WO2019146745A1 - テイ－サックス病及びザンドホッフ病治療用の新規アデノ随伴ウイルスビリオン - Google Patents

テイ－サックス病及びザンドホッフ病治療用の新規アデノ随伴ウイルスビリオン Download PDF

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伊藤　孝司
大輔 辻
慎一 村松
克仁 浅井
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国立大学法人徳島大学
学校法人自治医科大学
株式会社遺伝子治療研究所
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    • C12N2750/14171—Demonstrated in vivo effect

Definitions

  • the present invention relates to novel adeno-associated virus virions for the treatment of Tay-Sachs disease and Zandhoff's disease.
  • Both Tay-Sachs disease and Zandhoff's disease are diseases in which GM2 ganglioside accumulates in nervous system cells and causes cranial nerve symptoms due to the decrease in the activity of ⁇ -hexosaminidase A (Hex A).
  • Hex A is a heterodimer composed of an ⁇ -subunit and a ⁇ -subunit, and has an enzymatic activity to degrade GM2 ganglioside.
  • Tey-Sachs disease is a Hex A deficiency based on ⁇ -subunit deficiency
  • Sandhoff's disease is a Hex A deficiency based on ⁇ -subunit deficiency.
  • the present inventors have so far introduced expression vectors into CHO cell lines and special yeast strains in which genes encoding ⁇ -subunit and ⁇ -subunit (HEXA cDNA and HEXB cDNA, respectively) have been inserted.
  • wild type recombinant Hex A produced by this method is administered to a Zandhoff's disease model mouse, weight loss of GM2 ganglioside accumulated in the cranial nervous system and amelioration of neurological symptoms are observed, and it is possible for Shandhoff's disease and Tay-Sachs disease The effectiveness of the enzyme replacement therapy was confirmed (Patent Document 1; Non-Patent Document 1).
  • the present inventors further use the ⁇ -subunit of ⁇ -hexosaminidase. Based on the three-dimensional structural information of and ⁇ -subunits, modified ⁇ -subunits were created in which the active site of ⁇ -subunit was replaced with the active site of ⁇ -subunit. Then, using this modified ⁇ -subunit as a component, a homodimer, modified ⁇ -hexosaminidase B (hereinafter referred to as “ModB”) is produced, and the recombinant enzyme is used to generate GM2 ganglioside. It confirmed that it had the activity to decompose
  • disassemble (patent document 2; nonpatent literature 2).
  • ModB is easily degraded by protease in the patient's body. And, as a means to solve this problem, a modified form that is resistant to protease by changing the structure of the protease recognition site in ModB so that it is not affected or susceptible to hydrolysis by protease.
  • ModB (hereinafter referred to as "Mod2B") has been developed (Patent Document 3).
  • Patent Document 4 discloses an adeno-associated virus virion for gene transfer into neural cells.
  • the modified ⁇ -subunit needs to be constantly present in the patient's body, so the modified ⁇ -subunit is administered to the patient in the form of protein. In the case of treatment, it is necessary to perform the administration frequently, and there is a problem that the burden on the patient is large.
  • the present invention includes the following inventions.
  • capsomer containing a protein capable of forming a viral virion and A polynucleotide packaged within the capsomer, the promoter sequence and the 55th sequence of SEQ ID NO: 28 of the ⁇ -subunit of wild-type human ⁇ -hexosaminidase operably linked to the promoter sequence
  • a first amino acid sequence in which amino acids 312 to 318 are substituted in order of glycine, serine, glutamic acid, proline, serine, glycine and threonine and
  • a recombinant adeno-associated virus virion comprising a polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding a second amino acid sequence which is an amino acid sequence of a signal peptide linked to the N-terminal side of the first amino acid sequence.
  • the virus virion according to (1) which is the amino acid sequence being (3)
  • the first amino acid sequence is (A) the 31st to 532nd amino acid sequence of SEQ ID NO: 25; (B) An amino acid sequence in which one to several amino acids except for the amino acid at the substitution site are deleted, substituted or added in the 31st to 532nd amino acid sequences of SEQ ID NO: 25; Amino acid sequence contained in a protein having the activity derived from the ⁇ -subunit of the human ⁇ -hexosaminidase type and having resistance to a protease; and (C) the 31st to 532nd positions of SEQ ID NO: 25 An amino acid sequence having at least 90% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, and having
  • the 5 'end and the 3' end of the polynucleotide comprise inverted terminal repeat (ITR) sequences at the 5 'end and the 3' end derived from AAV1, AAV2, AAV3 or AAV4, respectively.
  • ITR inverted terminal repeat
  • the promoter sequence is a sequence of a systemic promoter selected from the group consisting of a cytomegalovirus (CMV) promoter, an EF-1 ⁇ promoter, an SV40 promoter and a CAG promoter.
  • CMV cytomegalovirus
  • the promoter sequence is synapsin I promoter sequence, myelin basic protein promoter sequence, neuron specific enolase promoter sequence, calcium / calmodulin-dependent protein kinase II (CMKII) promoter, tubulin ⁇ I promoter, platelet derived growth factor ⁇ Nervous system selected from the group consisting of: chain promoter, glial fibrillary acidic protein (GFAP) promoter sequence, L7 promoter sequence (cerebellar Purkinje cell specific promoter), and glutamate receptor delta 2 promoter (cerebellar Purkinje cell specific promoter)
  • the virus virion according to (7), which is a cell-specific promoter sequence.
  • the protein capable of forming the virus virion is type 1, 2, 3, 9, 9, rh10, PHP. Type B or PHP.
  • Amino acid sequence having at least 90% identity to the amino acid sequence of VP1 capsid protein derived from the adeno-associated virus of eB type, or amino acid having at least 90% identity to the amino acid sequence of said VP1 capsid protein The virus virion according to any one of (1) to (9), which is a protein comprising an amino acid sequence in which at least one surface exposed tyrosine residue is substituted by another amino acid residue in the sequence.
  • the virus virion according to any one of (1) to (10), which is a protein comprising an amino acid sequence substituted by amino acid residues.
  • the protein capable of forming the viral virion has at least a tyrosine residue at position 445 in SEQ ID NO: 2, a tyrosine residue at position 444 in SEQ ID NO: 4, or a tyrosine residue at position 446 in SEQ ID NO: 6
  • the virus virion as described in (11) containing the amino acid sequence by which group was substituted.
  • the protein capable of forming the viral virion has one to several amino acid sequences of SEQ ID NO: 8, 10 or 12 or at positions other than positions 444-446 of amino acid sequences of SEQ ID NO: 8, 10 or 12
  • a pharmaceutical composition comprising the virus virion according to any one of (1) to (14).
  • the viral virion according to (20) which is peripherally, intracerebrally or intrathecally administered to a patient in need of treatment for Tay-Sachs disease and / or Zandhoff disease.
  • the recombinant adeno-associated virus virion of the present invention is effective as a vector for introducing a gene encoding wild type human ⁇ -hexosaminidase modified ⁇ -subunit into a patient's body.
  • the pharmaceutical composition comprising the recombinant adeno-associated virus virion of the present invention can be used for the treatment of Zandhoff disease and Tay-Sachs disease.
  • Example 1 The measurement results of MUG degradation specific activity in the extract of each organ in Experiment 1.1 are shown in the graph at the top of FIG. 1, and the results of Western blot analysis of proteins in the extract of each organ in Experiment 1.2 are shown. Shown in the lower picture.
  • Fig. 2 shows a human modHEXB enzyme protein (primary antibody) in a brain section of an SD model mouse, a brain section after administration of AAV-CMV-modHEXB to the intracerebroventricular zone of a SD model mouse, and a brain section of a wild type mouse (C57BL / 6)
  • the results of immunofluorescence histochemical analysis of NAG (A) and GM2 ganglioside using anti-GM2 antibody as primary antibody are shown as FIG.
  • FIG. 3A shows the results of immunofluorescent histochemical analysis of accumulated GM2 ganglioside (green) in each region of the brain of the SD model mouse (Hexb ⁇ / ⁇ ).
  • FIG. 3B shows the results of immunofluorescent histochemical analysis of GM2 ganglioside (green) and modHEXB (red) in each region of the brain of an SD model mouse (Hexb ⁇ / ⁇ ) to which AAV-CMV-modHEXB was intracerebroventricularly administered.
  • FIG. 3C shows the results of immunofluorescent histochemical analysis of GM2 ganglioside (green) and modHEXB (red) in each region of the brain of wild type mice (C57BL / 6).
  • FIG. 4 shows the results of immunofluorescence histochemical analysis in Example 1 Experiment 2.
  • the result of Example 1 Experiment 3 is shown in FIG.
  • the result of Example 1 Experiment 4 is shown in FIG.
  • FIG. 7 shows the results of Example 1 Experiment 5.1.
  • FIG. 8 shows the results of Example 1 Experiment 5.2.
  • FIG. 9 shows the results of Example 1 Experiment 5.3.
  • FIG. 10 shows the results of Example 1 Experiment 5.4.
  • FIG. 11A shows the results of the rotarod test in Example 1 Experiment 6.1.
  • FIG. 11B shows the results of weight measurement in Example 1 Experiment 6.1.
  • FIG. 12 shows the results of the rotarod test in Example 1 Experiment 6.2.
  • FIG. 13A shows a single administration of AAV-CMV-modHEXB at a dose of 1.15 ⁇ 10 11 vg / animal into the intracerebroventricular or temporal vein of Sandhoff's disease hetero (Hexb +/-) neonatal (P0-P2) mice After that, the specific activity of Hex activity (MUG degradation activity) in each organ at 10 weeks of age is shown.
  • FIG. 13A shows a single administration of AAV-CMV-modHEXB at a dose of 1.15 ⁇ 10 11 vg / animal into the intracerebroventricular or temporal vein of Sandhoff's disease hetero (Hexb +/-) neonatal (P0-P2) mice After that, the specific activity of Hex activity (MUG degradation activity) in each organ at 10 weeks of age is shown.
  • FIG. 13B shows a single administration of AAV-CMV-modHEXB at a dose of 1.15 ⁇ 10 10 vg / animal into the intracerebroventricular or temporal vein of Sandhoff's disease hetero (Hexb +/ ⁇ ) neonatal (P0-P2) mice After that, the specific activity of Hex activity (MUG degradation activity) in each organ at 10 weeks of age is shown.
  • FIG. 14A shows the results of the rotarod test in Example 1 Experiment 8. The result of the weight measurement in Example 1 Experiment 8 is shown in FIG. 14B.
  • FIG. 15 shows an outline of differentiation induction from iPS cells to neurons.
  • FIG. 16 shows the results of Example 2 Experiment 1.1.
  • FIG. 17 shows the results of Example 2 Experiment 1.2.
  • FIG. 18 shows the results of Example 2 Experiment 1.2.
  • FIG. 19 shows the results of Example 2 Experiment 2.1.
  • FIG. 20 shows the results of Example 2 Experiment 2.1.
  • FIG. 21 shows the results of Example 2 Experiment 2.2.
  • FIG. 22 shows the results of Example 2 Experiment 2.3.
  • FIG. 23 shows the results of Example 2 Experiment 2.3.
  • FIG. 24 shows the results of Example 2 Experiment 2.4.
  • FIG. 25 shows MUG (4-methyl umbelliferyl ⁇ -D-glucosamide) and MUGS (4-methyl umbell berry) of tissue extracts 3 months after administration of AAV-CMV-modHEXB to cynomolgus monkey in Example 6.
  • FIG. 7 shows the decomposition activity of ferric 6-sulfo- ⁇ -D-glucosamide).
  • FIG. 26 shows the degradation activity of MUGS (4-methylumbelliferyl 6-sulfo- ⁇ -D-glucosamide) in plasma before and 12 weeks after administration of AAV-CMV-modHEXB to cynomolgus monkey in Example 6 in FIG. Indicates
  • FIG. 27 shows the measurement results of GFP by Western blotting of the tissue extract 3 months after administration of AAV-CMV-GFP to cynomolgus monkey in Example 7.
  • the ⁇ -subunit of wild type human ⁇ -hexosaminidase comprises the amino acid sequence of the 55th to 556th amino acids of SEQ ID NO: 28 and its N-terminal side Is expressed as an immature protein containing the amino acid sequence of the signal peptide linked thereto, and the signal peptide is released to function as a mature protein.
  • Examples of the amino acid sequence of the signal peptide of the ⁇ -subunit of wild-type human ⁇ -hexosaminidase include the first to 54th amino acid sequences of SEQ ID NO: 28. That is, the ⁇ -subunit of wild-type human ⁇ -hexosaminidase contains the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 28 at the immature stage.
  • the 312st to 318th amino acids are glycine in order, respectively
  • a protein comprising a first amino acid sequence substituted with serine, glutamic acid, proline, serine, glycine and threonine (hereinafter referred to as “the protein of the present invention” or “modified ⁇ -subunit”) is The structure of the active site of the ⁇ -subunit of human type ⁇ -hexosaminidase was changed to acquire the activity derived from the ⁇ -subunit of wild type human ⁇ -hexosaminidase, and wild type human ⁇ Recombinant protein that has acquired resistance to protease by changing the structure of the protease recognition site of the ⁇ -subunit of ⁇ -hexosaminidase Is the quality.
  • the protein of the present invention or the modified ⁇ -subunit may be a mature protein consisting of only the first amino acid sequence, or an amino acid sequence of the first amino acid sequence and a signal peptide linked to the N-terminal side thereof. It may be an immature protein comprising the second amino acid sequence, and both are included.
  • the second amino acid sequence which is the amino acid sequence of the signal peptide linked to the N-terminal side of the first amino acid sequence, includes the first to 30th amino acid sequences of SEQ ID NO: 25 and the first to 30th amino acids of SEQ ID NO: 28
  • the 54th amino acid sequence can be exemplified.
  • “acquired activity derived from ⁇ -subunit” refers to binding of ⁇ -subunit to a substrate rather than binding reactivity of ⁇ -subunit to a substrate at the substrate binding site of ⁇ -subunit It means that the reactivity is relatively high. Therefore, the structural change relating to the property is not limited to the structural change that completely makes it impossible to bind the ⁇ -subunit to the substrate, and is inherently ⁇ - rather than the binding reactivity of the ⁇ -subunit to the substrate. Those having relatively high binding reactivity with the subunit substrate are also included structural changes that make the binding reactivity with the ⁇ -subunit substrate significantly high.
  • having acquired activity derived from ⁇ -subunit preferably has substrate specificity of ⁇ -subunit.
  • substrate specificity of the ⁇ -subunit means the structure of the active site (in particular, the position and type of the amino acid residue that plays an important role in the binding reactivity of the substrate) and the association with the GM2 activator It means that the presence of the loop structure necessary for (coupling) is similar to that of the ⁇ -subunit.
  • protease recognition site has been changed so that it is not affected or susceptible to hydrolysis by protease (that is, it is not hydrolyzed by protease, Or it becomes difficult to be hydrolyzed).
  • the structural change of the protein with respect to each property can be performed as follows.
  • the structural change of the active site of the ⁇ -subunit to acquire the activity derived from the ⁇ -subunit can be performed based on the method detailed in WO 2010/082622.
  • Hex A heterodimer of ⁇ -subunit and ⁇ -subunit
  • Hex B homodimer of ⁇ -subunit
  • corresponding part means that a gap is inserted in one of the sequences as necessary so that the amino acid sequences of the ⁇ -subunit and the ⁇ -subunit have the highest identity. When aligned, it refers to the juxtaposed position.
  • sequence analysis software eg., BLAST (Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information). For example, default or default parameters can be used.
  • the portion corresponding to the amino acid residue in the active pocket for recognizing the GM2 ganglioside of the ⁇ -subunit as a substrate includes the 452nd amino acid residue and the 453rd amino acid Residues can be mentioned.
  • amino acid residues involved in the binding of the ⁇ -subunit to the GM2 activator include the 312st to 315th amino acid residues.
  • amino acid residues 312 to 315 among the ⁇ -subunits may be substituted in order to acquire the activity derived from the ⁇ -subunit.
  • amino acids residues 312 to 315 and amino acid residue 452 of the ⁇ -subunits are obtained in order to acquire the activity derived from the ⁇ -subunit.
  • the group and / or the 453rd amino acid residue may be substituted.
  • the amino acid residue at positions 312 to 315 and the amino acid residue at position 452 of the ⁇ -subunit are acquired in order to acquire the activity derived from the ⁇ -subunit.
  • the 453rd amino acid residue may be substituted.
  • Substitution of the amino acid sequence of these ⁇ -subunits can be carried out according to the amino acid residue of the corresponding part in the ⁇ -subunit, that is, for amino acids 312 to 315, glycine, serine, respectively, in order Glutamic acid and proline are substituted with asparagine for the 452nd amino acid and arginine for the 453rd amino acid.
  • protease recognition site refers to an amino acid sequence that is hydrolyzed by a specific protease.
  • amino acid residues corresponding to the protease non-recognition site of the ⁇ -subunit include amino acid residues 312 to 318.
  • at least the 312st to 318th amino acid residues in the ⁇ -subunit may be substituted in order to acquire resistance to a protease.
  • Substitution of the amino acid sequences of these ⁇ -subunits can be carried out according to the corresponding amino acid residues in the ⁇ -subunit, ie, for amino acids 312 to 315, as described above, In order, glycine, serine, glutamic acid and proline are substituted, and for amino acids 316 to 318, serine, glycine and threonine are sequentially substituted.
  • the first amino acid sequence contained in the protein of the present invention may be, for example, glycine, serine, glutamic acid, proline, in the order of positions 312 to 318 in the 55th to 556th amino acid sequences of SEQ ID NO: 28 It is an amino acid sequence substituted by serine, glycine and threonine.
  • the first amino acid sequence contained in the protein of the present invention further comprises an amino acid at position 452 and / or an amino acid at position 453 in the 55th to 556th amino acid sequences of SEQ ID NO: 28, respectively, asparagine and And arginine may be substituted.
  • the first amino acid sequence contained in the protein of the present invention comprises amino acids 312 to 318, 452 and 453 of the 55th to 556th amino acid sequences of SEQ ID NO: 28 , Amino acid sequences respectively substituted as described above.
  • the information on the amino acid sequence (SEQ ID NO: 28) of the ⁇ -subunit containing the signal peptide of wild type human ⁇ -hexosaminidase and the base sequence (SEQ ID NO: 27) encoding the sequence is, for example, GenBank Is published as "Accession number: NM 000512" and “Accession number: NM 000521", and Swiss-Prot (available from http://tw.expasy.org/uniprot/) is "Entry name: HEXB. Accession number: P07686 is registered.
  • the nucleotide sequence (cDNA) encoding the amino acid sequence of the ⁇ -subunit of SEQ ID NO: 27 is the 118th to 1788th nucleotides in the total 1919 bp nucleotide sequence published in GenBank (Accession number: NM 000521). It is a base sequence consisting of bases. In the present invention, information on these amino acid sequences and base sequences can be used.
  • the first amino acid sequence contained in the protein of the present invention is preferably any one of the following (a) to (c).
  • the 312nd to 318th amino acids are respectively substituted in order of glycine, serine, glutamic acid, proline, serine, glycine and threonine, And an amino acid sequence in which the 452nd amino acid is substituted with asparagine;
  • amino acid sequence of (i) to (iv) is more preferable as the amino acid sequence of (a).
  • amino acid sequence of (a) the 31st to 532nd amino acid sequences of SEQ ID NO: 25 can be mentioned.
  • the amino acid sequence of (b) above is one or several (for example, 1 to 10) excluding the amino acid at the substitution site in the amino acid sequence of any of (i) to (iv) defined in (a) above.
  • the activity derived from the ⁇ -subunit can be confirmed, for example, by expressing and collecting the target protein in mammalian cells such as CHO cells and human fibroblasts and measuring 4-MUGS degrading activity.
  • mammalian cells such as CHO cells and human fibroblasts and measuring 4-MUGS degrading activity.
  • the protein (enzyme solution) and 4-methylumbelliferyl-N-acetyl- ⁇ -D-glucosamine-6-sulfate 4-methylumbelliferyl-6-sulfo-N-acetyl- ⁇ -D-
  • a unit amount of the enzyme solution can be released per unit time of 4-methylumbelliferone It can be measured by detecting the amount of For detection of 4-methylumbelliferone, various known detection methods can be employed. For example, a method of detection using a fluorometer or the like is preferable.
  • expression of the target protein may be introduced into cells by incorporating it into various known expression vectors and the like, and may be expressed.
  • a target protein is expressed in cells of mammalian origin such as CHO cells or human fibroblasts and the like, and the collected target protein is treated with protease.
  • the treatment can be performed by detecting the presence or absence of a hydrolyzed form of the protein using a known protein detection method such as Western blotting.
  • the amino acid sequence of the above (c) is an amino acid sequence having at least 90% or more identity with the amino acid sequence of any of the above (i) to (iv) defined in the above (a).
  • the amino acid sequence is not limited as long as it has an activity derived from the ⁇ -subunit of ⁇ -hexosaminidase and is contained in a protein having resistance to a protease (although the amino acid at the substitution site is a sequence) Identical to the amino acid sequence shown by the number 25).
  • identity means the same amino acid and the same amino acid for all overlapping amino acid residues in the optimal alignment when aligning two amino acid sequences with or without introducing a gap. Mean percentage of residues.
  • identity can be determined by methods known to those skilled in the art, sequence analysis software, etc. (eg, BLAST (Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information). "Identity of at least 90% or more” indicates 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 99% or more of identity. The presence or absence of “activity from ⁇ -subunit” and “resistance to protease” can be determined as described above.
  • the second amino acid sequence of the signal peptide is the first to 30th amino acid sequences of SEQ ID NO: 25 or
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28 is preferably 1 to 54, and the amino acid sequence of SEQ ID NO 25 is preferably from 1 to 30.
  • the protein of the present invention may be present in the form of a monomer (ie, a modified (mutant) ⁇ -subunit) when expressed in the body of a patient, or in two doses of the mutant protein. It may be present in the form of a body (ie, modified (mutated) human ⁇ -hexosaminidase B).
  • nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the modified ⁇ -subunit of human ⁇ -hexosaminidase The polynucleotide contained in the recombinant adeno-associated virus virion of the present invention encodes the first amino acid sequence and the second amino acid sequence described above Containing the nucleotide sequence As a base sequence which codes said 1st amino acid sequence, the base sequence of the following (a) or (b) is mentioned, for example.
  • a base sequence which is substituted with a base showing a codon of proline, serine, glycine and threonine, and a base of 1354th to 1356s is substituted with a base showing a codon of asparagine; (Iii) in the 163rd to 1671th base sequences of SEQ ID NO: 27, the 934th to 936th bases, the 937th to 939th bases, the 940th to 942nd bases, The bases 943 to 945, the bases 946 to 948, the bases 949 to 951, and the bases 952 to 954 are, respectively, glycine, serine, glutamic acid in this order.
  • (B) A base sequence contained in DNA which hybridizes with a DNA consisting of a base sequence complementary to any of the base sequences of (i) to (iv) above under stringent conditions, which is the substitution site A base corresponding to the base of the same as the base of the substitution site, and having an activity derived from the .alpha.-subunit of wild-type human .beta.-hexosaminidase, and coding for a protein having resistance to a protease Base sequence.
  • codon means not only three-base linkage (triplet) on RNA sequence after transcription but also three-base linkage on DNA sequence.
  • codons on the DNA sequence are designated using thymine (T) instead of uracil (U).
  • the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 27 is 1,671, which encodes a ⁇ -subunit (amino acid sequence of SEQ ID NO: 28 consisting of 556 amino acids) including a signal peptide (54 amino acids) of wild type human ⁇ -hexosaminidase It is a base sequence consisting of bases.
  • the nucleotide sequence of the 163rd to 1671th nucleotides of SEQ ID NO: 27 is the mature protein of the ⁇ -subunit of wild type human ⁇ -hexosaminidase (the 55th amino acid to the 556th segment of SEQ ID NO: 28) Amino acid sequence) is encoded.
  • the above-mentioned (i) base sequence is more preferable as the above-mentioned (a) base sequence.
  • the 1518th to 3026th base sequences of SEQ ID NO: 26 can be mentioned.
  • the 1518th to 3026th base sequence of SEQ ID NO: 26 encodes the 31st to 532nd amino acid sequence of SEQ ID NO: 25.
  • polynucleotide containing the nucleotide sequence of the mutation substitution type as described above is described in, for example, Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.
  • Site-directed displacement introduction methods eg, Kunkel method, Gapped duplex method, PCR method described in, eg, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997), etc. Etc.
  • stringent conditions are the conditions for washing after hybridization, and the salt concentration of the buffer is 15 to 330 mM, the temperature is 25 to 65 ° C, preferably the salt concentration Means a condition of 15 to 150 mM and a temperature of 45 to 55.degree. Specifically, conditions such as 50 mM at 80 mM can be mentioned.
  • the DNA to be hybridized is preferably a base sequence having at least 40% or more homology to the base sequence of the above (a), more preferably 60%, still more preferably 90% or more, particularly preferably It is 95% or more, most preferably 99% or more.
  • the base corresponding to the base at the substitution site is the same as the base at the substitution site.
  • the "corresponding base” of the “base corresponding to the base at the substitution site” means that the DNA consisting of the base sequence of the above (b) hybridizes with the complementary strand to the DNA consisting of the base sequence of the above (a) In this case, in this hybrid, it means a base (triplet) in a position opposing relationship with a complementary base (triplet) to the base at the substitution site.
  • the base sequence of (b) for example, the base sequence is not completely identical as compared with the base sequence of (a), but the amino acid sequence after translation is completely identical.
  • are particularly preferred i.e., a nucleotide sequence obtained by subjecting the nucleotide sequence of (a) to a silent mutation).
  • the polynucleotide possessed by the recombinant adeno-associated virus virion of the present invention is a nucleotide sequence of the signal peptide, adjacent to the upstream side of the nucleotide sequence encoding the first amino acid sequence, such as the nucleotide sequence of (a) or (b) above.
  • the nucleotide sequence encoding the second amino acid sequence which includes the nucleotide sequence encoding the two amino acid sequence, includes the nucleotide sequence from 1428th to 1517th in SEQ ID NO: 26 or the 1st to 162nd nucleotides in SEQ ID NO: 27
  • the second base sequence can be exemplified.
  • the base sequence encoding the first amino acid sequence is the base sequence of the above (a) or (b)
  • the base sequence encoding the second amino acid sequence is the base sequence from 1428th to 1517th of SEQ ID NO: 26 Is preferred.
  • the recombinant adeno-associated virus virion of the present invention comprises Capsomers comprising proteins capable of forming viral virions, as well as A polynucleotide packaged in the capsomer, comprising a promoter sequence, and a base sequence encoding the first amino acid sequence and the second amino acid sequence operably linked to the promoter sequence. It is characterized by including.
  • a base sequence encoding the first amino acid sequence and the second amino acid sequence may be referred to as a "target base sequence”.
  • a polynucleotide comprising a promoter sequence and a target base sequence operably linked to the promoter sequence may be on either the sense strand side or the antisense strand side. That is, the range of the polynucleotide including the promoter sequence and the target base sequence operably linked to the promoter sequence also includes polynucleotides complementary thereto.
  • Such recombinant adeno-associated virus virions (rAAV virions) of the present invention can pass through the blood-brain barrier of a living body (including the uncompleted fetal and neonatal blood-brain barriers, and the established adult blood-brain barrier).
  • the rAAV virions of the present invention can target neural cells contained in adult brain, spinal cord and the like by peripheral administration.
  • peripheral administration includes intravenous administration, intraarterial administration, intraperitoneal administration, intracardiac administration, intramuscular administration, umbilical cord intravascular administration (for example, in the case of fetal administration), etc. Refers to a route of administration commonly understood as administration.
  • the rAAV virions of the present invention can also be targeted to neurons by intracerebral or intrathecal administration.
  • modHex B modified ⁇ -subunit of wild-type human ⁇ -hexosaminidase expressed from the polynucleotide in cells into which the rAAV virion of the present invention has been incorporated, but modHex B is secreted from the cells
  • a cross-collection effect that acts also in the other cells is recognized.
  • the features of the recombinant adeno-associated virus virion of the present invention are described below.
  • Adeno-associated virus Natural adeno-associated virus (AAV) is a non-pathogenic virus. Using this feature, various recombinant virus vectors are produced to deliver a desired gene for gene therapy (eg, WO 2003/018821, WO 2003/053476, WO 2007/001010, See pharmaceutical magazines 126 (11) 1021-1028 etc.).
  • the wild-type AAV genome is a single-stranded DNA molecule having a total length of about 5 kb and a nucleotide length, and is a sense strand or an antisense strand.
  • AAV genomes generally have inverted terminal repeat (ITR) sequences of about 145 nucleotides in length at both the 5 'and 3' ends of the genome.
  • ITR inverted terminal repeat
  • This ITR is known to have various functions such as a function as an origin of replication of the AAV genome and a function as a packaging signal of the genome into virions (for example, the above-mentioned pharmaceutical journal 126). (11) 1021-1028 etc.).
  • the internal region (hereinafter referred to as internal region) of the wild-type AAV genome flanked by ITRs contains the AAV replication (rep) gene and the capsid (cap) gene.
  • the rep gene and cap gene respectively encode a protein Rep involved in viral replication and a capsid protein (for example, at least one of VP1, VP2 and VP3) forming a capsomer which is an outer shell of an icosahedral structure .
  • a capsid protein for example, at least one of VP1, VP2 and VP3
  • a capsomer which is an outer shell of an icosahedral structure
  • Natural adeno-associated viruses are known in various types and tend to be found in the cells to be infected (eg, Gao, G, et al., Curr. Gene Ther. 5: 285-297, 2005, Xin, KQ, et al., J. Virol. 80: 11899-910, 2006, Hellstroem, M, et al., Gene Ther. 16: 521-32, 2009, etc.).
  • the rAAV vector of the present invention is preferably derived from natural adeno-associated virus type 1 (AAV1), type 2 (AAV2), type 3 (AAV3), type 4 (AAV4), type 5 (AAV5), type 6 (AAV6) And 7) (AAV 7), 8 (AAV 8), 9 (AAV 9) and the like, but is not limited thereto.
  • AAV1 adeno-associated virus
  • AAV2 type 3
  • AAV4 type 4
  • AAV5 type 6
  • AAV6 AAV 6
  • AAV9 AAV 9
  • GenBank accession numbers AF063497.1 (AAV1), AF043303 (AAV2), NC_001729 (AAV3), NC_001829.1 (AAV4), NC_006152.1 (AAV5), respectively.
  • AAV6 The nucleotide sequence of AF 028704.1 (AAV6), NC — 006260.1 (AAV 7), NC — 006261.1 (AAV 8), AY 530579 (AAV 9) can be referred to.
  • types 2, 3, 5 and 9 are of human origin.
  • B AAV-PHP. It is preferred to utilize a nucleotide sequence encoding a capsid protein derived from eB.
  • AAV1 and AAV9 have been reported to have a relatively high infection efficiency to neurons (Taymans, et al., Hum Gene Ther 18: 195-206, 2007, etc.).
  • AAV2 has already been clinically applied in gene therapy for Parkinson's disease, etc. (Kaplitt, et al., Lancet 369: 2097-2105, 2007, Marks, et al., Lancet Neurol 7: 400-408, 2008, Christine et al, Neurology 73: 1662-1669, 2009, Muramatsu, et al, MoI Ther 18: 1731-1735, 2010, etc.).
  • capsid proteins in the rAAV Virions of the Invention are preferably: AAV1, AAV2, AAV9, AAV-rh10, AAV-PHP. B or AAV-PHP.
  • eP-derived VP1 capsid protein more preferably, AAV1, AAV2, AAV9, AAV-rh10, AAV-PHP. B or AAV-PHP.
  • the rAAV virio of the present invention containing these capsid proteins are likely to cross the blood-brain barrier in fetuses, neonates and adults.
  • the capsid protein comprised by the rAAV virion of the present invention has a surface exposed tyrosine residue (e.g.
  • virus virion surface exposed amino acid side chain in the VP1 amino acid sequence (e.g. SEQ ID NO: 2, 4 or 6)
  • At least one of the tyrosine residues being substituted is replaced with another amino acid.
  • it has an amino acid sequence having 99.8% or more, 99.9% or more identity, at least one of surface exposed tyrosine residues is substituted with another amino acid, and can form a viral virion Protein is mentioned.
  • the capsid protein contained in the rAAV virion of the present invention alone or in combination with other capsid protein members (eg, VP2 and / or VP3 etc.) forms a capsomere, and the AAV genome (or AAV vector) in the capsomere
  • the genome can form the rAAV virions of the present invention packaged.
  • the mutually replaceable amino acid residues include other residues included in the group of similar amino acid residues (described later) to which the residue belongs.
  • Capsid proteins modified by mutually replaceable amino acid residues can be produced according to methods known to those skilled in the art, such as ordinary genetic engineering techniques. For such gene manipulation procedures, see, for example, Molecular Cloning 3rd Edition, J. Mol. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press. 2001, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997, etc. can be referred to.
  • the capsid protein contained in the rAAV virion of the present invention is preferably one of the tyrosine residues 252, 273, 445, 701, 705 or 731 which are surface exposed in SEQ ID NO: 2 One or more are substituted by another amino acid, preferably a phenylalanine residue.
  • the tyrosine residue at position 445 is substituted with a phenylalanine residue.
  • the capsid protein contained in the rAAV virion of the present invention is preferably a tyrosine residue of position 252, position 272, position 444, position 500, position 700, position 704 or position 730 exposed to surface in SEQ ID NO: 4
  • One or more of them are substituted by another amino acid, preferably a phenylalanine residue.
  • the tyrosine residue at position 444 is substituted with a phenylalanine residue.
  • the capsid protein contained in the rAAV virion of the present invention is preferably at least one tyrosine of position 252, position 274, position 446, position 701, position 705, position 706 or position 731 which is surface exposed in SEQ ID NO: 6
  • One or more of the residues are substituted with another amino acid, preferably a phenylalanine residue.
  • the tyrosine residue at position 446 is substituted with a phenylalanine residue.
  • the capsomer of the rAAV virion of the invention may comprise the above mentioned proteins alone or may comprise other members (VP2 and / or VP3) together.
  • the above-mentioned positions of substituted amino acid residues are substitution of amino acid residues at corresponding positions in VP2 and VP3 of the respective virus types, preferably substitution of phenylalanine residue of the corresponding tyrosine residue.
  • modified capsid proteins can be produced according to methods known to those skilled in the art, such as ordinary genetic engineering techniques. For such gene manipulation procedures, see, for example, Molecular Cloning (3rd Edition).
  • the viral virions of the invention containing these capsid proteins can cross the adult and fetal blood-brain barrier, as described above.
  • viral virions containing a functionally equivalent capsid protein can infect nervous system cells contained in adult brain, spinal cord and the like by peripheral administration.
  • neural cells as gene transfer targets include at least neurons contained in the central nervous system such as the brain and spinal cord, and further include glial cells, microglia, astrocytes, oligodendrocytes, It may also include ventricular ependymal cells, cerebral vascular endothelial cells and the like.
  • the percentage of neurons among the neural cells to be transfected is preferably 70% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, 99.1% or more, 99.2% or more, 99.3% or more, 99.4% or more, 99.5% or more, 99.6% or more, 99.7% or more, 99.8% or more, 99.9% or more, or 100%.
  • amino acid sequences of SEQ ID NO: 8, 10 or 12 or at positions other than positions 444-446 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, 10 or 12 contains a deleted, substituted, inserted and / or added amino acid sequence and still contains a protein capable of forming a viral virion.
  • the capsid protein contained in the rAAV virion of the present invention is contained in the capsomer of the rAAV virion of the present invention alone or together with other capsid protein members (such as VP2 and / or VP3)
  • An AAV genome (or a recombinant AAV vector genome) is packaged within the capsomer. Two or more of the above amino acid deletions, substitutions, insertions and additions may occur simultaneously.
  • a protein for example, 1 to 50, for example, at positions other than positions 444-446 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, 10 or 12 or in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, 10 or 12 1 to 40, 1 to 39, 1 to 38, 1 to 37, 1 to 36, 1 to 35, 1 to 34, 1 to 33, 1 to 32, 1 to 31, 1 to 30, 1 to 29, 1 to 28, 1 to 27, 1 to 26, 1 to 25, 1 to 24, 1 to 23, 1 to 22, 1 to 21, 1 to 20, 1 to 19, 1 to 18, 1 to 17, 1 to 16, 1 to 15, 1 to 14, 1 to 13, 1 to 12, 1 to 11, 1 to 10, 1 to 9 (1 to several), 1 to 8, 1 to 7, 1 to 6, 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3, 1 to 2 Or 1 ami Residues are deleted, substituted, including insertion and / or added in the amino acid sequence, and include proteins capable of forming a virion.
  • the rAAV virions of the present invention that are formed can pass through the adult and fetal blood-brain barrier, as described above, and can be introduced into nerve cells such as the brain and spinal cord preferably by peripheral administration.
  • the rAAV virion of the present invention can be gene-introduced into nervous system cells contained in the fetal brain and spinal cord of the mother by peripheral administration to the mother.
  • These modified capsid proteins can be produced according to methods known to those skilled in the art, such as ordinary genetic engineering techniques.
  • Examples of mutually replaceable amino acid residues in the protein (polypeptide) of the present invention are shown below.
  • Amino acid residues included in the same group can be mutually substituted.
  • Group A leucine, isoleucine, norleucine, valine, norvaline, alanine, 2-aminobutanoic acid, methionine, o-methylserine, t-butylglycine, t-butylalanine, cyclohexylalanine;
  • Group B aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid , Isoglutamic acid, 2-aminoadipic acid, 2-aminosuberic acid;
  • group C asparagine, glutamine;
  • group D lysine, arginine, ornithine, 2,4-diaminobutanoic acid, 2,3-diaminopropionic acid;
  • group E Proline, 3-hydroxyproline, 4-hydroxyproline; F
  • capsid proteins VP1, VP2 and / or VP3 contained in the rAAV virion of the present invention may be encoded by one or more polynucleotides.
  • all capsid proteins in the present invention are encoded by one type of polynucleotide.
  • the capsid protein is encoded by the polynucleotide of SEQ ID NO: 7, 9 or 11.
  • the polynucleotide encoding the above capsid protein contained in the rAAV virion of the present invention encodes a protein functionally equivalent to the capsid protein capable of forming the recombinant virus virion of the present invention.
  • a polynucleotide is, for example, one or more (for example, 1 to 50, 1 to 40) in the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 7, 9 or 11, or in the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 7, 9 or 11.
  • Form the virus virion Comprising a polynucleotide encoding a protein can be. Two or more of these deletions, substitutions, insertions and additions may occur simultaneously.
  • the rAAV virions of the invention comprising capsid proteins encoded by such polynucleotides can cross the adult and fetal blood-brain barrier, as described above.
  • the rAAV virions of the present invention can be preferably transfected into nervous system cells contained in adult brain, spinal cord and the like by peripheral administration.
  • the rAAV virion of the present invention can be gene-introduced into nervous system cells contained in the fetal brain and spinal cord of the mother by peripheral administration to the mother. Generally, the smaller the number of deletions, substitutions, insertions and / or additions of the above nucleotides, the better.
  • Such a polynucleotide is, for example, a polynucleotide that can hybridize under stringent hybridization conditions to SEQ ID NO: 7, 9 or 11 or a complementary sequence thereof, and can form the recombinant viral virion of the present invention.
  • a protein eg, an amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, 10 or 12 or a deletion or substitution of one or more amino acids at positions other than positions 444 to 446 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, 10 or 12
  • It may comprise a polynucleotide encoding a protein comprising an inserted and / or added amino acid sequence.
  • Hybridization can be performed according to a known method or a method according thereto, such as a method described in Molecular Cloning (Molecular Cloning 3rd Edition, J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001). Moreover, when using a commercially available library, it can carry out according to the method as described in the instruction manual etc. which are provided by the manufacturer.
  • stringent conditions may be any of low stringency conditions, moderate stringency conditions and high stringency conditions.
  • “Low stringency conditions” are, for example, 5x SSC, 5x Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 32 ° C.
  • “moderately stringent conditions” are, for example, conditions of 5 ⁇ SSC, 5 ⁇ Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, and 42 ° C.
  • “Highly stringent conditions” are, for example, 5 ⁇ SSC, 5 ⁇ Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 50 ° C. Under these conditions, it can be expected that DNAs having high homology can be efficiently obtained as the temperature is raised. However, multiple factors such as temperature, probe concentration, probe length, ionic strength, time, and salt concentration can be considered as factors affecting the stringency of hybridization, and those skilled in the art should appropriately select these factors. Similar stringency can be achieved with
  • the hybridizable polynucleotide may be, for example, 70% or more of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7, 9 or 11, as calculated using homology search software such as FASTA, BLAST, etc. using default parameters. 80% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 95% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, 99.1% or more, 99.2% or more, 99.3% or more, 99.4% or more, 99.5% or more, 99.6% or more, 99.7% or more, 99.8% or more, 99.8% or more, 99.9% or more of identity Can be mentioned. Generally, the larger the value of the homology, the better.
  • the Rep protein used in the present invention has a function of recognizing an ITR sequence and performing genome replication depending on the sequence, a function of recruiting and packaging a wild-type AAV genome (or rAAV genome) into viral virions, It may have the same number of amino acid sequence identity as described above as long as it has the same function as that of the present invention, such as the function to form rAAV virions, and deletion of the same number of amino acid residues as described above , Substitution, insertion and / or addition. Functionally similar ranges include those described in the above description of specific activity.
  • a protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 16 is used.
  • the polynucleotide encoding the Rep protein used in the present invention is capable of recognizing ITR sequences and performing genome replication depending on the sequences, and recruiting a wild-type AAV genome (or rAAV genome) into viral virions It may have the same number of identities as above, as long as it encodes a Rep protein having the same degree of known functions, such as the function to package and the function to form rAAV virions of the present invention, It may include deletions, substitutions, insertions and / or additions of as many nucleotides. Functionally similar ranges include those described in the above description of specific activity.
  • a polynucleotide having the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 15 is used.
  • the capsid protein VP1 or the like encoded in the internal region of the wild-type AAV genome as described above, and the Rep protein It is provided embedded in the In the capsid proteins (VP1, VP2 and / or VP3) used in the present invention, and Rep proteins, polynucleotides encoding them are incorporated into one, two, three or more plasmids, as needed. It may be Optionally, polynucleotides encoding one or more of these capsid and Rep proteins may be included in the AAV genome.
  • capsid proteins VP1, VP2 and / or VP3
  • Rep proteins are all encoded by one polynucleotide and provided as an AAV helper plasmid. See, for example, the Examples herein.
  • the rAAV genome of the invention The recombinant adeno-associated virus polynucleotide packaged in the rAAV virion of the invention (hereinafter rAAV genome of the invention) is ITR located 5 'and 3' of the wild type AAV genome
  • the 5 'and 3' located ITRs are located at the 5 'and 3' ends of the AAV genome, respectively.
  • the rAAV genome of the present invention preferably includes, as the ITRs located at the 5 'end and the 3' end, a 5 'ITR and a 3' ITR contained in the genome of AAV1, AAV2, AAV3 or AAV9, more preferably And the 5 'ITR and 3' ITR contained in the AAV3 genome, particularly preferably the polynucleotide of SEQ ID NO: 13 as the 5 'ITR and the poly of SEQ ID NO: 14 as the 3' ITR. Contains nucleotides.
  • the ITR contained in the rAAV genome of the present invention may be reversed in the 5 'and 3' direction, since the ITR portion has a flip-flop structure in which complementary sequences are easily exchanged.
  • the length of the gene cassette replaced with the internal region is practically preferred to be as long as the length of the original polynucleotide. That is, the rAAV genome of the present invention is preferably about the same as 5 kb in which the full length is wild type, for example, about 2 to 6 kb, preferably about 4 to 6 kb.
  • the viral genome packaged within the recombinant adeno-associated virus virion takes several days to express the gene of interest contained in the genome due to this genome being single-stranded
  • the therapeutic gene to be introduced is designed to be self-complementary (referred to as a self-complementary (sc) type vector) to promote expression after viral vector infection.
  • sc self-complementary
  • the length of the above therapeutic gene is designed to be about half the length compared to the non-sc genomic vector It should be.
  • the length of the gene of interest that can be integrated is designed to be about 2 kb including the region required for promoter, polyadenylation and the like.
  • the rAAV genome used in the present invention may be non-sc or sc.
  • the entire expression cassette containing the target nucleotide sequence, or a part thereof, can form double-stranded DNA.
  • the target base sequence is operably combined with various known promoter sequences to express the target modHex B polypeptide.
  • the promoter sequence may be a tissue-nonspecific systemic promoter (ubiquitous promoter) to be expressed or a tissue-specific promoter. Since the target modHex B is required to be expressed in neural cells, neural cell-specific promoters can be used as tissue-specific promoters. However, the present inventors have found that a therapeutic effect is high when a systemic promoter is used rather than a neural cell specific promoter.
  • a systemic promoter selected from the group consisting of a cytomegalovirus (CMV) promoter, an EF-1 ⁇ promoter, an SV40 promoter and a CAG promoter is suitable.
  • CMV cytomegalovirus
  • the neural cell specific promoter sequences used in the present invention are derived from, for example, neural cells, glial cells, oligodendrocytes, cerebral vascular endothelial cells, microglia, ventricular epithelial cells, etc. It is not limited.
  • Neuronal cell specific promoters include synapsin I promoter sequence, myelin basic protein promoter sequence, neuron specific enolase promoter sequence, calcium / calmodulin-dependent protein kinase II (CMKII) promoter, tubulin ⁇ I promoter, platelet derived growth factor A nerve selected from the group consisting of ⁇ -chain promoter, glial fibrillary acidic protein (GFAP) promoter sequence, L7 promoter sequence (cerebellar Purkinje cell specific promoter), and glutamate receptor delta 2 promoter (cerebellar Purkinje cell specific promoter) Lineage cell specific promoters are preferred.
  • promoter sequences such as a calcium / calmodulin-dependent protein kinase II (CMKII) promoter, tubulin ⁇ I promoter, platelet-derived growth factor ⁇ chain promoter and the like can also be used.
  • CMKII calcium / calmodulin-dependent protein kinase II
  • tubulin ⁇ I promoter tubulin ⁇ I promoter
  • platelet-derived growth factor ⁇ chain promoter and the like.
  • the above promoter sequences may be used alone or in combination of any two or more.
  • the promoter is particularly preferably a systemic promoter, most preferably a CMV promoter.
  • the rAAV genome of the present invention may further contain known sequences such as enhancer sequences that aid in transcription of mRNA, translation into protein, etc., Kozak sequences, appropriate polyadenylation signal sequences and the like.
  • virus virion As used herein, unless stated otherwise, the terms “virus virion”, “virus vector”, “virus particle” are used interchangeably.
  • nucleic acid As used herein, the term “polynucleotide” is used interchangeably with “nucleic acid”, “gene” or “nucleic acid molecule” and is intended to be a polymer of nucleotides.
  • nucleotide sequence is used interchangeably with “nucleic acid sequence” or “base sequence” and is the sequence of deoxyribonucleotides (abbreviated A, G, C and T) It is shown as.
  • a polynucleotide or a fragment thereof comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 means a polynucleotide or a fragment thereof comprising a sequence represented by each deoxynucleotide A, G, C and / or T of SEQ ID NO: 1 Be done.
  • the "virus genome” and the “polynucleotide” according to the invention may each be present in the form of DNA (eg cDNA or genomic DNA) but may optionally be in the form of RNA (eg mRNA).
  • the viral genomes and polynucleotides used herein may each be double stranded or single stranded DNA. In the case of single stranded DNA or RNA, it may be the coding strand (also known as the sense strand) or the non-coding strand (also known as the antisense strand).
  • polypeptide As used herein, “protein” and “polypeptide” are used interchangeably and are intended to be polymers of amino acids.
  • the polypeptide used in the present specification has the N-terminus (amino terminus) at the left end and the C-terminus (carboxy terminus) at the right end according to the peptide label convention.
  • the partial peptide of the polypeptide of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as the partial peptide of the present invention) is a partial peptide of the above-mentioned polypeptide of the present invention, preferably, the above-mentioned poly of the present invention It has the same properties as the peptide.
  • the term "plasmid” refers to various known genetic elements such as, for example, plasmids, phages, transposons, cosmids, chromosomes and the like. Plasmids can replicate in a particular host and transfer gene sequences between cells.
  • the plasmid contains various known nucleotides (DNA, RNA, PNA and a mixture thereof), and may be single-stranded or double-stranded, but preferably double-stranded.
  • the term "rAAV vector plasmid” is intended to include the duplex formed by the rAAV vector genome and its complement unless otherwise stated.
  • the plasmids used in the present invention may be linear or circular.
  • the target sequence to be integrated into the rAAV genome of the present invention is delivered to neural cells with higher efficiency than conventional and integrated into the cell genome.
  • the number of nerves is about 10 times or more, about 20 times or more, about 30 times or more, about 40 times or more or about 50 times or more than that when using conventional rAAV vectors It is possible to introduce a gene into cells.
  • the number of gene-introduced neural cells can be determined, for example, by preparing rAAV virions packaging a rAAV vector genome incorporating any marker gene, and then administering this rAAV virion to a test animal to generate rAAV vector genomes.
  • marker genes can be selected. Examples of such marker genes include LacZ gene, green fluorescent protein (GFP) gene, luminescent protein gene (such as firefly luciferase) and the like.
  • GFP green fluorescent protein
  • luminescent protein gene such as firefly luciferase
  • rAAV virions packaged with the rAAV vector genome can pass through the blood-brain barrier of a living body, and thus, by peripheral administration to a subject, the target treatment for nervous system cells such as the brain and spinal cord of the subject. Gene can be introduced.
  • the term "packaging” refers to events including preparation of single-stranded viral genome, assembly of coat protein (capsid), and encapsidation of viral genome and the like.
  • the appropriate plasmid vector usually multiple plasmids
  • the recombinant viral particles ie, viral virions, viral vectors
  • rAAV Virions of the invention are provided.
  • the method comprises (a) a first polynucleotide encoding a capsid protein of the invention (generally referred to as an AAV helper plasmid), and (b) a second packaged within the rAAV virion of the invention
  • the step of transfecting the polynucleotide (including the target nucleotide sequence) into cultured cells can be included.
  • the preparation method of the present invention further comprises (c) transfecting a cultured cell with a plasmid encoding an adenovirus-derived factor called an adenovirus (AdV) helper plasmid, or infecting the cultured cell with adenovirus.
  • AdV adenovirus
  • the method may further comprise the steps of culturing the above-mentioned transfected cultured cells, and collecting the recombinant adeno-associated virus vector from the culture supernatant.
  • AdV adenovirus
  • the method of preparing the rAAV virion of the present invention comprises (a) a first polynucleotide encoding a protein comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8, 10 and 12, and (b) Transfecting a cultured cell with a second polynucleotide comprising a promoter sequence and a target base sequence between the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13 and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14.
  • first and second polynucleotides comprise, for example, a combination of polynucleotides as described in Example 3.
  • the nucleotide encoding the capsid protein of the present invention in the first polynucleotide is preferably operably linked to a known promoter sequence operable in cultured cells.
  • a promoter sequence for example, cytomegalovirus (CMV) promoter, EF-1 ⁇ promoter, SV40 promoter and the like can be used appropriately.
  • CMV cytomegalovirus
  • EF-1 ⁇ promoter EF-1 ⁇ promoter
  • SV40 promoter SV40 promoter
  • known enhancer sequences, Kozak sequences, poly A addition signal sequences and the like may be suitably included.
  • a first polynucleotide encoding a protein comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 8, 10 and 12 can be produced by the following method. Plasmids pAAV1-RC, pAAV2-RC, pAAV9 containing base sequences encoding respective coat protein VP1 for three types of AAV such as type 1 AAV (AAV1), type 2 AAV (AAV2) and type 9 AAV (AAV9) -Use RC as a template. These plasmids are derived from AAV3 Rep / VP described in the literature (Handa, et.
  • AAV3 Rep sequence (Muramatsu, et al., Et al., Virology 221, 208-217 (1996)).
  • the nucleotide sequences of these AAV VP1s are described in GeneBank Accession No. 1 respectively. It has already been reported as AF063497, AF043303, AY530579 (shown in SEQ ID NO: 1, 3 and 5, respectively).
  • a forward primer which is a DNA consisting of SEQ ID NO: 17 and a reverse primer which is a DNA consisting of SEQ ID NO: 18 are synthesized, and using Quick Change II XL site-directed mutagenesis kit (Stratagene).
  • the tyrosine (Y) residue located at position 445 of the VP1 amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of AAV1 is substituted with a phenylalanine (F) residue.
  • a forward primer which is a DNA consisting of SEQ ID NO: 19 and a reverse primer which is a DNA consisting of SEQ ID NO: 20 are synthesized, and 444th position of VP1 amino acid sequence of AAV2 (SEQ ID NO: 4)
  • the located tyrosine (Y) residue is replaced with a phenylalanine (F) residue.
  • a forward primer which is a DNA consisting of SEQ ID NO: 21 and a reverse primer which is a DNA consisting of SEQ ID NO: 22 are synthesized, and 446th position of VP1 amino acid sequence of AAV9 (SEQ ID NO: 6)
  • the located tyrosine (Y) residue is replaced with a phenylalanine (F) residue.
  • a plasmid pAAV1-yfRC comprising a polynucleotide encoding each of the substituted amino acid sequences AAV1-yfVP1 (SEQ ID NO: 8), AAV2-yfVP1 (SEQ ID NO: 10) and AAV9-yfVP1-3 (SEQ ID NO: 12) respectively.
  • PAAV2-yfRC, pAAV9-yfRC PAAV2-yfRC, pAAV9-yfRC.
  • pAAV1-yfRC, pAAV2-yfRC and pAAV9-yfRC all contain a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 15) encoding AAV2 Rep.
  • the second polynucleotide comprises a promoter sequence and a target nucleotide sequence. Furthermore, known enhancer sequences, Kozak sequences, poly A addition signal sequences and the like may be suitably included.
  • AAV is a helper-dependent virus
  • co-treatment with a helper virus eg, adenovirus, herpes virus or vaccinia
  • a helper virus eg, adenovirus, herpes virus or vaccinia
  • AAV inserts the viral genome into the host cell chromosome but does not produce infectious AAV virions derived from the inserted viral genome.
  • infectious AAV virions derived from the integrated genome can be generated.
  • the helper virus is required to be the same species as the host cell. For example, human AAV can replicate in canine cells coinfected with canine adenovirus.
  • a helper virus plasmid eg, adenovirus, herpes virus or vaccinia
  • the preparation method of the present invention further comprises the step of introducing an adenovirus (AdV) helper plasmid.
  • AdV helper plasmid encodes a protein such as E1a, E1b, E2a, E4 orf4, which is required for AAV genome replication and the like.
  • recombinant viral or non-viral vectors eg, plasmids, episomes, etc.
  • that carry the necessary helper functions may be utilized.
  • Such recombinant viruses can be produced according to techniques known and published in the art.
  • a variety of adenovirus strains are available from the ATCC (American Type Culture Collection) and are also commercially available.
  • the sequences of many adenovirus strains are available, for example, from public databases (eg, PubMed, Genbank, etc.).
  • the AdV helper is derived from the same species of virus as the cultured cells.
  • human AdV-derived helper virus vectors can be used.
  • AdV helper vectors commercially available ones (for example, AAV Helper-Free System of Agilent Technologies (Catalog No. 240071)) can be used.
  • rAAV virion of the present invention methods for transfecting the above-mentioned one or more types of plasmids into cultured cells can be carried out using various known methods such as calcium phosphate method, lipofection method, electroporation method, etc. it can. Such methods are described, for example, in Molecular Cloning 3rd Ed. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997.
  • compositions Comprising the rAAV Virions of the Present Invention
  • a pharmaceutical composition comprising the rAAV virions (rAAV vectors) of the present invention.
  • a pharmaceutical composition containing the rAAV virion of the present invention hereinafter referred to as the pharmaceutical composition of the present invention
  • target cells of a subject with high efficiency and a modified ⁇ -hexosaminidase of target
  • the gene of the subunit can be introduced, and the introduced gene provides a method capable of treating Tay-Sachs disease and / or Zandhoff's disease.
  • the rAAV virion of the present invention can pass through the blood-brain barrier of a living body, peripheral administration to a subject enables delivery of a gene to neural cells of the brain, spinal cord, retina, etc. of the rAAV virion of the present invention. It is.
  • the rAAV virions of the present invention can also deliver genes to neural cells such as the brain and spinal cord by intracerebral administration or intrathecal administration.
  • the pharmaceutical composition of the present invention for example, oral, parenteral (intravenous), muscle, oral mucous membrane, rectal, vaginal, transdermal, intranasal or inhalant etc. can be used.
  • parenteral intravenous
  • muscle e.g., a cal, a cal, a cal, a syline, a syline, a syline, a sulfen, etc.
  • intracerebral or intrathecal administration is further preferred.
  • the active ingredients of the pharmaceutical composition of the present invention may be formulated singly or in combination, but may be formulated with a pharmaceutically acceptable carrier or a pharmaceutical additive to be provided as a formulation. it can.
  • the active ingredient of the present invention can be contained, for example, in an amount of 0.1 to 99.9% by weight in the preparation.
  • Pharmaceutically acceptable carriers or additives include, for example, excipients, disintegrants, disintegrants, binders, lubricants, coatings, dyes, diluents, solubilizers, solubilizers, etc. Agents, pH adjusters, stabilizers and the like can be used.
  • preparations suitable for oral administration include, for example, powders, tablets, capsules, fine granules, granules, solutions or syrups and the like.
  • various excipients such as microcrystalline cellulose, sodium citrate, calcium carbonate, dipotassium phosphate, glycine, starch, preferably corn, potato or tapioca starch, and alginic acid and certain types
  • various disintegrating agents such as double silicates of the formula (I) and granulating binders such as polyvinylpyrrolidone, sucrose, gelatin, gum arabic.
  • lubricants such as magnesium stearate, sodium lauryl sulfate and talc are often very effective for tablet formation.
  • Solid compositions of the same type can also be used by filling in gelatin capsules. Suitable substances in this connection include lactose or milk sugar as well as high molecular weight polyethylene glycols.
  • the active ingredient is used in combination with various sweeteners or flavoring agents, coloring agents or dyes, and, if necessary, also with emulsifying and / or suspending agents.
  • preparations suitable for parenteral administration include injections, suppositories and the like.
  • a solution of the active ingredient of the present invention in either sesame oil or peanut oil or in an aqueous propylene glycol solution can be used.
  • the aqueous solution should be suitably buffered (preferably at a pH of 8 or more) as necessary, and the liquid diluent first rendered isotonic.
  • physiological saline can be used.
  • the prepared aqueous solutions are suitable for intravenous injection, while the oily solutions are suitable for intraarticular, intramuscular and subcutaneous injection.
  • the sterile preparation of all these solutions can be readily accomplished with standard pharmaceutical techniques well known to those skilled in the art.
  • the active ingredient of the present invention can also be administered topically, such as skin. In this case, it is desirable to administer topically in the form of a cream, jelly, paste, ointment according to standard pharmaceutical practice.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited, and an appropriate dosage is selected according to various conditions such as the type of disease, patient's age and symptoms, administration route, purpose of treatment, presence or absence of concomitant drug. It is possible.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is, for example but not limited to, 1 to 5000 mg, preferably 10 to 1000 mg, per day for an adult (for example, 60 kg of body weight). These daily doses may be administered in two to four divided doses.
  • vg vector genome
  • the method for producing the vector AAV-CMV-modHEXB (also called AAV-CMV-mod2B) used in Examples 1 and 2 is Example 3, and the method for producing the vector AAV-SynI-modHEXB (also called AAV-SynI-mod 2B) is Example
  • the method for producing vector AAV-CMV-GFP is described in detail in Example 5.
  • Example 1 Efficacy evaluation for Sandhoff disease model mice by intracerebroventricular administration of AAV-CMV-modHEXB> 1. Evaluation of efficacy against Sandhoff's disease (Hexb-/-) model mice (Hexa and Hexb simultaneous deletion) by intracerebroventricular administration of AAV-CMV-modHEXB 1.1.
  • PBS phosphate buffer solution
  • the supernatant (tissue extract) was prepared after centrifugation for 15 minutes at 12,000 x g at 4 ° C.
  • the vector amount of 5.75 ⁇ 10 11 vg / animal for SD mice corresponds approximately to 1.9 ⁇ 10 13 vg / kg of body weight.
  • anti-human HexA ( ⁇ ) rabbit polyclonal antibody NAG (A) was treated overnight with a primary antibody (1,000-fold diluted solution) at 4 ° C. overnight for blocking and washing brain sections. After washing with PBS, they were treated with Alexa 555-labeled anti-rabbit IgG as a secondary antibody, washed, and then encapsulated with 50% glycerol / PBS.
  • GM2 ganglioside GM2 ganglioside
  • AAV vector administration the above brain section is treated with anti-GM2 mouse monoclonal IgM antibody (100-fold dilution) overnight at 4 ° C. did. After washing with PBS, they were treated with Alexa 388-labeled anti-mouse Ig as a secondary antibody, washed, and then encapsulated with 50% glycerol / PBS.
  • NEUN neural cell marker
  • GFAP astrocyte marker
  • Iba1 microglia marker
  • Fig. 2 shows a human modHEXB enzyme protein (primary antibody) in a brain section of an SD model mouse, a brain section after administration of AAV-CMV-modHEXB to the intracerebroventricular zone of a SD model mouse, and a brain section of a wild type mouse (C57BL / 6)
  • the results of immunofluorescence histochemical analysis of NAG (A) and GM2 ganglioside are shown as In brain sections of SD model mice, staining of anti-GM2 antibody was positive and staining of NAG (A) was negative.
  • FIG. 3A shows the results of immunofluorescent histochemical analysis of accumulated GM2 ganglioside (green) in each region of the brain of the SD model mouse (Hexb ⁇ / ⁇ ). Staining of anti-GM2 antibody was positive and staining of NAG (A) was negative. It can be confirmed that GM2 ganglioside is accumulated. modHEXB (red) was not detected.
  • FIG. 3B shows the results of immunofluorescent histochemical analysis of GM2 ganglioside (green) and modHEXB (red) in each region of the brain of an SD model mouse (Hexb ⁇ / ⁇ ) to which AAV-CMV-modHEXB was intracerebroventricularly administered. . Staining of anti-GM2 antibody was slightly positive, and staining of NAG (A) was positive. It was confirmed that modHEXB (red) was expressed and GM2 ganglioside (green) was decreased.
  • FIG. 3C shows the results of immunofluorescent histochemical analysis of GM2 ganglioside (green) and modHEXB (red) in each region of the brain of wild type mice (C57BL / 6). Staining of anti-GM2 antibody was slightly positive, and staining of NAG (A) was slightly positive. It was confirmed that GM2 ganglioside (green) was not accumulated. It was confirmed that NAG (A) used as a primary antibody for detection of modHEXB cross-stained mouse Hex.
  • NEUN neural cell marker
  • GFAP astrocyte marker
  • Iba1 microglia marker
  • Alexa 544-anti-rabbit IgG fluorescently labeled secondary antibody
  • FIG. 4 shows the results of the above-mentioned immunofluorescence histochemical analysis.
  • the upper part of FIG. 4 shows the coloration of GFP in each section, and the lower part in FIG. 4 shows the staining results of NEUN (neural cell marker), GFAP (astrocyte marker) and Iba1 (microglia marker) in the same section as shown in the upper part.
  • NEUN neural cell marker
  • GFAP astrocyte marker
  • Iba1 microglia marker
  • AAV-CMV-modHEXB (also known as AAV-CMV-mod2B) 5.75 ⁇ in the intracerebroventricular zone of the 15-week-old SD mouse (late onset)
  • AAV-CMV-modHEXB 5.75 ⁇ 10 11 vg / 25 ⁇ L PBS (phosphate buffer solution) intracerebroventricularly to SD mice at 5 weeks (at
  • An AAV vector administered to cerebrospinal fluid was introduced into brain parenchymal constituent cells, and the GFP gene was expressed under control of the CMV ⁇ promoter in cells.
  • FIG. 8 shows brain sections of wild-type mouse (WT) brain sections, SD model mouse (SD) brain sections, and AAV-CMV-modHEXB administration (AAV) brain sections into the intracerebroventricular zone of SD model mice (AAV) Immunization of human modHEXB enzyme protein (using NAG (A) as primary antibody, red), GM2 ganglioside (using anti-GM2 antibody as primary antibody, green), cell nucleus (Hoechist staining, blue) in cerebrum, cerebellum, hippocampus) The results of fluorescence histochemical analysis are shown.
  • WT wild-type mouse
  • SD SD model mouse
  • AAV AAV-CMV-modHEXB administration
  • All sections of brain sections of wild type mice were slightly positive for human modHEXB enzyme protein (cross staining of mouse Hex), negative for GM2 ganglioside, and positive for Hoechist staining.
  • All sections of brain sections of SD model mice (SD) were negative for human modHEXB enzyme protein, positive for GM2 ganglioside, and positive for Hoechist staining.
  • AAV-CMV-modHEXB into the intracerebroventricular zone of SD model mice (AAV)
  • each site of brain sections was positive for human modHEXB enzyme protein, slightly positive for GM2 ganglioside, and positive for Hoechist staining.
  • GM2 ganglioside accumulates in the brain in SD mice, it was confirmed that administration of AAV-CMV-modHEXB reduces GM2 ganglioside.
  • FIG. 9 shows the brain sections of a wild-type mouse (WT) brain section, an SD model mouse (SD) brain section, and an AAV-CMV-modHEXB administration (AAV) brain section into the intracerebroventricular zone of an SD model mouse (AAV)
  • WT wild-type mouse
  • SD SD model mouse
  • AAV AAV-CMV-modHEXB administration
  • AAV AAV-CMV-modHEXB administration
  • AAV-CMV-modHEXB administration AAV
  • AAV AAV-CMV-modHEXB
  • CD68 accumulated in the brain in SD mice, it was confirmed that administration of AAV-CMV-modHEXB decreases CD68.
  • the rotarod test is started from 4 round-per-minutes (rpm) and is performed under the condition that the number of rotations is increased to 40 rpm in 120 seconds, and it is performed 6 times for each individual, and the average time for the mouse to fall from the rotarod Was measured. Also, tests were conducted under the same conditions for the same age wild type mice (WT) and SD mice (SD). I practiced one week before the exam. In addition, weight was measured at each time point, and survival (life span) was confirmed.
  • a single administration of AAV-CMV-modHEXB at a dose of 5.75 ⁇ 10 11 vg / animal at 8 weeks of age showed rotarod performance comparable to that of wild-type.
  • the dose of AAV-CMV-modHEXB was 5.75 ⁇ 10 10 vg / animal, the onset was slightly delayed but life span was not prolonged.
  • AAV-CMV-modHEXB 1.15 ⁇ 10 11 vg / 5 ⁇ L PBS (phosphate buffer) or 1.15 ⁇ 10 10 vg / 5 ⁇ L PBS once into the intracerebroventricular or temporal vein of SD heteromouse neonatal (P0 to P1)
  • each organ brain, heart, lung, liver, spleen, kidney
  • a protease / phosphatase inhibitor cocktail final concentration 20 ⁇ M leupeptin, 2 mM EDTA, 1 mM PMSF
  • Tissues were disrupted by sonication (probe-type sonicator and water bath-type nicardia 10 minutes) in distilled water (milliQ level) containing 1 mM pepstatin A) (wet tissue weight 100 mg / 0.3 mL).
  • the supernatant (tissue extract) was prepared after centrifugation for 15 minutes at 12,000 x g at 4
  • FIG. 13A shows a single administration of AAV-CMV-modHEXB at a dose of 1.15 ⁇ 10 11 vg / animal into the intracerebroventricular or temporal vein of Sandhoff's disease hetero (Hexb +/-) neonatal (P0-P2) mice After that, the specific activity of Hex activity (MUG degradation activity) in each organ at 10 weeks of age is shown.
  • FIG. 13B shows a single administration of AAV-CMV-modHEXB at a dose of 1.15 ⁇ 10 10 vg / animal into the intracerebroventricular or temporal vein of Sandhoff's disease hetero (Hexb +/ ⁇ ) neonatal (P0-P2) mice After that, the specific activity of Hex activity (MUG degradation activity) in each organ at 10 weeks of age is shown.
  • AAV-CMV-modHEXB 1.15 ⁇ 10 10 vg / 5 ⁇ L PBS (phosphate buffer) is administered in a single dose into the intracerebroventricular or temporal vein of SD mouse newborns (P0 to P1), and one week from 11 weeks of age The rotarod test was conducted every time.
  • the rotarod test was started from 4 round-per-minutes (rpm), was performed under the condition of increasing the rotational speed to 40 rpm in 120 seconds, was performed 6 times for each individual, and the average time to fall was measured. Also, tests were conducted under the same conditions for the same age wild type mice (WT) and SD mice (SD). I practiced one week before the exam. In addition, weight was measured at each time point, and survival (life span) was confirmed.
  • Example 2 Evaluation of differentiation induction system of neurons from iPS cells of patients with Tay-Sachs disease and evaluation of administration of AAV-CMV-modHEXB and AAV-SynI-modHEXB to human Sandhoff disease cultured neuron model system> 1. Evaluation of the efficacy of AAV-CMV-modHEXB and AAV-SynI-modHEXB administration for differentiation induction system from iPS cells in patients with Tay-Sachs disease Kondo T, et al. Cell Stem Cell 12 (4): 487- Using the method reported in 496 (2013), differentiation induction of neurons was performed from Tay-Sachs disease (TSD) patient iPS cells (TSD iPS cells).
  • TSD Tay-Sachs disease
  • FIG. 15 shows an outline of differentiation induction from iPS cells to neurons.
  • healthy individuals seeded on 8-well chamber slides and TSD iPS cell-derived nervous system cells were fixed with 4% paraformaldehyde / PBS solution for 1 hour at room temperature. After washing with PBS, blocking was performed using 5% goat serum / PBS for 1 hour at room temperature.
  • GM2 ganglioside GM2 ganglioside
  • the results are shown in FIG. Each scale bar in the figure shows 50 ⁇ m.
  • the neural cells (TSD-N) induced to differentiate from TSD iPS cells and the neural cells (Normal-N) induced to differentiate from iPS cells derived from human healthy subjects are both ⁇ -Tubullin III, TBR1, A2B5, GFAP Immunofluorescence was positive.
  • GM2 ganglioside was slightly positive in Normal-N, whereas TSD-N was strongly positive for GM2 ganglioside immunofluorescence. Therefore, both neural cells (TSD-N) induced to differentiate from TSD iPS cells and neural cells (Normal-N) induced to differentiate from iPS cells derived from human healthy subjects are both neural cell marker positive cell populations.
  • TSD-N accumulation of GM2 ganglioside was confirmed.
  • the dose-dependency of modHex B gene transfer to Sachs patient iPS cell-derived neurons (Day 79 after differentiation start) was 0.1 x 10 6 and 0.5 x 10 per cell cultured on polyornithine / laminin-coated dishes, respectively. 6 and 1.0 ⁇ 10 6 vg were administered to the culture fluid, and after 7 days (Day 86 time point), the culture fluid was recovered, the cells were washed and harvested, and a cell extract was prepared.
  • MUG 4-methyl umbelliferyl ⁇ -D-glucosaminide
  • MUGS 4-methyl umbelliferyl 6-sulfo- ⁇ -D-glucosaminide
  • FIG. 17 shows the results of the effects of modHex B gene introduction to TSD-N and the dose dependency (restoration of the defective Hex activity) by AAV-SynI-modHEXB.
  • MUG degradation activity, MUGS degradation activity, and ⁇ -GAL degradation activity in TSD-N treated with each amount of AAV-SynI-modHEXB are set to 100% activity in Normal-N similarly treated Shown as a relative value.
  • TSD-N was treated with AAV-SynI-modHEXB at 1.0 ⁇ 10 6 vg / cell
  • MUGS degradation activity was slightly recovered (up to 15% for Normal-N).
  • FIG. 18 shows the results of the effects of modHex B gene transfer to TSD-N by AAV-CMV-modHEXB and the dose dependency (restoration of defective Hex activity).
  • MUG degradation activity, MUGS degradation activity, and ⁇ -GAL degradation activity in TSD-N treated with each amount of AAV-CMV-modHEXB were made 100% activity in the same treatment Normal-N Shown as a relative value.
  • MUGS degradation activity was greatly restored.
  • the SH-SY5Y cells into which HEXB knockout vector has been introduced are sorted by FACS into OFP-expressing (CAS9-expressing) cells, and maintenance culture is carried out using DMEM / F12 + 10% FBS, 70 ⁇ g / 100 ⁇ g / mL penicillin G / streptomycin medium Did.
  • a defective strain in which the degradation specific activity of the artificial fluorescent substrate MUG was reduced to 2% or less of the parent strain was selected by the limiting dilution method.
  • HEXB KO SH-SY5Y cells and the parent strain were fixed with 4% paraformaldehyde / PBS solution for 1 hour at room temperature. After washing with PBS, blocking for 1 hour at room temperature with 5% goat serum / PBS, anti-GM2 mouse monoclonal IgM antibody (100-fold dilution) against the accumulation substrate GM2 ganglioside (GM2) At 4 ° C. overnight. After washing, it was treated with Cy3-labeled anti-rabbit IgG antibody as a secondary antibody, and Hoechst 33258 was used for nuclear fluorescent staining. After washing, they were sealed with 50% glycerol / PBS, and immunofluorescently observed using a confocal laser scanning microscope (Zeiss LSM 700).
  • FIG. 19 shows MUG degradation activity and ⁇ -Gal degradation activity (both specific activity per unit protein amount) of HEXB KO SH-SY5Y cells (HEXB KO) and a wild-type parent strain (WT).
  • FIG. 20 shows immunofluorescence observation images of HEXB KO SH-SY5Y cells (HEXB KO) and GM2 ganglioside (red) and cell nucleus (blue) of a wild-type parent strain (WT).
  • the observed images of HEXB KO and WT in FIG. 20 both contain cell nuclei (blue), while the observed images of HEXB KO were strongly positive for the immunofluorescence of GM2 ganglioside (red), whereas the observed images of WT showed GM2
  • the immunofluorescence of ganglioside (red) was slightly positive.
  • MUG degradation activity reduced by about 2% and accumulation of a substrate (GM2 ganglioside) were observed as compared to the wild type parent strain (WT).
  • the cells were fixed with 4% paraformaldehyde / PBS solution for 1 hour at room temperature. After washing with PBS, blocking was performed using 5% goat serum / PBS for 1 hour at room temperature. Treated overnight at 4 ° C. with primary antibodies to Nestin (neural stem cell marker), PSA-NCAM (neural progenitor cell marker), ⁇ -Tubulin III and NF-L (neural cell marker).
  • a Cy3-labeled anti-rabbit IgG antibody was used as a secondary probe and Hoechst 33258 was used for nuclear fluorescent staining. After washing, they were sealed with 50% glycerol / PBS, and immunofluorescently observed using a confocal laser scanning microscope (Zeiss LSM 700).
  • FIG. 21 shows the results of immunofluorescence observation of HEXB KO SH-SY5Y cells (HEXB KO) before differentiation induction (differentiated) and after 12 days of culture in differentiation induction medium (differentiated).
  • differentiation induced untreated, differentiated was Nestin positive, PSA NCAM positive, GFAP positive, A2B 5 slightly positive, NF-L slightly positive, ⁇ -Tubulin III slightly positive, Hoechst 33258 positive .
  • differentiation induction medium differentiates into NF-L and ⁇ -tubulin III.
  • FIG. 22 shows MUG degradation specific activity (Hex activity) in cells (cell extract) of human HEXB KO SH-SY5Y cultured neurons treated with different doses of AAV vector.
  • AAV-CMV-modHEXB showed higher expression efficiency than AAV-SynI-modHEXB.
  • FIG. 23 shows MUG degradation specific activity (Hex activity) in the outside (culture supernatant) of human HEXB KO SH-SY5Y cultured neurons treated with different doses of AAV vector. It was shown that AAV-CMV-modHEXB showed higher expression efficiency than AAV-SynI-modHEXB and that the expressed modHexB was secreted extracellularly.
  • FIG. 24 shows the results of Western blotting. It was confirmed that the modHEXB gene product introduced into human neurons was secreted extracellularly as a precursor protein.
  • Example 2 Summary By gene transfer using AAV-SynI-modHEXB in which modHEXB gene is linked downstream of neuron specific expression promoter, MUGS degradation activity in iPS cell-derived neurons of Tay-Sachs disease patient and human Sandhoff disease MUG degradation activity in the model cultured neuroblastoma SH-SY5Y HEXB strain K0 was slightly restored.
  • AAV-CMV-modHEXB in which modHEXB gene is linked downstream of ubiquitous expression promoter CMV ⁇ is used, MUGS degradation activity in iPS cell-derived neurons of Tay-Sachs disease patient and human Sandhoff disease model cultured neuroblastoma SH-SY5Y MUG degradation activity in the HEXBK0 strain was significantly recovered.
  • AAV-CMV-modHEXB When AAV-CMV-modHEXB is administered at 1 ⁇ 10 6 vg / cell to human Sandhoff disease model cultured neuroblastoma SH-SY5Y HEXB strain K0, the recombinant human modHex B precursor protein expressed in neurons is extracellularly expressed. The cross-collection effect was expected because it was secreted.
  • Example 3 Preparation of AAV-CMV-modHEXB (1) Modification of AAV coat (capsid) protein VP1
  • AAV9 9-type AAV
  • a plasmid pAAV9-RC containing a nucleotide sequence encoding coat protein VP1 was used as a template.
  • This plasmid is derived from AAV3 Rep / VP described in the literature (Handa, et. Al., J Gen Virol, 81: 2077-2084, 2000) and contains the AAV3 Rep sequence (Muramatsu, et al., Virology 221, 208-217 (1996)).
  • the nucleotide sequence of VP1 of AAV9 is described in GeneBank Accession No.
  • pAAV9-yfRC contains a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 15) encoding AAV2 Rep.
  • yfAAV9-F 5 '-CGACCAATACTTGTACTTTCTTCAAAGAC-3' (SEQ ID NO: 21)
  • yfAAV9-R 3'-GCTGGTTATGAACATGAAAGAGAGTTTTCTG-5 '(SEQ ID NO: 22)
  • ITR inverted terminal repeats
  • hGH human growth hormone
  • WPRE woodchuck hepatitis virus posttranscriptional
  • SEQ ID NO: 26 shows the nucleotide sequence of the expression cassette from the ITR on the 5 'side of pAAV-CMV-modHEXB to the ITR on the 3' side.
  • the 1st to 146th base sequence of SEQ ID NO: 26 is the 5 'side ITR sequence
  • the 382nd to 951st base sequence of SEQ ID NO: 26 is the CMV promoter sequence
  • the h-th to 1369-th base sequence is the hGH first intron sequence
  • the 1-th to 4-th 3026-th base sequence of SEQ ID NO: 26 is the modHEXB sequence
  • the sequence is a WPRE sequence
  • the 3728th to 3862nd base sequences of SEQ ID NO: 26 are SV40 polyadenylation sequences
  • the 3939th to 4083th base sequences of SEQ ID NO: 26 are 3 'side ITR
  • the cells were detached from the culture dish by adding 0.5 M EDTA and suspended in TBS (100 mM Tris HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl). The cells were disrupted by freezing / thawing three times using dry ice ethanol and a water bath at 37 ° C. After centrifugation at 10,000 ⁇ g for 10 minutes, the supernatant was collected to remove coarse cell debris.
  • TBS 100 mM Tris HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl
  • rAAV vector was purified by ultracentrifugation with a cesium chloride CsCl density gradient according to the following procedure. A density gradient was prepared by overlaying 1.5 M and 1.25 M CsCl in an ultracentrifuge tube. After layering the cell disruption solution containing rAAV vector, ultracentrifugation (30,000 rpm, 2.5 hours) was performed. The refractive index was measured and a fraction containing RI: 1.365 to 1.380 rAAV vector was collected. This fraction was again overlaid on a CsCl solution and ultracentrifuged (36,000 rpm, 2.5 hours) to obtain a fraction containing rAAV.
  • AAV-SynI-modHEXB is a vector genome plasmid, and in the base sequence of the expression cassette of AAV-CMV-modHEXB shown in SEQ ID NO: 26, the CMV promoter sequence of SEQ ID NO: 26 from 382 to 951 is SEQ ID NO: 23 Except using the vector genome plasmid containing the expression cassette of the base sequence substituted to the SynI promoter sequence shown in, it was produced by the same method as the production method of AAV-CMV-modHEXB shown in Example 3.
  • Example 5 Preparation of AAV-CMV-GFP
  • AAV-CMV-GFP is known as the vector genome plasmid
  • the base sequence of 1428th to 3026th of SEQ ID NO: 26 is modHEXB
  • the AAV-CMV-modHEXB was prepared in the same manner as in Example 3 except that a vector genome plasmid containing an expression cassette for the base sequence substituted for the GFP sequence was used.
  • Example 6 Administration of AAV-CMV-modHEXB to cynomolgus monkeys> Single administration of AAV-CMV-modHEXB prepared by the method described in Example 3 at a dose of 2.0 ⁇ 10 12 vg / kg body weight into the intrathecal space of five 2-year-old healthy cynomolgus monkeys (Macaca fascicularis) did. Five individuals were designated as individual numbers # 1- # 5, respectively. As a result of observation for 3 months after administration, no adverse effects were observed on appetite, body weight and behavior.
  • Parietal cortex Temporal cortex Entorhinal cortex Hippocampus (Hippocampus) Putamen (Putamen) Cerebellum (Cerebellum) Brain stem (Brain stem) Cervical spinal cord (C4-C6) Thoracic spine (Thoracic spinal cord) (Th6-Th8) Lumber spinal cord (L2-L4) Heart Lung (Lung) Liver (Liver) Spleen Kidney (Kidney) 300 ⁇ L of ultrapure water was added per 100 mg of wet weight of each tissue, and ultrasonic crushing was performed 10 times for 2 minutes with an ultrasonic crushing apparatus to obtain a crushed solution.
  • the disrupted solution was then sonicated for 10 minutes in a sonication (water bath) apparatus.
  • the disrupted solution after treatment was centrifuged at 12,000 ⁇ g for 15 minutes at 4 ° C., and the supernatant was recovered as a sample for enzyme activity measurement (tissue extract).
  • the substrate degradation activity was measured by incubating a fixed amount of tissue extract appropriately diluted with ultrapure water and a solution of MUG or MUGS for 30 minutes at 37 ° C., and then adding 370 ⁇ L of 0.2 M glycine-NaOH (pH 10.7) The reaction was stopped, and 200 ⁇ L of each was dispensed into a 96-well multiwell plate to perform fluorescence measurement (excitation light 355 nm, detection light 460 nm).
  • Plasma Hex activity Blood was collected before administration of AAV-CMV-modHEXB and 12 weeks after administration (immediately after euthanasia) to obtain plasma. Incubate 15 ⁇ L of a 10-fold dilution of plasma with ultrapure water and 15 ⁇ L of MUGS solution at 37 ° C for 30 minutes, and then add 370 ⁇ L of 0.2 M glycine-NaOH (pH 10.7) to stop the reaction, 96-well multiwell 200 ⁇ L of each was dispensed on a plate and fluorescence measurement (excitation light 355 nm, detection light 460 nm) was performed.
  • Example 7 Administration of AAV-CMV-GFP to cynomolgus monkeys> Single administration of AAV-CMV-GFP prepared by the method described in Example 5 at a dose of 2.0 ⁇ 10 12 vg / kg body weight into the intrathecal space of two 2-year-old healthy cynomolgus monkeys (Macaca fascicularis) did. As a result of observation for 3 months after administration, no adverse effects were observed on appetite, body weight and behavior.
  • Parietal cortex Temporal cortex Entorhinal cortex Hippocampus (Hippocampus) Putamen (Putamen) Cerebellum (Cerebellum) Brain stem (Brain stem) Cervical spine (Spinal cord (C4-C6)) Thoracic spine (Spinal cord (Th6-Th8)) Lumbar spine (Spinal cord (L2-L4))
  • RIPA buffer 50 mM Tris-HCl (pH ya 7.5), 150 mM NaCl, 0.5% Sodium Deoxycholate, 0.1% SDS, 1% NP-40
  • the disrupted solution was then sonicated for 10 minutes in a sonication (water bath) apparatus.
  • the disrupted solution after treatment was centrifuged at 12,000 ⁇ g for 15 minutes at 4 ° C., and the supernatant was collected as a sample for GFP detection (tissue extract) by Western blotting.
  • SEQ ID NO: 1 wild type AAV1-derived capsid protein AAV1-VP1 nucleotide sequence (GenBank: NC 022077.1)
  • SEQ ID NO: 2 wild type AAV1-derived capsid protein AAV1-VP1 amino acid sequence (GenBank: NC — 2077.1)
  • SEQ ID NO: 3 wild type AAV2-derived capsid protein AAV2-VP1 nucleotide sequence (GenBank: NC_001401.2)
  • SEQ ID NO: 5 wild type AAV9-derived capsid protein AAV9-VP1 nucleotide sequence (GenBank: AY530579.1)
  • SEQ ID NO: 6 wild type AAV9-derived capsid protein AAV9-VP1 amino acid sequence (GenBank: AY530579.1)
  • SEQ ID NO: 7 AAV1-derived capsid protein variant AAV1-yf

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Abstract

改変型β－サブユニットをタンパク質の形態で患者に投与する、従来のザンドホッフ病及びテイ－サックス病の治療法は、投与を高頻度で行う必要がある。　本発明は、ウイルスビリオンを形成可能なタンパク質を含むキャプソメア、並びに、前記キャプソメア内にパッケージングされたポリヌクレオチドであって、プロモーター配列と、前記プロモーター配列と作動可能に連結される、野生型ヒトβ－ヘキソサミニダーゼのβ－サブユニットの配列番号２８の第５５番目～第５５６番目のアミノ酸配列において、第３１２番目～第３１８番目のアミノ酸が、それぞれ順に、グリシン、セリン、グルタミン酸、プロリン、セリン、グリシン、及び、トレオニンに置換されている第１アミノ酸配列、並びに、前記第１アミノ酸配列のＮ末端側に連結されたシグナルペプチドのアミノ酸配列である第２アミノ酸配列をコードする塩基配列とを含むポリヌクレオチドを含む、組換えアデノ随伴ウイルスビリオンに関する。

Description

テイ－サックス病及びザンドホッフ病治療用の新規アデノ随伴ウイルスビリオン
　本発明はテイ－サックス病及びザンドホッフ病治療用の新規アデノ随伴ウイルスビリオンに関する。
　テイ－サックス病及びザンドホッフ病は、いずれも、β－ヘキソサミニダーゼＡ（Ｈｅｘ　Ａ）の活性低下により、神経系細胞にＧＭ２ガングリオシドが蓄積して脳神経症状を来たす疾患である。Ｈｅｘ　Ａは、α－サブユニットとβ－サブユニットから構成されるヘテロ二量体であり、ＧＭ２ガングリオシドを分解する酵素活性を持つ。テイ－サックス病は、α－サブユニット欠損に基づくＨｅｘ　Ａ欠損症であり、ザンドホッフ病は、β－サブユニット欠損に基づくＨｅｘ　Ａ欠損症である。
　本発明者らはこれまでに、ＣＨＯ細胞株や特殊酵母株に対して、α－サブユニット及びβ－サブユニットをコードする遺伝子（各々ＨＥＸＡ　ｃＤＮＡ及びＨＥＸＢ　ｃＤＮＡ）が挿入された発現ベクターを導入し、野生型の組換えＨｅｘ　Ａを恒常発現する細胞株を樹立している。この方法で生産した野生型組換えＨｅｘ　Ａを、ザンドホッフ病モデルマウスに投与したところ、脳神経系に蓄積していたＧＭ２ガングリオシドの減量や神経症状の改善が見られ、ザンドホッフ病やテイ－サックス病に対する酵素補充療法の有効性を確認した（特許文献１；非特許文献１）。
　本発明者らはさらに、野生型組換えＨｅｘ　Ａをそのままテイ－サックス病やザンドホッフ病患者に投与する場合に副作用が生じるという問題を解消するために、β－ヘキソサミニダーゼのα－サブユニット及びβ－サブユニットの立体構造情報に基づいて、β－サブユニットの活性部位をα－サブユニットの活性部位と置換した改変型β－サブユニットを作製した。そして、この改変型β－サブユニットを構成成分として、ホモ二量体である改変型β－ヘキソサミニダーゼＢ（以下、「ＭｏｄＢ」と記載）を作製し、当該組換え酵素がＧＭ２ガングリオシドを分解する活性を有することを確認した（特許文献２；非特許文献２）。
　本発明者らはさらに、ＭｏｄＢが患者の体内でプロテアーゼによって分解され易いという課題を見出した。そしてこの課題を解決するための手段として、ＭｏｄＢにおけるプロテアーゼ認識部位の構造を変化させ、プロテアーゼによる加水分解の影響を受けない、又は受けづらくすることによって、プロテアーゼに対して抵抗性を有する改変型のＭｏｄＢ（以下、「Ｍｏｄ２Ｂ」と記載）を開発している（特許文献３）。
　一方特許文献４には、神経系細胞への遺伝子導入のためのアデノ随伴ウイルスビリオンが開示されている。
特開２００２－３６９６９２号公報 国際公開ＷＯ２０１０／０８２６２２ 国際公開ＷＯ２０１４／０６１７３５ 国際公開ＷＯ２０１２／０５７３６３
Tsuji D et al. Ann Neurol. 2011 Apr;69(4):691-701 Matsuoka K et al. Mol Ther. 2011 Jun;19(6):1017-1024
　特許文献３に記載されているようなＭｏｄ２Ｂ等の、ヒトβ－ヘキソサミニダーゼの改変型β－サブユニットを、タンパク質の形態で患者に投与することによりザンドホッフ病及びテイ－サックス病を有効に治療することができる。
　しかしながらザンドホッフ病及びテイ－サックス病を治療するためには、改変型β－サブユニットが患者の体内で恒常的に存在する必要があるため、改変型β－サブユニットをタンパク質の形態で患者に投与する場合には、投与を高頻度で行う必要があり、患者への負担が大きいという課題があった。
　そこで本発明者らは、ザンドホッフ病及びテイ－サックス病の患者の体内で改変型β－サブユニットを恒常的に存在させる手段を提供すべく鋭意検討を行い、以下の本発明を完成するに至った。本発明は以下の発明を包含する。
（１）ウイルスビリオンを形成可能なタンパク質を含むキャプソメア、並びに、
　前記キャプソメア内にパッケージングされたポリヌクレオチドであって、プロモーター配列と、前記プロモーター配列と作動可能に連結される、野生型ヒトβ－ヘキソサミニダーゼのβ－サブユニットの配列番号２８の第５５番目～第５５６番目のアミノ酸配列において、第３１２番目～第３１８番目のアミノ酸が、それぞれ順に、グリシン、セリン、グルタミン酸、プロリン、セリン、グリシン、及び、トレオニンに置換されている第１アミノ酸配列、並びに、前記第１アミノ酸配列のＮ末端側に連結されたシグナルペプチドのアミノ酸配列である第２アミノ酸配列をコードする塩基配列とを含むポリヌクレオチド
を含む、組換えアデノ随伴ウイルスビリオン。
（２）前記第１アミノ酸配列が、配列番号２８の第５５番目～第５５６番目のアミノ酸配列において、さらに、第４５２番目のアミノ酸がアスパラギンに、及び／又は、第４５３番目のアミノ酸がアルギニンに置換されているアミノ酸配列である、（１）に記載のウイルスビリオン。
（３）前記第１アミノ酸配列が、
（Ａ）配列番号２５の第３１番目～第５３２番目のアミノ酸配列；
（Ｂ）配列番号２５の第３１番目～第５３２番目のアミノ酸配列において、前記置換部位のアミノ酸を除く１から数個のアミノ酸が欠失、置換、又は、付加されたアミノ酸配列であって、野生型ヒトβ－ヘキソサミニダーゼのα－サブユニット由来の活性を有し、且つ、プロテアーゼに対する抵抗性を有するタンパク質に含まれるアミノ酸配列；並びに
（Ｃ）配列番号２５の第３１番目～第５３２番目のアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であって、野生型ヒトβ－ヘキソサミニダーゼのα－サブユニット由来の活性を有し、且つ、プロテアーゼに対する抵抗性を有するタンパク質に含まれるアミノ酸配列（ただし、前記置換部位のアミノ酸は配列番号：２５で示されるアミノ酸配列と同一である）
より選択されるいずれかのアミノ酸配列を含む、（２）に記載のウイルスビリオン。
（４）前記第２アミノ酸配列が、配列番号２５の第１番目～３０番目のアミノ酸配列、又は、配列番号２８の第１番目～第５４番目のアミノ酸配列である、（１）～（３）のいずれかに記載のウイルスビリオン。
（５）前記ポリヌクレオチドの５’末端及び３’末端が、それぞれ、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３又はＡＡＶ４に由来する５’末端及び３’末端のインバーテッドターミナルリピート（ＩＴＲ）配列を含む、（１）～（４）のいずれかに記載のウイルスビリオン。
（６）前記ポリヌクレオチドの５’末端及び３’末端が、それぞれ配列番号：１３及び配列番号：１４の塩基配列を含む、（１）～（５）のいずれかに記載のウイルスビリオン。
（７）前記プロモーター配列が、全身性プロモーター又は神経系細胞特異的プロモーターの配列である、（１）～（６）のいずれかに記載のウイルスビリオン。
（８）前記プロモーター配列が、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＥＦ－１αプロモーター、ＳＶ４０プロモーター及びＣＡＧプロモーターからなる群より選択される全身性プロモーターの配列である、（７）に記載のウイルスビリオン。
（９）前記プロモーター配列が、シナプシンＩプロモーター配列、ミエリン塩基性タンパク質プロモーター配列、ニューロン特異的エノラーゼプロモーター配列、カルシウム／カルモジュリン－依存性蛋白キナーゼＩＩ（ＣＭＫＩＩ）プロモーター、チュブリンαＩプロモーター、血小板由来成長因子β鎖プロモーター、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター配列、Ｌ７プロモーター配列（小脳プルキンエ細胞特異的プロモーター）、及びグルタミン酸受容体デルタ２プロモーター（小脳プルキンエ細胞特異的プロモーター）からなる群より選択される神経系細胞特異的プロモーターの配列である、（７）に記載のウイルスビリオン。
（１０）　前記ウイルスビリオンを形成可能なタンパク質が、１型、２型、３型、９型、ｒｈ１０型、ＰＨＰ．Ｂ型又はＰＨＰ．ｅＢ型のアデノ随伴ウイルスに由来するＶＰ１カプシドタンパク質のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、或いは、前記ＶＰ１カプシドタンパク質のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、少なくとも１つの表面露出チロシン残基が他のアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列を含むタンパク質である、（１）～（９）のいずれかに記載のウイルスビリオン。
（１１）前記ウイルスビリオンを形成可能なタンパク質が、配列番号：２、４若しくは６のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、少なくとも１つの表面露出チロシン残基が他のアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列を含むタンパク質である、（１）～（１０）のいずれかに記載のウイルスビリオン。
（１２）前記ウイルスビリオンを形成可能なタンパク質が、少なくとも、配列番号：２において４４５位のチロシン残基、配列番号：４において４４４位のチロシン残基、又は配列番号：６において４４６位のチロシン残基が置換されているアミノ酸配列を含む、（１１）に記載のウイルスビリオン。
（１３）前記チロシン残基がフェニルアラニン残基に置換されている、（１０）～（１２）のいずれかに記載のウイルスビリオン。
（１４）前記ウイルスビリオンを形成可能なタンパク質が、配列番号：８、１０若しくは１２のアミノ酸配列、又は配列番号：８、１０若しくは１２のアミノ酸配列の４４４～４４６位以外の位置に１～数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入及び／若しくは付加を含むアミノ酸配列を含み、ウイルスビリオンを形成可能である、（１）～（１３）のいずれかに記載のウイルスビリオン。
（１５）（１）～（１４）のいずれかに記載のウイルスビリオンを含む医薬組成物。
（１６）テイ－サックス病及び／又はザンドホッフ病の治療のための、（１５）に記載の医薬組成物。
（１７）テイ－サックス病及び／又はザンドホッフ病を治療する方法であって、
　テイ－サックス病及び／又はザンドホッフ病の治療を必要とする患者に（１）～（１４）のいずれかに記載のウイルスビリオンを投与することを含む方法。
（１８）前記患者に前記ウイルスビリオンを末梢投与、脳内投与又は髄腔内投与することを含む、（１７）に記載の方法。
（１９）前記患者が母体中の胎児であり、前記ウイルスビリオンを前記母体に末梢投与することを含む、（１７）に記載の方法。
（２０）テイ－サックス病及び／又はザンドホッフ病の治療に用いるための、（１）～（１４）のいずれかに記載のウイルスビリオン。
（２１）テイ－サックス病及び／又はザンドホッフ病の治療を必要とする患者に末梢投与、脳内投与又は髄腔内投与される、（２０）に記載のウイルスビリオン。
（２２）テイ－サックス病及び／又はザンドホッフ病の治療を必要とする患者が母体中の胎児であり、前記母体に末梢投与される、（２０）に記載のウイルスビリオン。
（２３）テイ－サックス病及び／又はザンドホッフ病の治療のための医薬の製造における、（１）～（１４）のいずれかに記載のウイルスビリオンの使用。
（２４）前記医薬が、テイ－サックス病及び／又はザンドホッフ病の治療を必要とする患者に末梢投与、脳内投与又は髄腔内投与される医薬である、（２３）に記載の使用。
（２５）前記医薬が、テイ－サックス病及び／又はザンドホッフ病の治療を必要とする患者が母体中の胎児であり、前記母体に末梢投与される医薬である、（２４）に記載の使用。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2018-011705号の開示内容を包含する。
　本発明の組換えアデノ随伴ウイルスビリオンは、野生型ヒトβ－ヘキソサミニダーゼ改変型β－サブユニットをコードする遺伝子を患者の体内に導入するためのベクターとして有効である。
　本発明の組換えアデノ随伴ウイルスビリオンを含む医薬組成物は、ザンドホッフ病及びテイ－サックス病の治療に用いることができる。
実施例１実験1.1での各臓器の抽出液中のMUG分解比活性の測定結果を図1上段のグラフに示し、実験1.2での各臓器の抽出液中のタンパク質のウエスタンブロット解析の結果を図1下段の写真に示す。 図2に、SDモデルマウスの脳切片、SDモデルマウスの脳室内へのAAV-CMV-modHEXB投与後の脳切片、野生型マウス(C57BL/6)の脳切片における、ヒトmodHEXB酵素タンパク質（一次抗体としてNAG(A)を使用）と、GM2ガングリオシド（一次抗体として抗GM2抗体を使用）の免疫蛍光組織化学的解析の結果を示す。 図3Aに、SDモデルマウス（Hexb-/-）の脳の各領域における蓄積GM2ガングリオシド（緑）の免疫蛍光組織化学的解析の結果を示す。 図3Bに、AAV-CMV-modHEXBを脳室内投与したSDモデルマウス（Hexb-/-）の脳の各領域におけるGM2ガングリオシド（緑）及びmodHEXB（赤）の免疫蛍光組織化学的解析の結果を示す。 図3Cに、野生型マウス(C57BL/6)の脳の各領域におけるGM2ガングリオシド（緑）及びmodHEXB（赤）の免疫蛍光組織化学的解析の結果を示す。 図4に、実施例1実験2での免疫蛍光組織化学的解析の結果を示す。 図5に、実施例1実験3の結果を示す。 図6に、実施例1実験4の結果を示す。 図7に、実施例1実験5.1の結果を示す。 図8に、実施例1実験5.2の結果を示す。 図9に、実施例1実験5.3の結果を示す。 図10に、実施例1実験5.4の結果を示す。 図11Aに、実施例1実験6.1でのロータロッド試験の結果を示す。 図11Bに、実施例1実験6.1での体重測定の結果を示す。 図1２に、実施例1実験6.2でのロータロッド試験の結果を示す。 図13Aに、AAV-CMV-modHEXBを1.15×1011vg/匹の投与量で、Sandhoff病ヘテロ（Hexb+/-）新生仔（P0～P2）マウスの脳室内または側頭静脈内へ単回投与後、10週齢時点での各臓器でのHex活性（MUG分解活性）の比活性を示す。 図13Bに、AAV-CMV-modHEXBを1.15×1010vg/匹の投与量で、Sandhoff病ヘテロ（Hexb+/-）新生仔（P0～P2）マウスの脳室内または側頭静脈内へ単回投与後、10週齢時点での各臓器でのHex活性（MUG分解活性）の比活性を示す。 図14Aに、実施例1実験8でのロータロッド試験の結果を示す。 図1４Bに、実施例1実験8での体重測定の結果を示す。 図15に、iPS細胞から神経細胞への分化誘導の概要を示す。 図16に、実施例2実験1.1の結果を示す。 図17に、実施例2実験1.2の結果を示す。 図18に、実施例2実験1.2の結果を示す。 図19に、実施例2実験2.1の結果を示す。 図20に、実施例2実験2.1の結果を示す。 図21に、実施例2実験2.2の結果を示す。 図22に、実施例2実験2.3の結果を示す。 図23に、実施例2実験2.3の結果を示す。 図24に、実施例2実験2.4の結果を示す。 図25に、実施例6での、カニクイザルへのAAV-CMV-modHEXBの投与3カ月後の組織抽出液のMUG(4-メチルウンベリフェリルβ-D-グルコサミド)及びMUGS(4-メチルウンベリフェリル6-スルホ-β-D-グルコサミド)の分解活性を示す。 図26に、実施例6での、カニクイザルへのAAV-CMV-modHEXBの投与前及び投与12週後の血漿のMUGS(4-メチルウンベリフェリル6-スルホ-β-D-グルコサミド)の分解活性を示す。 図27に、実施例7での、カニクイザルへのAAV-CMV-GFPの投与3カ月後の組織抽出液のウエスタン・ブロッティングによるGFPの測定結果を示す。
１．ヒトβ－ヘキソサミニダーゼの改変型β－サブユニット
　野生型ヒトβ－ヘキソサミニダーゼのβ－サブユニットは、配列番号２８の第５５番目～第５５６番目のアミノ酸配列と、そのＮ末端側に連結されたシグナルペプチドのアミノ酸配列とを含む未成熟タンパク質として発現し、シグナルペプチドが外れて成熟タンパク質となり機能する。野生型ヒトβ－ヘキソサミニダーゼのβ－サブユニットのシグナルペプチドのアミノ酸配列としては、配列番号２８の第１番目～第５４番目のアミノ酸配列が挙げられる。すなわち、野生型ヒトβ－ヘキソサミニダーゼのβ－サブユニットは、未成熟段階では、配列番号２８に示すアミノ酸配列を含む。
　本発明において「野生型ヒトβ－ヘキソサミニダーゼのβ－サブユニットの配列番号２８の第５５番目～第５５６番目のアミノ酸配列において、第３１２番目～第３１８番目のアミノ酸が、それぞれ順に、グリシン、セリン、グルタミン酸、プロリン、セリン、グリシン、及び、トレオニンに置換されている第１アミノ酸配列」を含むタンパク質（以下「本発明のタンパク質」又は「改変型β－サブユニット」と呼ぶ）は、野生型ヒトβ-ヘキソサミニダーゼのβ-サブユニットの活性部位の構造を変化させて、野生型ヒトβ-ヘキソサミニダーゼのα-サブユニット由来の活性を獲得した、且つ、野生型ヒトβ-ヘキソサミニダーゼのβ-サブユニットのプロテアーゼ認識部位の構造を変化させて、プロテアーゼに対する抵抗性を獲得した組換えタンパク質である。本発明のタンパク質又は改変型β－サブユニットは、第１アミノ酸配列のみからなる成熟タンパク質であってもよいし、第１アミノ酸配列と、そのＮ末端側に連結されたシグナルペプチドのアミノ酸配列である第２アミノ酸配列とを含む未成熟タンパク質であってもよく、どちらも包含する。
　第１アミノ酸配列のＮ末端側に連結されたシグナルペプチドのアミノ酸配列である第２アミノ酸配列としては、配列番号２５の第１番目～３０番目のアミノ酸配列、及び、配列番号２８の第１番目～第５４番目のアミノ酸配列が例示できる。
　本発明において「α－サブユニット由来の活性を獲得した」とは、β－サブユニットの基質結合部位において、β－サブユニットの基質との結合反応性よりもα－サブユニットの基質との結合反応性が相対的に高くなったことを意味する。従って、当該特性に関する構造変化としては、β－サブユニットの基質との結合を完全に不可能にする構造変化には限定されず、本来α－サブユニットの基質との結合反応性よりもβ－サブユニットの基質との結合反応性が相対的に有意に高かったものを、逆にα－サブユニットの基質との結合反応性が有意に高くなるようにする構造変化も含む。特に、「α－サブユニット由来の活性を獲得した」とはα－サブユニットの基質特異性を有することが好ましい。「α－サブユニットの基質特異性を有する」とは、活性部位の構造（特に、基質の結合反応性に重要な役割を果たすアミノ酸残基の位置及び種類）や、ＧＭ２活性化因子との会合（結合）に必要なループ構造の存在が、α－サブユニットと同様であることを意味する。
　また、「プロテアーゼに対する抵抗性を獲得した」とは、プロテアーゼ認識部位の構造を変化させたことにより、プロテアーゼによる加水分解の影響を受けない、又は受けづらくなった（すなわち、プロテアーゼにより加水分解されない、又は加水分解されづらくなった）ことを意味する。
　各特性に関するタンパク質の構造変化は以下の通りおこなうことができる。
　α－サブユニット由来の活性を獲得するためのβ－サブユニットの活性部位の構造変化は、ＷＯ２０１０／０８２６２２に詳述される手法に基づいて行うことができる。
　すなわち、ヒトＨｅｘ　Ａ（α－サブユニットとβ－サブユニットのヘテロ二量体）とＨｅｘ　Ｂ（β－サブユニットのホモ二量体）のＸ線結晶構造情報に基づいて、α－サブユニットのうち、ＧＭ２ガングリオシドを基質として認識するための活性ポケット内のアミノ酸残基、及び、ＧＭ２活性化因子（当該酵素とその基質であるＧＭ２ガングリオシドとの邂逅に働く）との結合に関係するアミノ酸残基を同定し、β－サブユニット分子のうち、これらの特定アミノ酸残基に相当する部分を、α－サブユニットで同定された特定アミノ酸残基で置換することにより行うことができる。なお、本明細書において、「相当する部分」とは、α－サブユニットとβ－サブユニットのアミノ酸配列を同一性が最も高くなるように、必要に応じて一方の配列にギャップを挿入してアライメントした場合に、並置される位置をいう。アミノ酸配列のアライメントは、当業者に周知の方法、配列解析ソフトウェア等（例えばＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ　Ｌｏｃａｌ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｓｅａｒｃｈ　Ｔｏｏｌ　ａｔ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメーター）を使用して行うことができる。
　β－サブユニットのうち、α－サブユニットのＧＭ２ガングリオシドを基質として認識するための活性ポケット内のアミノ酸残基に相当する部分としては、第４５２番目のアミノ酸残基、及び、第４５３番目のアミノ酸残基が挙げられる。また、β－サブユニットのうち、α－サブユニットのＧＭ２活性化因子との結合に関係するアミノ酸残基としては、第３１２番目～第３１５番目のアミノ酸残基が挙げられる。
　本発明のタンパク質においては、α－サブユニット由来の活性を獲得するために、β－サブユニットのうち、第３１２番目～第３１５番目のアミノ酸残基が置換されていればよい。好ましくは、本発明のタンパク質においては、α－サブユニット由来の活性を獲得するために、β－サブユニットのうち、第３１２番目～第３１５番目のアミノ酸残基、並びに、第４５２番目のアミノ酸残基、及び／又は、第４５３番目のアミノ酸残基が置換されていればよい。さらに好ましくは、本発明のタンパク質においては、α－サブユニット由来の活性を獲得するために、β－サブユニットのうち、第３１２番目～第３１５番目のアミノ酸残基、第４５２番目のアミノ酸残基、並びに、第４５３番目のアミノ酸残基が置換されていればよい。
　これらβ－サブユニットのアミノ酸配列の置換は、α－サブユニットにおいて相当する部分のアミノ酸残基に従って行うことができ、すなわち、第３１２番目～第３１５番目のアミノ酸については、それぞれ順に、グリシン、セリン、グルタミン酸及びプロリンに、第４５２番目のアミノ酸については、アスパラギンに、第４５３番目のアミノ酸のアミノ酸については、アルギニンに置換する。
　プロテアーゼに対する抵抗性を獲得するためのβ－サブユニットの活性部位の構造変化は、β－サブユニットのプロテアーゼ認識部位にプロテアーゼ非認識部位を置換して導入することにより行うことができる。ここで「プロテアーゼ認識部位」とは、特定のプロテアーゼによって加水分解されるアミノ酸配列を意味する。本発明において、β－サブユニットのプロテアーゼ認識部位へのプロテアーゼ非認識部位の導入は、例えば、α－サブユニットにおいて、プロテアーゼに対して抵抗性を有することが公知である領域を、β－サブユニットの当該領域に相当する部分に置換して導入することにより行うことができる。
　β－サブユニットのうち、α－サブユニットのプロテアーゼ非認識部位に相当するアミノ酸残基としては、第３１２番目～第３１８番目のアミノ酸残基が挙げられる。本発明のタンパク質においては、プロテアーゼに対する抵抗性を獲得するために、β－サブユニットのうち、少なくとも、第３１２番目～第３１８番目のアミノ酸残基が置換されていればよい。
　これらβ－サブユニットのアミノ酸配列の置換は、α－サブユニットにおいて相当する部分のアミノ酸残基に従って行うことができ、すなわち、第３１２番目～第３１５番目のアミノ酸については、上記したように、それぞれ順に、グリシン、セリン、グルタミン酸及びプロリンに、第３１６番目～第３１８番目のアミノ酸については、それぞれ順に、セリン、グリシン、及びトレオニンに置換する。
　β－サブユニットの少なくとも第３１２番目～第３１８番目のアミノ酸を上記のように置換することにより、プロテアーゼにより認識されないようにする効果が得られ、プロテアーゼによる加水分解の影響を受けない、又は受けづらくすることができる。
　したがって、本発明のタンパク質が含む第１アミノ酸配列は、例えば、配列番号２８の第５５番目～第５５６番目のアミノ酸配列における第３１２番目～第３１８番目がそれぞれ順に、グリシン、セリン、グルタミン酸、プロリン、セリン、グリシン、及びトレオニンに置換されたアミノ酸配列である。本発明のタンパク質が含む第１アミノ酸配列はさらに、配列番号２８の第５５番目～第５５６番目のアミノ酸配列において、第４５２番目のアミノ酸、及び／又は、第４５３番目のアミノ酸がそれぞれ、アスパラギン、及び、アルギニンに置換されていても良い。好ましくは、本発明のタンパク質が含む第１アミノ酸配列は、配列番号２８の第５５番目～第５５６番目のアミノ酸配列における第３１２番目～第３１８番目、第４５２番目、及び、第４５３番目のアミノ酸が、それぞれ上記の通り置換されたアミノ酸配列である。
　なお、野生型ヒトβ－ヘキソサミニダーゼのシグナルペプチドを含むβ-サブユニットのアミノ酸配列（配列番号：２８）及び当該配列をコードする塩基配列（配列番号：２７）の情報は、例えば、GenBankには「Accession number：NM 000512」及び「Accession number：NM 000521」として公表されており、Swiss-Prot（http://tw.expasy.org/uniprot/ から取得可能）には「Entry name：HEXB-HUMAN；Accession number：P07686」として登録されている。配列番号２７の、β-サブユニットのアミノ酸配列をコードする塩基配列（cDNA）は、GenBank（Accession number：NM 000521）に公表されている合計1919 bpの塩基配列中の第118番目～1788番目の塩基からなる塩基配列である。本発明においては、これらのアミノ酸配列及び塩基配列の情報を利用することができる。
　すなわち、本発明のタンパク質に含まれる第１アミノ酸配列は、以下の（ａ）～（ｃ）のいずれかであることが好ましい。
（ａ）下記（ｉ）～（ｉｖ）のいずれかのアミノ酸配列：
（ｉ）配列番号２８の第５５番目～第５５６番目のアミノ酸配列において、第３１２番目～第３１８番目のアミノ酸がそれぞれ順に、グリシン、セリン、グルタミン酸、プロリン、セリン、グリシン、及びトレオニンに置換されたアミノ酸配列；
（ｉｉ）配列番号２８の第５５番目～第５５６番目のアミノ酸配列において、第３１２番目～第３１８番目のアミノ酸がそれぞれ順に、グリシン、セリン、グルタミン酸、プロリン、セリン、グリシン、及びトレオニンに置換され、且つ、４５２番目のアミノ酸がアスパラギンに置換されたアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号２８の第５５番目～第５５６番目のアミノ酸配列において、第３１２番目～第３１８番目のアミノ酸がそれぞれ順に、グリシン、セリン、グルタミン酸、プロリン、セリン、グリシン、及びトレオニンに置換され、且つ、４５３番目のアミノ酸がアルギニンに置換されたアミノ酸配列；又は
（ｉｖ）配列番号２８の第５５番目～第５５６番目のアミノ酸配列において、第３１２番目～第３１８番目のアミノ酸がそれぞれ順に、グリシン、セリン、グルタミン酸、プロリン、セリン、グリシン、及びトレオニンに置換され、且つ、４５２番目のアミノ酸がアスパラギンに置換され、且つ、４５３番目のアミノ酸がアルギニンに置換されたアミノ酸配列；あるいは、
（ｂ）上記（ｉ）～（ｉｖ）のいずれかのアミノ酸配列において前記置換部位のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ野生型ヒトβ－ヘキソサミニダーゼのα－サブユニット由来の活性を有し、且つ、プロテアーゼに対する抵抗性を有するタンパク質に含まれるアミノ酸配列；あるいは、
（ｃ）上記（ｉ）～（ｉｖ）のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列（ただし、前記置換部位のアミノ酸は配列番号２５で示されるアミノ酸配列と同一である）であって、かつ野生型ヒトβ－ヘキソサミニダーゼのα－サブユニット由来の活性を有し、且つ、プロテアーゼに対する抵抗性を有するタンパク質に含まれるアミノ酸配列。
　上記（ａ）のアミノ酸配列としては、上記（ｉ）～（ｉｖ）のアミノ酸配列のうち、上記（ｉｖ）のアミノ酸配列がより好ましい。このようなアミノ酸配列としては、配列番号２５の第３１番目～第５３２番目のアミノ酸配列が挙げられる。
　上記（ｂ）のアミノ酸配列は、上記（ａ）で規定する上記（ｉ）～（ｉｖ）のいずれかのアミノ酸配列において前記置換部位のアミノ酸を除く、１個又は数個（例えば１個～１０個程度、好ましくは１個～５個程度、より好ましくは１～５個程度、最も好ましくは１又は２個）のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、且つ、α－サブユニット由来の活性を有し、且つ、プロテアーゼに対する抵抗性を有するタンパク質に含まれるアミノ酸配列であればよく、限定はされない。
　α－サブユニット由来の活性は、例えば、ＣＨＯ細胞やヒト線維芽細胞等の哺乳類由来の細胞に目的タンパク質を発現させて採取し、４－ＭＵＧＳ分解活性を測定することにより確認できる。具体的には、当該タンパク質（酵素溶液）と、４－メチルウムベリフェリル－Ｎ－アセチル－β－Ｄ－グルコサミン－６－硫酸（４－ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ－６－ｓｕｌｆｏ－Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－β－Ｄ－ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄｅ）（人工基質）とを混合して、ｐＨ４．５の条件下で反応させた場合に、当該酵素溶液の単位量が単位時間当たりに遊離させ得る４－メチルウムベリフェロン（４－ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ）の量を検出することにより測定することができる。４－メチルウムベリフェロンの検出は、公知の各種検出方法を採用できるが、例えば、蛍光光度計等を用いて検出する方法が好ましい。また、目的タンパク質の発現は、公知の各種発現ベクター等に組込んで細胞に導入し発現させればよい。
　また、プロテアーゼに対する抵抗性を有するか否かの判定は、例えば、ＣＨＯ細胞やヒト線維芽細胞等の哺乳類由来の細胞に目的タンパク質を発現させて採取し、採取された目的タンパク質をプロテアーゼにより処理し、処理物に対し、ウエスタンブロット法などの公知のタンパク質検出方法を用いて、当該タンパク質の加水分解された形態の有無を検出することによって行うことができる。
　上記（ｃ）のアミノ酸配列は、上記（ａ）で規定する上記（ｉ）～（ｉｖ）のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であって、かつ野生型ヒトβ－ヘキソサミニダーゼのα－サブユニット由来の活性を有し、且つ、プロテアーゼに対する抵抗性を有するタンパク質に含まれるアミノ酸配列であればよく、限定はされない（ただし、前記置換部位のアミノ酸は配列番号２５で示されるアミノ酸配列と同一である）。ここで「同一性」とは、２つのアミノ酸配列にギャップを導入して、またはギャップを導入しないで整列させた場合の、最適なアライメントにおいて、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸および類似アミノ酸残基の割合（パーセンテージ）を意味する。同一性は、当業者に周知の方法、配列解析ソフトウェア等（例えばＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ　Ｌｏｃａｌ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｓｅａｒｃｈ　Ｔｏｏｌ　ａｔ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメーター）を使用して求めることができる。「少なくとも９０％以上の同一性」とは、９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９９％以上の同一性を示す。「α－サブユニット由来の活性」及び「プロテアーゼに対する抵抗性」の有無は、上記の通り判定することができる。
　第１アミノ酸配列が上記（ａ）～（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列である場合には、シグナルペプチドの第２アミノ酸配列は、配列番号２５の第１番目～３０番目のアミノ酸配列、又は、配列番号２８の第１番目～第５４番目のアミノ酸配列であることが好ましく、配列番号２５の第１番目～３０番目のアミノ酸配列であることが特に好ましい。
　本発明のタンパク質は、患者の体内で発現したときに、単量体（すなわち、改変型（変異型）β－サブユニット）の形態として存在していてもよいし、当該変異体タンパク質の二量体（すなわち、改変型（変異型）ヒトβ－ヘキソサミニダーゼＢ）の形態で存在していてもよい。
２．ヒトβ－ヘキソサミニダーゼの改変型β－サブユニットのアミノ酸配列をコードする塩基配列
　本発明の組換えアデノ随伴ウイルスビリオンが含むポリヌクレオチドは、上記の第１アミノ酸配列並びに第２アミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。
　上記の第１アミノ酸配列をコードする塩基配列としては、例えば、以下の（ａ）又は（ｂ）の塩基配列が挙げられる。
（ａ）下記（ｉ）～（ｉｖ）のいずれかの塩基配列：
（ｉ）配列番号２７の第１６３番目～第１６７１番目の塩基配列において、第９３４番目～第９３６番目の塩基、第９３７番目～第９３９番目の塩基、第９４０番目～第９４２番目の塩基、第９４３番目～第９４５番目の塩基、第９４６番目～第９４８番目の塩基、第９４９番目～第９５１番目の塩基、及び、第９５２番目～第９５４番目の塩基が、それぞれ順に、グリシン、セリン、グルタミン酸、プロリン、セリン、グリシン、及びトレオニンのコドンを示す塩基に置換された塩基配列；
（ｉｉ）配列番号２７の第１６３番目～第１６７１番目の塩基配列において、第９３４番目～第９３６番目の塩基、第９３７番目～第９３９番目の塩基、第９４０番目～第９４２番目の塩基、第９４３番目～第９４５番目の塩基、第９４６番目～第９４８番目の塩基、第９４９番目～第９５１番目の塩基、及び、第９５２番目～第９５４番目の塩基が、それぞれ順に、グリシン、セリン、グルタミン酸、プロリン、セリン、グリシン、及びトレオニンのコドンを示す塩基に置換され、且つ、第１３５４番目～第１３５６番目の塩基がアスパラギンのコドンを示す塩基に置換された塩基配列；
（ｉｉｉ）配列番号２７の第１６３番目～第１６７１番目の塩基配列において、第９３４番目～第９３６番目の塩基、第９３７番目～第９３９番目の塩基、第９４０番目～第９４２番目の塩基、第９４３番目～第９４５番目の塩基、第９４６番目～第９４８番目の塩基、第９４９番目～第９５１番目の塩基、及び、第９５２番目～第９５４番目の塩基が、それぞれ順に、グリシン、セリン、グルタミン酸、プロリン、セリン、グリシン、及びトレオニンのコドンを示す塩基に置換され、且つ、第１３５７番目～第１３５９番目の塩基がアルギニンのコドンを示す塩基に置換された塩基配列；
（ｉｖ）配列番号２７の第１６３番目～第１６７１番目の塩基配列において、第９３４番目～第９３６番目の塩基、第９３７番目～第９３９番目の塩基、第９４０番目～第９４２番目の塩基、第９４３番目～第９４５番目の塩基、第９４６番目～第９４８番目の塩基、第９４９番目～第９５１番目の塩基、及び、第９５２番目～第９５４番目の塩基が、それぞれ順に、グリシン、セリン、グルタミン酸、プロリン、セリン、グリシン、及びトレオニンのコドンを示す塩基に置換され、且つ、第１３５４番目～第１３５６番目の塩基がアスパラギンのコドンを示す塩基に置換され、且つ、第１３５７番目～第１３５９番目の塩基がアルギニンのコドンを示す塩基に置換された塩基配列。
（ｂ）上記（ｉ）～（ｉｖ）のいずれかの塩基配列に対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡに含まれる塩基配列であって、前記置換部位の塩基に対応する塩基が当該置換部位の塩基と同一であり、かつ野生型ヒトβ－ヘキソサミニダーゼのα－サブユニット由来の活性を有し、且つ、プロテアーゼに対する抵抗性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
　本発明において「コドン」とは、転写後のＲＮＡ配列上の３塩基連鎖（トリプレット）に限らず、ＤＮＡ配列上の３塩基連鎖をも意味する。よって、ＤＮＡ配列上のコドンの表記は、ウラシル（Ｕ）の代わりにチミン（Ｔ）を用いて行う。
　配列番号２７に示される塩基配列は、野生型ヒトβ－ヘキソサミニダーゼのシグナルペプチド（５４アミノ酸）を含むβ－サブユニット（５５６アミノ酸からなる配列番号２８のアミノ酸配列）をコードする１６７１個の塩基からなる塩基配列である。配列番号２７の第１６３番目～第１６７１番目の塩基配列が、野生型ヒトβ－ヘキソサミニダーゼのβ－サブユニットの成熟したタンパク質（５０２アミノ酸からなる、配列番号２８の第５５番目～第５５６番目のアミノ酸配列）をコードする塩基配列である。
　上記（ａ）の塩基配列としては、上記（ｉ）～（ｉｖ）のうち、上記（ｉｖ）の塩基配列がより好ましい。このような塩基配列としては、配列番号２６の第１５１８番目～第３０２６番目の塩基配列が挙げられる。配列番号２６の第１５１８番目～第３０２６番目の塩基配列は、配列番号２５の第３１番目～第５３２番目のアミノ酸配列をコードする。
　以上のような変異置換型の塩基配列を含むポリヌクレオチドは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　２ｎｄ　ｅｄ．，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ（１９８７－１９９７）等に記載される公知の部位特異的変位導入法（例えば、Ｋｕｎｋｅｌ法、Ｇａｐｐｅｄ　ｄｕｐｌｅｘ法、ＰＣＲ法等）を用いて調製することができる。
　上記（ｂ）の塩基配列において、「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄時の条件であって、バッファーの塩濃度が１５～３３０ｍＭ、温度が２５～６５℃、好ましくは塩濃度が１５～１５０ｍＭ、温度が４５～５５℃の条件を意味する。具体的には、例えば８０ｍＭで５０℃等の条件を挙げることができる。
　ハイブリダイズするＤＮＡとしては、上記（ａ）の塩基配列に対して少なくとも４０％以上の相同性を有する塩基配列であることが好ましく、より好ましくは６０％、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上である。
　また、上記（ｂ）の塩基配列は、前記置換部位の塩基に対応する塩基が当該置換部位の塩基と同一である。ここで、「前記置換部位の塩基に対応する塩基」の「対応する塩基」とは、上記（ｂ）の塩基配列からなるＤＮＡが上記（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡに対する相補鎖とハイブリダイズした場合に、このハイブリッドにおいて、前記置換部位の塩基に対する相補塩基（トリプレット）と、位置的に対向する関係にある塩基（トリプレット）を意味する。
　上記（ｂ）の塩基配列としては、例えば、上記（ａ）の塩基配列と比較して、塩基配列については完全に同一ではないが、翻訳された後のアミノ酸配列については完全に同一となるような塩基配列（すなわち上記（ａ）の塩基配列にサイレント変異が施された塩基配列）が、特に好ましい。
　本発明の組換えアデノ随伴ウイルスビリオンが有するポリヌクレオチドは、上記（ａ）又は（ｂ）の塩基配列等の、第１アミノ酸配列をコードする塩基配列の上流側に隣接して、シグナルペプチドの第２アミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、第２アミノ酸配列をコードする塩基配列としては、配列番号２６の第１４２８番目～第１５１７番目の塩基配列、又は、配列番号２７の第１番目～第１６２番目の塩基配列が例示できる。第１アミノ酸配列をコードする塩基配列が上記（ａ）又は（ｂ）の塩基配列である場合、第２アミノ酸配列をコードする塩基配列は、配列番号２６の第１４２８番目～第１５１７番目の塩基配列であることが好ましい。
３．組換えアデノ随伴ウイルスビリオン
　本発明の組換えアデノ随伴ウイルスビリオンは、
　ウイルスビリオンを形成可能なタンパク質を含むキャプソメア、並びに、
　前記キャプソメア内にパッケージングされたポリヌクレオチドであって、プロモーター配列と、前記プロモーター配列と作動可能に連結される、前記第１アミノ酸配列並びに前記第２アミノ酸配列をコードする塩基配列とを含むポリヌクレオチド
を含むことを特徴とする。
　以下の説明では「前記第１アミノ酸配列並びに前記第２アミノ酸配列をコードする塩基配列」を「目的塩基配列」と呼ぶことがある。
　プロモーター配列と、前記プロモーター配列と作動可能に連結される、目的塩基配列とを含むポリヌクレオチドは、センス鎖側又はアンチセンス鎖側のどちらであってもよい。すなわち、プロモーター配列と、前記プロモーター配列と作動可能に連結される、目的塩基配列とを含むポリヌクレオチドの範囲には、それに相補的なポリヌクレオチドも包含される。
　このような本発明の組換えアデノ随伴ウイルスビリオン（ｒＡＡＶビリオン）は、生体の血液脳関門（未完成な胎児及び新生児の血液脳関門、および確立した成体の血液脳関門を含む）を通過できる。本発明のｒＡＡＶビリオンは、末梢投与によって成体の脳、脊髄などに含まれる神経細胞を標的とすることができる。本明細書において末梢投与とは、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、心腔内投与、筋肉内投与、臍帯血管内投与（例えば、胎児を対象とする場合）など、当業者に末梢投与として通常理解される投与経路をいう。本発明のｒＡＡＶビリオンはまた、脳内投与又は髄腔内投与によっても神経細胞を標的とすることができる。本発明のｒＡＡＶビリオンが取り込まれた細胞内で、ポリヌクレオチドから野生型ヒトβ－ヘキソサミニダーゼの改変型β－サブユニット（ｍｏｄＨｅｘＢ）が発現するだけでなく、ｍｏｄＨｅｘＢは、前記細胞内から分泌され、血流に乗り他の細胞に運ばれ取り込まれることで、当該他の細胞内でも作用する「クロスコレクション効果」が認められる。
　以下に、本発明の組換えアデノ随伴ウイルスビリオンの特徴について説明する。
３．１　アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）
　天然のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は非病原性ウイルスである。この特徴を利用して、種々の組換ウイルスベクターを作製して、遺伝子治療のために所望の遺伝子を送達することが行われている（例えば、ＷＯ２００３／０１８８２１、ＷＯ２００３／０５３４７６、ＷＯ２００７／００１０１０、薬学雑誌１２６（１１）１０２１－１０２８などを参照のこと）。野生型ＡＡＶゲノムは、全長が約５ｋｂのヌクレオチド長を有する一本鎖ＤＮＡ分子であり、センス鎖またはアンチセンス鎖である。ＡＡＶゲノムは、一般に、ゲノムの５’側および３’側の両末端に約１４５ヌクレオチド長のインバーテッドターミナルリピート（ＩＴＲ）配列を有する。このＩＴＲは、ＡＡＶゲノムの複製起点としての機能及びこのゲノムのビリオン内へのパッケージングシグナルとしての機能等の多様な機能を有することが知られている（例えば、上記の文献である薬学雑誌１２６（１１）１０２１－１０２８などを参照のこと）。ＩＴＲに挟まれた野生型ＡＡＶゲノムの内部領域（以下、内部領域）は、ＡＡＶ複製（ｒｅｐ）遺伝子及びカプシド（ｃａｐ）遺伝子を含む。これらｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子は、それぞれ、ウイルスの複製に関与するタンパク質Ｒｅｐ及び正２０面体構造の外殻であるキャプソメアを形成するカプシドタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３の少なくとも１つ）をコードする。さらなる詳細については、例えば、Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ，１３，ｐｐ．３４５－３５４，２００２、Ｎｅｕｒｏｎａｌ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　４５，ｐｐ．９２－１０３，２００１、実験医学２０，ｐｐ．１２９６－１３００，２００２、薬学雑誌１２６（１１）１０２１－１０２８、Ｈｕｍ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ，１６，５４１－５５０，２００５などを参照のこと。
　天然のアデノ随伴ウイルスは、種々の型が知られており、それぞれ感染する対象細胞に傾向が認められる（例えば、Ｇａｏ，Ｇ，ｅｔ　ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．５：２８５－２９７，２００５、Ｘｉｎ，Ｋ－Ｑ，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８０：１１８９９－９１０，２００６、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｅｍ，Ｍ，ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．１６：５２１－３２，２００９などに記載される）。本発明のｒＡＡＶベクターは、好ましくは由来の天然のアデノ随伴ウイルス１型（ＡＡＶ１）、２型（ＡＡＶ２）、３型（ＡＡＶ３）、４型（ＡＡＶ４）、５型（ＡＡＶ５）、６型（ＡＡＶ６）、７型（ＡＡＶ７）、８型（ＡＡＶ８）、９型（ＡＡＶ９）などより作製できるが、これらに限定されない。これらのアデノ随伴ウイルスゲノムのヌクレオチド配列は公知であり、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＦ０６３４９７．１（ＡＡＶ１）、ＡＦ０４３３０３（ＡＡＶ２）、ＮＣ＿００１７２９（ＡＡＶ３）、ＮＣ＿００１８２９．１（ＡＡＶ４）、ＮＣ＿００６１５２．１（ＡＡＶ５）、ＡＦ０２８７０４．１（ＡＡＶ６）、ＮＣ＿００６２６０．１（ＡＡＶ７）、ＮＣ＿００６２６１．１（ＡＡＶ８）、ＡＹ５３０５７９（ＡＡＶ９）のヌクレオチド配列を参照できる。これらのうち、２型、３型、５型および９型がヒト由来である。本発明において、特にＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ９、ＡＡＶ－ｒｈ１０、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢに由来するカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を利用することが好ましい。ＡＡＶ１とＡＡＶ９はヒト由来のＡＡＶのうちで神経細胞への感染効率が比較的高いことが報告されている（Ｔａｙｍａｎｓ，ｅｔ　ａｌ．，Ｈｕｍ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ　１８：１９５－２０６，２００７など）。また、ＡＡＶ２は既にパーキンソン病に対する遺伝子治療などで臨床応用されている（Ｋａｐｌｉｔｔ，ｅｔ　ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ　３６９：２０９７－２１０５，２００７、Ｍａｒｋｓ，ｅｔ　ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ　Ｎｅｕｒｏｌ　７：４００－４０８，２００８、Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ　ｅｔ．ａｌ，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ　７３：１６６２－１６６９，２００９、Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，ｅｔ　ａｌ，Ｍｏｌ　Ｔｈｅｒ　１８：１７３１－１７３５，２０１０など）。
３．２．本発明のｒＡＡＶビリオン中のカプシドタンパク質
　本発明のｒＡＡＶビリオンが含むカプシドタンパク質は、好ましくは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ９、ＡＡＶ－ｒｈ１０、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ又はＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢに由来するＶＰ１カプシドタンパク質であり、より好ましくは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ９、ＡＡＶ－ｒｈ１０、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ又はＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢに由来するＶＰ１カプシドタンパク質のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、或いは、前記ＶＰ１カプシドタンパク質のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、表面露出チロシン残基（例えば、ウイルスビリオン表面にアミノ酸側鎖が露出されているチロシン残基）の少なくとも１つが別のアミノ酸に置換されたものである。これらのカプシドタンパク質を含む本発明のｒＡＡＶビリオは胎児、新生児、成人における血液脳関門を通過し易い。特に好ましい実施形態では、本発明のｒＡＡＶビリオンが含むカプシドタンパク質は、ＶＰ１アミノ酸配列（例えば配列番号：２、４又は６）において、表面露出チロシン残基（例えば、ウイルスビリオン表面にアミノ酸側鎖が露出されているチロシン残基）の少なくとも１つが別のアミノ酸に置換される。このようなタンパク質としては、配列番号：２、４又は６のアミノ酸配列と約９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、９９．９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、表面露出されるチロシン残基の少なくとも１つが別のアミノ酸に置換されており、かつウイルスビリオンを形成できるタンパク質が挙げられる。上記数値は一般的に大きい程好ましい。本発明のｒＡＡＶビリオンに含まれるカプシドタンパク質は、単独で又は他のカプシドタンパク質メンバー（例えば、ＶＰ２および／またはＶＰ３など）と一緒になってキャプソメアを形成し、該キャプソメア内にＡＡＶゲノム（又はＡＡＶベクターゲノム）がパッケージングされている本発明のｒＡＡＶビリオンを形成できる。相互に置換可能なアミノ酸残基としては、その残基が属する類似アミノ酸残基の群（後述）内に含まれる他の残基が挙げられる。相互に置換可能なアミノ酸残基によって改変されたカプシドタンパク質は、通常の遺伝子操作技術など、当業者に公知の方法に従って作製することができる。このような遺伝子操作手順については、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　３ｒｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ．２００１、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ　１９８７－１９９７などを参照することができる。
　本発明のｒＡＡＶビリオン中に含まれるカプシドタンパク質は、好ましくは、配列番号：２において、表面露出される２５２位、２７３位、４４５位、７０１位、７０５位若しくは７３１位のチロシン残基のうち１つ以上が他のアミノ酸、好ましくはフェニルアラニン残基に置換されている。好ましくは、配列番号：２のアミノ酸配列において、４４５位のチロシン残基がフェニルアラニン残基に置換されている。本発明のｒＡＡＶビリオン中に含まれるカプシドタンパク質は、好ましくは、配列番号：４において表面露出される２５２位、２７２位、４４４位、５００位、７００位、７０４位若しくは７３０位のチロシン残基のうち１つ以上が他のアミノ酸、好ましくはフェニルアラニン残基に置換されている。好ましくは、配列番号：４のアミノ酸配列において、４４４位のチロシン残基がフェニルアラニン残基に置換されている。本発明のｒＡＡＶビリオンが含むカプシドタンパク質は、好ましくは、配列番号：６において表面露出される２５２位、２７４位、４４６位、７０１位、７０５位、７０６位若しくは７３１位のうちの少なくとも１つのチロシン残基のうち１つ以上が他のアミノ酸、好ましくはフェニルアラニン残基に置換されている。好ましくは、配列番号：６のアミノ酸配列において、４４６位のチロシン残基がフェニルアラニン残基に置換されている。本発明のｒＡＡＶビリオンのキャプソメアは、上記のタンパク質単独を含んでもよいし、または他のメンバー（ＶＰ２および／またはＶＰ３）を一緒に含んでもよい。本発明において、上記の置換されるアミノ酸残基の位置は、それぞれのウイルス型のＶＰ２およびＶＰ３において対応する位置のアミノ酸残基の置換、好ましくは対応するチロシン残基のフェニルアラニン残基への置換を含む。これらの改変されたカプシドタンパク質は、通常の遺伝子操作技術など、当業者に公知の方法に従って作製することができる。このような遺伝子操作手順については、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　３ｒｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ）などを参照のこと。これらのカプシドタンパク質を含む本発明のウイルスビリオンは、上記のように、成体及び胎児の血液脳関門を通過できる。好ましくは、機能的に同等なカプシドタンパク質を含むウイルスビリオンは、末梢投与によって成体の脳、脊髄などに含まれる神経系細胞に感染できる。本発明において使用される神経系とは、神経組織により構成される器官系を指す。本発明において、遺伝子導入標的としての神経系細胞は、少なくとも脳、脊髄など中枢神経系に含まれる神経細胞を含み、さらに、神経膠細胞、小膠細胞、星状膠細胞、乏突起膠細胞、脳室上衣細胞、脳血管内皮細胞などを含んでもよい。遺伝子導入される神経系細胞のうち神経細胞の割合は、好ましくは、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、９９．９％以上、または１００％である。
　本発明のｒＡＡＶビリオンのキャプソメアの別の実施形態では、配列番号：８、１０または１２のアミノ酸配列、あるいは配列番号：８、１０または１２のアミノ酸配列において４４４～４４６位以外の位置に１個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列を含み、依然としてウイルスビリオンを形成することが可能であるタンパク質を含む。より詳細には、本発明のｒＡＡＶビリオンに含まれるカプシドタンパク質は、単独で又は他のカプシドタンパク質メンバー（例えば、ＶＰ２および／またはＶＰ３など）と一緒に本発明のｒＡＡＶビリオンのキャプソメアに含まれ、該キャプソメア内にＡＡＶゲノム（又は組換えＡＡＶベクターゲノム）がパッケージングされている。上記のアミノ酸の欠失、置換、挿入及び付加のうち２種以上が同時に生じてもよい。このようなタンパク質としては、例えば、配列番号：８、１０又は１２のアミノ酸配列、あるいは配列番号：８、１０又は１２のアミノ酸配列において４４４～４４６位以外の位置に、例えば、１～５０個、１～４０個、１～３９個、１～３８個、１～３７個、１～３６個、１～３５個、１～３４個、１～３３個、１～３２個、１～３１個、１～３０個、１～２９個、１～２８個、１～２７個、１～２６個、１～２５個、１～２４個、１～２３個、１～２２個、１～２１個、１～２０個、１～１９個、１～１８個、１～１７個、１～１６個、１～１５個、１～１４個、１～１３個、１～１２個、１～１１個、１～１０個、１～９個（１～数個）、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個、１～２個、または１個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含み、かつウイルスビリオンを形成できるタンパク質が挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の数は、一般的に小さい程好ましい。形成される本発明のｒＡＡＶビリオンは、上記のとおり、成体及び胎児の血液脳関門を通過でき、好ましくは末梢投与によって脳、脊髄などの神経細胞に遺伝子導入できる。また本発明のｒＡＡＶビリオンは、母体への末梢投与によって、母体中の胎児の脳、脊髄などに含まれる神経系細胞に遺伝子導入できる。これらの改変されたカプシドタンパク質は、通常の遺伝子操作技術など、当業者に公知の方法に従って作製することができる。
　本発明のタンパク質（ポリペプチド）において相互に置換可能なアミノ酸残基の例を以下に示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２－アミノブタン酸、メチオニン、ｏ－メチルセリン、ｔ－ブチルグリシン、ｔ－ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン；　Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２－アミノアジピン酸、２－アミノスベリン酸；　Ｃ群：アスパラギン、グルタミン；　Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４－ジアミノブタン酸、２，３－ジアミノプロピオン酸；　Ｅ群：プロリン、３－ヒドロキシプロリン、４－ヒドロキシプロリン；　Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン；　Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン。
　本発明のｒＡＡＶビリオンに含まれる上記のカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３は、１種類以上のポリヌクレオチドによってコードされ得る。好ましくは、本発明におけるカプシドタンパク質は全て、１種類のポリヌクレオチドによってコードされる。より好ましくは、カプシドタンパク質は、配列番号：７、９または１１のポリヌクレオチドによってコードされる。
　本発明のｒＡＡＶビリオンに含まれる上記のカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本発明の組換えウイルスビリオンを形成可能であるカプシドタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする。このようなポリヌクレオチドは、例えば、配列番号：７、９または１１のポリヌクレオチド配列、あるいは配列番号：７、９または１１のポリヌクレオチド配列において１個以上（例えば、１～５０個、１～４０個、１～３０個、１～２５個、１～２０個、１～１５個、１～１０個、１～９個（１～数個）、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個、１～２個、１個など）のヌクレオチドの欠失、置換、挿入および／または付加を有するポリヌクレオチドであって、配列番号：８、１０または１２のアミノ酸配列、あるいは配列番号：８、１０または１２のアミノ酸配列において４４４～４４６位以外の位置に１個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列を含みウイルスビリオンを形成することが可能であるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。これら欠失、置換、挿入及び付加のうち２種以上が同時に生じてもよい。そのようなポリヌクレオチドによってコードされるカプシドタンパク質を含む本発明のｒＡＡＶビリオンは、上記のとおり、成体及び胎児の血液脳関門を通過できる。本発明のｒＡＡＶビリオンは、好ましくは、末梢投与によって成体の脳、脊髄などに含まれる神経系細胞に遺伝子導入できる。また本発明のｒＡＡＶビリオンは、母体への末梢投与によって、母体中の胎児の脳、脊髄などに含まれる神経系細胞に遺伝子導入できる。上記ヌクレオチドの欠失、置換、挿入および／または付加の数は、一般的に小さい程好ましい。このようなポリヌクレオチドは、例えば、配列番号：７、９もしくは１１またはその相補配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドであって、本発明の組換えウイルスビリオンを形成可能であるタンパク質（例えば、配列番号：８、１０又は１２のアミノ酸配列、あるいは配列番号：８、１０または１２のアミノ酸配列において４４４～４４６位以外の位置に１個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列を含むタンパク質）をコードするポリヌクレオチドを含み得る。
　ハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　３ｒｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ、２００１）に記載の方法などに従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、製造業者により提供される使用説明書などに記載の方法に従って行うことができる。ここで、「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するＤＮＡが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
　ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなどの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメーターを用いて計算したときに、配列番号：７、９又は１１のヌクレオチド配列と、例えば、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、９９．９％以上の同一性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。上記相同性の数値は一般的に大きい程好ましい。
　なお、アミノ酸配列やポリヌクレオチド配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８７２２６４－２２６８，１９９０；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ　ＵＳＡ　９０：５８７３，１９９３）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ　ＳＦ，ｅｔ　ａｌ：Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　２１５：４０３，１９９０）。ＢＬＡＳＴＮを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴＸを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
　本発明において用いられるＲｅｐタンパク質は、ＩＴＲ配列を認識してその配列に依存してゲノム複製を行う機能、ウイルスビリオン内へと野生型ＡＡＶゲノム（又はｒＡＡＶゲノム）をリクルートしてパッケージングする機能、本発明のｒＡＡＶビリオンを形成する機能など公知の機能を同程度に有する限り、上記と同様の数のアミノ酸配列同一性を有してもよいし、上記と同様の数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加を含み得る。機能的に同程度の範囲については、上記の比活性に関する説明において記載される範囲が挙げられる。本発明において、好ましくは、配列番号：１６に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質が使用される。
　本発明において用いられるＲｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ＩＴＲ配列を認識してその配列に依存してゲノム複製を行う機能、ウイルスビリオン内へと野生型ＡＡＶゲノム（又はｒＡＡＶゲノム）をリクルートしてパッケージングする機能、本発明のｒＡＡＶビリオンを形成する機能などの公知の機能を同程度に有するＲｅｐタンパク質をコードする限り、上記と同様の数の同一性を有してもよいし、上記と同様の数のヌクレオチドの欠失、置換、挿入および／または付加を含んでもよい。機能的に同程度の範囲については、上記の比活性に関する説明において記載される範囲が挙げられる。本発明において、好ましくは、配列番号：１５に記載のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドが使用される。
　本発明の１実施形態において、上記の野生型ＡＡＶゲノムの内部領域にコードされるカプシドタンパク質ＶＰ１など（ＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３）、およびＲｅｐタンパク質は、これをコードするポリヌクレオチドがＡＡＶヘルパープラスミドに組込まれて提供される。本発明において用いられるカプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３）、ならびにＲｅｐタンパク質は、それらをコードするポリヌクレオチドが、必要に応じて１種、２種、３種またはそれ以上のプラスミドに組込まれていてもよい。場合によって、これらのカプシドタンパク質およびＲｅｐタンパク質のうちの１種以上をコードするポリヌクレオチドがＡＡＶゲノムに含まれてもよい。本発明において、好ましくは、カプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３）およびＲｅｐタンパク質は全て、１種のポリヌクレオチドにコードされ、ＡＡＶヘルパープラスミドとして提供される。例えば、本明細書中の実施例を参照のこと。
３．３．本発明のｒＡＡＶゲノム
　本発明のｒＡＡＶビリオン中にパッケージングされる組換えアデノ随伴ウイルスポリヌクレオチド（以下、本発明のｒＡＡＶゲノム）は、野生型ＡＡＶゲノムの５’側および３’側に位置するＩＴＲの間に位置する内部領域（すなわち、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子の一方または両方）のポリヌクレオチドを、上記の目的塩基配列を含むポリヌクレオチド（治療用遺伝子）およびこのポリヌクレオチドを転写するためのプロモーター配列などを含む遺伝子カセットによって置換することにより作製できる。好ましくは、５’側および３’側に位置するＩＴＲは、それぞれＡＡＶゲノムの５’末端および３’末端に位置する。本発明のｒＡＡＶゲノムは、５’末端および３’末端に位置するＩＴＲとして、好ましくは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３またはＡＡＶ９のゲノムに含まれる５’側ＩＴＲおよび３’側ＩＴＲを含み、より好ましくは、ＡＡＶ３のゲノムに含まれる５’側ＩＴＲおよび３’側ＩＴＲを含み、特に好ましくは、５’側のＩＴＲとして配列番号：１３のポリヌクレオチドを含み、３’側ＩＴＲとして配列番号：１４のポリヌクレオチドを含む。一般的に、ＩＴＲ部分は容易に相補配列が入れ替わった配列（ｆｌｉｐ　ａｎｄ　ｆｌｏｐ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）をとるため、本発明のｒＡＡＶゲノムに含まれるＩＴＲは、５’と３’の方向が逆転していてもよい。本発明のｒＡＡＶゲノムにおいて、内部領域と置き換えられる遺伝子カセットの長さは、元のポリヌクレオチドの長さと同程度が実用上好ましい。すなわち、本発明のｒＡＡＶゲノムは、全長が野生型の全長である５ｋｂと同程度、例えば約２～６ｋｂ、好ましくは約４～６ｋｂであることが好ましい。
　一般的に、組換えアデノ随伴ウイルスビリオン内にパッケージングされるウイルスゲノムは、このゲノムが一本鎖であることに起因して、ゲノムに含まれる目的の遺伝子を発現するまで時間（数日）を要するという問題がある。この問題を解決するため、導入される治療用遺伝子を自己相補性に設計し（ｓｅｌｆ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ（ｓｃ）型ベクターと称される）、ウイルスベクター感染後の発現を促進することが図られている。この場合、二本鎖形成のため逆向きの配列も含める必要性に起因して、上記の治療用遺伝子の長さは、非ｓｃ型ゲノムベクターと比較しておよそ半分の長さになるよう設計されるべきである。より具体的には、組換えウイルスゲノムをｓｃ型とする場合、組込み可能な目的の遺伝子の長さは、プロモーター、ポリアデニレーション等に要する領域を含めて約２ｋｂに設計される。具体的な実施の詳細については、例えば、前述のＦｏｕｓｔ　ＫＤ，ｅｔ　ａｌ．（Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００９　Ｊａｎ；２７（１）：５９－６５、非特許文献３）などに記載されている。本発明において用いられるｒＡＡＶゲノムは、非ｓｃ型であってもよいし、ｓｃ型であってもよい。ｓｃ型の場合、目的塩基配列を含む発現カセット全体、またはその一部が二本鎖ＤＮＡを形成できる。
　本発明のｒＡＡＶゲノムでは、目的とするｍｏｄＨｅｘＢポリペプチドを発現させるため、目的塩基配列が種々の公知のプロモーター配列と作動可能に組み合わされる。プロモーター配列としては、発現する組織非特異的な全身性プロモーター（ユビキタスプロモーター）であってもよいし、組織特的なプロモーターであってもよい。目的とするｍｏｄＨｅｘＢは神経系細胞での発現が求められるから、組織特的なプロモーターとして、神経系細胞特異的プロモーターを用いることができる。ただし、本発明者らは、神経系細胞特異的プロモーターよりも全身性プロモーターを用いた場合に、治療効果が高いことを見出している。
　全身性プロモーターとしては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＥＦ－１αプロモーター、ＳＶ４０プロモーター及びＣＡＧプロモーターからなる群より選択される全身性プロモーターが好適である。
　本発明において使用される神経系細胞特異的プロモーター配列は、例えば、神経細胞、神経膠細胞、乏突起膠細胞、脳血管内皮細胞、小膠細胞、脳室上皮細胞などに由来するが、これらに限定されない。神経系細胞特異的プロモーターとしては、シナプシンＩプロモーター配列、ミエリン塩基性タンパク質プロモーター配列、ニューロン特異的エノラーゼプロモーター配列、カルシウム／カルモジュリン－依存性蛋白キナーゼＩＩ（ＣＭＫＩＩ）プロモーター、チュブリンαＩプロモーター、血小板由来成長因子β鎖プロモーター、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター配列、Ｌ７プロモーター配列（小脳プルキンエ細胞特異的プロモーター）、及びグルタミン酸受容体デルタ２プロモーター（小脳プルキンエ細胞特異的プロモーター）からなる群より選択される神経系細胞特異的プロモーターが好適である。
　また、本発明のｒＡＡＶビリオンにおいて、カルシウム／カルモジュリン－依存性蛋白キナーゼＩＩ（ＣＭＫＩＩ）プロモーター、チュブリンαＩプロモーター、血小板由来成長因子β鎖プロモーターなどのプロモーター配列も使用され得る。上記のこれらプロモーター配列は、単独であっても任意の複数の組み合わせであってもよい。
　プロモーターとしては、特に好ましくは、全身性プロモーターであり、最も好ましくは、ＣＭＶプロモーターである。
　本発明のｒＡＡＶゲノムは、さらに、ｍＲＮＡの転写、タンパク質への翻訳などを補助するエンハンサー配列、Ｋｏｚａｋ配列、適切なポリアデニル化シグナル配列などの公知の配列を含んでもよい。
　本明細書中で使用される場合、特に述べられない限り、「ウイルスビリオン」、「ウイルスベクター」、「ウイルス粒子」の各用語は、相互に交換可能に用いられる。
　本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「核酸」、「遺伝子」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「ヌクレオチド配列」は、「核酸配列」または「塩基配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。例えば、「配列番号１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメント」とは、配列番号１の各デオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃおよび／またはＴによって示される配列を含むポリヌクレオチドまたはその断片部分が意図される。
　本発明に係る「ウイルスゲノム」および「ポリヌクレオチド」は各々、ＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在し得るが、場合によってはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態であってもよい。本明細書において使用されるウイルスゲノムおよびポリヌクレオチドは各々、二本鎖または一本鎖のＤＮＡであり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの場合、コード鎖（センス鎖としても知られる）であっても、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であってもよい。特に述べられない限り、本明細書中、ｒＡＡＶゲノムがコードするプロモーター、目的遺伝子、ポリアデニレーションシグナルなどの遺伝子上の配置について説明される場合、ｒＡＡＶゲノムがセンス鎖である場合についてはその鎖自体について、アンチセンス鎖である場合はその相補鎖について記載される。
　本明細書において、「タンパク質」と「ポリペプチド」とは相互に交換可能に用いられ、アミノ酸の重合体が意図される。本明細書において使用されるポリペプチドは、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。本発明のポリペプチドの部分ペプチド（本明細書中、本発明の部分ペプチドと略記する場合がある）としては、前記した本発明のポリペプチドの部分ペプチドで、好ましくは、前記した本発明のポリペプチドと同様の性質を有するものである。
　本明細書において、用語「プラスミド」は、種々の公知の遺伝子要素、例えば、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体等を意味する。プラスミドは特定の宿主において複製することができ、そして細胞間で遺伝子配列を輸送できる。本明細書において、プラスミドは、種々の公知のヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡおよびその混合物）を含み、一本鎖であっても二本鎖であってもよいが、好ましくは二本鎖である。例えば、本明細書において、用語「ｒＡＡＶベクタープラスミド」は、特に明記しない限り、ｒＡＡＶベクターゲノムおよびその相補鎖により形成される二本鎖を含むことが意図される。本発明において使用されるプラスミドは、直鎖状であっても環状であってもよい。
　本発明のｒＡＡＶゲノムに組込まれる目的塩基配列は、従来よりも高い効率で神経系細胞に送達され、その細胞のゲノム中に組込まれる。本発明のｒＡＡＶベクターを使用する場合、従来のｒＡＡＶベクターを用いる場合と比較して、約１０倍以上、約２０倍以上、約３０倍以上、約４０倍以上または約５０倍以上の数の神経細胞に遺伝子導入可能である。遺伝子導入された神経細胞の数は、例えば、任意のマーカー遺伝子を組込んだｒＡＡＶベクターゲノムをパッケージングするｒＡＡＶビリオンを作製し、次いでこのｒＡＡＶビリオンを被検動物に投与して、ｒＡＡＶベクターゲノムに組込まれたマーカー遺伝子（またはマーカータンパク質）を発現する神経系細胞の数を計測することによって測定可能である。使用されるマーカー遺伝子としては公知のものを選択できる。このようなマーカー遺伝子としては、例えば、ＬａｃＺ遺伝子、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子、発光タンパク質遺伝子（ホタルルシフェラーゼなど）などが挙げられる。
　本発明において、ｒＡＡＶベクターゲノムをパッケージングしたｒＡＡＶビリオンは、生体の血液脳関門を通過可能であり、したがって被検体への末梢投与によって、被検体の脳、脊髄などの神経系細胞に目的の治療用遺伝子を導入可能である。
　本明細書中において使用される場合、用語「パッケージング」とは、１本鎖ウイルスゲノムの調製、外被タンパク質（キャプシド）の組み立て、およびウイルスゲノムをキャプシドで包むこと（ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ）などを含む事象をいう。適切なプラスミドベクター（通常、複数のプラスミド）が適切な条件下でパッケージング可能な細胞株に導入される場合、組換えウイルス粒子（すなわち、ウイルスビリオン、ウイルスベクター）が組み立てられ、培養物中に分泌される。
４．本発明のｒＡＡＶビリオンの調製
　本発明の別の実施形態において、本発明のｒＡＡＶビリオンを調製する方法が提供される。この方法は、（ａ）本発明のカプシドタンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド（一般に、ＡＡＶヘルパープラスミドと称される）、および（ｂ）本発明のｒＡＡＶビリオン内にパッケージングされる第２のポリヌクレオチド（目的塩基配列を含む）を、培養細胞にトランスフェクトする工程を含むことができる。本発明における調製方法はさらに、（ｃ）アデノウイルス（ＡｄＶ）ヘルパープラスミドと称されるアデノウイルス由来因子をコードするプラスミドを培養細胞にトランフェクトする工程、またはアデノウイルスを培養細胞に感染させる工程も含むことができる。さらに、上記のトランスフェクトされた培養細胞を培養する工程、および培養上清より組換えアデノ随伴ウイルスベクターを収集する工程を含むこともできる。このような方法は既に公知であり、本明細書の実施例においても利用される。
　好ましくは、本発明のｒＡＡＶビリオンを調製する方法は、（ａ）配列番号：８、１０および１２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド、ならびに（ｂ）プロモーター配列と目的塩基配列とを、配列番号：１３のヌクレオチド配列と配列番号：１４のヌクレオチド配列との間に含む第２のポリヌクレオチドを、培養細胞にトランスフェクトすることを含む。このような第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドは、例えば、実施例３に記載のポリヌクレオチドの組合せを含む。
　第１のポリヌクレオチドにおいて本発明のカプシドタンパク質をコードするヌクレオチドは、好ましくは、培養細胞において作動可能である公知のプロモーター配列に作動可能に結合される。このようなプロモーター配列としては、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＥＦ－１αプロモーター、ＳＶ４０プロモーターなどを適宜使用することができる。さらに、公知のエンハンサー配列、Ｋｏｚａｋ配列、ポリＡ付加シグナル配列などを適宜含み得る。
　例えば、配列番号：８、１０および１２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドは次の方法により製造することができる。１型ＡＡＶ（ＡＡＶ１）、２型ＡＡＶ（ＡＡＶ２）、９型ＡＡＶ（ＡＡＶ９）という３種類のＡＡＶについて、それぞれの外被蛋白ＶＰ１をコードする塩基配列を含むプラスミドｐＡＡＶ１－ＲＣ、ｐＡＡＶ２－ＲＣ、ｐＡＡＶ９－ＲＣを鋳型として使用する。これらのプラスミドは文献（Ｈａｎｄａ，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ　Ｇｅｎ　Ｖｉｒｏｌ，８１：２０７７－２０８４，２０００）に記載されたＡＡＶ３　Ｒｅｐ／ＶＰに由来し、ＡＡＶ３のＲｅｐ配列を含む（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，ｅｔ　ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　２２１，２０８－２１７（１９９６））。これらのＡＡＶのＶＰ１の塩基配列はＧｅｎｅＢａｎｋにそれぞれＡｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＦ０６３４９７、ＡＦ０４３３０３、ＡＹ５３０５７９として既に報告されている（それぞれ、配列番号：１、３および５に示される）。ｐＡＡＶ１－ＲＣを鋳型とし、配列番号１７からなるＤＮＡであるフォワードプライマー及び配列番号１８からなるＤＮＡであるリバースプライマーを合成し、Ｑｕｉｃｋ　Ｃｈａｎｇｅ　ＩＩ　ＸＬ　ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を使用して、ＡＡＶ１のＶＰ１アミノ酸配列（配列番号：２）の４４５番目に位置するチロシン（Ｙ）残基をフェニルアラニン（Ｆ）残基で置換する。同様に、ｐＡＡＶ２－ＲＣを鋳型とし、配列番号１９からなるＤＮＡであるフォワードプライマー及び配列番号２０からなるＤＮＡであるリバースプライマーを合成し、ＡＡＶ２のＶＰ１アミノ酸配列（配列番号：４）の４４４番目に位置するチロシン（Ｙ）残基をフェニルアラニン（Ｆ）残基で置換する。同様に、ｐＡＡＶ９－ＲＣを鋳型とし、配列番号２１からなるＤＮＡであるフォワードプライマー及び配列番号２２からなるＤＮＡであるリバースプライマーを合成し、ＡＡＶ９のＶＰ１アミノ酸配列（配列番号：６）の４４６番目に位置するチロシン（Ｙ）残基をフェニルアラニン（Ｆ）残基で置換する。こうして、置換されたアミノ酸配列ＡＡＶ１－ｙｆＶＰ１（配列番号：８）、ＡＡＶ２－ｙｆＶＰ１（配列番号：１０）およびＡＡＶ９－ｙｆＶＰ１－３（配列番号：１２）それぞれをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＡＡＶ１－ｙｆＲＣ、ｐＡＡＶ２－ｙｆＲＣ、ｐＡＡＶ９－ｙｆＲＣを作製する。また、ｐＡＡＶ１－ｙｆＲＣ、ｐＡＡＶ２－ｙｆＲＣ、ｐＡＡＶ９－ｙｆＲＣはいずれもＡＡＶ２のＲｅｐをコードするヌクレオチド配列（配列番号：１５）を含む。
　第２のポリヌクレオチドは、プロモーター配列及び目的塩基配列を含む。さらに、公知のエンハンサー配列、Ｋｏｚａｋ配列、ポリＡ付加シグナル配列などを適宜含み得る。
　ＡＡＶはヘルパー依存性ウイルスであるので、本発明のｒＡＡＶビリオンを調製するため、ビリオン生産用の細胞（培養細胞）に感染する際、ヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス又はワクシニア）との共感染を必要とする。ヘルパーウイルスとの共感染がない場合、ＡＡＶは、ウイルスゲノムを宿主細胞染色体に挿入するが、挿入されたウイルスゲノムに由来する感染性ＡＡＶビリオンは生成されない。その挿入されたウイルスゲノムを有する宿主がヘルパーウイルスに感染される場合、組み込まれたゲノムに由来する感染性ＡＡＶビリオンを生じ得る。ＡＡＶ自体は、異なる種由来の細胞に感染し得るが、ヘルパーウイルスは、宿主細胞と同じ種であることが必要とされる。例えば、ヒトＡＡＶは、イヌのアデノウイルスに共感染されたイヌの細胞において複製できる。
　本発明のｒＡＡＶビリオンの調製において、ヘルパーウイルスプラスミド（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス又はワクシニア）を使用して、上記第１および第２のポリヌクレオチドと同時に培養細胞に導入され得る。好ましくは、本発明の調製方法は、アデノウイルス（ＡｄＶ）ヘルパープラスミドを導入する工程をさらに含む。ＡｄＶヘルパープラスミドは、ＡＡＶゲノムの複製などに必要とされるＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ４　ｏｒｆ４などのタンパク質をコードする。あるいは、必要なヘルパー機能を運搬する組換えウイルスもしくは非ウイルスベクター（例えばプラスミド、エピソームなど）を利用してもよい。こうした組換えウイルスは当該技術分野で既知でありかつ公表された技術に従って製造できる。多様なアデノウイルス株がＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手可能であり、また市販されてもいる。あるいは、多くのアデノウイルス株の配列は、例えば、公的なデータベース（例えば、ＰｕｂＭｅｄ、Ｇｅｎｂａｎｋなど）より入手可能である。
　本発明において、好ましくは、ＡｄＶヘルパーは、培養細胞と同じ種のウイルスに由来する。例えば、ヒト培養細胞２９３Ｔを用いる場合、ヒトＡｄＶ由来のヘルパーウイルスベクターを用いることができる。このようなＡｄＶヘルパーベクターとして、市販されているもの（例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＡＡＶ　Ｈｅｌｐｅｒ－Ｆｒｅｅ　Ｓｙｓｔｅｍ（カタログ番号２４００７１））を使用することができる。
　本発明のｒＡＡＶビリオンの調製において、上記の１種以上のプラスミドを培養細胞にトランスフェクションする方法は、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法など、公知の種々の方法を使用することができる。このような方法は、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　３ｒｄ　Ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ　１９８７－１９９７などに記載されている。
５．本発明のｒＡＡＶビリオンを含む医薬組成物
　本発明のさらなる実施形態において、本発明のｒＡＡＶビリオン（ｒＡＡＶベクター）を含む医薬組成物が提供される。本発明のｒＡＡＶビリオンを含む医薬組成物（以下、本発明の医薬組成物という）を利用することによって、被検体の細胞に高い効率で、目的とするβ－ヘキソサミニダーゼの改変型β-サブユニットの遺伝子を導入可能であり、この導入される遺伝子によって、テイ－サックス病及び／又はザンドホッフ病を治療できる方法を提供する。本発明のｒＡＡＶビリオンは、生体の血液脳関門を通過可能であるので、被検体に末梢投与することによって、本発明のｒＡＡＶビリオンを脳、脊髄、網膜などの神経系細胞に遺伝子の送達が可能である。また本発明のｒＡＡＶビリオンは、脳内投与又は髄腔内投与によっても脳、脊髄などの神経系細胞に遺伝子の送達が可能である。
　本発明の医薬組成物を使用する場合、例えば、経口、非経口（静脈内）、筋肉、口腔粘膜、直腸、膣、経皮、鼻腔経由または吸入経由などですることができるが、非経口的に投与するのが好ましい。静脈内投与、脳内投与又は髄腔内投与がさらに好ましい。本発明の医薬組成物の有効成分は単独で、あるいは組み合わせて配合されても良いが、これに製薬学的に許容しうる担体あるいは製剤用添加物を配合して製剤の形態で提供することもできる。この場合、本発明の有効成分は、例えば、製剤中、０．１～９９．９重量％含有することができる。
　製薬学的に許容しうる担体あるいは添加剤としては、例えば賦形剤、崩壊剤、崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、溶解剤、溶解補助剤、等張化剤、ｐＨ調整剤、安定化剤等を用いることができる。
　経口投与に適する製剤の例としては、例えば散剤、錠剤、カプセル剤、細粒剤、顆粒剤、液剤またはシロップ剤等を挙げることが出来る。経口投与の場合、微晶質セルロース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸ジカリウム、グリシンのような種々の賦形剤を、澱粉、好適にはとうもろこし、じゃがいもまたはタピオカの澱粉、およびアルギン酸やある種のケイ酸複塩のような種々の崩壊剤、およびポリビニルピロリドン、蔗糖、ゼラチン、アラビアゴムのような顆粒形成結合剤と共に使用することができる。また、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、タルク等の滑沢剤も錠剤形成に非常に有効であることが多い。同種の固体組成物をゼラチンカプセルに充填して使用することもできる。これに関連して好適な物質としてラクトースまたは乳糖の他、高分子量のポリエチレングリコールを挙げることができる。経口投与用として水性懸濁液および／またはエリキシルにしたい場合、活性成分を各種の甘味料または香味料、着色料または染料と併用する他、必要であれば乳化剤および／または懸濁化剤も併用し、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン等、およびそれらを組み合わせた希釈剤と共に使用することができる。
　非経口投与に適する製剤としては、例えば注射剤、坐剤等を挙げることが出来る。非経口投与の場合、本発明の有効成分をゴマ油または落花生油のいずれかに溶解するか、あるいはプロピレングリコール水溶液に溶解した溶液を使用することができる。水溶液は必要に応じて適宜に緩衝し（好適にはｐＨ８以上）、液体希釈剤をまず等張にする必要がある。このような液体希釈剤としては、例えば、生理食塩水を使用できる。調製された水溶液は静脈内注射に適し、一方、油性溶液は関節内注射、筋肉注射および皮下注射に適する。これらすべての溶液を無菌状態で製造するには、当業者に周知の標準的な製薬技術で容易に達成することができる。さらに、本発明の有効成分は皮膚など局所的に投与することも可能である。この場合は標準的な医薬慣行によりクリーム、ゼリー、ペースト、軟膏の形で局所投与するのが望ましい。
　本発明の医薬組成物の投与量は特に限定されず、疾患の種類、患者の年齢や症状、投与経路、治療の目的、併用薬剤の有無等の種々の条件に応じて適切な投与量を選択することが可能である。本発明の医薬組成物の投与量は、例えば、成人（例えば、体重６０ｋｇ）１日当たり１～５０００ｍｇ、好ましくは１０～１０００ｍｇであるが、これらに限定されない。これらの１日投与量は２回から４回に分けて投与されても良い。また、投与単位としてｖｇ（ｖｅｃｔｏｒ　ｇｅｎｏｍｅ）を利用する場合、例えば、体重１ｋｇあたり、１０９～１０１４ｖｇ、好ましくは１０１０～１０１３ｖｇ、さらに好ましくは１０１０～１０１２ｖｇの範囲の投与量を選択することが可能であるが、これらに限定されない。
　以下、本発明の実施形態を、実施例に基づき具体的に説明する。ただし本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。なお、以下にいう％は特に明示しない限り重量％を意味する。
　実施例1及び2で用いるベクターAAV-CMV-modHEXB（別名AAV-CMV-mod2B）の製造方法は実施例3で、ベクターAAV-SynI-modHEXB（別名AAV-SynI-mod2B）の製造方法は実施例4で、ベクターAAV-CMV-GFPの製造方法は実施例5で、それぞれ詳述する。
＜実施例1: AAV-CMV-modHEXBの脳室内投与によるSandhoff病モデルマウスに対する有効性評価＞
1. AAV-CMV-modHEXBの脳室内投与によるSandhoff病（Hexb-/-）モデルマウス（Hexa及びHexb同時欠損）に対する有効性評価
1.1. AAV-CMV-modHEXBのSandhoff病モデル（SD）マウス脳室内投与後の脳及び各臓器におけるβ-ヘキソサミニダーゼ（Hex）活性発現
　15週齢のSandhoff病モデルマウス（SDマウス）（発症後期）の脳室内にAAV-CMV-modHEXB（別名AAV-CMV-mod2B）5.75×1011vg/25μL PBS（リン酸緩衝液）を一回投与し、1週間後に各臓器を摘出し、プロテアーゼ/フォスファターゼ阻害剤カクテル（終濃度20μMロイペプチン、2mMEDTA、1mMPMSF、1mMペプスタチンA）含有蒸留水（milliQレベル）（組織湿重量100mg/0.3mL）中で、ソニケーション（プローブ型ソニケーター及び湯浴式シニケーター10分）で組織を破砕した。4℃、12,000 x gで15分の遠心分離後の上清（組織抽出液）を調製した。なお、SDマウスに対するベクター量5.75×1011vg/匹は、概ね1.9×1013vg/kg体重に相当する。
　一定量の前記抽出液を、0.1M クエン酸ナトリウム緩衝液(pH 4.2)中で、人工蛍光基質4-メチルウンベリフェリルβ-D-グルコサミニド（MUG）及び4-メチルウンベリフェリル6-スルホ-β-D-グルコサミニド（MUGS）の分解活性を測定した。また同抽出液中のタンパク濃度を測定し、単位タンパク質量あたりの基質分解活性、すなわち比活性、を算出した。　なおHEXBを欠損しHEXAを有するSDマウスは、通常は、MUG分解活性を有さず、MUGS分解活性を有する。
1.2. AAV-CMV-modHEXBのSandhoff病モデル（SD）マウス脳室内投与後の脳及び各臓器におけるヒト改変型β-ヘキソサミニダーゼB（modHexB）の酵素タンパクの発現
　ヒトmodHexBに対するウエスタンブロット解析では、実験1.1.で得た各組織抽出液の一定量（各10μg）を試料として15%ポリアクリルアミドゲルを用いるSDS-電気泳動（SDS-PAGE）（定電流15mA）を行った。泳動後のゲルを、定電圧15VでPVDF膜に転写後、膜をブロッキング剤で1時間処理した。抗ヒトHexA(αβ)ウサギポリクローナル抗体NAG(A)を一次抗体（1,000倍希釈液）で４℃一晩処理、Tris緩衝液で洗浄後、二次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗ウサギIgG抗体で処理、洗浄後、化学発光キットを用い、LAS4000mini（GEHealthcare）でヒトmodHexBタンパク質を検出した。
　実験1.1.での各臓器の抽出液中のMUG分解比活性の測定結果を図1上段のグラフに示し、実験1.2.での各臓器の抽出液中のタンパク質のウエスタンブロット解析の結果を図1下段の写真に示す。大脳、脳幹、心臓、肝臓では、改変型Hexβ鎖前駆体タンパク質が検出された。AAV-CMV-modHEXBの脳室内投与による遺伝子導入効果が確認された。
1.3.AAV-CMV-modHEXBのSandhoff病モデル（SD）マウス脳室内投与後の各脳領域におけるヒト改変型β-ヘキソサミニダーゼB（modHexB）の酵素タンパクの分布と、蓄積GM2ガングリオシドの減少の評価
　15週齢のSDマウスの脳室内にAAV-CMV-modHEXB 5.75×1011vg/25μL PBS（リン酸緩衝液）を一回投与し、1週間後に摘出した脳の凍結切片を作成し、ガラスプレパラートに付着乾燥後、4%パラフォルムアルデヒド/PBS溶液で室温１時間固定した。PBSで洗浄後、5%ヤギ血清/PBS、室温で１時間ブロッキングを行った。
　ヒトmodHEXB酵素タンパク質の解析は、ブロッキング・洗浄後の脳切片に対し、抗ヒトHexA(αβ)ウサギポリクローナル抗体NAG(A)を一次抗体（1,000倍希釈液）で4℃一晩処理した。PBSで洗浄後、二次抗体として、Alexa555標識抗ウサギIgGで処理し、洗浄後、50%グリセロール/PBSで封入した。
　蓄積基質であるGM2ガングリオシド（GM2）の脳内分布及びAAVベクター投与によるGM2の減少の確認のために、上記脳切片を、抗GM2マウスモノクローナルIgM抗体（100倍希釈液）で4℃一晩処理した。PBSで洗浄後、二次抗体として、Alexa388標識抗マウスIgで処理し、洗浄後、50%グリセロール/PBSで封入した。なお、神経系細胞マーカーとして、NEUN（神経細胞マーカー）、GFAP（アストロサイトマーカー）及びIba1（ミクログリアマーカー）に対する一次抗体と蛍光標識二次抗体による免疫蛍光組織化学的解析を実施した。
　免疫蛍光した封入脳切片についてはBIOREVO（Keyence社）装置を用いて、観察した。
　図2に、SDモデルマウスの脳切片、SDモデルマウスの脳室内へのAAV-CMV-modHEXB投与後の脳切片、野生型マウス(C57BL/6)の脳切片における、ヒトmodHEXB酵素タンパク質（一次抗体としてNAG(A)を使用）と、GM2ガングリオシド（一次抗体として抗GM2抗体を使用）の免疫蛍光組織化学的解析の結果を示す。SDモデルマウスの脳切片では、抗GM2抗体の染色が陽性、NAG(A)の染色が陰性であった。野生型マウス(C57BL/6)の脳切片では、抗GM2抗体の染色が陰性、NAG(A)の染色が僅かに陽性であった（マウスのHexを交差染色していると考えられる）。SDモデルマウスの脳室内へのAAV-CMV-modHEXB投与後の脳切片では、NAG(A)の染色が部分的に陽性であり、NAG(A)の染色が陽性の部分が、抗GM2抗体の染色が陰性であった。すなわちヒトmodHexB酵素タンパク質が分布する領域では、蓄積GM2の減少が観察された。
　図3Aに、SDモデルマウス（Hexb-/-）の脳の各領域における蓄積GM2ガングリオシド（緑）の免疫蛍光組織化学的解析の結果を示す。抗GM2抗体の染色が陽性、NAG(A)の染色が陰性であった。GM2ガングリオシドが蓄積していることが確認できる。modHEXB（赤）は検出されなかった。
　図3Bに、AAV-CMV-modHEXBを脳室内投与したSDモデルマウス（Hexb-/-）の脳の各領域におけるGM2ガングリオシド（緑）及びmodHEXB（赤）の免疫蛍光組織化学的解析の結果を示す。抗GM2抗体の染色が僅かに陽性、NAG(A)の染色が陽性であった。modHEXB（赤）が発現し、GM2ガングリオシド（緑）が減少していることが確認された。
　図3Cに、野生型マウス(C57BL/6)の脳の各領域におけるGM2ガングリオシド（緑）及びmodHEXB（赤）の免疫蛍光組織化学的解析の結果を示す。抗GM2抗体の染色が僅かに陽性、NAG(A)の染色が僅かに陽性であった。GM2ガングリオシド（緑）は蓄積していないことが確認された。modHEXBの検出のための一次抗体として用いたNAG(A)が、マウスのHexを交差染色していることが確認された。
2. AAV-CMV-GFPの脳室内投与によるSandhoff病（Hexb+/-）ヘテロマウスに対する、緑色蛍光タンパク質の発現分布
　15週齢のSandhoff病モデルヘテロマウス(Hexb+/-,n=1)にAAV-CMV-GFP 5.5×1011vgを脳室内投与（25μL）し、1週間後に摘出、凍結脳切片作製したのち、BIOREVO装置を用いてEGFP（Ex=488nm,Em=514nm)による蛍光観察した。なお、神経系細胞マーカーとして、NEUN（神経細胞マーカー）、GFAP（アストロサイトマーカー）及びIba1（ミクログリアマーカー）に対する一次抗体と蛍光標識二次抗体（Alexa544-anti-rabbitIgG）による免疫蛍光染色を行い、GFPが発現した細胞タイプを解析した。
　図4に、上記の免疫蛍光組織化学的解析の結果を示す。図4上段は、各切片のGFPの発色を示し、図4下段は、上段に示すのと同じ切片の、NEUN（神経細胞マーカー）、GFAP（アストロサイトマーカー）及びIba1（ミクログリアマーカー）の染色結果を示す。各切片はNEUN、GFAP及びIba1が陽性であったことから、脳実質構成細胞を含むことが確認された。そして、各切片の投与部位近傍部分でGFPの発色が陽性であったことから、15週齢Sandhoff病ヘテロマウスにAAV-CMV-GFP 5.5×1011vg/匹で脳室内投与すると、1週間後に投与部位近傍における発現GFPによる緑色蛍光が観察されたことが分かる。脳脊髄液に投与されたAAVベクターが脳実質構成細胞に導入され、細胞内でGFP遺伝子がCMVβプロモーター制御下で発現したことが裏付けられる。
3. AAV-CMV-modHEXBの脳室内一回投与の投与時期の検討
　上記の、15週齢のSDマウス（発症後期）の脳室内にAAV-CMV-modHEXB（別名AAV-CMV-mod2B）5.75×1011vg/25μL PBS（リン酸緩衝液）を単回投与、1週間後（16週齢時）に各臓器におけるmodHexBの発現解析に加え、
　14週齢（発症後期）SDマウスにAAV-CMV-modHEXB 5.75×1011vg/25μL PBS（リン酸緩衝液）脳室内単回投与、1週間後（15週齢時）、及び
　10週齢（発症前期）SDマウスにAAV-CMV-modHEXB 5.75×1011vg/25μL PBS（リン酸緩衝液）脳室内単回投与、5週間後（15週齢時）の、各臓器でのmodHexBの発現解析を行った。　各臓器でのmodHexBの発現は、MUG分解活性の回復を指標とする上記1.1.に記載の手順により評価した。
　結果を図5に示す。脳室内一回投与1週後（14週齢時に投与し15週齢時に解剖）には、大脳や心臓において、野生型マウスの数倍以上のMUG分解活性が観察された。脳室内一回投与5週後(10週齢時に投与し15週齢時に解剖）では、大脳、脳幹、心臓、肝臓、脾臓、腎臓で顕著なMUG分解活性回復が認められ、導入遺伝子の持続的発現、発現産物であるmodHexBの生体内安定性、及び分泌されたmodHexBの周辺細胞内への取り込み（クロスコレクション効果）が示唆された。
4. AAV-CMV-modHEXBの脳室内への単回投与量の検討
　10週齢（発症前期）SDマウスにAAV-CMV-modHEXBを各5.75×109vg、3.45x1010vg及び5.75×1011vg/25μL PBS（リン酸緩衝液）の投与量で、脳室内単回投与し、5週間後（15週齢時）の各臓器でのmodHexBの発現解析を行った。
　各臓器でのmodHexBの発現は、MUG分解活性の回復を指標とする上記1.1.に記載の手順により評価した。
　結果を図6（図6では、5.75×109vg及び5.75×1011vg単回投与の結果を示す）に示す。10週齢（発症前期）SDマウスにAAV-CMV-modHEXBを投与する場合、上記のいずれの投与量でも、各臓器において、野生型マウス（WT）と同程度のmodHexB活性が認められた。
実験1～4まとめ
　実験2では、15週齢Sandhoff病ヘテロマウスにAAV-CMV-GFP5.5×1011vg/匹で脳室内投与すると、1週間後に投与部位近傍における発現GFPによる緑色蛍光が観察された。脳脊髄液に投与されたAAVベクターが脳実質構成細胞に導入され、細胞内でGFP遺伝子がCMVβプロモーター制御下で発現した。
　実験1.3.では、15週齢Sandhoff病ホモマウス（n=1)にAAV-CMV-modHEXB 5.75×1011vg/匹で脳室内投与すると、1週間後に、広範な脳領域で、抗ヒトHex抗体との免疫蛍光（赤色）が観察され（図2）、AAVベクター導入細胞のみならず、modHEXB導入・発現細胞から分泌されたmodHexBが脳脊髄液を介して他の脳領域の構成細胞に取り込まれた（クロスコレクション効果が期待される）。
　実験1.3.では、抗GM2ガングリオシド抗体と抗ヒトHex抗体を用いた免疫組織染色では、15週齢Sandhoff病ホモマウスの広範な脳領域で、抗GM2抗体の免疫蛍光（緑色）が観察された (図3A) が、同週齢ホモマウスにAAV-CMV-modHEXB 5.75×1011vg/匹で脳室内投与すると、1週間後に、NAG(A)の免疫蛍光（赤色）が陽性となると共に抗GM2抗体の免疫蛍光（緑色）が弱まり、蓄積GM2が減少した領域が観察された(図3B)。AAV導入・発現細胞に由来するmodHexBが周囲の神経系細胞に取り込まれ、リソソームまで輸送され、蓄積GM2を分解したことが示唆される。
5. 8週齢のSandhoff病モデルマウスの脳室内への、AAV-CMV-modHEXBの単回投与の有効性
5.1. Sandhoff病モデルマウスの脳室内への、AAV-CMV-modHEXB単回投与による各臓器でのHex（MUG分解）活性回復
　8週齢SDマウスの脳室内に、AAV-CMV-modHEXBを5.75×1011vg/匹で単回投与した後、17週齢時点で解剖し、各臓器でのHex（MUG分解）活性を測定した。実験の手順は実験1～3と同様である。
　結果を図7に示す。比較のために野生型マウス(WT)及びSDマウス(SD)についての活性測定結果も示す。脳では、大脳と脳幹で、末梢では心臓で顕著なHex活性回復が認められた。
5.2. Sandhoff病モデルマウスの脳室内へのAAV-CMV-modHEXB単回投与による脳領域でのHexB分布及び蓄積GM2の減少
　8週齢SDマウスの脳室内に、AAV-CMV-modHEXBを5.75×1011vg/匹で単回投与した後、17週齢時点で解剖し脳切片を免疫染色した。実験の手順は実験1～3と同様である。免疫染色は実験1.3.に記載の手順で行った。
　図8に、野生型マウス(WT)の脳切片、SDモデルマウス(SD)の脳切片、SDモデルマウスの脳室内へのAAV-CMV-modHEXB投与後(AAV)の脳切片の、各部位（大脳、小脳、海馬）における、ヒトmodHEXB酵素タンパク質（一次抗体としてNAG(A)を使用、赤）、GM2ガングリオシド（一次抗体として抗GM2抗体を使用、緑）、細胞核（Hoechist染色、青）の免疫蛍光組織化学的解析の結果を示す。野生型マウス(WT)の脳切片の各部位はいずれも、ヒトmodHEXB酵素タンパク質が僅かに陽性（マウスHexの交差染色）、GM2ガングリオシドが陰性、Hoechist染色陽性であった。SDモデルマウス(SD)の脳切片の各部位はいずれも、ヒトmodHEXB酵素タンパク質が陰性、GM2ガングリオシドが陽性、Hoechist染色陽性であった。SDモデルマウスの脳室内へのAAV-CMV-modHEXB投与後(AAV)の脳切片の各部位はいずれも、ヒトmodHEXB酵素タンパク質が陽性、GM2ガングリオシドが僅かに陽性、Hoechist染色陽性であった。SDマウスではGM2ガングリオシドが脳内で蓄積しているが、AAV-CMV-modHEXBの投与により、GM2ガングリオシドが減少することが確認された。
5.3. Sandhoff病モデルマウスの脳室内へのAAV-CMV-modHEXB単回投与による脳領域でのCD68陽性活性化ミクログリアの減少
　8週齢SDマウスの脳室内に、AAV-CMV-modHEXBを5.75×1011vg/匹で単回投与した後、17週齢時点で解剖し脳切片を免疫染色した。実験の手順は実験1～3と同様である。免疫染色は実験1.3.に記載の手順で行った。
　図9に、野生型マウス(WT)の脳切片、SDモデルマウス(SD)の脳切片、SDモデルマウスの脳室内へのAAV-CMV-modHEXB投与後(AAV)の脳切片の、各部位（大脳、小脳、海馬）における、CD68（一次抗体として抗CD68抗体を使用、赤）、細胞核（Hoechist染色、青）の免疫蛍光組織化学的解析の結果を示す。野生型マウス(WT)の脳切片の各部位はいずれも、CD68が僅かに陽性、Hoechist染色陽性であった。SDモデルマウス(SD)の脳切片の各部位はいずれも、CD68が強い陽性、Hoechist染色陽性であった。SDモデルマウスの脳室内へのAAV-CMV-modHEXB投与後(AAV)の脳切片の各部位はいずれも、CD68が僅かに陽性、Hoechist染色陽性であった。SDマウスではCD68が脳内で蓄積しているが、AAV-CMV-modHEXBの投与により、CD68が減少することが確認された。
5.4. Sandhoff病モデルマウスの脳室内へのAAV-CMV-modHEXB単回投与による各脳領域での炎症性ケモカイン（Mip1）の減少
　8週齢SDマウスの脳室内に、AAV-CMV-modHEXBを5.75×1011vg/匹で単回投与した後、17週齢時点で解剖し、大脳、小脳、脳幹での炎症性ケモカイン（Mip1-α）を定量した。野生型マウス(WT)、SDモデルマウス(SD)についても、同様に、大脳、小脳、脳幹でのMip1-αを定量した。Mip1-αの定量はMouse CCL3/MIP-1 alpha Quantikine ELISA Kit（R&D Systems社製）を用いて行った。その他の実験の手順は実験1～3と同様である。
　結果を図10に示す。SDマウスの大脳、小脳及び脳幹で増大しているMip1-αが、AAVの脳室内単回投与により、大脳及び小脳では野生型レベルまで減少したことが確認された。
6.ロータロッド試験による運動機能・体重及び寿命に対する有効性評価
6.1. Sandhoff病モデル（Hexb-/-）マウスの運動機能及び体重に対する、AAV-CMV-modHEXB の脳室内一回投与の投与量の検討
　8週齢の成体SDマウス（発症前期）の脳室内に、AAV-CMV-modHEXBを5.75×1010vg/匹または5.75×1011vg/匹の投与量で単回投与し、11週齢時点から、1週毎にロータロッド試験を実施した。
　ロータロッド試験は、4 round-per-minutes (rpm)から開始し、120秒間に40rpmまで回転数を上げる条件で行い、1個体毎に6回行い、ロータロッドからマウスが落下するまでの平均時間を測定した。また同週齢の野生型マウス（WT）及びSDマウス(SD)についても同じ条件で試験を行った。なお、試験1週間前に練習を行った。
　また各時点で体重測定を行うとともに、生存（寿命）を確認した。
　ロータロッド試験の結果を図11Aに、体重測定の結果を図11Bに示す。AAV-CMV-modHEXBを5.75×1010vg/匹を投与したSDマウスは、14週齢で死亡した。
　AAV-CMV-modHEXB を、8週齢時点で5.75×1011vg/匹の量で単回投与することにより、野生型と同等のロータロッドパフォーマンスを示した。一方、AAV-CMV-modHEXBの投与量が5.75×1010vg/匹の場合は、わずかに発症を遅延させるだけで、寿命は延長しなかった。
6.2. 8週齢Sandhoff病モデル（Hexb-/-）マウスの脳室内へのAAV-CMV-modHEXB 単回投与の運動機能に対する有効性
　8週齢SDマウスの脳室内に、AAV-CMV-modHEXBを1.15×1011vg/匹の投与量で投与した。実験6.1.と同様の手順でロータロッド試験を行い、落下するまでの平均時間を求めた。
　結果を図12に示す。AAV-CMV-modHEXB を、8週齢時点で1.15×1011vg/匹の投与量で単回投与した場合、14週齢以降でロータロッドパフォーマンスが低下した。このことは、運動機能に対する有効性の減弱を示している。
7. AAV-CMV-modHEXBのSandhoff病ヘテロ（Hexb+/-）新生仔（P0～P2）マウスの脳室内または側頭静脈への単回投与による各臓器でのHex活性増大
　SDヘテロマウスに脳室内または側頭静脈内投与した後の、脳及び各臓器におけるβ-ヘキソサミニダーゼ（Hex）活性の増大を評価した。
　SDヘテロマウス新生仔（P0～P1）の脳室内または側頭静脈内にAAV-CMV-modHEXB 1.15×1011vg/5μL PBS（リン酸緩衝液）又は1.15×1010vg/5μL PBSを一回投与し、10週齢時点で、PBSにより灌流後、各臓器（脳、心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓）を摘出し、プロテアーゼ/フォスファターゼ阻害剤カクテル（終濃度20μMロイペプチン、2mM EDTA、1mM PMSF、1mMペプスタチンA）含有蒸留水（milliQレベル）（組織湿重量100mg/0.3mL）中で、ソニケーション（プローブ型ソニケーター及び湯浴式シニケーター10分）で組織を破砕した。4℃、12,000 x gで15分の遠心分離後の上清（組織抽出液）を調製した。
　一定量の抽出液を、0.1M クエン酸ナトリウム緩衝液(pH 4.2)中で、人工蛍光基質4-メチルウンベリフェリルβ-D-グルコサミニド（MUG）の分解活性を測定した。また同抽出液中のタンパク濃度を測定し、酵素比活性を算出した。
　図13Aに、AAV-CMV-modHEXBを1.15×1011vg/匹の投与量で、Sandhoff病ヘテロ（Hexb+/-）新生仔（P0～P2）マウスの脳室内または側頭静脈内へ単回投与後、10週齢時点での各臓器でのHex活性（MUG分解活性）の比活性を示す。
　図13Bに、AAV-CMV-modHEXBを1.15×1010vg/匹の投与量で、Sandhoff病ヘテロ（Hexb+/-）新生仔（P0～P2）マウスの脳室内または側頭静脈内へ単回投与後、10週齢時点での各臓器でのHex活性（MUG分解活性）の比活性を示す。
8. AAV-CMV-modHEXBのSandhoff病（Hexb-/-）新生仔（P0～P2）マウスの脳室内または側頭静脈内への単回投与による運動機能保持、体重維持及び寿命延長に対する有効性評価
　AAV-CMV-modHEXBの、SDマウス脳室内または側頭静脈内への単回投与後の協調運動機能をロータロッド試験により評価した。
　SDマウス新生仔（P0～P1）の脳室内または側頭静脈内にAAV-CMV-modHEXB 1.15×1010vg/5μL PBS（リン酸緩衝液）を単回投与し、11週齢時点から1週毎にロータロッド試験を実施した。
　ロータロッド試験は、4 round-per-minutes(rpm)から開始し、120秒間に40rpmまで回転数を上げる条件で行い、1個体毎に６回行い、落下するまでの平均時間を測定した。また同週齢の野生型マウス(WT)及びSDマウス(SD)についても同じ条件で試験を行った。なお、試験1週間前に練習を行った。
　また各時点で体重測定を行うとともに、生存（寿命）を確認した。
　AAV-CMV-modHEXBを1.15×1010vg/匹の投与量で、Sandhoff病（Hexb-/-）新生仔（P0）マウスの脳室内または側頭静脈内への単回投与したときの、11週齢時点以後のロータロッド試験で落下するまでの時間（協調運動機能）の測定結果を図14Aに示し、10週齢時点以後体重の測定結果（10週齢時点を100とする）を図14Bに示す。AAV-CMV-modHEXBをSDマウスの室内または側頭静脈内へ単回投与することで、協調運動機能及び体重が野生型マウスと同程度に維持された。なお、AAV-CMV-modHEXBを投与したSDマウスは15週齢まで生存したが16週目で死亡した。
＜実施例2: Tay-Sachs病患者iPS細胞からの神経細胞の分化誘導系及びヒトSandhoff病培養神経細胞モデル系に対するAAV-CMV-modHEXB及びAAV-SynI-modHEXB投与の有効性評価＞
1. Tay-Sachs病患者iPS細胞から神経細胞への分化誘導系に対するAAV-CMV-modHEXB及びAAV-SynI-modHEXB投与の有効性評価
　Kondo T, et al. Cell Stem Cell 12(4):487-496(2013)で報告された方法を用い、Tay-Sachs病（TSD）患者iPS細胞（TSD iPS細胞）から神経細胞の分化誘導を実施した。一定数のTSD iPS細胞をDorsomorphin、SB431542、非必須アミノ酸（NEAA）を含むDFK5%DS培地中で、8日間浮遊培養を行った後、N2 supplement、Dorsomorphin、NEAAを含むDFN2D培地中で16日間接着培養を行い、神経栄養因子BDNF、GDNF及びNT-3とB-27 Supplement（Vitamin A及びGlutamax不含）を含むNB27full培地中で、さらに25日以上接着培養し、以後継代培養を行い、AAV-CMV-modHEXB及びAAV-SynI-modHEXB投与実験に供した。
　図15に、iPS細胞から神経細胞への分化誘導の概要を示す。
　免疫細胞化学的実験のために、8-wellチャンバースライドに播種した健常者及びTSD iPS細胞由来神経系細胞を、4%パラフォルムアルデヒド/PBS溶液で室温１時間固定した。PBSで洗浄後、5%ヤギ血清/PBSを用い、室温で1時間ブロッキングを行った。
1.1. 神経系細胞マーカー発現及びGM2ガングリオシド蓄積の確認
　TSD iPS細胞又は健常者由来iPS細胞から上記の手順で分化誘導された神経細胞におけるGM2ガングリオシド（GM2）の蓄積の有無の確認のために、各細胞を抗GM2マウスモノクローナルIgM抗体（100倍希釈液）で4℃一晩処理した。
　ヒト神経系細胞マーカーとして、β-Tubullin III（神経細胞）、TBR1（大脳皮質ニューロン）、A2B5（グリア前駆細胞）、GFAP（アストロサイト）に対する一次抗体と、二次プローブとしてBiotin標識抗マウスIgG+M抗体及びCy3標識抗ウサギIgG抗体を、さらに三次プローブとしてFITC-streptavidin、また核蛍光染色のためにHoechst33258を用いた。免疫蛍光の観察は、共焦点レーザー走査型顕微鏡（ZeissLSM700）を用いて行った。
　結果を図16に示す。図中の各スケールバーは50μmを示す。TSD iPS細胞から分化誘導された神経細胞(TSD-N)と、ヒト健常者由来iPS細胞から分化誘導された神経細胞(Normal-N)は、どちらも、β-Tubullin III、TBR1、A2B5、GFAPの免疫蛍光が陽性であった。一方、TSD-NではGM2ガングリオシドの免疫蛍光が強い陽性であったのに対して、Normal-NではGM2ガングリオシドは僅かに陽性であった。このため、TSD iPS細胞から分化誘導された神経細胞(TSD-N)と、ヒト健常者由来iPS細胞から分化誘導された神経細胞(Normal-N)は、ともに神経細胞マーカー陽性細胞集団であることが確認された。また、TSD-Nでは、GM2ガングリオシドの蓄積が確認された。
1.2. AAV-SynI-modHEXB及びAAV-CMV-modHEXBによる、Tay-Sachs病患者iPS細胞由来神経細胞(TSD-N)へのmodHexB遺伝子導入
　AAV-SynI-modHEXB及びAAV-CMV-modHEXBによる、Tay-Sachs病患者iPS細胞由来神経細胞(分化誘導開始後Day 79 時点)へのmodHexB遺伝子導入の用量依存性は、ポリオルニチン/ラミニンコートしたディッシュ上で培養する1細胞当り各々、0.1x106、0.5x106及び1.0x106vgを培養液に投与し、7日後（Day 86 時点）に培養液を回収し、細胞を洗浄後、ハーベストし、細胞抽出液を作製した。
　人工蛍光基質を用いて、Hex活性の回復を評価した。また同抽出液中のタンパク濃度を測定し、酵素比活性を算出した。
　人工蛍光基質としては、4-メチルウンベリフェリルβ-D-グルコサミニド（MUG）及び4-メチルウンベリフェリル6-スルホ-β-D-グルコサミニド（MUGS）を用いた。Hexのαサブユニットを欠損した細胞は、通常はMUGS分解活性を有さず、Hexのβサブユニットを欠損した細胞はMUG分解活性を有さない。
　図17に、AAV-SynI-modHEXBによる、TSD-NへのmodHexB遺伝子導入効果と用量依存性（欠損Hex活性の回復）の結果を示す。この図では、各量のAAV-SynI-modHEXBで処理したTSD-NでのMUG分解活性、MUGS分解活性、β‐GAL分解活性を、同様に処理したNormal-Nでの活性を100％とした相対値として示す。TSD-Nを、1.0x106vg/細胞のAAV-SynI-modHEXBで処理したとき、MUGS分解活性がわずかに（Normal-Nに対し15%まで）回復した。
　図18に、AAV-CMV-modHEXBによる、TSD-NへのmodHexB遺伝子導入効果と用量依存性（欠損Hex活性の回復）の結果を示す。この図では、各量のAAV-CMV-modHEXBで処理したTSD-NでのMUG分解活性、MUGS分解活性、β‐GAL分解活性を、同様に処理したNormal-Nでの活性を100％とした相対値として示す。TSD-Nを、0.1x106vg/細胞のAAV-CMV-modHEXBで処理したとき、MUGS分解活性が大きく回復した。
2.ゲノム編集技術により作製したSandhoff病培養ヒト神経細胞モデル系に対するAAV-CMV-modHEXB及びAAV-SynI-modHEXB投与の有効性評価
2.1. Sandhoff病培養ヒト神経細胞モデル系のゲノム編集技術による作製
　HEXBのexon1にあるゲノム配列：CGGCTTGGCCGAGACGCTCGをターゲット配列とし、GeneArtTM CRISPR Nuclease Vector with OFP Reporter Kit (Invitrogen #A21174) を用いて、ヒトHEXBノックアウト用ベクターを作製した。このベクターをヒト神経芽細胞腫であるSH-SY5Y細胞株へリポフェクションによりトランスフェクションし、CRISPR/Cas9系を用いたゲノム編集によるHEXB KOを行った。
　HEXBノックアウト用ベクターを導入したSH-SY5Y細胞を、FACSを用いてOFP発現（CAS9発現）細胞をソーティングし、DMEM/F12＋10%FBS、70μg/100μg/mL penicillin G/streptomycin培地を用いて、維持培養をした。また限界希釈法により、人工蛍光基質MUGの分解比活性が、親株の2%以下まで低下した欠損株を選別した。
　また、HEXB KO SH-SY5Y細胞と親株を4%パラフォルムアルデヒド/PBS溶液で室温１時間固定した。PBSで洗浄後、5%ヤギ血清/PBSを用い、室温で１時間ブロッキングを行った後、蓄積基質であるGM2ガングリオシド（GM2）に対しては、抗GM2マウスモノクローナルIgM抗体（100倍希釈液）で４℃一晩処理した。洗浄後、二次抗体として、Cy3標識抗ウサギIgG抗体で処理し、また核蛍光染色のためにHoechst33258を用いた。洗浄後、50%グリセロール/PBSで封入し、共焦点レーザー走査型顕微鏡（ZeissLSM700）を用いて免疫蛍光観察した。
　図19に、HEXB KO SH-SY5Y細胞(HEXB KO)と野生型の親株(WT)の、MUG分解活性及びβ-Gal分解活性（共に単位タンパク質量あたりの比活性）を示す。
　図20に、HEXB KO SH-SY5Y細胞(HEXB KO)と野生型の親株(WT)のGM2ガングリオシド（赤）及び細胞核（青）の免疫蛍光観察像を示す。図20のHEXB KOとWTの観察像は共に細胞核（青）を含み、HEXB KOの観察像ではGM2ガングリオシド（赤）の免疫蛍光が強い陽性であったのに対して、WTの観察像ではGM2ガングリオシド（赤）の免疫蛍光は僅かに陽性であった。
　HEXB KO SH-SY5Y細胞(HEXB KO)では、野生型の親株(WT)と比較して、約2％まで低下したMUG分解活性と、基質(GM2ガングリオシド)の蓄積を認めた。
2.2. HEXB KO SH-SY5Y細胞の神経細胞への分化誘導
　HEXB KO SH-SY5Y細胞(HEXB KO)を、DMEM/F12＋3%FBS、70μg/100μg/mL penicillin G/streptomycin、10μg/mL retinoic acid存在下で10日以上培養し、神経細胞への分化誘導を行った。
　神経分化誘導後に、4%パラフォルムアルデヒド/PBS溶液で室温1時間固定した。PBSで洗浄後、5%ヤギ血清/PBSを用い、室温で１時間ブロッキングを行った。Nestin（神経幹細胞マーカー）、PSA-NCAM（神経前駆細胞マーカー）、β-Tubulin III及びNF-L（神経細胞マーカー）に対する一次抗体で4℃一晩処理した。二次プローブとしてCy3標識抗ウサギIgG抗体と、核蛍光染色のためにHoechst33258を用いた。洗浄後、50%グリセロール/PBSで封入し、共焦点レーザー走査型顕微鏡（ZeissLSM700）を用いて免疫蛍光観察した。
　図21に、HEXB KO SH-SY5Y細胞(HEXB KO)の、分化誘導前（untreated, undifferentiated）及び分化誘導培地での培養12日後(differentiated)の免疫蛍光観察の結果を示す。図21において、分化誘導前（untreated, undifferentiated）は、Nestin陽性、PSA-NCAM陽性、GFAP陽性、A2B5僅かに陽性、NF-L僅かに陽性、β-Tubulin III僅かに陽性、Hoechst33258陽性であった。一方、分化誘導培地での培養12日後(differentiated)は、Nestin陽性、PSA-NCAM陽性、GFAP陽性、A2B5僅かに陽性、NF-L強い陽性、β-Tubulin III強い陽性、Hoechst33258陽性であった。すなわち、分化誘導により、NF-L、β-tubulinIIIといった成熟神経細胞マーカーの発現が増加した。
2.3. AAV-CMV-modHEXB及びAAV-SynI-modHEXBによる、ヒトHEXBKO培養神経細胞へのmodHexB遺伝子導入
　AAV-CMV-modHEXB及びAAV-SynI-modHEXBのヒトHEXB KO SH-SY5Y培養神経細胞への一回投与における用量依存性の検討は、分化誘導後8日のヒトHEXB KO培養神経細胞（SH-SY5Y細胞）1.0×106cellsに、各々0.1x105、0.5x105、1x105、及び1.0x106vg/細胞の用量で投与を行い、7日後に培養上清と細胞を集め、細胞については抽出液を調製し、細胞内外の人工蛍光基質MUGを用いて、Hex活性の発現を評価した。また細胞抽出液中のタンパク濃度を測定し、酵素比活性を算出した。
　図22に、異なる用量のAAVベクターで処理したヒトHEXB KO SH-SY5Y培養神経細胞の細胞内(細胞抽出液)でのMUG分解比活性（Hex活性）を示す。AAV-SynI-modHEXBよりもAAV-CMV-modHEXBの方が高い発現効率を示した。
　図23に、異なる用量のAAVベクターで処理したヒトHEXB KO SH-SY5Y培養神経細胞の細胞外（培養上清）でのMUG分解比活性（Hex活性）を示す。AAV-SynI-modHEXBよりもAAV-CMV-modHEXBの方が高い発現効率を示すこと、及び、発現したmodHexBが細胞外に分泌されたことが示された。
2.4. 細胞外に分泌されたmodHexBのウエスタンブロットによる解析
　上記実験2.3.で得た、各用量のベクターAAV-CMV-modHEXBをヒトHEXB KO SH-SY5Y培養神経細胞に投与し7日後の培養上清中のタンパク質の一定量（各10μg）を試料として、10%ポリアクリルアミドゲルを用いるSDS-PAGEを行い、ヒトmodHexBに対するウエスタンブロット解析を行った。泳動後のゲルを、定電圧でPVDF膜に転写後、膜をブロッキング剤で1時間処理した。抗ヒトHexA(αβ)ウサギポリクローナル抗体NAG(A)を一次抗体（1,000倍希釈液）で4℃一晩処理、Tris緩衝液で洗浄後、二次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗ウサギIgG抗体で処理、洗浄後、化学発光キット（ECLplus）を用い、LAS4000mini（GEHealthcare）でヒトmodHexB由来タンパク質を検出した。
　図24には、ウエスタンブロットの結果を示す。ヒト神経細胞に導入されたmodHEXB遺伝子産物は、前駆体タンパク質として細胞外に分泌されたことが確認された。
3. 実施例2まとめ
　神経細胞特異的発現プロモーター下流にmodHEXB遺伝子を連結したAAV-SynI-modHEXBを用いた遺伝子導入により、Tay-Sachs病患者iPS細胞由来神経細胞内のMUGS分解活性及びヒトSandhoff病モデル培養神経芽細胞腫SH-SY5Y HEXB K0株内のMUG分解活性がわずかに回復した。
　ユビキタスな発現プロモーターCMVβ下流にmodHEXB遺伝子を連結したAAV-CMV-modHEXBを用いた場合、Tay-Sachs病患者iPS細胞由来神経細胞内のMUGS分解活性及びヒトSandhoff病モデル培養神経芽細胞腫SH-SY5Y HEXBK0株内のMUG分解活性が顕著に回復した。
　ヒトSandhoff病モデル培養神経芽細胞腫SH-SY5Y HEXB K0株に、AAV-CMV-modHEXBを1×106vg/cellで投与しところ、神経細胞で発現した組換えヒトmodHexB前駆体タンパク質が細胞外に分泌されたことから、クロスコレクション効果が期待された。
＜実施例３：ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｍｏｄＨＥＸＢの作製＞
（１）ＡＡＶの外被（カプシド）蛋白ＶＰ１の改変
　９型ＡＡＶ（ＡＡＶ９）について、外被蛋白ＶＰ１をコードする塩基配列を含むプラスミドｐＡＡＶ９－ＲＣを鋳型として使用した。このプラスミドは文献（Ｈａｎｄａ，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ　Ｇｅｎ　Ｖｉｒｏｌ，８１：２０７７－２０８４，２０００）に記載されたＡＡＶ３ Ｒｅｐ／ＶＰに由来し、ＡＡＶ３のＲｅｐ配列を含む（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，ｅｔ　ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　２２１，２０８－２１７（１９９６））。ＡＡＶ９のＶＰ１の塩基配列はＧｅｎｅＢａｎｋにＡｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＹ５３０５７９として既に報告されている（配列番号：５に示される）。以下に示すプライマーを合成し、Ｑｕｉｃｋ　Ｃｈａｎｇｅ　ＩＩ　ＸＬ　ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を使用して、ＡＡＶ９のＶＰ１アミノ酸配列（配列番号：６）の４４６番目に位置するチロシン（Ｙ）残基をフェニルアラニン（Ｆ）残基で置換した。置換されたアミノ酸配列ＡＡＶ９－ｙｆＶＰ１－３（配列番号：１２）をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＡＡＶ９－ｙｆＲＣを作製した。また、ｐＡＡＶ９－ｙｆＲＣはＡＡＶ２のＲｅｐをコードするヌクレオチド配列（配列番号：１５）を含む。
yfAAV9-F：5' - CGACCAATACTTGTACTTTCTCTCAAAGAC -3'　（配列番号：２１）
yfAAV9-R：3' - GCTGGTTATGAACATGAAAGAGAGTTTCTG - 5’（配列番号：２２）
（２）ｒＡＡＶベクターの作製
（ａ）ベクターゲノムプラスミドの作製
　３型ＡＡＶ（ＡＡＶ３）のＤＮＡ配列を含むプラスミドｐＡＡＶ３の５’側と３’側のインバーテッドターミナルリピートｉｎｖｅｒｔｅｄ　ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｒｅｐｅａｔｓ（ＩＴＲ）と呼ばれるヘアピンＤＮＡ配列の間に、５’末端から３’末端に向けて、ＣＭＶプロモーター、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）第１イントロン、ｍｏｄＨＥＸＢ（配列番号２５のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ）、ＷＰＲＥ（ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　ｖｉｒｕｓ　ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｅｌｅｍｅｎｔ）、ＳＶ４０ポリアデニル化配列がこの順で配置されたＤＮＡ配列が挿入されたプラスミドｐＡＡＶ－ＣＭＶ－ｍｏｄＨＥＸＢを作製した。配列番号２６に、ｐＡＡＶ－ＣＭＶ－ｍｏｄＨＥＸＢの５’側のＩＴＲから３’側のＩＴＲまでの発現カセットの塩基配列を示す。配列番号２６の第１番目～第１４６番目の塩基配列が５’側ＩＴＲ配列であり、配列番号２６の第３８２番目～第９５１番目の塩基配列がＣＭＶプロモーター配列であり、配列番号２６の第１０４９番目～第１３６９番目の塩基配列がｈＧＨ第１イントロン配列であり、配列番号２６の第１４２８番目～第３０２６番目の塩基配列がｍｏｄＨＥＸＢ配列であり、配列番号２６の第３０４６番目～第３６３４番目の塩基配列がＷＰＲＥ配列であり、配列番号２６の第３７２８番目～第３８６２番目の塩基配列がＳＶ４０ポリアデニル化配列であり、配列番号２６の第３９３９番目～第４０８３番目の塩基配列が３’側ＩＴＲ配列である。このプラスミドの基本構造の参考文献：Ｌｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌ　Ｔｈｅｒ　１３：１６０－１６６．２００６。
（ｂ）ＨＥＫ２９３細胞へのトランスフェクション
＜第１日目＞
　２２５ｃｍ２フラスコに１．５×１０６のＨＥＫ２９３細胞をまき、１０％ＦＣＳ－ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を使用して５％ＣＯ２、３７℃で培養した。
＜第３日目＞
　リン酸カルシウム法でトランスフェクションを行った。
　ＡＡＶヘルパープラスミドとしてのｐＡＡＶ９－ｙｆＲＣと、ＡＡＶベクターゲノムプラスミドとしてのｐＡＡＶ－ＣＭＶ－ｍｏｄＨＥＸＢと、アデノウイルス（ＡｄＶ）の塩基配列を含むヘルパープラスミドｐＨｅｌｐｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＡＡＶ　Ｈｅｌｐｅｒ－Ｆｒｅｅ　Ｓｙｓｔｅｍ（カタログ番号２４００７１））とを、各２５μｇずつ（計７５μｇ）０．３ＭＣａＣｌ２中で混合した。
　その後、２×ＨＢＳ（８０ｍＭ　ＮａＣｌ，５０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ　ｂｕｆｆｅｒ，１．５ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．１０））を加え、ＤＮＡ－リン酸カルシウムを作製した。フラスコ中の培養液の培地をＤＮＡ－リン酸カルシウムを添加した培地と入れ換え、数時間培養した後に培地を交換した。
＜第６日目＞
　ウイルスビリオン（ｒＡＡＶビリオン）を回収した。０．５Ｍ　ＥＤＴＡを加えて細胞を培養ディッシュより剥がし、ＴＢＳ（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ）に懸濁した。ドライアイスエタノールと３７℃のウォーターバスを使用して凍結／融解を３回繰り返し、細胞を破砕した。１０，０００×ｇで１０分間遠心した後、上清を回収して粗大な細胞破片を除去した。
（ｃ）ウイルスベクターの精製
　以下の手順に従って、塩化セシウムＣｓＣｌの密度勾配による超遠心を行い、ｒＡＡＶベクターを精製した。超遠心チューブ内に１．５Ｍ及び１．２５ＭのＣｓＣｌを重層し密度勾配を作製した。ｒＡＡＶベクターを含む細胞破砕溶液を重層後、超遠心（３０，０００ｒｐｍ、２．５時間）を行った。屈折率を計測してＲＩ：１．３６５～１．３８０のｒＡＡＶベクターを含む画分を回収した。この分画を再度ＣｓＣｌ溶液上に重層し、超遠心（３６，０００ｒｐｍ、２．５時間）を行ってｒＡＡＶを含む分画を得た。
（ｄ）ウイルスベクター力価の測定（リアルタイムＰＣＲ）
　精製したｒＡＡＶの１０－２～１０－６の希釈系列を作製した。ＷＰＲＥ配列をスタンダードとしたプライマーセットを用いて、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７９００ＨＴ ＦａｓｔリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）で定量した。
＜実施例４：ＡＡＶ－ＳｙｎＩ－ｍｏｄＨＥＸＢの作製＞
　ＡＡＶ－ＳｙｎＩ－ｍｏｄＨＥＸＢは、ベクターゲノムプラスミドとして、配列番号２６に示すＡＡＶ－ＣＭＶ－ｍｏｄＨＥＸＢの発現カセットの塩基配列において、配列番号２６の第３８２番目～第９５１番目のＣＭＶプロモーター配列を、配列番号２３に示すＳｙｎＩプロモーター配列に置換した塩基配列の発現カセットを含むベクターゲノムプラスミドを用いた以外は、実施例３に示したＡＡＶ－ＣＭＶ－ｍｏｄＨＥＸＢの作製方法と同様の方法で作製した。
＜実施例５：ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＧＦＰの作製＞
　ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＧＦＰは、ベクターゲノムプラスミドとして、配列番号２６に示すＡＡＶ－ＣＭＶ－ｍｏｄＨＥＸＢの発現カセットの塩基配列において、配列番号２６の第１４２８番目～第３０２６番目の塩基配列がｍｏｄＨＥＸＢ配列を、公知のＧＦＰの配列に置換した塩基配列の発現カセットを含むベクターゲノムプラスミドを用いた以外は、実施例３に示したＡＡＶ－ＣＭＶ－ｍｏｄＨＥＸＢの作製方法と同様の方法で作製した。
＜実施例６：ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｍｏｄＨＥＸＢのカニクイザルへの投与＞
　５個体の２歳齢の健常なカニクイザル（Macaca fascicularis）の髄腔内に、実施例３に記載の方法で作製したAAV-CMV-modHEXBを2.0×1012vg/kg体重の用量で単回投与した。５個体をそれぞれ個体番号#1-#5とした。投与後3カ月間観察したところ、食欲、体重及び行動に悪影響は認められなかった。
(組織抽出液の調製)
　投与後3カ月経過時点で下記の組織を摘出した。
頭頂葉皮質 (Parietal cortex)
側頭葉皮質 (Temporal cortex)
嗅内皮質 (Entothinal cortex)
海馬 (Hippocampus)
被殻 (Putamen)
小脳 (Cerebellum)
脳幹 (Brain stem)
頸椎 (Cervical spinal cord) (C4-C6)
胸椎 (Thoracic spinal cord) (Th6-Th8)
腰椎 (Lumber spinal cord) (L2-L4)
心臓 (Heart)
肺 (Lung)
肝臓 (Liver)
脾臓 (Spleen) 
腎臓 (Kidney)
　各組織の湿重量100mg当たり、300μLの超純水を加え、超音波破砕装置で2分間の超音波破砕処理を10回行い、破砕液を得た。
　次いで前記破砕液を、超音波洗浄（水浴式）装置で10分間超音波処理した。
　処理後の前記破砕液を4℃、12,000×gで15分間遠心分離し、上清を酵素活性測定用サンプル（組織抽出液）として回収した。
(組織抽出液のHex活性の測定)
　一定量の各組織抽出液の、人工蛍光基質であるMUG(4-メチルウンベリフェリルβ-D-グルコサミド)及びMUGS(4-メチルウンベリフェリル6-スルホ-β-D-グルコサミド)の分解活性を測定した。各組織抽出液のタンパク質濃度を測定し、単位タンパク質量あたりの基質分解活性、すなわち比活性、を算出した。
　基質分解活性の測定は、超純水で適宜希釈した一定量の組織抽出液とMUG又はMUGSの溶液とを37℃で30分間インキュベートした後、0.2Mグリシン-NaOH(pH 10.7)を370μL加えて反応を停止し、96穴マルチウェルプレートに200μLずつ分注して蛍光測定（励起光355nm, 検出光460nm）を行った。検量線作成のために、0.2Mグリシン-NaOH(pH 10.7)中で0.5nmol～5 nmolに希釈した4-MU(4-メチルウンベリフェロン)についても同様に96穴マルチウェルプレートに200μLずつ分注して蛍光測定を行った。
　結果を図25に示す。中枢神経系の組織のうち被殻 (Putamen)、脳幹 (Brain stem)、頸椎 (Cervical spinal cord) (C4-C6)、胸椎 (Thoracic spinal cord) (Th6-Th8)、腰椎 (Lumber spinal cord) (L2-L4)に比較的高いHex活性が分布していたことが確認された。
(血漿のHex活性の測定)
　AAV-CMV-modHEXBの投与前と、投与から12週後（安楽殺直前）に採血を行い、血漿を取得した。
　血漿を超純水で10倍希釈した希釈液15μLとMUGS溶液15μLとを37℃で30分間インキュベートした後、0.2Mグリシン-NaOH(pH 10.7)を370μL加えて反応を停止し、96穴マルチウェルプレートに200μLずつ分注して蛍光測定（励起光355nm, 検出光460nm）を行った。検量線作成のために、0.2Mグリシン-NaOH(pH 10.7)中で0.5nmol～5 nmolに希釈した4-MU(4-メチルウンベリフェロン)についても同様に96穴マルチウェルプレートに200μLずつ分注して蛍光測定を行った。
　#1-#5の各個体についてのAAV-CMV-modHEXBの投与前と、投与から12週後（安楽殺直前）の血漿のMUGS分解活性の測定結果を図26に示す。霊長類動物であるカニクイザルへのAAV-CMV-modHEXBの投与により、血中Hex活性が上昇することが確認された。
＜実施例７：ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＧＦＰのカニクイザルへの投与＞
　２個体の２歳齢の健常なカニクイザル（Macaca fascicularis）の髄腔内に、実施例５に記載の方法で作製したAAV-CMV-GFPを2.0×1012vg/kg体重の用量で単回投与した。投与後3カ月間観察したところ、食欲、体重及び行動に悪影響は認められなかった。
 (組織抽出液の調製)
　投与後3カ月経過時点で下記の組織を摘出した。
頭頂葉皮質 (Parietal cortex)
側頭葉皮質 (Temporal cortex)
嗅内皮質 (Entothinal cortex)
海馬 (Hippocampus)
被殻 (Putamen)
小脳 (Cerebellum)
脳幹 (Brain stem)
頸椎 (Spinal cord (C4-C6))
胸椎 (Spinal cord (Th6-Th8))
腰椎 (Spinal cord (L2-L4))
　各組織の湿重量100mg当たり、300μLのRIPA緩衝液 (50mM Tris-HCl (pH ya7.5), 150mM NaCl, 0.5% Sodium Deoxycholate, 0.1% SDS, 1% NP-40) を加え、超音波破砕装置で2分間の超音波破砕処理を10回行い、破砕液を得た。
　次いで前記破砕液を、超音波洗浄（水浴式）装置で10分間超音波処理した。
　処理後の前記破砕液を4℃、12,000×gで15分間遠心分離し、上清をウエスタン・ブロッティングによるGFP検出用サンプル（組織抽出液）として回収した。
(ウエスタン・ブロッティングによる組織抽出液のGFPの検出)
　前記各組織抽出液をタンパク質量30μgに調製し、超純水 6×dye(+)を添加して全量を18μLに調節した。
　前記体積調節後の各サンプルを3分間煮沸した後、全量を15% SDS-PAGEゲルにアプライし、15mA～20mAで電気泳動を行った。
　泳動後のゲルをPVDF膜に15V定電圧で1時間、転写した。
　転写後のPVDF膜を、Blocking OneとTBS (トリス緩衝生理食塩水)とを1:1の比で混合したブロッキング剤により1時間保持してブロッキングした。
　一次抗体である抗GFP抗体として、1000倍希釈したマウス由来Anti-GFP Clontech jl-8（クロンテック社）を用い、ブロッキングした前記PVDF膜と4℃で終夜インキュベートした。
　一次抗体処理後の前記PVDF膜をTBS/0.1%Tween20により5分間×3回洗浄した。
　洗浄後のPVDF膜を、二次抗体であるHRP標識抗マウスIg抗体（Anti-Mouse Ig HRP-linked  lot:32  1000倍希釈）及びHRP標識抗ビオチン抗体（Anti-Biotin  HRP-linked  lot:32  1000倍希釈、分子量マーカー検出用）と1時間インキュベートした。
　二次抗体処理後の前記PVDF膜をTBS/0.1%Tween20により5分間×3回洗浄した。
　バンドの強度をBIORAD ChemiDoc XRSにより検出した。
　結果を図27に示す。霊長類動物であるカニクイザルへのAAV-CMV-GFPの投与により、GFP遺伝子を中枢神経系の各組織に導入することができた。
配列番号：１　　野生型ＡＡＶ１由来カプシドタンパク質ＡＡＶ１－ＶＰ１ヌクレオチド配列　（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＣ＿００２０７７．１）
配列番号：２　　野生型ＡＡＶ１由来カプシドタンパク質ＡＡＶ１－ＶＰ１アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＣ＿２０７７．１）
配列番号：３　　野生型ＡＡＶ２由来カプシドタンパク質ＡＡＶ２－ＶＰ１ヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＣ＿００１４０１．２）
配列番号：４　　野生型ＡＡＶ２由来カプシドタンパク質ＡＡＶ２－ＶＰ１アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＣ＿００１４０１．２）
配列番号：５　　野生型ＡＡＶ９由来カプシドタンパク質ＡＡＶ９－ＶＰ１ヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＹ５３０５７９．１）
配列番号：６　　野生型ＡＡＶ９由来カプシドタンパク質ＡＡＶ９－ＶＰ１アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＹ５３０５７９．１）
配列番号：７　　ＡＡＶ１由来カプシドタンパク質変異体ＡＡＶ１－ｙｆＶＰ１ヌクレオチド配列
配列番号：８　　ＡＡＶ１由来カプシドタンパク質変異体ＡＡＶ１－ｙｆＶＰ１アミノ酸配列
配列番号：９　　ＡＡＶ２由来カプシドタンパク質変異体ＡＡＶ２－ｙｆＶＰ１ヌクレオチド配列
配列番号：１０　ＡＡＶ２由来カプシドタンパク質変異体ＡＡＶ２－ｙｆＶＰ１アミノ酸配列
配列番号：１１　ＡＡＶ９由来カプシドタンパク質変異体ＡＡＶ９－ｙｆＶＰ１ヌクレオチド配列
配列番号：１２　ＡＡＶ９由来カプシドタンパク質変異体ＡＡＶ９－ｙｆＶＰ１アミノ酸配列
配列番号：１３　ＡＡＶ３由来５’側ＩＴＲヌクレオチド配列　（ＧｅｎＢａｎｋ　ＮＣ＿００１７２９由来）
配列番号：１４　ＡＡＶ３由来３’側ＩＴＲヌクレオチド配列
配列番号：１５　ＡＡＶ２由来ｒｅｐ遺伝子ヌクレオチド配列
配列番号：１６　ＡＡＶ２由来Ｒｅｐタンパク質アミノ酸配列
配列番号：１７　変異導入プライマー１（ｙｆＡＡＶ１－Ｆ）ヌクレオチド配列
配列番号：１８　変異導入プライマー２（ｙｆＡＡＶ１－Ｒ）ヌクレオチド配列
配列番号：１９　変異導入プライマー３（ｙｆＡＡＶ２－Ｆ）ヌクレオチド配列
配列番号：２０　変異導入プライマー４（ｙｆＡＡＶ２－Ｒ）ヌクレオチド配列
配列番号：２１　変異導入プライマー５（ｙｆＡＡＶ９－Ｆ）ヌクレオチド配列
配列番号：２２　変異導入プライマー６（ｙｆＡＡＶ９－Ｒ）ヌクレオチド配列
配列番号：２３　シナプシンＩプロモーター配列（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｍ５５３００．１）配列番号：２４　ミエリン塩基性タンパク質プロモーター配列（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｍ６３５９９（ヒト）由来）
配列番号：２５　ｍｏｄＨＥＸＢのアミノ酸配列
配列番号：２６　ＣＭＶ－ｍｏｄＨＥＸＢの発現カセットのヌクレオチド配列
配列番号：２７　野生型ヒトβ－ヘキソサミニダーゼのβ－サブユニットのヌクレオチド配列
配列番号：２８　野生型ヒトβ－ヘキソサミニダーゼのβ－サブユニットのアミノ酸配列
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (16)

  1. 　ウイルスビリオンを形成可能なタンパク質を含むキャプソメア、並びに、
    　前記キャプソメア内にパッケージングされたポリヌクレオチドであって、プロモーター配列と、前記プロモーター配列と作動可能に連結される、野生型ヒトβ－ヘキソサミニダーゼのβ－サブユニットの配列番号２８の第５５番目～第５５６番目のアミノ酸配列において、第３１２番目～第３１８番目のアミノ酸が、それぞれ順に、グリシン、セリン、グルタミン酸、プロリン、セリン、グリシン、及び、トレオニンに置換されている第１アミノ酸配列、並びに、前記第１アミノ酸配列のＮ末端側に連結されたシグナルペプチドのアミノ酸配列である第２アミノ酸配列をコードする塩基配列とを含むポリヌクレオチド
    を含む、組換えアデノ随伴ウイルスビリオン。
  2. 　前記第１アミノ酸配列が、配列番号２８の第５５番目～第５５６番目のアミノ酸配列において、さらに、第４５２番目のアミノ酸がアスパラギンに、及び／又は、第４５３番目のアミノ酸がアルギニンに置換されているアミノ酸配列である、請求項１に記載のウイルスビリオン。
  3. 　前記第１アミノ酸配列が、
    （Ａ）配列番号２５の第３１番目～第５３２番目のアミノ酸配列；
    （Ｂ）配列番号２５の第３１番目～第５３２番目のアミノ酸配列において、前記置換部位のアミノ酸を除く１から数個のアミノ酸が欠失、置換、又は、付加されたアミノ酸配列であって、野生型ヒトβ－ヘキソサミニダーゼのα－サブユニット由来の活性を有し、且つ、プロテアーゼに対する抵抗性を有するタンパク質に含まれるアミノ酸配列；並びに
    （Ｃ）配列番号２５の第３１番目～第５３２番目のアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であって、野生型ヒトβ－ヘキソサミニダーゼのα－サブユニット由来の活性を有し、且つ、プロテアーゼに対する抵抗性を有するタンパク質に含まれるアミノ酸配列（ただし、前記置換部位のアミノ酸は配列番号：２５で示されるアミノ酸配列と同一である）
    より選択されるいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のウイルスビリオン。
  4. 　前記第２アミノ酸配列が、配列番号２５の第１番目～３０番目のアミノ酸配列、又は、配列番号２８の第１番目～第５４番目のアミノ酸配列である、請求項１～３のいずれか１項に記載のウイルスビリオン。
  5. 　前記ポリヌクレオチドの５’末端及び３’末端が、それぞれ、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３又はＡＡＶ４に由来する５’末端及び３’末端のインバーテッドターミナルリピート（ＩＴＲ）配列を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載のウイルスビリオン。
  6. 　前記ポリヌクレオチドの５’末端及び３’末端が、それぞれ配列番号：１３及び配列番号：１４の塩基配列を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載のウイルスビリオン。
  7. 　前記プロモーター配列が、全身性プロモーター又は神経系細胞特異的プロモーターの配列である、請求項１～６のいずれか１項に記載のウイルスビリオン。
  8. 　前記プロモーター配列が、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＥＦ－１αプロモーター、ＳＶ４０プロモーター及びＣＡＧプロモーターからなる群より選択される全身性プロモーターの配列である、請求項７に記載のウイルスビリオン。
  9. 　前記プロモーター配列が、シナプシンＩプロモーター配列、ミエリン塩基性タンパク質プロモーター配列、ニューロン特異的エノラーゼプロモーター配列、カルシウム／カルモジュリン－依存性蛋白キナーゼＩＩ（ＣＭＫＩＩ）プロモーター、チュブリンαＩプロモーター、血小板由来成長因子β鎖プロモーター、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター配列、Ｌ７プロモーター配列（小脳プルキンエ細胞特異的プロモーター）、及びグルタミン酸受容体デルタ２プロモーター（小脳プルキンエ細胞特異的プロモーター）からなる群より選択される神経系細胞特異的プロモーターの配列である、請求項７に記載のウイルスビリオン。
  10. 　前記ウイルスビリオンを形成可能なタンパク質が、１型、２型、３型、９型、ｒｈ１０型、ＰＨＰ．Ｂ型又はＰＨＰ．ｅＢ型のアデノ随伴ウイルスに由来するＶＰ１カプシドタンパク質のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、或いは、前記ＶＰ１カプシドタンパク質のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、少なくとも１つの表面露出チロシン残基が他のアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列を含むタンパク質である、請求項１～９のいずれか１項に記載のウイルスビリオン。
  11. 　前記ウイルスビリオンを形成可能なタンパク質が、配列番号：２、４若しくは６のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、少なくとも１つの表面露出チロシン残基が他のアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列を含むタンパク質である、請求項１～１０のいずれか１項に記載のウイルスビリオン。
  12. 　前記ウイルスビリオンを形成可能なタンパク質が、少なくとも、配列番号：２において４４５位のチロシン残基、配列番号：４において４４４位のチロシン残基、又は配列番号：６において４４６位のチロシン残基が置換されているアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載のウイルスビリオン。
  13. 　前記チロシン残基がフェニルアラニン残基に置換されている、請求項１０～１２のいずれか１項に記載のウイルスビリオン。
  14. 　前記ウイルスビリオンを形成可能なタンパク質が、配列番号：８、１０若しくは１２のアミノ酸配列、又は配列番号：８、１０若しくは１２のアミノ酸配列の４４４～４４６位以外の位置に１～数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入及び／若しくは付加を含むアミノ酸配列を含み、ウイルスビリオンを形成可能である、請求項１～１３のいずれか１項に記載のウイルスビリオン。
  15. 　請求項１～１４のいずれか１項に記載のウイルスビリオンを含む医薬組成物。
  16. 　テイ－サックス病及び／又はザンドホッフ病の治療のための、請求項１５に記載の医薬組成物。
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