JP7134444B2 - テイ-サックス病及びザンドホッフ病治療用の新規アデノ随伴ウイルスビリオン - Google Patents
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Description
前記キャプソメア内にパッケージングされたポリヌクレオチドであって、プロモーター配列と、前記プロモーター配列と作動可能に連結される、野生型ヒトβ-ヘキソサミニダーゼのβ-サブユニットの配列番号28の第55番目~第556番目のアミノ酸配列において、第312番目~第318番目のアミノ酸が、それぞれ順に、グリシン、セリン、グルタミン酸、プロリン、セリン、グリシン、及び、トレオニンに置換されている第1アミノ酸配列、並びに、前記第1アミノ酸配列のN末端側に連結されたシグナルペプチドのアミノ酸配列である第2アミノ酸配列をコードする塩基配列とを含むポリヌクレオチド
を含む、組換えアデノ随伴ウイルスビリオン。
(2)前記第1アミノ酸配列が、配列番号28の第55番目~第556番目のアミノ酸配列において、さらに、第452番目のアミノ酸がアスパラギンに、及び/又は、第453番目のアミノ酸がアルギニンに置換されているアミノ酸配列である、(1)に記載のウイルスビリオン。
(3)前記第1アミノ酸配列が、
(A)配列番号25の第31番目~第532番目のアミノ酸配列;
(B)配列番号25の第31番目~第532番目のアミノ酸配列において、前記置換部位のアミノ酸を除く1から数個のアミノ酸が欠失、置換、又は、付加されたアミノ酸配列であって、野生型ヒトβ-ヘキソサミニダーゼのα-サブユニット由来の活性を有し、且つ、プロテアーゼに対する抵抗性を有するタンパク質に含まれるアミノ酸配列;並びに
(C)配列番号25の第31番目~第532番目のアミノ酸配列と少なくとも90%以上の同一性を有するアミノ酸配列であって、野生型ヒトβ-ヘキソサミニダーゼのα-サブユニット由来の活性を有し、且つ、プロテアーゼに対する抵抗性を有するタンパク質に含まれるアミノ酸配列(ただし、前記置換部位のアミノ酸は配列番号:25で示されるアミノ酸配列と同一である)
より選択されるいずれかのアミノ酸配列を含む、(2)に記載のウイルスビリオン。
(4)前記第2アミノ酸配列が、配列番号25の第1番目~30番目のアミノ酸配列、又は、配列番号28の第1番目~第54番目のアミノ酸配列である、(1)~(3)のいずれかに記載のウイルスビリオン。
(5)前記ポリヌクレオチドの5’末端及び3’末端が、それぞれ、AAV1、AAV2、AAV3又はAAV4に由来する5’末端及び3’末端のインバーテッドターミナルリピート(ITR)配列を含む、(1)~(4)のいずれかに記載のウイルスビリオン。
(6)前記ポリヌクレオチドの5’末端及び3’末端が、それぞれ配列番号:13及び配列番号:14の塩基配列を含む、(1)~(5)のいずれかに記載のウイルスビリオン。
(7)前記プロモーター配列が、全身性プロモーター又は神経系細胞特異的プロモーターの配列である、(1)~(6)のいずれかに記載のウイルスビリオン。
(8)前記プロモーター配列が、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、EF-1αプロモーター、SV40プロモーター及びCAGプロモーターからなる群より選択される全身性プロモーターの配列である、(7)に記載のウイルスビリオン。
(9)前記プロモーター配列が、シナプシンIプロモーター配列、ミエリン塩基性タンパク質プロモーター配列、ニューロン特異的エノラーゼプロモーター配列、カルシウム/カルモジュリン-依存性蛋白キナーゼII(CMKII)プロモーター、チュブリンαIプロモーター、血小板由来成長因子β鎖プロモーター、グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)プロモーター配列、L7プロモーター配列(小脳プルキンエ細胞特異的プロモーター)、及びグルタミン酸受容体デルタ2プロモーター(小脳プルキンエ細胞特異的プロモーター)からなる群より選択される神経系細胞特異的プロモーターの配列である、(7)に記載のウイルスビリオン。
(10) 前記ウイルスビリオンを形成可能なタンパク質が、1型、2型、3型、9型、rh10型、PHP.B型又はPHP.eB型のアデノ随伴ウイルスに由来するVP1カプシドタンパク質のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列、或いは、前記VP1カプシドタンパク質のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列において、少なくとも1つの表面露出チロシン残基が他のアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列を含むタンパク質である、(1)~(9)のいずれかに記載のウイルスビリオン。
(11)前記ウイルスビリオンを形成可能なタンパク質が、配列番号:2、4若しくは6のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列において、少なくとも1つの表面露出チロシン残基が他のアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列を含むタンパク質である、(1)~(10)のいずれかに記載のウイルスビリオン。
(12)前記ウイルスビリオンを形成可能なタンパク質が、少なくとも、配列番号:2において445位のチロシン残基、配列番号:4において444位のチロシン残基、又は配列番号:6において446位のチロシン残基が置換されているアミノ酸配列を含む、(11)に記載のウイルスビリオン。
(13)前記チロシン残基がフェニルアラニン残基に置換されている、(10)~(12)のいずれかに記載のウイルスビリオン。
(14)前記ウイルスビリオンを形成可能なタンパク質が、配列番号:8、10若しくは12のアミノ酸配列、又は配列番号:8、10若しくは12のアミノ酸配列の444~446位以外の位置に1~数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入及び/若しくは付加を含むアミノ酸配列を含み、ウイルスビリオンを形成可能である、(1)~(13)のいずれかに記載のウイルスビリオン。
(15)(1)~(14)のいずれかに記載のウイルスビリオンを含む医薬組成物。
(16)テイ-サックス病及び/又はザンドホッフ病の治療のための、(15)に記載の医薬組成物。
(17)テイ-サックス病及び/又はザンドホッフ病を治療する方法であって、
テイ-サックス病及び/又はザンドホッフ病の治療を必要とする患者に(1)~(14)のいずれかに記載のウイルスビリオンを投与することを含む方法。
(18)前記患者に前記ウイルスビリオンを末梢投与、脳内投与又は髄腔内投与することを含む、(17)に記載の方法。
(19)前記患者が母体中の胎児であり、前記ウイルスビリオンを前記母体に末梢投与することを含む、(17)に記載の方法。
(20)テイ-サックス病及び/又はザンドホッフ病の治療に用いるための、(1)~(14)のいずれかに記載のウイルスビリオン。
(21)テイ-サックス病及び/又はザンドホッフ病の治療を必要とする患者に末梢投与、脳内投与又は髄腔内投与される、(20)に記載のウイルスビリオン。
(22)テイ-サックス病及び/又はザンドホッフ病の治療を必要とする患者が母体中の胎児であり、前記母体に末梢投与される、(20)に記載のウイルスビリオン。
(23)テイ-サックス病及び/又はザンドホッフ病の治療のための医薬の製造における、(1)~(14)のいずれかに記載のウイルスビリオンの使用。
(24)前記医薬が、テイ-サックス病及び/又はザンドホッフ病の治療を必要とする患者に末梢投与、脳内投与又は髄腔内投与される医薬である、(23)に記載の使用。
(25)前記医薬が、テイ-サックス病及び/又はザンドホッフ病の治療を必要とする患者が母体中の胎児であり、前記母体に末梢投与される医薬である、(24)に記載の使用。
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2018-011705号の開示内容を包含する。
本発明の組換えアデノ随伴ウイルスビリオンを含む医薬組成物は、ザンドホッフ病及びテイ-サックス病の治療に用いることができる。
野生型ヒトβ-ヘキソサミニダーゼのβ-サブユニットは、配列番号28の第55番目~第556番目のアミノ酸配列と、そのN末端側に連結されたシグナルペプチドのアミノ酸配列とを含む未成熟タンパク質として発現し、シグナルペプチドが外れて成熟タンパク質となり機能する。野生型ヒトβ-ヘキソサミニダーゼのβ-サブユニットのシグナルペプチドのアミノ酸配列としては、配列番号28の第1番目~第54番目のアミノ酸配列が挙げられる。すなわち、野生型ヒトβ-ヘキソサミニダーゼのβ-サブユニットは、未成熟段階では、配列番号28に示すアミノ酸配列を含む。
α-サブユニット由来の活性を獲得するためのβ-サブユニットの活性部位の構造変化は、WO2010/082622に詳述される手法に基づいて行うことができる。
(a)下記(i)~(iv)のいずれかのアミノ酸配列:
(i)配列番号28の第55番目~第556番目のアミノ酸配列において、第312番目~第318番目のアミノ酸がそれぞれ順に、グリシン、セリン、グルタミン酸、プロリン、セリン、グリシン、及びトレオニンに置換されたアミノ酸配列;
(ii)配列番号28の第55番目~第556番目のアミノ酸配列において、第312番目~第318番目のアミノ酸がそれぞれ順に、グリシン、セリン、グルタミン酸、プロリン、セリン、グリシン、及びトレオニンに置換され、且つ、452番目のアミノ酸がアスパラギンに置換されたアミノ酸配列;
(iii)配列番号28の第55番目~第556番目のアミノ酸配列において、第312番目~第318番目のアミノ酸がそれぞれ順に、グリシン、セリン、グルタミン酸、プロリン、セリン、グリシン、及びトレオニンに置換され、且つ、453番目のアミノ酸がアルギニンに置換されたアミノ酸配列;又は
(iv)配列番号28の第55番目~第556番目のアミノ酸配列において、第312番目~第318番目のアミノ酸がそれぞれ順に、グリシン、セリン、グルタミン酸、プロリン、セリン、グリシン、及びトレオニンに置換され、且つ、452番目のアミノ酸がアスパラギンに置換され、且つ、453番目のアミノ酸がアルギニンに置換されたアミノ酸配列;あるいは、
(b)上記(i)~(iv)のいずれかのアミノ酸配列において前記置換部位のアミノ酸を除く1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ野生型ヒトβ-ヘキソサミニダーゼのα-サブユニット由来の活性を有し、且つ、プロテアーゼに対する抵抗性を有するタンパク質に含まれるアミノ酸配列;あるいは、
(c)上記(i)~(iv)のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列(ただし、前記置換部位のアミノ酸は配列番号25で示されるアミノ酸配列と同一である)であって、かつ野生型ヒトβ-ヘキソサミニダーゼのα-サブユニット由来の活性を有し、且つ、プロテアーゼに対する抵抗性を有するタンパク質に含まれるアミノ酸配列。
本発明の組換えアデノ随伴ウイルスビリオンが含むポリヌクレオチドは、上記の第1アミノ酸配列並びに第2アミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。
上記の第1アミノ酸配列をコードする塩基配列としては、例えば、以下の(a)又は(b)の塩基配列が挙げられる。
(i)配列番号27の第163番目~第1671番目の塩基配列において、第934番目~第936番目の塩基、第937番目~第939番目の塩基、第940番目~第942番目の塩基、第943番目~第945番目の塩基、第946番目~第948番目の塩基、第949番目~第951番目の塩基、及び、第952番目~第954番目の塩基が、それぞれ順に、グリシン、セリン、グルタミン酸、プロリン、セリン、グリシン、及びトレオニンのコドンを示す塩基に置換された塩基配列;
(ii)配列番号27の第163番目~第1671番目の塩基配列において、第934番目~第936番目の塩基、第937番目~第939番目の塩基、第940番目~第942番目の塩基、第943番目~第945番目の塩基、第946番目~第948番目の塩基、第949番目~第951番目の塩基、及び、第952番目~第954番目の塩基が、それぞれ順に、グリシン、セリン、グルタミン酸、プロリン、セリン、グリシン、及びトレオニンのコドンを示す塩基に置換され、且つ、第1354番目~第1356番目の塩基がアスパラギンのコドンを示す塩基に置換された塩基配列;
(iii)配列番号27の第163番目~第1671番目の塩基配列において、第934番目~第936番目の塩基、第937番目~第939番目の塩基、第940番目~第942番目の塩基、第943番目~第945番目の塩基、第946番目~第948番目の塩基、第949番目~第951番目の塩基、及び、第952番目~第954番目の塩基が、それぞれ順に、グリシン、セリン、グルタミン酸、プロリン、セリン、グリシン、及びトレオニンのコドンを示す塩基に置換され、且つ、第1357番目~第1359番目の塩基がアルギニンのコドンを示す塩基に置換された塩基配列;
(iv)配列番号27の第163番目~第1671番目の塩基配列において、第934番目~第936番目の塩基、第937番目~第939番目の塩基、第940番目~第942番目の塩基、第943番目~第945番目の塩基、第946番目~第948番目の塩基、第949番目~第951番目の塩基、及び、第952番目~第954番目の塩基が、それぞれ順に、グリシン、セリン、グルタミン酸、プロリン、セリン、グリシン、及びトレオニンのコドンを示す塩基に置換され、且つ、第1354番目~第1356番目の塩基がアスパラギンのコドンを示す塩基に置換され、且つ、第1357番目~第1359番目の塩基がアルギニンのコドンを示す塩基に置換された塩基配列。
(b)上記(i)~(iv)のいずれかの塩基配列に対し相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAに含まれる塩基配列であって、前記置換部位の塩基に対応する塩基が当該置換部位の塩基と同一であり、かつ野生型ヒトβ-ヘキソサミニダーゼのα-サブユニット由来の活性を有し、且つ、プロテアーゼに対する抵抗性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
本発明の組換えアデノ随伴ウイルスビリオンは、
ウイルスビリオンを形成可能なタンパク質を含むキャプソメア、並びに、
前記キャプソメア内にパッケージングされたポリヌクレオチドであって、プロモーター配列と、前記プロモーター配列と作動可能に連結される、前記第1アミノ酸配列並びに前記第2アミノ酸配列をコードする塩基配列とを含むポリヌクレオチド
を含むことを特徴とする。
以下に、本発明の組換えアデノ随伴ウイルスビリオンの特徴について説明する。
天然のアデノ随伴ウイルス(AAV)は非病原性ウイルスである。この特徴を利用して、種々の組換ウイルスベクターを作製して、遺伝子治療のために所望の遺伝子を送達することが行われている(例えば、WO2003/018821、WO2003/053476、WO2007/001010、薬学雑誌126(11)1021-1028などを参照のこと)。野生型AAVゲノムは、全長が約5kbのヌクレオチド長を有する一本鎖DNA分子であり、センス鎖またはアンチセンス鎖である。AAVゲノムは、一般に、ゲノムの5’側および3’側の両末端に約145ヌクレオチド長のインバーテッドターミナルリピート(ITR)配列を有する。このITRは、AAVゲノムの複製起点としての機能及びこのゲノムのビリオン内へのパッケージングシグナルとしての機能等の多様な機能を有することが知られている(例えば、上記の文献である薬学雑誌126(11)1021-1028などを参照のこと)。ITRに挟まれた野生型AAVゲノムの内部領域(以下、内部領域)は、AAV複製(rep)遺伝子及びカプシド(cap)遺伝子を含む。これらrep遺伝子及びcap遺伝子は、それぞれ、ウイルスの複製に関与するタンパク質Rep及び正20面体構造の外殻であるキャプソメアを形成するカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2及びVP3の少なくとも1つ)をコードする。さらなる詳細については、例えば、Human Gene Therapy,13,pp.345-354,2002、Neuronal Development 45,pp.92-103,2001、実験医学20,pp.1296-1300,2002、薬学雑誌126(11)1021-1028、Hum Gene Ther,16,541-550,2005などを参照のこと。
本発明のrAAVビリオンが含むカプシドタンパク質は、好ましくは、AAV1、AAV2、AAV9、AAV-rh10、AAV-PHP.B又はAAV-PHP.eBに由来するVP1カプシドタンパク質であり、より好ましくは、AAV1、AAV2、AAV9、AAV-rh10、AAV-PHP.B又はAAV-PHP.eBに由来するVP1カプシドタンパク質のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列、或いは、前記VP1カプシドタンパク質のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列において、表面露出チロシン残基(例えば、ウイルスビリオン表面にアミノ酸側鎖が露出されているチロシン残基)の少なくとも1つが別のアミノ酸に置換されたものである。これらのカプシドタンパク質を含む本発明のrAAVビリオは胎児、新生児、成人における血液脳関門を通過し易い。特に好ましい実施形態では、本発明のrAAVビリオンが含むカプシドタンパク質は、VP1アミノ酸配列(例えば配列番号:2、4又は6)において、表面露出チロシン残基(例えば、ウイルスビリオン表面にアミノ酸側鎖が露出されているチロシン残基)の少なくとも1つが別のアミノ酸に置換される。このようなタンパク質としては、配列番号:2、4又は6のアミノ酸配列と約90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.1%以上、99.2%以上、99.3%以上、99.4%以上、99.5%以上、99.6%以上、99.7%以上、99.8%以上、99.9%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、表面露出されるチロシン残基の少なくとも1つが別のアミノ酸に置換されており、かつウイルスビリオンを形成できるタンパク質が挙げられる。上記数値は一般的に大きい程好ましい。本発明のrAAVビリオンに含まれるカプシドタンパク質は、単独で又は他のカプシドタンパク質メンバー(例えば、VP2および/またはVP3など)と一緒になってキャプソメアを形成し、該キャプソメア内にAAVゲノム(又はAAVベクターゲノム)がパッケージングされている本発明のrAAVビリオンを形成できる。相互に置換可能なアミノ酸残基としては、その残基が属する類似アミノ酸残基の群(後述)内に含まれる他の残基が挙げられる。相互に置換可能なアミノ酸残基によって改変されたカプシドタンパク質は、通常の遺伝子操作技術など、当業者に公知の方法に従って作製することができる。このような遺伝子操作手順については、例えば、Molecular Cloning 3rd Edition,J.Sambrook et al.,Cold Spring Harbor Lab.Press.2001、Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons 1987-1997などを参照することができる。
本発明のrAAVビリオン中にパッケージングされる組換えアデノ随伴ウイルスポリヌクレオチド(以下、本発明のrAAVゲノム)は、野生型AAVゲノムの5’側および3’側に位置するITRの間に位置する内部領域(すなわち、rep遺伝子及びcap遺伝子の一方または両方)のポリヌクレオチドを、上記の目的塩基配列を含むポリヌクレオチド(治療用遺伝子)およびこのポリヌクレオチドを転写するためのプロモーター配列などを含む遺伝子カセットによって置換することにより作製できる。好ましくは、5’側および3’側に位置するITRは、それぞれAAVゲノムの5’末端および3’末端に位置する。本発明のrAAVゲノムは、5’末端および3’末端に位置するITRとして、好ましくは、AAV1、AAV2、AAV3またはAAV9のゲノムに含まれる5’側ITRおよび3’側ITRを含み、より好ましくは、AAV3のゲノムに含まれる5’側ITRおよび3’側ITRを含み、特に好ましくは、5’側のITRとして配列番号:13のポリヌクレオチドを含み、3’側ITRとして配列番号:14のポリヌクレオチドを含む。一般的に、ITR部分は容易に相補配列が入れ替わった配列(flip and flop structure)をとるため、本発明のrAAVゲノムに含まれるITRは、5’と3’の方向が逆転していてもよい。本発明のrAAVゲノムにおいて、内部領域と置き換えられる遺伝子カセットの長さは、元のポリヌクレオチドの長さと同程度が実用上好ましい。すなわち、本発明のrAAVゲノムは、全長が野生型の全長である5kbと同程度、例えば約2~6kb、好ましくは約4~6kbであることが好ましい。
本発明の別の実施形態において、本発明のrAAVビリオンを調製する方法が提供される。この方法は、(a)本発明のカプシドタンパク質をコードする第1のポリヌクレオチド(一般に、AAVヘルパープラスミドと称される)、および(b)本発明のrAAVビリオン内にパッケージングされる第2のポリヌクレオチド(目的塩基配列を含む)を、培養細胞にトランスフェクトする工程を含むことができる。本発明における調製方法はさらに、(c)アデノウイルス(AdV)ヘルパープラスミドと称されるアデノウイルス由来因子をコードするプラスミドを培養細胞にトランフェクトする工程、またはアデノウイルスを培養細胞に感染させる工程も含むことができる。さらに、上記のトランスフェクトされた培養細胞を培養する工程、および培養上清より組換えアデノ随伴ウイルスベクターを収集する工程を含むこともできる。このような方法は既に公知であり、本明細書の実施例においても利用される。
本発明のさらなる実施形態において、本発明のrAAVビリオン(rAAVベクター)を含む医薬組成物が提供される。本発明のrAAVビリオンを含む医薬組成物(以下、本発明の医薬組成物という)を利用することによって、被検体の細胞に高い効率で、目的とするβ-ヘキソサミニダーゼの改変型β-サブユニットの遺伝子を導入可能であり、この導入される遺伝子によって、テイ-サックス病及び/又はザンドホッフ病を治療できる方法を提供する。本発明のrAAVビリオンは、生体の血液脳関門を通過可能であるので、被検体に末梢投与することによって、本発明のrAAVビリオンを脳、脊髄、網膜などの神経系細胞に遺伝子の送達が可能である。また本発明のrAAVビリオンは、脳内投与又は髄腔内投与によっても脳、脊髄などの神経系細胞に遺伝子の送達が可能である。
1. AAV-CMV-modHEXBの脳室内投与によるSandhoff病(Hexb-/-)モデルマウス(Hexa及びHexb同時欠損)に対する有効性評価
1.1. AAV-CMV-modHEXBのSandhoff病モデル(SD)マウス脳室内投与後の脳及び各臓器におけるβ-ヘキソサミニダーゼ(Hex)活性発現
15週齢のSandhoff病モデルマウス(SDマウス)(発症後期)の脳室内にAAV-CMV-modHEXB(別名AAV-CMV-mod2B)5.75×1011vg/25μL PBS(リン酸緩衝液)を一回投与し、1週間後に各臓器を摘出し、プロテアーゼ/フォスファターゼ阻害剤カクテル(終濃度20μMロイペプチン、2mMEDTA、1mMPMSF、1mMペプスタチンA)含有蒸留水(milliQレベル)(組織湿重量100mg/0.3mL)中で、ソニケーション(プローブ型ソニケーター及び湯浴式シニケーター10分)で組織を破砕した。4℃、12,000 x gで15分の遠心分離後の上清(組織抽出液)を調製した。なお、SDマウスに対するベクター量5.75×1011vg/匹は、概ね1.9×1013vg/kg体重に相当する。
ヒトmodHexBに対するウエスタンブロット解析では、実験1.1.で得た各組織抽出液の一定量(各10μg)を試料として15%ポリアクリルアミドゲルを用いるSDS-電気泳動(SDS-PAGE)(定電流15mA)を行った。泳動後のゲルを、定電圧15VでPVDF膜に転写後、膜をブロッキング剤で1時間処理した。抗ヒトHexA(αβ)ウサギポリクローナル抗体NAG(A)を一次抗体(1,000倍希釈液)で4℃一晩処理、Tris緩衝液で洗浄後、二次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗ウサギIgG抗体で処理、洗浄後、化学発光キットを用い、LAS4000mini(GEHealthcare)でヒトmodHexBタンパク質を検出した。
実験1.1.での各臓器の抽出液中のMUG分解比活性の測定結果を図1上段のグラフに示し、実験1.2.での各臓器の抽出液中のタンパク質のウエスタンブロット解析の結果を図1下段の写真に示す。大脳、脳幹、心臓、肝臓では、改変型Hexβ鎖前駆体タンパク質が検出された。AAV-CMV-modHEXBの脳室内投与による遺伝子導入効果が確認された。
15週齢のSDマウスの脳室内にAAV-CMV-modHEXB 5.75×1011vg/25μL PBS(リン酸緩衝液)を一回投与し、1週間後に摘出した脳の凍結切片を作成し、ガラスプレパラートに付着乾燥後、4%パラフォルムアルデヒド/PBS溶液で室温1時間固定した。PBSで洗浄後、5%ヤギ血清/PBS、室温で1時間ブロッキングを行った。
免疫蛍光した封入脳切片についてはBIOREVO(Keyence社)装置を用いて、観察した。
15週齢のSandhoff病モデルヘテロマウス(Hexb+/-,n=1)にAAV-CMV-GFP 5.5×1011vgを脳室内投与(25μL)し、1週間後に摘出、凍結脳切片作製したのち、BIOREVO装置を用いてEGFP(Ex=488nm,Em=514nm)による蛍光観察した。なお、神経系細胞マーカーとして、NEUN(神経細胞マーカー)、GFAP(アストロサイトマーカー)及びIba1(ミクログリアマーカー)に対する一次抗体と蛍光標識二次抗体(Alexa544-anti-rabbitIgG)による免疫蛍光染色を行い、GFPが発現した細胞タイプを解析した。
上記の、15週齢のSDマウス(発症後期)の脳室内にAAV-CMV-modHEXB(別名AAV-CMV-mod2B)5.75×1011vg/25μL PBS(リン酸緩衝液)を単回投与、1週間後(16週齢時)に各臓器におけるmodHexBの発現解析に加え、
14週齢(発症後期)SDマウスにAAV-CMV-modHEXB 5.75×1011vg/25μL PBS(リン酸緩衝液)脳室内単回投与、1週間後(15週齢時)、及び
10週齢(発症前期)SDマウスにAAV-CMV-modHEXB 5.75×1011vg/25μL PBS(リン酸緩衝液)脳室内単回投与、5週間後(15週齢時)の、各臓器でのmodHexBの発現解析を行った。 各臓器でのmodHexBの発現は、MUG分解活性の回復を指標とする上記1.1.に記載の手順により評価した。
10週齢(発症前期)SDマウスにAAV-CMV-modHEXBを各5.75×109vg、3.45x1010vg及び5.75×1011vg/25μL PBS(リン酸緩衝液)の投与量で、脳室内単回投与し、5週間後(15週齢時)の各臓器でのmodHexBの発現解析を行った。
各臓器でのmodHexBの発現は、MUG分解活性の回復を指標とする上記1.1.に記載の手順により評価した。
結果を図6(図6では、5.75×109vg及び5.75×1011vg単回投与の結果を示す)に示す。10週齢(発症前期)SDマウスにAAV-CMV-modHEXBを投与する場合、上記のいずれの投与量でも、各臓器において、野生型マウス(WT)と同程度のmodHexB活性が認められた。
実験2では、15週齢Sandhoff病ヘテロマウスにAAV-CMV-GFP5.5×1011vg/匹で脳室内投与すると、1週間後に投与部位近傍における発現GFPによる緑色蛍光が観察された。脳脊髄液に投与されたAAVベクターが脳実質構成細胞に導入され、細胞内でGFP遺伝子がCMVβプロモーター制御下で発現した。
5.1. Sandhoff病モデルマウスの脳室内への、AAV-CMV-modHEXB単回投与による各臓器でのHex(MUG分解)活性回復
8週齢SDマウスの脳室内に、AAV-CMV-modHEXBを5.75×1011vg/匹で単回投与した後、17週齢時点で解剖し、各臓器でのHex(MUG分解)活性を測定した。実験の手順は実験1~3と同様である。
結果を図7に示す。比較のために野生型マウス(WT)及びSDマウス(SD)についての活性測定結果も示す。脳では、大脳と脳幹で、末梢では心臓で顕著なHex活性回復が認められた。
8週齢SDマウスの脳室内に、AAV-CMV-modHEXBを5.75×1011vg/匹で単回投与した後、17週齢時点で解剖し脳切片を免疫染色した。実験の手順は実験1~3と同様である。免疫染色は実験1.3.に記載の手順で行った。
図8に、野生型マウス(WT)の脳切片、SDモデルマウス(SD)の脳切片、SDモデルマウスの脳室内へのAAV-CMV-modHEXB投与後(AAV)の脳切片の、各部位(大脳、小脳、海馬)における、ヒトmodHEXB酵素タンパク質(一次抗体としてNAG(A)を使用、赤)、GM2ガングリオシド(一次抗体として抗GM2抗体を使用、緑)、細胞核(Hoechist染色、青)の免疫蛍光組織化学的解析の結果を示す。野生型マウス(WT)の脳切片の各部位はいずれも、ヒトmodHEXB酵素タンパク質が僅かに陽性(マウスHexの交差染色)、GM2ガングリオシドが陰性、Hoechist染色陽性であった。SDモデルマウス(SD)の脳切片の各部位はいずれも、ヒトmodHEXB酵素タンパク質が陰性、GM2ガングリオシドが陽性、Hoechist染色陽性であった。SDモデルマウスの脳室内へのAAV-CMV-modHEXB投与後(AAV)の脳切片の各部位はいずれも、ヒトmodHEXB酵素タンパク質が陽性、GM2ガングリオシドが僅かに陽性、Hoechist染色陽性であった。SDマウスではGM2ガングリオシドが脳内で蓄積しているが、AAV-CMV-modHEXBの投与により、GM2ガングリオシドが減少することが確認された。
8週齢SDマウスの脳室内に、AAV-CMV-modHEXBを5.75×1011vg/匹で単回投与した後、17週齢時点で解剖し脳切片を免疫染色した。実験の手順は実験1~3と同様である。免疫染色は実験1.3.に記載の手順で行った。
図9に、野生型マウス(WT)の脳切片、SDモデルマウス(SD)の脳切片、SDモデルマウスの脳室内へのAAV-CMV-modHEXB投与後(AAV)の脳切片の、各部位(大脳、小脳、海馬)における、CD68(一次抗体として抗CD68抗体を使用、赤)、細胞核(Hoechist染色、青)の免疫蛍光組織化学的解析の結果を示す。野生型マウス(WT)の脳切片の各部位はいずれも、CD68が僅かに陽性、Hoechist染色陽性であった。SDモデルマウス(SD)の脳切片の各部位はいずれも、CD68が強い陽性、Hoechist染色陽性であった。SDモデルマウスの脳室内へのAAV-CMV-modHEXB投与後(AAV)の脳切片の各部位はいずれも、CD68が僅かに陽性、Hoechist染色陽性であった。SDマウスではCD68が脳内で蓄積しているが、AAV-CMV-modHEXBの投与により、CD68が減少することが確認された。
8週齢SDマウスの脳室内に、AAV-CMV-modHEXBを5.75×1011vg/匹で単回投与した後、17週齢時点で解剖し、大脳、小脳、脳幹での炎症性ケモカイン(Mip1-α)を定量した。野生型マウス(WT)、SDモデルマウス(SD)についても、同様に、大脳、小脳、脳幹でのMip1-αを定量した。Mip1-αの定量はMouse CCL3/MIP-1 alpha Quantikine ELISA Kit(R&D Systems社製)を用いて行った。その他の実験の手順は実験1~3と同様である。
結果を図10に示す。SDマウスの大脳、小脳及び脳幹で増大しているMip1-αが、AAVの脳室内単回投与により、大脳及び小脳では野生型レベルまで減少したことが確認された。
6.1. Sandhoff病モデル(Hexb-/-)マウスの運動機能及び体重に対する、AAV-CMV-modHEXB の脳室内一回投与の投与量の検討
8週齢の成体SDマウス(発症前期)の脳室内に、AAV-CMV-modHEXBを5.75×1010vg/匹または5.75×1011vg/匹の投与量で単回投与し、11週齢時点から、1週毎にロータロッド試験を実施した。
また各時点で体重測定を行うとともに、生存(寿命)を確認した。
8週齢SDマウスの脳室内に、AAV-CMV-modHEXBを1.15×1011vg/匹の投与量で投与した。実験6.1.と同様の手順でロータロッド試験を行い、落下するまでの平均時間を求めた。
結果を図12に示す。AAV-CMV-modHEXB を、8週齢時点で1.15×1011vg/匹の投与量で単回投与した場合、14週齢以降でロータロッドパフォーマンスが低下した。このことは、運動機能に対する有効性の減弱を示している。
SDヘテロマウスに脳室内または側頭静脈内投与した後の、脳及び各臓器におけるβ-ヘキソサミニダーゼ(Hex)活性の増大を評価した。
AAV-CMV-modHEXBの、SDマウス脳室内または側頭静脈内への単回投与後の協調運動機能をロータロッド試験により評価した。
SDマウス新生仔(P0~P1)の脳室内または側頭静脈内にAAV-CMV-modHEXB 1.15×1010vg/5μL PBS(リン酸緩衝液)を単回投与し、11週齢時点から1週毎にロータロッド試験を実施した。
また各時点で体重測定を行うとともに、生存(寿命)を確認した。
1. Tay-Sachs病患者iPS細胞から神経細胞への分化誘導系に対するAAV-CMV-modHEXB及びAAV-SynI-modHEXB投与の有効性評価
Kondo T, et al. Cell Stem Cell 12(4):487-496(2013)で報告された方法を用い、Tay-Sachs病(TSD)患者iPS細胞(TSD iPS細胞)から神経細胞の分化誘導を実施した。一定数のTSD iPS細胞をDorsomorphin、SB431542、非必須アミノ酸(NEAA)を含むDFK5%DS培地中で、8日間浮遊培養を行った後、N2 supplement、Dorsomorphin、NEAAを含むDFN2D培地中で16日間接着培養を行い、神経栄養因子BDNF、GDNF及びNT-3とB-27 Supplement(Vitamin A及びGlutamax不含)を含むNB27full培地中で、さらに25日以上接着培養し、以後継代培養を行い、AAV-CMV-modHEXB及びAAV-SynI-modHEXB投与実験に供した。
免疫細胞化学的実験のために、8-wellチャンバースライドに播種した健常者及びTSD iPS細胞由来神経系細胞を、4%パラフォルムアルデヒド/PBS溶液で室温1時間固定した。PBSで洗浄後、5%ヤギ血清/PBSを用い、室温で1時間ブロッキングを行った。
TSD iPS細胞又は健常者由来iPS細胞から上記の手順で分化誘導された神経細胞におけるGM2ガングリオシド(GM2)の蓄積の有無の確認のために、各細胞を抗GM2マウスモノクローナルIgM抗体(100倍希釈液)で4℃一晩処理した。
AAV-SynI-modHEXB及びAAV-CMV-modHEXBによる、Tay-Sachs病患者iPS細胞由来神経細胞(分化誘導開始後Day 79 時点)へのmodHexB遺伝子導入の用量依存性は、ポリオルニチン/ラミニンコートしたディッシュ上で培養する1細胞当り各々、0.1x106、0.5x106及び1.0x106vgを培養液に投与し、7日後(Day 86 時点)に培養液を回収し、細胞を洗浄後、ハーベストし、細胞抽出液を作製した。
2.1. Sandhoff病培養ヒト神経細胞モデル系のゲノム編集技術による作製
HEXBのexon1にあるゲノム配列:CGGCTTGGCCGAGACGCTCGをターゲット配列とし、GeneArtTM CRISPR Nuclease Vector with OFP Reporter Kit (Invitrogen #A21174) を用いて、ヒトHEXBノックアウト用ベクターを作製した。このベクターをヒト神経芽細胞腫であるSH-SY5Y細胞株へリポフェクションによりトランスフェクションし、CRISPR/Cas9系を用いたゲノム編集によるHEXB KOを行った。
HEXB KO SH-SY5Y細胞(HEXB KO)では、野生型の親株(WT)と比較して、約2%まで低下したMUG分解活性と、基質(GM2ガングリオシド)の蓄積を認めた。
HEXB KO SH-SY5Y細胞(HEXB KO)を、DMEM/F12+3%FBS、70μg/100μg/mL penicillin G/streptomycin、10μg/mL retinoic acid存在下で10日以上培養し、神経細胞への分化誘導を行った。
AAV-CMV-modHEXB及びAAV-SynI-modHEXBのヒトHEXB KO SH-SY5Y培養神経細胞への一回投与における用量依存性の検討は、分化誘導後8日のヒトHEXB KO培養神経細胞(SH-SY5Y細胞)1.0×106cellsに、各々0.1x105、0.5x105、1x105、及び1.0x106vg/細胞の用量で投与を行い、7日後に培養上清と細胞を集め、細胞については抽出液を調製し、細胞内外の人工蛍光基質MUGを用いて、Hex活性の発現を評価した。また細胞抽出液中のタンパク濃度を測定し、酵素比活性を算出した。
上記実験2.3.で得た、各用量のベクターAAV-CMV-modHEXBをヒトHEXB KO SH-SY5Y培養神経細胞に投与し7日後の培養上清中のタンパク質の一定量(各10μg)を試料として、10%ポリアクリルアミドゲルを用いるSDS-PAGEを行い、ヒトmodHexBに対するウエスタンブロット解析を行った。泳動後のゲルを、定電圧でPVDF膜に転写後、膜をブロッキング剤で1時間処理した。抗ヒトHexA(αβ)ウサギポリクローナル抗体NAG(A)を一次抗体(1,000倍希釈液)で4℃一晩処理、Tris緩衝液で洗浄後、二次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗ウサギIgG抗体で処理、洗浄後、化学発光キット(ECLplus)を用い、LAS4000mini(GEHealthcare)でヒトmodHexB由来タンパク質を検出した。
図24には、ウエスタンブロットの結果を示す。ヒト神経細胞に導入されたmodHEXB遺伝子産物は、前駆体タンパク質として細胞外に分泌されたことが確認された。
神経細胞特異的発現プロモーター下流にmodHEXB遺伝子を連結したAAV-SynI-modHEXBを用いた遺伝子導入により、Tay-Sachs病患者iPS細胞由来神経細胞内のMUGS分解活性及びヒトSandhoff病モデル培養神経芽細胞腫SH-SY5Y HEXB K0株内のMUG分解活性がわずかに回復した。
(1)AAVの外被(カプシド)蛋白VP1の改変
9型AAV(AAV9)について、外被蛋白VP1をコードする塩基配列を含むプラスミドpAAV9-RCを鋳型として使用した。このプラスミドは文献(Handa,et.al.,J Gen Virol,81:2077-2084,2000)に記載されたAAV3 Rep/VPに由来し、AAV3のRep配列を含む(Muramatsu,et al.,Virology 221,208-217(1996))。AAV9のVP1の塩基配列はGeneBankにAccession No.AY530579として既に報告されている(配列番号:5に示される)。以下に示すプライマーを合成し、Quick Change II XL site-directed mutagenesis kit(Stratagene社)を使用して、AAV9のVP1アミノ酸配列(配列番号:6)の446番目に位置するチロシン(Y)残基をフェニルアラニン(F)残基で置換した。置換されたアミノ酸配列AAV9-yfVP1-3(配列番号:12)をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドpAAV9-yfRCを作製した。また、pAAV9-yfRCはAAV2のRepをコードするヌクレオチド配列(配列番号:15)を含む。
yfAAV9-F:5' - CGACCAATACTTGTACTTTCTCTCAAAGAC -3' (配列番号:21)
yfAAV9-R:3' - GCTGGTTATGAACATGAAAGAGAGTTTCTG - 5’(配列番号:22)
(a)ベクターゲノムプラスミドの作製
3型AAV(AAV3)のDNA配列を含むプラスミドpAAV3の5’側と3’側のインバーテッドターミナルリピートinverted terminal repeats(ITR)と呼ばれるヘアピンDNA配列の間に、5’末端から3’末端に向けて、CMVプロモーター、ヒト成長ホルモン(hGH)第1イントロン、modHEXB(配列番号25のアミノ酸配列をコードするDNA)、WPRE(woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element)、SV40ポリアデニル化配列がこの順で配置されたDNA配列が挿入されたプラスミドpAAV-CMV-modHEXBを作製した。配列番号26に、pAAV-CMV-modHEXBの5’側のITRから3’側のITRまでの発現カセットの塩基配列を示す。配列番号26の第1番目~第146番目の塩基配列が5’側ITR配列であり、配列番号26の第382番目~第951番目の塩基配列がCMVプロモーター配列であり、配列番号26の第1049番目~第1369番目の塩基配列がhGH第1イントロン配列であり、配列番号26の第1428番目~第3026番目の塩基配列がmodHEXB配列であり、配列番号26の第3046番目~第3634番目の塩基配列がWPRE配列であり、配列番号26の第3728番目~第3862番目の塩基配列がSV40ポリアデニル化配列であり、配列番号26の第3939番目~第4083番目の塩基配列が3’側ITR配列である。このプラスミドの基本構造の参考文献:Li et al.,Mol Ther 13:160-166.2006。
<第1日目>
225cm2フラスコに1.5×106のHEK293細胞をまき、10%FCS-DMEM/F12培地を使用して5%CO2、37℃で培養した。
<第3日目>
リン酸カルシウム法でトランスフェクションを行った。
AAVヘルパープラスミドとしてのpAAV9-yfRCと、AAVベクターゲノムプラスミドとしてのpAAV-CMV-modHEXBと、アデノウイルス(AdV)の塩基配列を含むヘルパープラスミドpHelper(Agilent Technologies社のAAV Helper-Free System(カタログ番号240071))とを、各25μgずつ(計75μg)0.3MCaCl2中で混合した。
その後、2×HBS(80mM NaCl,50mM Hepes buffer,1.5mM Na2HPO4(pH7.10))を加え、DNA-リン酸カルシウムを作製した。フラスコ中の培養液の培地をDNA-リン酸カルシウムを添加した培地と入れ換え、数時間培養した後に培地を交換した。
<第6日目>
ウイルスビリオン(rAAVビリオン)を回収した。0.5M EDTAを加えて細胞を培養ディッシュより剥がし、TBS(100mM Tris HCl,pH8.0,150mM NaCl)に懸濁した。ドライアイスエタノールと37℃のウォーターバスを使用して凍結/融解を3回繰り返し、細胞を破砕した。10,000×gで10分間遠心した後、上清を回収して粗大な細胞破片を除去した。
以下の手順に従って、塩化セシウムCsClの密度勾配による超遠心を行い、rAAVベクターを精製した。超遠心チューブ内に1.5M及び1.25MのCsClを重層し密度勾配を作製した。rAAVベクターを含む細胞破砕溶液を重層後、超遠心(30,000rpm、2.5時間)を行った。屈折率を計測してRI:1.365~1.380のrAAVベクターを含む画分を回収した。この分画を再度CsCl溶液上に重層し、超遠心(36,000rpm、2.5時間)を行ってrAAVを含む分画を得た。
精製したrAAVの10-2~10-6の希釈系列を作製した。WPRE配列をスタンダードとしたプライマーセットを用いて、Applied Biosystems 7900HT FastリアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems社)で定量した。
AAV-SynI-modHEXBは、ベクターゲノムプラスミドとして、配列番号26に示すAAV-CMV-modHEXBの発現カセットの塩基配列において、配列番号26の第382番目~第951番目のCMVプロモーター配列を、配列番号23に示すSynIプロモーター配列に置換した塩基配列の発現カセットを含むベクターゲノムプラスミドを用いた以外は、実施例3に示したAAV-CMV-modHEXBの作製方法と同様の方法で作製した。
AAV-CMV-GFPは、ベクターゲノムプラスミドとして、配列番号26に示すAAV-CMV-modHEXBの発現カセットの塩基配列において、配列番号26の第1428番目~第3026番目の塩基配列がmodHEXB配列を、公知のGFPの配列に置換した塩基配列の発現カセットを含むベクターゲノムプラスミドを用いた以外は、実施例3に示したAAV-CMV-modHEXBの作製方法と同様の方法で作製した。
5個体の2歳齢の健常なカニクイザル(Macaca fascicularis)の髄腔内に、実施例3に記載の方法で作製したAAV-CMV-modHEXBを2.0×1012vg/kg体重の用量で単回投与した。5個体をそれぞれ個体番号#1-#5とした。投与後3カ月間観察したところ、食欲、体重及び行動に悪影響は認められなかった。
投与後3カ月経過時点で下記の組織を摘出した。
頭頂葉皮質 (Parietal cortex)
側頭葉皮質 (Temporal cortex)
嗅内皮質 (Entothinal cortex)
海馬 (Hippocampus)
被殻 (Putamen)
小脳 (Cerebellum)
脳幹 (Brain stem)
頸椎 (Cervical spinal cord) (C4-C6)
胸椎 (Thoracic spinal cord) (Th6-Th8)
腰椎 (Lumber spinal cord) (L2-L4)
心臓 (Heart)
肺 (Lung)
肝臓 (Liver)
脾臓 (Spleen)
腎臓 (Kidney)
各組織の湿重量100mg当たり、300μLの超純水を加え、超音波破砕装置で2分間の超音波破砕処理を10回行い、破砕液を得た。
次いで前記破砕液を、超音波洗浄(水浴式)装置で10分間超音波処理した。
処理後の前記破砕液を4℃、12,000×gで15分間遠心分離し、上清を酵素活性測定用サンプル(組織抽出液)として回収した。
一定量の各組織抽出液の、人工蛍光基質であるMUG(4-メチルウンベリフェリルβ-D-グルコサミド)及びMUGS(4-メチルウンベリフェリル6-スルホ-β-D-グルコサミド)の分解活性を測定した。各組織抽出液のタンパク質濃度を測定し、単位タンパク質量あたりの基質分解活性、すなわち比活性、を算出した。
基質分解活性の測定は、超純水で適宜希釈した一定量の組織抽出液とMUG又はMUGSの溶液とを37℃で30分間インキュベートした後、0.2Mグリシン-NaOH(pH 10.7)を370μL加えて反応を停止し、96穴マルチウェルプレートに200μLずつ分注して蛍光測定(励起光355nm, 検出光460nm)を行った。検量線作成のために、0.2Mグリシン-NaOH(pH 10.7)中で0.5nmol~5 nmolに希釈した4-MU(4-メチルウンベリフェロン)についても同様に96穴マルチウェルプレートに200μLずつ分注して蛍光測定を行った。
結果を図25に示す。中枢神経系の組織のうち被殻 (Putamen)、脳幹 (Brain stem)、頸椎 (Cervical spinal cord) (C4-C6)、胸椎 (Thoracic spinal cord) (Th6-Th8)、腰椎 (Lumber spinal cord) (L2-L4)に比較的高いHex活性が分布していたことが確認された。
AAV-CMV-modHEXBの投与前と、投与から12週後(安楽殺直前)に採血を行い、血漿を取得した。
血漿を超純水で10倍希釈した希釈液15μLとMUGS溶液15μLとを37℃で30分間インキュベートした後、0.2Mグリシン-NaOH(pH 10.7)を370μL加えて反応を停止し、96穴マルチウェルプレートに200μLずつ分注して蛍光測定(励起光355nm, 検出光460nm)を行った。検量線作成のために、0.2Mグリシン-NaOH(pH 10.7)中で0.5nmol~5 nmolに希釈した4-MU(4-メチルウンベリフェロン)についても同様に96穴マルチウェルプレートに200μLずつ分注して蛍光測定を行った。
#1-#5の各個体についてのAAV-CMV-modHEXBの投与前と、投与から12週後(安楽殺直前)の血漿のMUGS分解活性の測定結果を図26に示す。霊長類動物であるカニクイザルへのAAV-CMV-modHEXBの投与により、血中Hex活性が上昇することが確認された。
2個体の2歳齢の健常なカニクイザル(Macaca fascicularis)の髄腔内に、実施例5に記載の方法で作製したAAV-CMV-GFPを2.0×1012vg/kg体重の用量で単回投与した。投与後3カ月間観察したところ、食欲、体重及び行動に悪影響は認められなかった。
投与後3カ月経過時点で下記の組織を摘出した。
頭頂葉皮質 (Parietal cortex)
側頭葉皮質 (Temporal cortex)
嗅内皮質 (Entothinal cortex)
海馬 (Hippocampus)
被殻 (Putamen)
小脳 (Cerebellum)
脳幹 (Brain stem)
頸椎 (Spinal cord (C4-C6))
胸椎 (Spinal cord (Th6-Th8))
腰椎 (Spinal cord (L2-L4))
各組織の湿重量100mg当たり、300μLのRIPA緩衝液 (50mM Tris-HCl (pH ya7.5), 150mM NaCl, 0.5% Sodium Deoxycholate, 0.1% SDS, 1% NP-40) を加え、超音波破砕装置で2分間の超音波破砕処理を10回行い、破砕液を得た。
次いで前記破砕液を、超音波洗浄(水浴式)装置で10分間超音波処理した。
処理後の前記破砕液を4℃、12,000×gで15分間遠心分離し、上清をウエスタン・ブロッティングによるGFP検出用サンプル(組織抽出液)として回収した。
前記各組織抽出液をタンパク質量30μgに調製し、超純水 6×dye(+)を添加して全量を18μLに調節した。
前記体積調節後の各サンプルを3分間煮沸した後、全量を15% SDS-PAGEゲルにアプライし、15mA~20mAで電気泳動を行った。
泳動後のゲルをPVDF膜に15V定電圧で1時間、転写した。
転写後のPVDF膜を、Blocking OneとTBS (トリス緩衝生理食塩水)とを1:1の比で混合したブロッキング剤により1時間保持してブロッキングした。
一次抗体である抗GFP抗体として、1000倍希釈したマウス由来Anti-GFP Clontech jl-8(クロンテック社)を用い、ブロッキングした前記PVDF膜と4℃で終夜インキュベートした。
一次抗体処理後の前記PVDF膜をTBS/0.1%Tween20により5分間×3回洗浄した。
洗浄後のPVDF膜を、二次抗体であるHRP標識抗マウスIg抗体(Anti-Mouse Ig HRP-linked lot:32 1000倍希釈)及びHRP標識抗ビオチン抗体(Anti-Biotin HRP-linked lot:32 1000倍希釈、分子量マーカー検出用)と1時間インキュベートした。
二次抗体処理後の前記PVDF膜をTBS/0.1%Tween20により5分間×3回洗浄した。
バンドの強度をBIORAD ChemiDoc XRSにより検出した。
結果を図27に示す。霊長類動物であるカニクイザルへのAAV-CMV-GFPの投与により、GFP遺伝子を中枢神経系の各組織に導入することができた。
配列番号:2 野生型AAV1由来カプシドタンパク質AAV1-VP1アミノ酸配列(GenBank:NC_2077.1)
配列番号:3 野生型AAV2由来カプシドタンパク質AAV2-VP1ヌクレオチド配列(GenBank:NC_001401.2)
配列番号:4 野生型AAV2由来カプシドタンパク質AAV2-VP1アミノ酸配列(GenBank:NC_001401.2)
配列番号:5 野生型AAV9由来カプシドタンパク質AAV9-VP1ヌクレオチド配列(GenBank:AY530579.1)
配列番号:6 野生型AAV9由来カプシドタンパク質AAV9-VP1アミノ酸配列(GenBank:AY530579.1)
配列番号:7 AAV1由来カプシドタンパク質変異体AAV1-yfVP1ヌクレオチド配列
配列番号:8 AAV1由来カプシドタンパク質変異体AAV1-yfVP1アミノ酸配列
配列番号:9 AAV2由来カプシドタンパク質変異体AAV2-yfVP1ヌクレオチド配列
配列番号:10 AAV2由来カプシドタンパク質変異体AAV2-yfVP1アミノ酸配列
配列番号:11 AAV9由来カプシドタンパク質変異体AAV9-yfVP1ヌクレオチド配列
配列番号:12 AAV9由来カプシドタンパク質変異体AAV9-yfVP1アミノ酸配列
配列番号:13 AAV3由来5’側ITRヌクレオチド配列 (GenBank NC_001729由来)
配列番号:14 AAV3由来3’側ITRヌクレオチド配列
配列番号:15 AAV2由来rep遺伝子ヌクレオチド配列
配列番号:16 AAV2由来Repタンパク質アミノ酸配列
配列番号:17 変異導入プライマー1(yfAAV1-F)ヌクレオチド配列
配列番号:18 変異導入プライマー2(yfAAV1-R)ヌクレオチド配列
配列番号:19 変異導入プライマー3(yfAAV2-F)ヌクレオチド配列
配列番号:20 変異導入プライマー4(yfAAV2-R)ヌクレオチド配列
配列番号:21 変異導入プライマー5(yfAAV9-F)ヌクレオチド配列
配列番号:22 変異導入プライマー6(yfAAV9-R)ヌクレオチド配列
配列番号:23 シナプシンIプロモーター配列(GenBank:M55300.1)配列番号:24 ミエリン塩基性タンパク質プロモーター配列(GenBank:M63599(ヒト)由来)
配列番号:25 modHEXBのアミノ酸配列
配列番号:26 CMV-modHEXBの発現カセットのヌクレオチド配列
配列番号:27 野生型ヒトβ-ヘキソサミニダーゼのβ-サブユニットのヌクレオチド配列
配列番号:28 野生型ヒトβ-ヘキソサミニダーゼのβ-サブユニットのアミノ酸配列
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
Claims (7)
- 配列番号:12のアミノ酸配列、又は配列番号:12のアミノ酸配列の444~446位以外の位置に1~5個のアミノ酸の欠失、置換、挿入及び/若しくは付加を含むアミノ酸配列を含む、 ウイルスビリオンを形成可能なタンパク質を含むキャプソメア、並びに、 前記キャプソメア内にパッケージングされたポリヌクレオチドであって、全身性プロモーター配列と、前記プロモーター配列と作動可能に連結される、野生型ヒトβ-ヘキソサミニダーゼのβ-サブユニットの配列番号28の第55番目~第556番目のアミノ酸配列において、第312番目~第318番目のアミノ酸が、それぞれ順に、グリシン、セリン、グルタミン酸、プロリン、セリン、グリシン、及び、トレオニンに置換されている第1アミノ酸配列、並びに、前記第1アミノ酸配列のN末端側に連結されたシグナルペプチドのアミノ酸配列である第2アミノ酸配列をコードする塩基配列とを含むポリヌクレオチド
を含む、組換えアデノ随伴ウイルスビリオンを含む、脳室内投与又は髄腔内投与される、テイ-サックス病及び/又はザンドホッフ病の治療のための医薬組成物。 - 前記第1アミノ酸配列が、配列番号28の第55番目~第556番目のアミノ酸配列において、さらに、第452番目のアミノ酸がアスパラギンに、及び/又は、第453番目のアミノ酸がアルギニンに置換されているアミノ酸配列である、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記第1アミノ酸配列が、
(A)配列番号25の第31番目~第532番目のアミノ酸配列;
(B)配列番号25の第31番目~第532番目のアミノ酸配列において、第288番目~第294番目、第428番目及び第429番目からなる置換部位のアミノ酸を除く1~5個のアミノ酸が欠失、置換、又は、付加されたアミノ酸配列であって、野生型ヒトβ-ヘキソサミニダーゼのα-サブユニット由来の活性を有し、且つ、プロテアーゼに対する抵抗性を有するタンパク質に含まれるアミノ酸配列;並びに
(C)配列番号25の第31番目~第532番目のアミノ酸配列と少なくとも90%以上の同一性を有するアミノ酸配列であって、野生型ヒトβ-ヘキソサミニダーゼのα-サブユニット由来の活性を有し、且つ、プロテアーゼに対する抵抗性を有するタンパク質に含まれるアミノ酸配列(ただし、配列番号25のアミノ酸配列における第288番目~第294番目、第428番目及び第429番目からなる置換部位のアミノ酸は配列番号:25で示されるアミノ酸配列と同一である)
より選択されるいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項2に記載の医薬組成物。 - 前記第2アミノ酸配列が、配列番号25の第1番目~30番目のアミノ酸配列、又は、配列番号28の第1番目~第54番目のアミノ酸配列である、請求項1~3のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記ポリヌクレオチドの5’末端及び3’末端が、それぞれ、AAV1、AAV2、AAV3又はAAV4に由来する5’末端及び3’末端のインバーテッドターミナルリピート(ITR)配列を含む、請求項1~4のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記ポリヌクレオチドの5’末端及び3’末端が、それぞれ配列番号:13及び配列番号:14の塩基配列を含む、請求項1~5のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記プロモーター配列が、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、EF-1αプロモーター、SV40プロモーター及びCAGプロモーターからなる群より選択される全身性プロモーターの配列である、請求項1~6のいずれか1項に記載の医薬組成物。
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