DE4203254A1 - Fluorhaltige kernmagnetische resonanz-sonde und deren verwendung - Google Patents
Fluorhaltige kernmagnetische resonanz-sonde und deren verwendungInfo
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Description
Die Erfindung betrifft fluorhaltige kernmagnetische Resonanz
sonden, deren Verwendung für die Herstellung modifizierter
Biomoleküle sowie deren Verwendung für die kernmagnetische
Resonanzspektroskopie oder die Kernspin-Tomographie.
Sowohl aufgrund der geringen Häufigkeit in biologischen
Systemen als auch aufgrund der hohen Sensitivität der Resonanz-
Signale und des großen Bereichs bezüglich der chemischen
Verschiebung in der kernmagnetischen Resonanz-Spektroskopie (im
folgenden wird die kernmagnetische Resonanz mit NMR abgekürzt),
ist das 19F-Atom hervorragend für Untersuchungen in
biologischen Systemen mittels NMR-Methoden geeignet.
Um biologische Systeme einer Untersuchung durch die 19F-NMR-
Spektroskopie zugänglich zu machen, müssen Fluor-Atome über
spezielle Markierungsverbindungen in das biologische System
eingeführt werden, in dem dann die Markierungsverbindung als
NMR-Sonde dient.
In der Vergangenheit wurden solche Fluor-markierten
Verbindungen in Proteine eingebaut, um über die Markierungs-
Verbindung als Sonde mittels der NMR-Spektroskopie
Informationen über Kinetik, Reaktionsmechanismus, intra- und
intermolekularen Wechselwirkungen und/oder Konformations
änderungen des Proteins zu erhalten.
So wurden zu diesem Zweck von J. W. Shriver und B. D. Sykes,
Biochemistry 21, S. 3022-3028 (1982), N-[4-(Trifluoromethyl)
phenyl]-jodacetamid zur Markierung von Myosin an einer
reaktiven SH-Gruppe des Proteins verwendet, während von
M. Brauer und B. D. Sykes, Biochemistry 25, S. 2187-2191 (1986)
3-Brom-1,1,1-trifluoropropan zur Markierung von Actin verwendet
wurde. Weitere Beispiele von 19F-NMR-Spektroskopie-Sonden und
deren Anwendung zu Protein-Untersuchungen werden beschrieben
von J. A. Barden et al., Biochemistry 28, S. 5895-5901 (1989),
wobei neben dem 3-Brom-1,1,1-trifluoropropan auch das
(Trifluoromethyl)-Quecksilberbromid angewendet wurde, und von
J. A. Barde und L. Philips, Biochemistry 29, S. 1348-1354 (1990),
von denen Pentafluorophenyl-isothiocyanat und [m-(Trifluoro
methyl)phenyl]-Quecksilberbromid zur Markierung eingesetzt
wurden.
Alle diese NMR-Sonden besitzen jedoch den Nachteil, daß die
NMR-Nachweisempfindlichkeit relativ gering ist, so daß bei
19F-NMR-Untersuchungen die erforderliche Substanzmenge relativ
hoch ist oder sensitivere Untersuchungen schlecht möglich sind.
Demnach bestand die Aufgabe der Erfindung, eine fluorhaltige,
kernmagnetische Resonanz (NMR)-Sonde zur Verfügung zu stellen,
die eine im Vergleich zu herkömmlichen 19F-NMR-Sonden höhere
Sensitivität aufweist.
Die Aufgabe wird durch eine fluorhaltige NMR-Sonde gelöst,
welche Perfluoro-tertiär-butyl als Struktureinheit enthält.
Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den
Unteransprüchen wiedergegeben. Weitere Gegenstände der
Erfindung sind die Verwendung der erfindungsgemäßen NMR-Sonde
für die Herstellung modifizierter bzw. markierter Biomoleküle
und die Verwendung für NMR-Methoden, wie die NMR-Spektroskopie
und die Kernspin-Tomographie.
Ausführungsbeispiele der Erfindung werden anhand der Figuren
näher erläutert. Es zeigt
Fig. 1 die Struktur von 4-Perfluoro-tert.-butyl-phenyl
jodacetamid (PFP),
Fig. 2 das 19F-NMR-Spektrum von PFP,
Fig. 3 das 19F-NMR-Spektrum von PFP-markiertem G-Actin, und
Fig. 4 19F-NMR-Spektren in Abhängigkeit der Zeit im Laufe der
Polymersation von PFP-markiertem G-Actin zu F-Actin.
Durch den Perfluoro-tert.-butyl-Rest enthält die NMR-Sonde
mindestens 9 Fluoratome, die an äquivalenten Positionen
lokalisiert sind. Weiterhin sind diese 9 Fluoratome nicht
direkt von Atomen mit Kernspin wie Wasserstoff-Protonen
benachbart, so daß keine Spin-Spin-Wechselwirkung (J-Kopplung)
auftritt. Im Resultat ergibt sich aus dieser Struktureinheit
des Sonden-Moleküls eine einzige, homogene scharfe Kernspin-
Resonanzlinie mit hoher Intensität.
Die erfindungsgemäße NMR-Sonde kann einen Perfluoro-tert.-
butyl-Rest enthalten. Sie kann aber auch mehrere Perfluoro-
tert.-butyl-Reste enthalten, um die Sensitivität der NMR-Sonde
weiter zu erhöhen.
Die erfindungsgemäße NMR-Sonde kann insbesondere noch weitere
Fluoratome enthalten, die ihrerseits wieder an äquivalenten
Positionen im Sonden-Molekül lokalisiert sind und vorzugsweise
nicht von Atomen mit Kernspin benachbart sind.
Der bzw. die Perfluoro-tert.-butyl-Rest(e) kann bzw. können an
jede beliebige organische Verbindung gebunden sein. Vorzugs
weise ist der Perfluoro-tert.-butyl-Rest an ein Phenylrest
gebunden, wobei die Wasserstoffatome des Phenylrests
derivatisiert sein können. Insbesondere enthält die
erfindungsgemäße NMR-Sonde 4-(Perfluoro-tert.-butyl)phenyl als
Struktureinheit.
Weitere geeignete organische Verbindungen umfassen allgemein
Kunststoff-Monomere und -Polymere.
Eine weitere bevorzugte Ausgestaltung der Erfindung besteht
darin, daß die NMR-Sonde strukturelle Einheiten enthält, um die
Sonde einer sogenannten "Reporter"-Funktion in biologischen
Systemen zugänglich zu machen. So kann bzw. können Perfluoro-
tert.-butyl-Rest(e) an Biomoleküle gebunden sein, wobei
natürliche oder auf chemische Weise synthetisch geänderte
Biomoleküle verwendet werden können. Als Biomoleküle eignen
sich beispielsweise Enzymsubstrate, Aminosäuren, Polypeptide,
Proteine bzw. Enzyme, in biologischen Systemen regulierende
Faktoren wie Hormone und sogenannte "Biological Response
Modifiers"; weiterhin Antigene bzw. Haptene, Antikörper,
Nucleotide, Oligonucleotide, Nucleinsäuren (RNA, DNA),
Polysaccharide, Lipide und dergleichen, sowie für die
biologische Funktion der Biomoleküle wesentliche Bestandteile
dieser Biomoleküle.
Wenn der bzw. die Perfluoro-tert.-butyl-Rest(e) an solche
Biomoleküle gekoppelt ist bzw. sind, können diese Konjugate
selbst als NMR-Sonde, beispielsweise als Detektions-Sonde in
Nachweis-Reaktionen, dienen. Auf diese Weise können
beispielsweise bestimmte antigene Strukturen von Perfluoro-
tert.-butyl-markierten Antikörpern nachgewiesen werden.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung besteht darin, daß
die NMR-Sonde mindestens eine Struktureinheit enthält, die
entweder eine funktionelle Gruppe ist, wie beispielsweise eine
Amino-, Thiol-, Carboxy-, Hydroxygruppe, oder die eine auf
solche funktionelle Gruppen reaktive Struktureinheit ist, wobei
als NH2-reaktive Struktureinheiten beispielsweise Isothio
cyanat- oder N-Hydroxysuccinimidestergruppen, als SH-reaktive
Struktureinheiten beispielsweise Quecksilber enthaltende
Gruppen (wie -HgBr), N-Maleimidogruppen, Halogenoacetyl- oder
Halogenoacetamidgruppen, wobei das Halogen vorzugsweise Brom
oder Jod ist, als COOH-reaktive Struktureinheiten beispiels
weise Carbodiimid-aktivierte Aminogruppen und als OH-rektive
Struktureinheiten beispielsweise aktivierte Säureester geeignet
sind.
Gemäß dieser letztgenannten Ausführungsform der Erfindung kann
dann, falls die erfindungsgemäße NMR-Sonde nicht bereits per se
entsprechend gewünschte strukturelle Einheiten enthält, der
bzw. die Perfluoro-tert.-butyl-Rest(e) nach Wahl an beliebige
Verbindungen, wie Kunststoff-Monomere und -Polymere sowie die
oben bereits genannten, natürlichen oder halb-synthetischen
Biomolekülen unter milden Bedingungen gebunden bzw. gekoppelt
werden, so daß eine mit einem oder mehreren Perfluoro-tert.-
butyl-Rest(en) modifizierte bzw. markierte Verbindung erhalten
wird.
Die Kopplung des gemäß der Erfindung Perfluoro-tert.-butyl-
Rest(e) enthaltenden NMR-Sonden-Moleküls an eine der
gewünschten Verbindungen erfolgt dabei über die funktionelle
Gruppe des einen Moleküls und die entsprechenderweise auf diese
funktionelle Gruppe reaktive Struktureinheit des anderen
Moleküls. Wenn sowohl einerseits das erfindungsgemäße NMR-
Sonden-Molekül als auch andererseits die zu markierende
Verbindung funktionelle Gruppen enthalten, erfolgt die Kopplung
geeigneterweise über entsprechende homo- oder hetero
bifunktionelle Vernetzungsreagentien.
Ein 19F-NMR-Sonden-Molekül mit folgender Struktur ist als
Kopplungssubstanz zur Modifizierung bzw. Markierung
verschiedenartiger Verbindungen mit reaktiven Amino- und/oder
Thiolgruppen besonders gut geeignet:
worin - R gleich - N = C = S oder - NH - CO - CH2 - X, wobei X = Halogen, vorzugsweise Br oder J, insbesondere J ist.
Gemäß der Erfindung wird die Perfluoro-tert.-butyl-enthaltende
NMR-Sonde für NMR-Methoden, insbesondere die kernmagnetischen
Resonanz-Spektroskopie und die Kernspin-Tomographie, verwendet.
In biologischen Systemen bzw. für den biochemischen oder
medizinischen Bereich kann die erfindungsgemäße NMR-Sonde als
Nachweisreagens dienen. Die vielfache Verstärkung des 19F-NMR-
Signals durch die Einführung von mindestens 9 äquivalenten
Fluoratomen ermöglicht die Detektion der Sonde, und
gegebenenfalls die Detektion einer mit der Sonde markierten
Verbindung, wie beispielsweise den obenerwähnten Biomolekülen,
in sehr geringen Mengen.
Mit der erfindungsgemäßen NMR-Sonde ist es auch möglich,
zeitabhängige und/oder zeitunabhängige strukturelle
Veränderungen oder enzymatische Prozesse zu verfolgen oder
Wechselwirkungen zwischen Molekülen zu studieren. Weiterhin
können Polymerisationsreaktionen, sowohl in biologischen
Systemen als auch bei der Herstellung synthetischer Polymere
untersucht werden.
Ein sehr attraktives Einsatzgebiet ist die Verwendung von mit
Perfluoro-tert.-butyl-Rest(en) modifizierten, spezifischen
Antikörpern in der Kernspin-Tomographie, um über die
Antikörper-Bindungen an entsprechende Bindungsstellen Tumoren
oder Abszesse zu identifizieren.
Die Erfindung wird nachstehend anhand von Beispielen näher
beschrieben.
(4-Perfluoro-tert.-butyl)-anilin wurde durch Reduktion aus
p-Nitro-(perfluoro-tert.-butyl)-benzol nach L. M. Yagupollskii
et al., Zh. Org. Khim. 9, S. 649 ff. (1973) hergestellt.
Hierzu wurden 17,6 g SnCl2·2H2O in 13 ml konzentrierter HCl
langsam zu einer Lösung von 7,5 g p-Nitro-(perfluoro-tert.-
butyl)-benzol in 30 ml Methanol zugegeben. Das Amin-Rohprodukt
wurde durch langsame Zugabe von 60 ml einer 50%igen
Natriumhydroxidlösung, gefolgt von wiederholter Extraktion mit
Diethylether, isoliert. Die Etherlösung wurde zweimal mit
Wasser gewaschen und über Calciumsulfat getrocknet. Nach
Abdampfen des Lösungsmittels wurde der Rückstand aus Pentan
umkristallisiert, um das gewünschte (4-Perfluoro-tert.-butyl)-
anilin mit einem Schmelzpunkt von 62°C in 80% Ausbeute zu
erhalten.
Zur Synthese des in der Fig. 1 dargestellten PFP wurden 1,53 g
Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) in 20 ml Ethylacetat unter Rühren
bei Raumtemperatur langsam zu in 15 ml Ethylacetat gelösten
27 g Jodessigsäure zugegeben. Nach 2 h wurde das Präzipitat
abgefiltert, und 2,26 g (4-Perfluoro-tert.-butyl)-anilin wurden
zu der Lösung des aktivierten Jodessigsäureanhydrids gegeben.
Die Mischung wurde 2 h gerührt, wonach das Lösungsmittel
entfernt wurde und der Rückstand in Benzol gelöst wurde. Nach
wiederholter Extraktion mit 0,1 N NaOH wurde die Benzollösung
über Natriumsulfat getrocknet und dann, zuletzt im Vakuum,
eingedampft. Der Rückstand wurde zweimal aus Chloroform und n-
Pentan auskristallisiert. Das PFP-Produkt hat eine Schmelzpunkt
von 163°C; die Dünnschichtchromatographie (Kieselgel/ Methylen
chlorid : n-Hexan 9 : 1) zeigt einen einzelnen Fleck. Die
Massenspektroskopie zeigt Mz-Werte von 479 (100%), 460 (10%),
324 (16%) und 311 (96%), entsprechend zu C12H7F9NJ = 479. Das
¹H-NMR-Spektrum (Acetonitril- D2O (1 : 1)) ergab das für die
Phenyl- jodacetamid-gruppe erwartete Signalmuster.
Das in Fig. 2 dargestellte 19F-NMR-Spektrum (Bruker AM-500
NMR-Spektrometer; 470,5 MHz; 308°K) von PFP in Acetonitril- D2O
(1 : 1) zeigt eine einzige Resonanzlinie mit einer Linienbreite
von 2,4 Hz bei einer chemischen Verschiebung von 16,05 ppm
gegenüber Trifluorethanol als internem Standard.
Gemäß H. G. Mannherz et al., Eur. J. Biochem. 10f, 367 ff. (1980)
aus skelettalem Kaninchenmuskel isoliertes F-Actin wurde in
Puffer A (0,1 M KCI, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,2 mM ATP, 0,2 mM
CaCl2 und 0,01 mM NaN3) gelöst. Die in Dimethylformamid
gelöste NMR-Sonde PFP wurde nach und nach mit Puffer A so
verdünnt, daß eine Endkonzentration an Dimethylforamid von
weniger als 0,5% erhalten wurde. Die verdünnte NMR-Sonde wurde
tropfenweise unter Rühren zu der F-Actinlösung zugegeben, um
einen 10fachen molaren Überschuß der Markierungssubstanz über
Actin zu erhalten. Nach Inkubation für 24 h bei 0°C wurde die
Mischung bei 150 000 g für 1,5 h zentrifugiert, und das F-
Actin-Pellet wurde in 2 mM Tris-HCl, pH 7,8, 0,2 mM ATP, 0,2 mM
CaCl2, 0,01 mM NaN3 homogenisiert. Das Homogenat wurde dann
extensiv gegen eine Pufferlösung von 5 mM HEPES (4-(2-
hydroxyethal)-1-piperazin-sulfonsäure), 2 mM ATP, 0,2 mM CaCl2,
0,5 mM NaN3 dialysiert, um depolymerisiertes F-Actin zu
erhalten.
Fig. 3 zeigt ein 19F-NMR-Spektrum (gleiche NMR-Meßbedingungen
wie in Beispiel 1) von PFP-markiertem, monomerem G-Actin (MG
42 000) bei einer Protein-Konzentration von 74 µm in 4 mM
Hepes, 1,8 mM ATP, 0,16 mM CaCl2, 0,4 mM NaN3 (Meßvolumen 2,5
ml Wasser mit 20% D2O). Eine Integration über 1000 Scanläufe
bei exponentieller Linienverbreiterung von 5 Hz (Fig. 3 oben)
zeigt eine Gruppe von Fluor-Signalen zwischen 13,5 und 13,8 ppm
mit Linienbreiten von etwa 9 Hz, die eine intensivste Linie A
bei 13,67 ppm und vier weitere Resonanzlinien (Linie B bei
13,59 ppm, Linie C bei 13,61 ppm, Linie D bei 13,75 ppm und
Linie E bei 13,72 ppm) mit schwächeren Intensitäten umfaßt. Das
Verhältnis der Intensitäten der Linien B, C, D und E relativ
zur Linie A beträgt, in dieser Reihenfolge, 0,4, 0,2, 0,06 und
0,04. Bei der Proteinkonzentration von 74 µM sind die drei
intensivsten Linien bereits nach einem einzigen Scanlauf
(exponentielle Linienverbreiterung 5 Hz) eindeutig zu erkennen
(Fig. 3 unten). Aus diesen Daten kann abgeschätzt werden, daß
bei hintereinander ausgeführten Scanläufen des 19F-NMR-
Spektrums mit Akkumulationszeiten von etwa einer Stunde das mit
der erfindungsgemäßen 19F-NMR-Sonde markierte G-Actin noch in
einer Konzentration im Bereich von 1 µM, entsprechend 0,4 nMol
in 2,5 ml Meßvolumen, detektiert werden kann.
Die 5 erhaltenen Resonanzlinien von mit PFP markiertem G-Actin
korrespondiert mit der Zahl der an den Aminosäure-Positionen
10, 217, 257, 285 und 374 lokalisierten Cystein-Resten des
Proteins, wobei die unterschiedlichen chemischen Verschiebungen
von unterschiedlichen chemischen Umgebungen dieser Cystein-
Reste im Actin-Molekül herrühren dürften. Die unterschiedlichen
Intensitäten der Resonanzlinien sind durch die
unterschiedlichen Zugänglichkeiten der genannten Cystein-Reste
erklärbar. Es ist nämlich bekannt, daß Cys-374 im sphärischen
Proteinmolekül frei zugänglich ist, während Cys-10 und Cys-257
weniger zugänglich sind, und Cys-217 und Cys-285 ganz im
Proteininneren begraben sind.
Die Polymerisation von PFP-markiertem G-Actin zu F-Actin wurde
durch Zugabe von 30 mM KCl bewirkt, und der Fortgang der
Polymerisation wurde durch 19F-NMR-Spektren (100 Scanläufe pro
Spur, entsprechend einer Aufzeichnungszeit von 2,7 min pro
Spektrum; exponentielle Linienverbreiterung 4 Hz) in
Abhängigkeit der Zeit untersucht. Wie Fig. 4 zeigt,
verbreitern sich die Resonanz-Linien der NMR-Sonde im Laufe der
Zeit, während die Signale gleichzeitig kleiner werden, bis
diese nach 30 min vollständig verschwunden sind. Genau dieses
Ergebnis ist bei der ablaufenden Polymerisation zu erwarten, da
im Laufe der Polymerisation die Sonde im Makromolekül
immobilisiert wird und keine freie Rotation der Sonden-Moleküle
an den Markierungsstellen des Actins möglich ist, d. h. die
effektive Rotations-Korrelationszeit stark zunimmt. Die
Resonanz-Linienbreite (und -Intensität) ist also ein Maß für
die effektive Rotations-Korrelationszeit der Sonden-Moleküle
und damit für die Struktur bzw. den Polymerisationsgrad des
Actins.
Claims (11)
1. Fluorhaltige, kernmagnetische Resonanz-Sonde, dadurch
gekennzeichnet, daß die Sonde Perfluoro-tertiär-butyl als
Struktureinheit enthält.
2. Kernmagnetische Resonanz-Sonde nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß die Sonde 4-(Perfluoro-tertiär-butyl)-
phenyl als Struktureinheit enthält.
3. Kernmagnetische Resonanz-Sonde nach Anspruch 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet, daß die Sonde weitere Fluoratome an
äquivalenten Positionen enthält.
4. Kernmagnetische Resonanz-Sonde nach einem der Ansprüche 1
bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Sonde weiterhin
mindestens eine funktionelle Gruppe enthält.
5. Kernmagnetische Resonanz-Sonde nach einem der Ansprüche 1
bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Sonde weiterhin
mindestens eine auf funktionelle Gruppen reaktive
Struktureinheit enthält.
6. Kernmagnetische Resonanz-Sonde nach Anspruch 1,
gekennzeichnet durch folgende Struktur
worin - R gleich - N = C = S oder - NH - CO - CH2 - X,
wobei X = Halogen, vorzugsweise Br oder J, insbesondere J ist.
7. Kernmagnetische Resonanz-Sonde nach einem der
vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Sonde
als weitere Struktureinheit ein Biomolekül enthält.
8. Kernmagnetische Resonanz-Sonde nach einem der
vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Sonde
als weitere Struktureinheit ein Kunststoff-Monomer oder ein
Kunststoff-Polymer enthält.
9. Verwendung der kernmagnetischen Resonanz-Sonde nach einem
der vorhergehenden Ansprüche für die Kernmagnetische Resonanz-
Spektroskopie.
10. Verwendung der kernmagnetischen Resonanz-Sonde nach einem
der Ansprüche 1 bis 7 für die Kernspin-Tomographie.
11. Verwendung der kernmagnetischen Resonanz-Sonde nach einem
der Ansprüche 4 bis 6 für die Herstellung modifizierter
Biomoleküle oder für die Herstellung modifizierter Kunststoff-
Monomere und Kunststoff-Polymere.
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