel på isocyanatförening enligt uppfinningen.

I samtliga försök utnyttjades 3,5 g bärare, som för- sattes med lO0 ml TBT-lösning (0,3-1,5 g TBT/l00 ml CH2Cl2) och omrördes i 1 timme. Efter avdekantering av lösningen försattes den så impregnerade bäraren med l00 ml di-, isocyanatlösning (4-l2 g diisocyanat/100 ml CH2Cl2) och omrördes i 2 timmar för att binda diisocyanatet till den så TBT-impregnerade bäraren. (I försök 5-8 omrördes mellan 0,5 och l timme.) Efter avdekantering av lösningarna torkades bärarna under vakuum i 30 min i exikator.

Därefter försattes l,5.g av den så torkade bäraren med 100 ml ureaslösning och omrördes i l timme för att binda ureaset till den diisocyanatbehandlade bäraren.

Suspensionen filtrerades slutligen över ett nät och tvättades 4 gånger med 100 ml fosfatbuffertlösning och utnyttjades för aktivitetsbestämning. Följande bestäm- 10 450 854 1.0 ningsmetoder användes.

A. Aktivitet hos bundet ureas Den med ureas behandlade bäraren omrördes vid 37°C i 100 ml ureaslösning (250 mg/100 mlfosfatbuffert, pH 7, 1/15 M, 5 ppm EDTA) i l timme. Efter 30 min respektive 1 timme bestämdes mängden omsatt urea enligt Berthelot- metcden. Resultaten återges i Tabell 2.

B. Ureasaktivitet i de använda lösningarna Ureasaktiviteten bestämdes i enlighet med föreskrif- ten H.U. Bergmeier, Methoden der enzymatischen Analyse, Vol. 1 (1974). Resultaten återges i Tabell 2. 450 834 ll N QAHNÉB D D.DD _. _. ^xD DH D m.H = NN D D.mH = = ^xD D = _. HN D DH _. ._ = D D.H = DN D Nm _. _. = D m.H = DH D D.m~ _. ._ = D D.H = DH D N_H~ = = = ^xD D = _. DH D ~.- = = ^xD NH _. = DH D >.D~ _. = ^xD DH _. = DH D ~.DH ._ = ^xD D = _. DH D D_N~ = = ^xD D _. = DH s m_mH _. ._ Hxm N ._ _. NH D m.NH = D N = ^xD H D m.D = HH = = ._ _. D Dm_H = DH D DN D N _. _. D DD.D ._ D = ._ _. = D ~D_H = D D »H D H _. _. D DD.D ._ D D DH ._ ._ = D DD_D = D D DH ODDH D ~\H D H ^xD H D Hm.D D m_m D DDDDDD Ha °DH\D u>HuMm Umcmä Unm>:m umcm>00wH Bma HE ooH\vmGm>oomH HE ooH\BmB mmoH5HHmU mEEHu H ..H mnmnmn m m.H wHumfloHuxmmu m. .wvfimä Ucmïhm mm mdHcmmwHwQwmwuD øwumnmn >m mGHHUGmflmQHßm xwmumm 450 834 12 vmflmwoømflfiwmwfläuwñmxwflflhumäfluu uumflmmuomfl wow | ^U< Hwwmmv HQEH N QQHNQB .WBMOM xx Mmflmæoomfiflwfiwfihvwfimxwm uumfimhuowfl www | ^w< Hwæmmv ooaz nflëowmwn AAN D Nim så ._ _. ._ ._ _. Hm D w.m oofi = = ._ = = om n »J om ._ ._ cämëå» ._ ._ mm D w.mH com = = _. _. = mm D H.oH oofi = = _. = = »N o MÄH 3 Q N s fi tama w _. _. 3 D ow oom = = ._ _. = mm D w.mm oofl _. _. = = = wm s 3 3. n Nä n fi Em w m OJ w mä .NN uwønsn Ha 023 u>fluxm Umfimš wømßøm uøcmhoømfl Hmß HE ooH\uøcmM00mfl HE coH\BmB mwofløflfiwu mëšflu H H wumnmn m m.H Uflumøofluxmmn m .wmcmä Ucm>cm mm mcflcmmmfimnmmwuø nmumnmn >m mcflflflcmswnnmm xmmnmm 10 15 20 450 834 13 Av Tabell 2 framgår att en ökning av bindningskapa- citeten erhålles genom ökning av TBT-koncentrationen från 0,34 g till l g TBT per 100 ml CH2Cl2. Vidare erhålls en ökning av bindningskapaciteten genom förlängning av reaktionstiden med hexametylendiisocyanat. Under optimala betingelser (exempelvis försök 21) kan 35-40 U ureas bindas.

Vidare framgår att under dessa optimala betingelser kunde mängden använd ureas (försök 23-25) minskas med bibehållen hög bindningskapacitet.

För att förhindra eventuella aktivitetsförluster kan det vara lämpligt att tillsätta en fosfatbuffert och EDTA för att undvika ureasdeaktivering. Eventuella tungmetaller i de använda materialen kommer därigenom att komplexbindas med detta EDTA.

INDUSTRIELL ANVÄNDBARHET Sättet enligt uppfinnningen är användbart i flera olika sammanhang där man önskar binda ett biologiskt aktivt protein till en bärare innehållande hydroxylgrupper.

Speciellt användbart är sättet för att binda enzymet ureas till en bärare på basis av cellulosa för användning i samband med extrakorporeal behandling av kroppsvätskor för nedbrytning av urea vid exempelvis dialys av blod.

Claims (6)

l0 15 20 25 30 450 854 PATENTKRAV

1. l. Sätt att binda ett protein till en bärare inne- hållande hydroxylgrupper, varvid en isocyanatförening innehållande åtminstone två isocyanatgrupper i närvaro av ett ämne med förmåga att katalysera uretanbildning bindes till bäraren, varefter proteinet bindes till den på bäraren bundna isocyanatföreningen, k ä n n e t e c k - n a t därav, att såsom nämnda ämne med förmåga att kata- lysera uretanbildning användes ett icke-toxiskt ämne på titanbas, företrädesvis en ortotitansyraester.

2. Sätt enligt krav l, att nämnda ortotitansyraester är en ester innehållande k ä n n e t e c k n a t därav, lågmolekylära alkylgrupper såsom metyl, etyl, n-propyl, i-propyl, n-butyl och isomerer av dessa, företrädesvis tetrabutyltitanat (TBT).

3. Sätt enligt krav 1 eller 2, n a t därav, att nämnda isocyanatförening väljes bland k ä n n e t e c k - di- eller polyisocyanatföreningar med hög kokpunkt och icke-flyktiga förpolymerer av dessa.

4. Sätt enligt krav 3 för bindning av ureas till en bärare på basis av cellulosa, k ä n n e t e c k n a t därav, att nämnda isocyanatförening är en diisocyanat- förening, exempelvis hexametylendiisocyanat, trimetyl- hexametylendiisocyanat, toluendiisocyanat, metylendifenyl- diisocyanat och förpolymerer baserade därpå, företrädesvis hexametylendiisocyanat.

5. Sätt enligt krav 4, att diisocyanatföreningen är löst i ett lösningsmedel som k ä n n e t e c k n a t därav, valts bland diklormetan, eter, aceton och frigen, företrä- desvis diklormetan.

6. Sätt enligt krav 5, att mellan 4 och 12 g diisocyanatförening är löst per 100 ml k ä n n e t e c k n a t därav, diklormetan.