ES2239853T3

ES2239853T3 - Clonacion y produccion recombinante de enzimas fosfolipasas de veneno de polistinae y terapias inmunologicas basadas en esto.

Info

Publication number: ES2239853T3
Application number: ES99950198T
Authority: ES
Inventors: Te Paio King
Original assignee: Rockefeller University
Current assignee: Rockefeller University
Priority date: 1998-10-01
Filing date: 1999-10-01
Publication date: 2005-10-01
Anticipated expiration: 2019-10-01
Also published as: US6372471B1; DE69924628T2; ATE346143T1; AU760812B2; CA2344578A1; EP1528102A2; EP1117769B1; DE69924628D1; ES2280059T3; ATE292678T1; DE69934150T2; EP1528102A3; AU6290699A; PT1117769E; WO2000018896A1; US20040175393A1; EP1117769A1; US6652851B1; DK1528102T3; EP1528102B1

Abstract

Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una fosfolipasa A1 de veneno de Polistinae que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2, o un fragmento inmunomodulador de la misma, donde dicha molécula de ácido nucleico es adecuada para la expresión de una forma madura de dicha fosfolipasa.

Description

Clonación y producción recombinante de enzimas fosfolipasas de veneno de Polistinae y terapias inmunológicas basadas en esto.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican alergenos de veneno de Polistinae, en particular enzimas fosfolipasas o fragmentos de las mismas, a vectores recombinantes que comprenden tales moléculas de ácido nucleico y a células hospedadoras que contienen los vectores recombinantes. La invención también se refiere a la expresión de tales moléculas de ácido nucleico para producir una enzima fosfolipasa de veneno de Polistinae recombinante o fragmentos recombinantes de la misma. Tal alergeno y sus fragmentos son útiles para el diagnóstico de alergias, para el tratamiento terapéutico de alergias, para el tratamiento de enfermedades o trastornos relacionados con el sistema inmune o de síntomas asociados con dichas enfermedades o trastornos, y para la modulación de respuestas inmunes hacia un inmunógeno.

Antecedentes de la invención

Las alergias a las picaduras de abejas y véspidos son comunes. Los véspidos incluyen avispones, véspulas y avispas (Golden, et al., 1989, Am. Med. Assoc. 262:240). Las personas sensibles pueden sensibilizarse tras la exposición a cantidades muy pequeñas de proteínas de veneno; en la piel, tras una sola picadura por un véspido, se inyectan tan sólo 2-10 \mug de proteína (Hoffman y Jacobson, 1984, Ann. Allergy. 52:276).

Hay muchas especies de avispas (género Dolichovespula), véspulas (género Vespula) y avispas (género Polistes) en Norteamérica (Akre, et al., 1980, "Yellowjackets of America North of Mexico", Agriculture Handbook Nº 522, US Department of Agriculture). Los véspidos tienen composiciones de veneno similares (King, et al., 1978, Biochemistry 17:5165: King, et al. 1983, Mol. Immunol. 20:297; King, et al., 1984, Arch. Biochem. Biophys. 230:1; King, et al., 1985, J. Allergy and Clin. Immunol. 76:621; King, 1987, J. Allergy Clin. Immunol. 79:113; Hoffman, 1985, J. Allergy and Clin. Immunol. 75:611). Su veneno contiene tres alergenos de veneno principales, fosfolipasa (37 kD), hialuronidasa (43 kD) y antígeno 5 (23 kD) de función biológica hasta ahora desconocida. La Patente de Estados Unidos Nº 5.593.877 describe la clonación y expresión de los alergenos de veneno de véspido fosfolipasa e hialuronidasa. Como se describe en esta patente, los alergenos recombinantes permiten la expresión de una proteína o de fragmentos de la misma para uso en inmunoterapia, diagnóstico y para investigar alergenos de células T y B, explicando con mayor detalle el fundamento para la clonación de enzimas de veneno de véspidos. Sin embargo, no se describieron ADNc de veneno de véspidos únicos.

Además de los alergenos de veneno de insectos descritos anteriormente, en los últimos años se han presentado las secuencias de aminoácidos completas de varios alergenos principales de diferentes hierbas (Perez, et al., 1990, J. Biol. Chem. 265:16210; Ansari, et al., 1989, Biochemistry 26:8665; Silvanovich, et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:1204), polen de árboles (Breiteneder, 1989, EMBO J. 8:1935; Valenta, et al., 1991, Science, 253:557), polen de malas hierbas (Rafnar, et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:1229; Griffith, et al., 1991, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 96:296), ácaros (Chua, et al., 1988, J. Exp. Med. 167:175), caspa de gato (Griffith, et al., 1992, Gene. 113:263), y mohos (Aruda, et al., 1990, J. Exp. Med. 172:1529; Han, et al., 1991, J. Allergy Clin. Immunol. 87:327). Estos alergenos principales son proteínas de 10-40 kD y tienen funciones biológicas bastantes diferentes. Casi todos los alergenos de secuencias conocidas tienen un grado variable de similitud de secuencia con otras proteínas de nuestro entorno.

Aunque la Patente de Estados Unidos Nº 5.593.877 proporciona la clonación y expresión de enzimas de veneno de véspidos, particularmente hialuronidasa y fosfolipasa, sigue existiendo la necesidad de identificar secuencias inusuales e inesperadas para tales enzimas, y de diseñar sistemas de expresión eficaces para las mismas. Existe una necesidad particular de delinear los epítopos de células B y de células T adyuvantes de la avispa de papel (por ejemplo, Polistes annularis). En particular, los alergenos de veneno de Polistinae principales fosfolipasa e hialuronidasa son dianas apropiadas para determinar los epítopos importantes de células B y T. Para tratar con detalle la base de la respuesta alérgica a alergenos de véspidos, y para crear inmunoterapias basadas en alergenos, necesitan investigarse los ADNc y las secuencias de proteínas de varios alergenos homólogos. Además, deben crearse vectores adecuados para la expresión de alto nivel en bacterias y células eucariotas de alergenos de véspidos o sus fragmentos. Los alergenos de véspidos recombinantes y sus fragmentos después pueden usarse para localizar sus epítopos de células B y de células T en sistemas murinos y, lo que es más importante, en sistemas humanos por medio de ensayos de unión de anticuerpos y de proliferación de células T, respectivamente.

En la técnica también existe la necesidad de usar péptidos que tengan epítopos de células T o B de alergenos de veneno de véspidos para estudiar la inducción de tolerancia en ratones y la inducción de tolerancia en seres humanos.

Además, existe la necesidad de ensayar si un péptido modificado inhibe la unión del epítopo de células T del alergeno a la molécula del MHC de clase II, induce anergia de células T, o ambas cosas.

De esta manera, en la técnica sigue existiendo la necesidad de una información de secuencia única sobre alergenos de veneno de véspidos y una fuente abundante de tales alergenos para investigaciones inmunológicas y para la terapia inmunológica de la alergia.

Además, debido al uso excesivo de antibióticos en todo el mundo, y a la extensión de numerosos virus tales como VIH, Ebolla, etc., se han realizado esfuerzos para producir nuevas medicaciones de "super" antibióticos y compuestos que tengan actividad contra virus. Por ejemplo, se ha creado AZT, junto con inhibidores de proteasa para el tratamiento de sujetos que padecen VIH. Sin embargo, los costes para desarrollar nuevos "super" antibióticos y medicaciones antivirales son enormes.

Por lo tanto, lo que se necesitan son agentes y composiciones farmacéuticas para tratar enfermedades o trastornos relacionados con el sistema inmune cuya actividad no dependa necesariamente de la lucha contra el virus o patógeno particular, sino que más bien modulen o potencien la capacidad del sistema inmune para combatir la enfermedad o trastorno, mejorando de esta manera la enfermedad o trastorno, o un síntoma asociado con el mismo. Los venenos de himenópteros, particularmente los venenos de véspidos, proporcionan una posible fuente para tales agentes y composiciones farmacéuticas, como se describe en las Patentes de Estados Unidos Nº 4.822.608 y 5.827.829.

La cita de referencias del presente documento no debe considerarse una admisión de que es la técnica anterior de la presente invención.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica enzimas de veneno de Polistinae, fragmentos inmunomoduladores de la misma o derivados o análogos de la misma. En particular, la invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican una fosfolipasa de veneno de Polistinae. En realizaciones específicas, una molécula de ácido nucleico de la invención codifica una porción inmunomoduladora de un epítopo de células T de una enzima de veneno de Polistinae. En otra realización, una molécula de ácido nucleico de la invención codifica una porción antigénica de un epítopo de células B de una enzima de veneno de Polistinae.

En una realización se ha descubierto que, sorprendentemente, los ácidos nucleicos de la invención, que no son genómicos, contienen secuencias no codificantes, por ejemplo intrónicas. En una realización específica, las moléculas de ADNc para la enzima de veneno de Polistinae contienen lo que parece ser un intrón. De esta manera, inesperadamente ha resultado ser necesario delecionar estas secuencias "intrónicas" para obtener un ácido nucleico que codifique una enzima de veneno de Polistinae madura, por ejemplo, una fosfolipasa o hialuronidasa.

Por lo tanto, en sentido amplio, la presente invención incluye una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una enzima de veneno, una variante conservada de la misma, un fragmento inmunomodulador de la misma o un análogo o derivado de la misma. Como se ha indicado anteriormente, la molécula de ácido nucleico contiene secuencias no codificantes internas, es decir, además de secuencias 5' y 3' no traducidas (UTR), pero no es una secuencia genómica. Son ejemplos de enzimas de veneno de Polistinae codificadas por una molécula de ácido nucleico aislada de la invención fosfolipasas. Además, las enzimas, variantes conservadas de las mismas, fragmentos inmunomoduladores de las mismas o análogos o derivados de las mismas, procedentes del veneno de numerosos venenos de Polistinae pueden codificarse por una molécula de ácido nucleico aislada de la invención. Un ejemplo particular comprende Polistinae del género Polistes, y particularmente la especie annularis.

En una realización particular, la presente invención incluye una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una fosfolipasa A_{1}, variantes conservadas de la misma, fragmentos inmunomoduladores de la misma o análogos o derivados de la misma, procedente del género Polistinae y la especie annularis, donde P. annularis tiene la secuencia de aminoácidos representada en la SEC ID Nº: 2, y más específicamente, donde la molécula de ácido nucleico aislada tiene la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 1, variantes degeneradas de la misma, fragmentos de la misma, o análogos o derivados de la misma.

Además, la presente invención incluye una molécula de ácido nucleico aislada hibridable con una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de ADN de la SEC ID Nº: 1 ó 3, variantes degeneradas de la misma, fragmentos de la misma o análogos o derivados de la misma.

Además, la presente invención incluye además una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una enzima de veneno de Polistinae, o un fragmento inmunomodulador, derivado o análogo de la misma, donde la molécula de ácido nucleico aislada codifica una porción inmunomoduladora de un epítopo de células T o una porción antigénica de un epítopo de células B de la enzima de veneno de Polistinae. De forma similar, la presente invención incluye un polipéptido aislado que comprende una porción inmunomoduladora de un epítopo de células T de una enzima de veneno de Polistinae, donde el polipéptido se codifica por una molécula de ácido nucleico aislada de la invención. Los ejemplos de enzimas de veneno de avispa para las que moléculas de ácido nucleico aisladas de la presente invención codifican una porción inmunomoduladora de un epítopo de células T incluyen la fosfolipasa. En una realización específica, la fosfolipasa A_{1} procede del género Polistes, y particularmente de la especies annularis.

La invención también proporciona vectores de clonación y vectores de expresión que permiten la expresión de los ácidos nucleicos. Tales vectores contienen ácidos nucleicos de la invención como se ha indicado anteriormente. En el caso de los vectores de expresión, tales ácidos nucleicos están asociados operativamente con una secuencia de control de la expresión.

\newpage

Ventajosamente, la invención proporciona un método para producir una fosfolipasa de veneno de Polistinae, una variante conservada de la misma, fragmento inmunomodulador de la misma o análogo o derivado de la misma, que se incluye por la presente invención, que comprende:

(a): cultivar una célula hospedadora transformada con un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico aislada hibridable con una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de ADN de la SEC ID Nº: 1, preferiblemente que tiene una secuencia de la SEC ID Nº: 1, variantes degeneradas de la misma, fragmentos de la misma o análogos o derivados de la misma, donde la molécula de ácido nucleico aislada está asociada operativamente con un promotor, de forma que la fosfolipasa de veneno de Polistinae, la variante conservada de la misma, el fragmento inmunomodulador de la misma o el análogo derivado de la misma se produzca por la célula hospedadora; y

(b): recuperar la fosfolipasa de veneno de Polistinae, la variante conservada de la misma, el fragmento inmunomodulador de la misma o el análogo o derivado de la misma producido de esta manera en el cultivo, la célula hospedadora o ambos.

En un ejemplo particular, los métodos indicados anteriormente producen fosfolipasa A_{1} o hialuronidasa del género Polistes, y particularmente de la especie annularis, donde la fosfolipasa A_{1} comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2, variantes conservadas de la misma, fragmentos inmunomoduladores de la misma o análogos o derivados de la misma, y la hialuronidasa comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 4, variantes conservadas de la misma, fragmentos inmunomoduladores de la misma o análogos o derivados de la misma.

La presente invención incluye además composiciones farmacéuticas eficaces para el tratamiento de un estado alérgico específico de alergenos de veneno. En particular, la presente invención incluye una composición farmacéutica que comprende un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una porción inmunomoduladora de una célula T o una porción antigénica de un epítopo de células B de una enzima fosfolipasa de veneno de Polistinae, y un vehículo farmacéuticamente aceptable para el mismo. Por consiguiente, en una realización preferida, una composición farmacéutica de la invención comprende un epítopo de células T inmunomodulador de fosfolipasa A_{1} de veneno de Polistes annularis o una porción antigénica de un epítopo de células B de fosfolipasa A_{1} de Polistes annularis.

Naturalmente, la composición farmacéutica de la presente invención es para tratar un estado alérgico específico de alergeno de veneno de véspido, comprendiendo el tratamiento la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica de la invención, de la que se han proporcionado ejemplos anteriormente. La administración de una composición farmacéutica de la invención puede realizarse por vía parenteral y particularmente por vía oral, pulmonar, nasal, tópica o sistémica.

Además, la presente invención incluye el uso de una enzima de veneno de Polistinae recombinante de la invención en la fabricación de un medicamento y un método asociado para modular una respuesta inmune hacia un inmunógeno, por ejemplo, para tratar una afección alérgica a véspidos o para tratar una enfermedad o trastorno relacionado con el sistema inmune o un síntoma de la enfermedad o trastorno relacionado con el sistema inmune. El polipéptido se codifica por una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una enzima de veneno de Polistinae, donde el polipéptido comprende un fragmento inmunomodulador de una enzima de veneno de Polistinae. Más particularmente, un agente para tratar una enfermedad o trastorno relacionado con el sistema inmune, o un síntoma asociado con el mismo, comprende una enzima de veneno de Polistinae, o un vector que permite la expresión del veneno de Polistinae o la enzima in vivo.

En una realización específica, el polipéptido es una fosfolipasa codificada por una molécula de ácido nucleico aislada hibridable, o preferiblemente que comprende una secuencia de ADN de la SEC ID Nº: 1, variantes degeneradas de la misma, fragmentos de la misma o análogos o derivados de la misma.

Además, la presente invención incluye una composición farmacéutica para modular una respuesta inmune hacia un inmunógeno, por ejemplo, para tratar un estado alérgico a véspidos o para tratar una enfermedad o trastorno relacionado con el sistema inmune o un síntoma relacionado con el mismo, donde la composición farmacéutica comprende una enzima de veneno de Polistinae recombinante, y un vehículo farmacéuticamente aceptable para la misma.

La administración de una composición farmacéutica para tratar una enfermedad o trastorno relacionado con el sistema inmune en un sujeto puede realizarse por vía parenteral y, particularmente, por vía oral, pulmonar, nasal, tópica o sistémica. Además, numerosas enfermedades o trastornos relacionados con el sistema inmune pueden tratarse con la presente invención. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación, una enfermedad o trastorno producido por patógenos tal como una enfermedad o trastorno viral, por ejemplo VIH, virus herpes simplex o papilomavirus; una enfermedad autoinmune, por ejemplo, artritis o Lupus; o una combinación de tales enfermedades o trastornos.

Es otro objeto de la invención proporcionar secuencias de aminoácidos de la fosfolipasa A_{1} de Polistes annularis, junto con variantes conservadas de la misma, fragmentos de la misma, incluyendo porciones inmunomoduladoras de epítopos de células T y porciones antigénicas de epítopos de células B de fosfolipasa A_{1} de Polistes annularis, que contienen, o más preferiblemente carecen de secuencias "intrónicas". Las secuencias de aminoácidos deducidas de la fosfolipasa A_{1} y de la hialuronidasa de Pol a permite la comparación de su homología con enzimas análogas de otros véspidos. Esta información proporciona una base para evaluar la reactividad cruzada de los alergenos, que puede ser importante para las reacciones alérgicas y para los tratamientos terapéuticos. Por lo tanto, en una realización específica, la presente invención permite a un especialista habitual en la técnica determinar y evaluar el grado de similitud de la fosfolipasa A_{1} de Pol a con proteínas ambientales y/o proteínas autólogas. Se cree que la similitud de las enzimas de veneno de véspidos con tales proteínas ambientales y particularmente con proteínas autólogas tiene implicaciones importantes para la respuesta alérgica.

Es otro objeto de la invención proporcionar vectores de expresión y clonación que comprenden una molécula de ácido nucleico aislada que codifica la fosfolipasa A_{1} de Polistes annularis, incluyendo fragmentos que comprenden una porción inmunomoduladora de un epítopo de células T o una porción antigénica de un epítopo de células B de esta enzima de veneno de Polistinae, de forma que la molécula de ácido nucleico aislada pueda reproducirse y expre-
sarse.

Otro objeto de la invención comprende la producción de enzimas de veneno de Polistinae tales como fosfolipasa, junto con variantes conservadas de la misma, fragmentos inmunomoduladores de la misma o análogos o derivados de la misma, usando vectores de expresión de la invención, a pesar de la presencia de secuencias intrónicas en clones de ADNc.

Otro objeto de la invención es proporcionar agentes y composiciones farmacéuticas para tratar un estado alérgico específico de alergeno en un sujeto, donde los agentes y la composición farmacéutica comprenden un polipéptido aislado codificado por una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una enzima fosfolipasa de veneno de Polistinae, particularmente de Polistes annularis, donde el polipéptido comprende una porción antigénica de un epítopo de células B, o una porción inmunomoduladora de un epítopo de células T de la fosfolipasa A_{1} de Polistinae.

Otro objeto de la invención es proporcionar un método para tratar una alergia específica de alergeno de veneno de véspido en un sujeto, donde al sujeto se le administra una composición farmacéutica para tratar un estado alérgico específico de alergeno.

Otro objeto de la invención es proporcionar agentes y composiciones farmacéuticas que comprenden tales agentes que tratan una enfermedad o trastorno relacionado con el sistema inmune en un mamífero, tal como una enfermedad o trastorno producido por patógenos, una enfermedad o trastorno viral, una enfermedad o trastorno autoinmune o una combinación de enfermedades o trastornos relacionados con el sistema inmune.

Otro objeto de la invención es proporcionar agentes y composiciones farmacéuticas para modular la respuesta inmune hacia un inmunógeno en un mamífero. Como resultado, la administración de tal composición farmacéutica modula la capacidad del sistema inmune de reconocer y atacar al inmunógeno. En una realización particular, la capacidad del sistema inmune del mamífero para reconocer y atacar al inmunógeno se aumenta tras la administración de la composición farmacéutica con respecto a la susceptibilidad del sistema inmune del sujeto de reconocer y atacar al inmunógeno antes de la administración de una composición farmacéutica de la invención.

Abreviaturas

Dol m Dolichovespula maculata	avispón de cara blanca
Dol a D. arenaria	avispón amarillo
Pol a Polistes annularis	avispa
Pol e P. exclamans	avispa
Ves m Vespula maculifrons	véspula
Ves v V. vulgaris	véspula
PCR	reacción en cadena de la polimerasa
RACE	amplificación rápida de extremos de ADNc
TCR	receptor de células T para el antígeno

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. La secuencia de nucleótidos de ADNc que codifica la fosfolipasa A_{1} de veneno de Pol a (SEC ID Nº: 1) y la secuencia de aminoácidos de la fosfolipasa A_{1} de veneno de Pol a (SEC ID Nº: 2). Debe tenerse en cuenta que los primeros 18 restos aminoacídicos de la SEC ID Nº: 2 representan una porción de una secuencia señal. Por lo tanto, el resto aminoacídico 19 de la SEC ID Nº: 2 (glicina) es el resto aminoacídico N-terminal en la fosfolipasa A_{1} de Pol a madura.

Figuras 2A y 2B. El ADNc de la fosfolipasa de Pol a contiene dos intrones. (A) La secuencia de nucleótidos del intrón 1 de papla (SEC ID Nº: 5), un intrón en el ADNc de la fosfolipasa A_{1} de veneno de Pol a localizado entre los nucleótidos 111 y 112 de la SEC ID Nº: 1. (B) Las secuencias de nucleótidos del intrón 2 de papla (SEC ID Nº: 6), un intrón en el ADNc de la fosfolipasa A_{1} de veneno de Pol a localizado entre los nucleótidos 720 y 721 de la SEC ID Nº: 1.

Figura 3. Similitud de las secuencias de restos aminoacídicos entre la fosfolipasa de veneno de avispón (SEC ID Nº: 7), la fosfolipasa de véspula (SEC ID Nº: 8) y la fosfolipasa A_{1} de la avispa de papel (SEC ID Nº: 2).

Figura 4. La secuencia de nucleótidos de ADNc que codifica la hialuronidasa de veneno de Pol a (SEC ID Nº: 3) y la secuencia de aminoácidos de la hialuronidasa de Pol a (SEC ID Nº: 4). Obsérvese que los primeros 23 restos aminoacídicos de la SEC ID Nº: 4 representan una porción de una secuencia señal. Por lo tanto, el resto aminoacídico 30 de la SEC ID Nº: 4 (serina) es el resto aminoacídico N-terminal de la hialuronidasa de Pol a madura.

Figura 5. La secuencia de nucleótidos de Pahya (SEC ID Nº: 9), un intrón del ADNc de la hialuronidasa de Pol a, localizado entre los nucleótidos 733 y 734 de la SEC ID Nº: 3.

Figura 6. Similitud de secuencias de restos aminoacídicos entre la hialuronidasa de veneno de abeja (bv) (SEC ID Nº: 10), la hialuronidasa de Dol m (wfh) (SEC ID Nº: 11), la hialuronidasa de Ves v (vv) (SEC ID Nº: 12) y la hialuronidasa de Pol a (pa) (SEC ID Nº: 4).

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a moléculas de ácido nucleico recombinantes que codifican enzimas fosfolipasas de veneno de Polistinae, y fragmentos inmunomoduladores, derivados o análogos de las mismas, y polipéptidos codificados por tales moléculas de ácido nucleico útiles en el diagnóstico y terapia de la alergia específica de veneno de véspidos. En realizaciones específicas, la presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica un fragmento inmunomodulador de una fosfolipasa de Polistinae, en particular la fosfolipasa A_{1} de Pol a, fragmentos inmunomoduladores de la misma, análogos o derivados de la misma.

La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento sorprendente y completamente inesperado de segmentos no codificantes internos de ADNc que codifican tanto la fosfolipasa de Pol a como la hialuronidasa de Pol a. Antes de este descubrimiento, los ADNc para enzimas de veneno de véspidos no contenían tales secuencias "intrónicas" aparentes.

Este descubrimiento tiene dos implicaciones significativas. La primera es que los ADNc de Polistinae, y más particularmente de Polistes, y aún más particularmente de Pol a parecen contener "intrones". De esta manera, los Polistinae de esta subfamilia expresan ARNm únicos, tienen capacidades de procesamiento de ARNm únicas y potencialmente representan variantes de ayuste interesantes.

El término "intrones" se usa para hacer referencia a secuencias de ácido nucleico que no se espera que estén presentes en un ADNc que codifica fosfolipasa o hialuronidasa, y que no son secuencias UTR 5' o 3'. Las secuencias pueden representar variantes de ayuste inesperadas de las proteínas, procesamientos incompletos de ARNm o algunas características reguladoras encontradas en esta subfamilia, género y especie de véspido.

La presencia de estas secuencias "intrónicas" afecta significativamente a la preparación de vectores de expresión. Aunque es posible expresar los polipéptidos únicos codificados por estos ADNc, en otra realización se requiere una modificación impredecible del ADNc para eliminar estos "intrones" para expresar formas maduras de las enzimas de veneno de Polistinae, por ejemplo, para uso en inmunoterapia. De esta manera, inesperadamente ha resultado necesario modificar adicionalmente por ingeniería genética secuencias codificantes de la fosfolipasa e hialuronidasa de Polistinae. Una vez delecionadas estas secuencias "intrónicas", pueden obtenerse proteínas fosfolipasa y hialuronidasa que comprenden la secuencia de aminoácidos natural.

La invención se refiere adicionalmente a vectores de expresión que comprenden tales moléculas de ácido nucleico y a métodos para producir polipéptidos de enzima de veneno de Polistinae de la invención por medio de la expresión de tales vectores de expresión y la recuperación de los polipéptidos de enzima de veneno de Polistinae producidos.

La invención también proporciona composiciones farmacéuticas eficaces para el tratamiento de un veneno de véspido, y probablemente incluso un veneno de himenóptero, un estado alérgico específico de alergeno que comprende un polipéptido de la invención y métodos para tratar tales estados alérgicos que comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de las composiciones farmacéuticas de la invención.

Los polipéptidos de la invención también pueden ser útiles para diagnosticar estados alérgicos específicos de veneno de véspido, particularmente de Polistinae.

Además, se ha descubierto que, inesperadamente, la administración de una composición farmacéutica que comprende fosfolipasa o hialuronidasa de veneno de Polistinae puede usarse para tratar una enfermedad o trastorno relacionado con el sistema inmune, tal como una enfermedad o trastorno producido por patógenos, una enfermedad o trastorno viral, una enfermedad o trastorno autoinmune, o una combinación de tales enfermedades o trastornos.

Por consiguiente, como se usa en este documento, la expresión "alergeno de veneno de Polistinae" se refiere a una proteína encontrada en el veneno de un Polistinae, tal como la avispa de papel (Polistes annularis), a la que son sensibles las personas susceptibles tras la exposición a la picadura del insecto. Aunque la mayoría de los antígenos se caracterizan por ser reactivos con anticuerpos específicos de la clase IgG, un alergeno se caracteriza por ser reactivo también con anticuerpos de tipo IgE. Los anticuerpos de tipo IgE son responsables de la mediación de los síntomas de un estado alérgico, es decir, de la hipersensibilidad de tipo inmediato.

Como se usa en este documento, el término "véspido" se usa de acuerdo con la práctica de los especialistas en el campo de la alergia y se refiere a insectos que pertenecen a la familia mundial Vespidae, es decir, avispas sociales incluyendo avispones, véspulas y avispas de papel. En particular, los véspidos de la subfamilia Vespinae incluyen las subfamilias Vespinae y Polistinae. Más particularmente, los véspidos de la subfamilia incluyen los géneros Vespa Linnaeus, Vespula Thomson, Dolichovespula Rohwer y Polistes Latreille. Vespula y Dolichovespula pueden considerarse subgéneros del género Vespula. Las especies del género Vespa incluyen, pero sin limitación, V. crabro (L.) y V. orientalis (Linnaeus). Las especies del género Vespula incluyen, pero sin limitación, V. germanica (Fab.), V. squamosa (Drury), V. maculifrons (Buysson), V. flavopilosa (Jacobson), V. vulgaris (L.), y V. pensylvanica (Saussure). Las especies del género Dolichovespula incluyen, pero sin limitación, P. dominulus, D. maculata (L.) y D. arenaria (Fab.).

La subfamilia Polistinae incluye el género Polistes. Las especies del género Polistes incluyen, pero sin limitación, P. dominulus, Pol a (Linnaeus), P. exclamans (Viereck), P. metricus (Say), P. fuscatus (Fabricius), P. gallicus, pacificus, P. canadensis, P. kaibabensis, P. comanchus, P. commanchus, P. annularis, P. exclamans, P. instabilis, P. carnifex, P. major, P. metricus, P. perplexus, P. carolinus, P. flavus, P. fuscatus, P. aurifer, P. dorsalis, P. bellicosus, P. apachus, P. sulcifer, P. semenowi, P. atrimandibularis, P. biglumis, P. bischoffi, P. dominulus, P. nimpha, P. Pgallicus, P. associus, P. gigas, P. stigma, P. adustus, P. snelleni, P. mandarinus, P. chinensis, P. sulcatus, P. formosanus, P. japonicus, P. watttii, P. macaensis, P. jadwigae, P. olivaceus, P. rothneyi, P. jokohamae, P. poeyi, P. paraguayensis, P. rossi, P. cinctus, P. cavapyta, P. buysonni, P. brevifissus, P. ferreri, P. infuscatus, P. satan, P. melanotus, P. erythrocephalus, P. lanio, P. penai, P. aterrimus, P. huacapistana, P. versicolor, P. ninabamba, P. simillimus, P. adelphus, P. biguttatus, P. binotatus, P. consobrinus, P. peruvianus, P. weyrauchorum, P. xanthogaster, P. maranonensis, P. myersi, P. veracrucis, P. eburneus, P. stabilinus, P. pseudoculatus, P. apicalis, P. oculatus, P. crinitus, P. cubensis, P. minor, P. incertus, P. franciscanus, P. goeldii, P. olivaceus, P. bicolor, P. thoracicus, P. rufiventrus, P. moraballi, P. angulinus, P. subsericeus, P. testaceicolor, P. claripennis, P. billardieri, P. davillae, P. occipitalis, P. atrox, P. deceptor, P. niger, P. candidoi, P. geminatus, P. melanosoma, P. actaeon, P. obscurus, P. bequaertianus, P. cinerascens y P. apachus (Saussure).

Como se usa en este documento, el término "fosfolipasa" se refiere a la clase de enzimas que actúan sobre substratos de fosfolípidos, por ejemplo para hidrolizar ácidos grasos. En una realización específica, una fosfolipasa cataliza la hidrólisis rápida del grupo acilo en la posición 1 de fosfatidilcolinas sintéticas, y una hidrólisis lenta del grupo acilo en la posición 2. De esta manera, las fosfolipasas de véspidos de la invención pueden tener tanto el tipo A_{1} como el tipo B de actividades de fosfolipasa. Las fosfolipasas de la invención también pueden tener actividad lipasa de bajo nivel.

Como se usa en este documento, el término "hialuronidasa" se refiere a la clase de enzimas que actúan sobre la unidad de disacárido del ácido D-glucurónico y N-acetil-D-glucosamina. Tales enzimas median la hidrólisis de polímeros de disacáridos repetidos que comprenden ácido D-glucurónico y N-acetil-D-glucosamina. Un ejemplo de tal polímero es el ácido hialurónico. La hialuronidasa cataliza la liberación de grupos reductores de N-acetilglucosamina del ácido hialurónico.

Una secuencia "genómica" contiene todas las secuencias intrónicas 5' y 3' no traducidas, y secuencias 5' y 3' no transcritas (y a menudo reguladoras) de un gen. De esta manera, una secuencia codificante no es genómica cuando carece de uno o más intrones y secuencias 5' y 3' no transcritas, particularmente secuencias reguladoras.

Como se usa en este documento, el término "inmunomodulador" se refiere a la capacidad de aumentar o reducir una respuesta inmune específica de antígeno, a nivel de las células B o de las células T. La actividad inmunomoduladora puede detectarse, por ejemplo, en ensayos de proliferación de células T, midiendo la producción de anticuerpos, la producción de linfoquinas o la capacidad de respuesta de las células T. En particular, además de los efectos sobre las respuestas de las células T, los polipéptidos inmunomoduladores de la invención pueden unirse a moléculas de inmunoglobulina (es decir, anticuerpos) sobre la superficie de las células B y afectar también a las respuestas de las células B.

Como se usa este documento, el término "derivado" se refiere a un ácido nucleico modificado que codifica una enzima de veneno fosfolipasa o hialuronidasa de Polistinae, particularmente de Polistes, que contiene una substitución, deleción o inserción, y la proteína codificada por dicho ácido nucleico. El término "derivado" se refiere específicamente a un derivado de baja unión a IgE (o análogo) que contiene substituciones de aminoácidos en restos aminoacídicos clave, dando como resultado una unión a IgE reducida sin alterar la conformación global o la estructura secundaria y terciaria de la proteína. En PCT/DK99/00136 se describen derivados de baja unión a IgE.

Como se usa en este documento, la frase "enfermedad o trastorno relacionado con el sistema inmune" se refiere a una enfermedad o trastorno que provoca una respuesta inmune en un sujeto, o que afecta a la capacidad del sistema inmune para responder a un inmunógeno. Por lo tanto, los ejemplos de enfermedades o trastornos relacionados con el sistema inmune comprenden una enfermedad o trastorno producido por patógenos; una enfermedad o trastorno viral, por ejemplo, VIH, virus herpes simplex o papilomavirus; una enfermedad autoinmune, por ejemplo, artritis o lupus.

Una "molécula de ácido nucleico" se refiere a la forma polimérica de éster de fosfato de ribonucleósidos (adenosina, guanosina, uridina o citidina; "moléculas de ARN") o desoxirribonucleósidos (desoxiadenosina, desoxiguanosina, desoxitimidina o desoxicitidina; "moléculas de ADN") en forma monocatenaria o en forma de hélice de doble cadena. Son posibles hélices bicatenarias ADN-ADN, ADN-ARN y ARN-ARN. La expresión "molécula de ácido nucleico" y, en particular, molécula de ADN o ARN, se refiere sólo a la estructura primaria y secundaria de la molécula y no se limita a ninguna forma terciaria particular. De esta manera, esta expresión incluye el ADN bicatenario encontrado, entre otras cosas, en moléculas de ADN lineales o circulares (por ejemplo, fragmentos de restricción), virus, plásmidos y cromosomas. Para discutir la estructura de moléculas de ADN bicatenarias particulares, las secuencias pueden describirse en este documento de acuerdo con la convención normal de proporcionar sólo la secuencia en la dirección 5' a 3' a lo largo de la cadena no transcrita de ADN (es decir, la cadena que tiene una secuencia homóloga al ARNm). Una "molécula de ADN recombinante" es una molécula de ADN que ha experimentado una manipulación de biología molecular.

Una molécula de ácido nucleico es "hibridable" con otra molécula de ácido nucleico, tal como ADNc, ADN genómico o ARN, cuando una forma monocatenaria de la molécula de ácido nucleico puede hibridar con otra molécula de ácido nucleico en las condiciones apropiadas de temperatura e intensidad iónica en solución (véase Sambrook et al., supra). Las condiciones de temperatura e intensidad iónica determinan la "rigurosidad" de la hibridación. Para una investigación preliminar de moléculas de ácido nucleico homólogas, pueden usarse condiciones de hibridación de baja rigurosidad, que corresponden a una T_{m} de 55º, por ejemplo, 5xSSC, SDS al 0,1%, leche al 0,25% y sin formamida; o formamida al 30%, 5xSSC y SDS al 0,5%). Las condiciones de hibridación de rigurosidad moderada corresponden a una T_{m} superior (de aproximadamente 60ºC), por ejemplo, formamida al 40% con 5x o 6x SSC. Las condiciones de hibridación de alta rigurosidad corresponden a la mayor T_{m} (mayor o igual a aproximadamente 65ºC), por ejemplo, formamida al 50%, 5x o 6x SSC. La hibridación requiere que las dos moléculas de ácido nucleico contengan secuencias complementarias, aunque dependiendo de la rigurosidad de la hibridación, son posibles desacoplamientos entre bases. La rigurosidad apropiada para la hibridación de las moléculas de ácido nucleico depende de la longitud de las moléculas de ácido nucleico y del grado de complementación, variables bien conocidas en la técnica. Cuanto mayor es el grado de similitud u homología entre dos secuencias de nucleótidos, mayor es el valor de T_{m} para híbridos de moléculas de ácido nucleico que tienen esas secuencias. La estabilidad relativa (correspondiente a una mayor T_{m}) de las hibridaciones de ácidos nucleicos se reduce en el siguiente orden: ARN:ARN, ADN:ARN, ADN:ADN. Para híbridos con una longitud mayor de 100 nucleótidos, se han obtenido ecuaciones para calcular la T_{m} (véase Sambrook et al., supra, 9.50-0.51). Para la hibridación con moléculas de ácido nucleico más cortas, es decir, oligonucleótidos, la posición de los desacoplamientos se vuelve más importante, y la longitud del oligonucleótido determina su especificidad (véase Sambrook et al., supra, 11.7-11.8). Preferiblemente, una longitud mínima para una molécula de ácido nucleico hibridable es de al menos aproximadamente 10 nucleótidos; preferiblemente de al menos aproximadamente 10 nucleótidos; y más preferiblemente la longitud es de al menos aproximadamente 20 nucleótidos; incluso más preferiblemente de 30 nucleótidos; y aún más preferiblemente de 40 nucleótidos.

En una realización específica, la expresión "condiciones de hibridación convencionales" se refiere a una T_{m} de 55ºC, y utiliza condiciones como las indicadas anteriormente. En una realización preferida, la T_{m} es 60ºC; en una realización más preferida, la T_{m} es 65ºC.

Una "secuencia codificante" de ADN es una secuencia de ADN bicatenaria que se transcribe y se traduce en un polipéptido in vivo cuando se pone bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia codificante se determinan por un codón de iniciación en el extremo 5' (amino) y un codón stop de la traducción en el extremo 3' (carboxilo). Una secuencia codificante puede incluir, pero sin limitación, secuencias procarióticas, ADNc de ARNm eucariótico, secuencias de ADN genómicas de ADN eucariótico (por ejemplo, de mamífero) e incluso secuencias de ADN sintéticas. Si la secuencia codificante se pretende usar para la expresión en una célula eucariótica, normalmente se localizará una señal de poliadenilación y una secuencia de terminación de la transcripción en posición 3' con respecto a la secuencia codificante.

Las secuencias de control de la transcripción y la traducción son secuencias reguladoras de ADN, tales como promotores, potenciadores, terminadores y similares, que proporcionan la expresión de una secuencia codificante en una célula hospedadora. En células eucarióticas, las señales de poliadenilación son secuencias de control.

Una "secuencia promotora" es una región reguladora de ADN capaz de unirse a la ARN polimerasa en una célula e iniciar la transcripción de una secuencia codificante cadena abajo (dirección 3'). Para los fines de definir la presente invención, la secuencia promotora está unida por su extremo 3' al sitio de inicio de la transcripción y se extiende cadena arriba (dirección 5') para incluir el número mínimo de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripción a niveles detectables por encima de los niveles basales. Dentro de la secuencia promotora se encontrará un sitio de inicio de la transcripción (definido convenientemente, por ejemplo, por mapeo con la nucleasa S1), así como dominios de unión a proteínas (secuencias consenso) responsables de la unión de la ARN polimerasa. Los promotores eucarióticos, a menudo pero no siempre, contienen cajas "TATA" y cajas "CAT".

Una secuencia codificante está "bajo el control" de secuencias de control de la transcripción y la traducción en una célula cuando la ARN polimerasa transcribe la secuencia codificante en ARNm, que después se traduce para dar la proteína codificada por la secuencia codificante.

Puede incluirse una "secuencia señal" antes de la secuencia codificante. Esta secuencia codifica un péptido señal, en posición N-terminal con respecto al polipéptido, que dirige a la célula hospedadora para que transporte el polipéptido a la superficie celular o secrete el polipéptido en el medio, y este péptido señal normalmente se degrada selectivamente por la célula tras la exportación. Pueden encontrarse secuencias señal asociadas con una diversidad de proteínas nativas a los procariotas y eucariotas.

De acuerdo con la presente invención, pueden emplearse técnicas convencionales de biología molecular, microbiología y ADN recombinante dentro de la experiencia de la técnica. Tales técnicas se explican con detalle en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Sambrook, Fritsch & Maniatis, "Molecular Cloning: a Laboratory Manual", Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (en este documento "Sambrook et al., 1989"); "DNA Cloning: a Practical Approach", Volúmenes I y II (D.N. Glover ed. 1985); "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait ed. 1984); "Nucleic Acid Hybridization" [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)]; "Transcription And Translation" [B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)]; "Animal Cell Culture" [R.I. Freshney, ed. (1986)]; "Immobilized Cells And Enzymes" [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, "a Practical Guide To Molecular Cloning" (1984).

La presente invención se basa, en parte, en la clonación y determinación de la secuencia de una fosfolipasa y hialuronidasa de veneno de Polistinae. La clonación y determinación de la secuencia de esta enzima de veneno de Polistinae es muy significativa, ya que los clones de ADNc contienen inesperadamente secuencias de nucleótidos extra que no parecen codificar polipéptidos. Los estados alérgicos de veneno de véspido son comunes, y en algunos individuos sensibles una reacción alérgica puede preceder a una anafilaxis, que puede ser fatal. Como ocurre con los véspidos en general, es probable que los componentes del veneno de Polistinae jueguen un papel importante en la producción de alergina. Por lo tanto, es de gran importancia que se conozca la información de la secuencia de nucleótidos y de aminoácidos para los alergenos de veneno de Polistinae de manera que pueda determinarse una información precisa de diagnóstico acerca de la naturaleza del estado alérgico, especialmente sensibilidades específicas de alergeno, y puedan realizarse tratamientos terapéuticos eficaces del estado alérgico subyacente. Inesperadamente, éste ha sido el caso, ya que sorprendentemente se encontraron ADNc de Polistinae sin secuencias no transcritas.

Aislamiento de una Molécula de Ácido Nucleico que Codifica una Enzima de Veneno de Avispa

En la Patente de Estados Unidos Nº 5.593.877 se describió completamente el aislamiento de moléculas de ácido nucleico que codifican enzimas de veneno de véspido. La presente invención se refiere a descubrimientos inesperados y sorprendentes de que los ADNc de Polistinae contienen "intrones". Típicamente, los intrones se han eliminado del ARNm y, por lo tanto, normalmente no se encuentran en los ADNc. Las secuencias pueden representar variantes de ayuste.

Además se proporcionan derivados de una enzima de veneno de Polistinae, fragmentos y proteínas de fusión (véase, infra), así como moléculas de ácido nucleico que los codifican.

En un aspecto preferido, la presente invención proporciona la secuencia de ácido nucleico completa de una enzima de veneno de Polistinae. En particular, la presente invención proporciona la secuencia de ácido nucleico de una fosfolipasa de Polistinae, en particular la fosfolipasa A_{1} y la hialuronidasa de Pol a (avispa de papel), en particular la hialuronidasa de Pol a.

En una realización específica, para obtener una molécula de ácido nucleico que codifica una enzima de veneno de Polistinae, se combina la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con la técnica de amplificación rápida de extremos de ADNc (RACE) descrita por Frohman et al. (Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1998, 85:8998-9002; véase también Frohman, 1990, Amplifications: A Forum for PCR Users 5:11) para amplificar un fragmento que codifica una secuencia que comprende la enzima de veneno de Polistinae antes de la selección. Los cebadores oligonucleotídicos que representan una enzima de veneno de Polistinae de la invención pueden usarse como cebadores en PCR. Generalmente, tales cebadores se preparan por síntesis. A partir de la información de la secuencia de aminoácidos pueden deducirse secuencias para tales cebadores oligonucleotídicos. Tales secuencias de oligonucleótidos pueden ser no degeneradas, pero más frecuentemente las secuencias son degeneradas. Más preferiblemente, los cebadores se basan en las secuencias de ácido nucleico para las enzimas de veneno de Polistinae descritas en este documento. Los oligonucleótidos pueden utilizarse como cebadores para amplificar por PCR secuencias a partir de una fuente (ARN o ADN), preferiblemente una biblioteca de ADNc, de potencial interés. Por ejemplo, puede usarse PCR para amplificar una secuencia codificante de la enzima de veneno de Polistinae a partir de una biblioteca de ADNc de glándula ácida de Polistinae. La PCR puede realizarse, por ejemplo, por medio del uso de un aparato de ciclos térmicos Perkin-Elmer Cetus y la Taq polimerasa (Gene Amp^{TM}).

La presente invención además proporciona medios para aislar un homólogo de una enzima de veneno de Polistinae de cualquier especie de Polistinae. Se puede elegir sintetizar varios cebadores degenerados diferentes para uso, por ejemplo, en reacciones de PCR. También es posible variar la rigurosidad de las condiciones de hibridación usadas para cebar las reacciones de PCR, para permitir un mayor o menor grado de similitud de secuencia de nucleótidos entre un homólogo de una enzima de veneno de Polistinae y una enzima de veneno de Polistinae específica descrita en este documento. Después de una amplificación satisfactoria de un segmento de un homólogo de una enzima de veneno de Polistinae, el segmento puede clonarse y secuenciarse, y utilizarse como sonda para aislar un ADNc completo o clon genómico. Éste, a su vez, permitirá la determinación de la secuencia de nucleótidos completa, el análisis de su expresión, y la producción de su producto proteico para el análisis funcional, como se describe infra. De esta manera, pueden identificarse y expresarse genes adicionales que codifican enzimas de veneno de Polistinae, en particular, fosfolipasas e hialuronidasas.

En otra realización, pueden aislarse genes que codifican una enzima de veneno de Polistinae a partir de una biblioteca adecuada por selección con una sonda. A partir de la información de secuencia proporcionada en este documento pueden generarse sondas útiles para aislar un gen de enzima de veneno de Polistinae.

Puede construirse una biblioteca de expresión por métodos conocidos en la técnica. Preferiblemente, se prepara una biblioteca de ADNc a partir de células o tejidos que expresan una enzima de veneno de Polistinae, es decir, células de la glándula de veneno localizada cerca del saco de veneno. Algunas veces, la glándula de veneno se denomina glándula ácida. Por ejemplo, puede aislarse ARNm o ARN total, se obtiene ADNc y se une a un vector de expresión (por ejemplo, un plásmido o un derivado de bacteriófago) de tal forma que sea capaz de expresarse por la célula hospedadora en la que se introduce después. Después pueden usarse diversos ensayos de selección para seleccionar los clones positivos. Por ejemplo, puede usarse PCR con cebadores apropiados, que pueden sintetizarse basándose en las secuencias proporcionadas en este documento. Se prefiere la PCR, ya que puede detectarse directamente la producción amplificada, por ejemplo, por tinción con bromuro de etidio. Como alternativa, pueden usarse sondas marcadas derivadas de las secuencias de ácido nucleico de la presente solicitud para seleccionar las colonias. Aunque la glándula de veneno (ácida) puede ser difícil de aislar, y la cantidad de ARNm puede ser problemática, la PCR específica basada en cebadores de la presente invención puede solucionar estos problemas permitiendo una amplificación específica de cantidades muy pequeñas de ARNm o ADNc o incluso ADN genómico.

Como alternativa, la presencia del gen puede detectarse por ensayos basados en las propiedades físicas, químicas o inmunológicas de su producto expresado. Por ejemplo, pueden seleccionarse clones de ADNc o clones de ADN que seleccionan por hibridación los ARNm apropiados, que producen una proteína que, por ejemplo, tiene una migración electroforética similar o idéntica, comportamiento de enfoque isoeléctrico, mapas de digestión proteolítica o propiedades antigénicas conocidas para una enzima de veneno de Polistinae.

Algunas proteínas recombinantes expresadas por bacterias, por ejemplo, hialuronidasas de veneno de Polistinae, pueden reaccionar con anticuerpos específicos para las proteínas nativas. Es posible que otras proteínas recombinantes expresadas por bacterias, tales como fosfolipasas de veneno, no reaccionen con anticuerpos específicos para la proteína nativa. De esta manera, en casos en los que las proteínas recombinantes son inmunorreactivas, es posible seleccionar clones positivos por inmunotransferencia.

En otra realización, la actividad catalítica específica de la enzima, tal como la actividad lipasa de una fosfolipasa de veneno de Polistinae expresada, puede usarse para la selección. Sin embargo, las proteínas eucarióticas expresadas por bacterias pueden no plegarse en una conformación activa.

Generalmente, de acuerdo con la presente invención, puede usarse cualquier método de selección de clones positivos.

Las alternativas para el aislamiento de ADN genómico o ADNc de enzima de veneno de Polistinae incluyen, pero sin limitación, la síntesis química de la propia secuencia génica a partir de la secuencia proporcionada en este documento.

Los métodos anteriores no pretenden limitar los métodos por los que pueden obtenerse clones de una enzima de veneno de Polistinae.

Puede usarse un gran número de sistemas de vector-hospedador conocidos en la técnica. Los vectores posibles incluyen, pero sin limitación, plásmidos o virus modificados, pero el sistema de vector debe ser compatible con la célula hospedadora usada. Tales vectores incluyen, pero sin limitación, bacteriófagos tales como derivados de lambda, o plásmidos tales como diversos derivados de pBR322, por ejemplo, vectores pUC, CR, pGEX, pmal-c, pFLAG, etc. La inserción en un vector de clonación puede realizarse, por ejemplo, uniendo el fragmento de ADN en un vector de clonación que tiene extremos cohesivos complementarios. En un aspecto preferido de la invención, las moléculas de ácido nucleico amplificadas por PCR de la invención contienen nucleótidos de A solapantes en posición 3', y pueden usarse directamente para la clonación en un vector de PCR con salientes de nucleótidos de T compatibles (Invitrogen Corp., San Diego, CA). Sin embargo, si en el vector de clonación no están presentes los sitios de restricción complementarios usados para fragmentar el ADN, pueden modificarse enzimáticamente los extremos de las moléculas de ADN. Como alternativa, puede producirse cualquier sitio deseado uniendo secuencias de nucleótidos (enlazadores) sobre los extremos de ADN; estos enlazadores unidos pueden comprender oligonucleótidos sintetizados químicamente específicos que codifican secuencias de reconocimiento de endonucleasas de restricción. En un método alternativo, el vector escindido y el gen de la enzima de veneno de Polistinae pueden modificarse por medio de la adición de una cola homopolimérica. Pueden introducirse moléculas recombinantes en células hospedadoras mediante transformación, transfección, infección, electroporación, etc., de manera que se generen muchas copias de la secuencia génica.

En realizaciones específicas, la transformación de las células hospedadoras con moléculas de ADN recombinante que incorporan el gen de la enzima de veneno de Polistinae, ADNc o una secuencia de ADN sintetizada de dicha enzima, permite la generación de múltiples copias del gen. De esta manera, el gen puede obtenerse en grandes cantidades por medio del cultivo de los transformantes, el aislamiento de las moléculas de ADN recombinante a partir de los transformantes y, cuando sea necesario, la recuperación del gen insertado del ADN recombinante aislado.

Expresión de un Polipéptido o Fragmento de Alergeno de Veneno de Polistinae

Como se ha indicado anteriormente, los ácidos nucleicos aislados que codifican enzimas de veneno de Polistinae, particularmente proteínas de veneno de Polistes, contienen secuencias inesperadas que deben estar ausentes del ADNc para codificar una proteína similar a otras enzimas de veneno de Polistinae, por ejemplo, como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5.593.877. En una realización, los ácidos nucleicos que contienen "intrones" se expresan sin modificación adicional. En otra realización, los ácidos nucleicos se modifican usando las técnicas descritas en este documento y ejemplificadas infra, o como se describe en las referencias citadas anteriormente, tal como Sambrook et al., para producir una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos de una enzima de veneno de Polistinae nativa (aunque, como se describe más adelante, tal proteína puede tener una estructura secundaria o terciaria diferente, o incluir otras secuencias de polipéptidos fusionadas a la misma).

La secuencia de nucleótidos que codifica una enzima de veneno de Polistinae, o un fragmento inmunomodulador, derivado o análogo de la misma, puede insertarse en un vector de expresión apropiado, es decir, un vector que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia codificante de la proteína insertada. Tales elementos se denominan en este documento "promotor". De esta manera, la molécula de ácido nucleico que codifica la enzima de veneno de Polistinae está asociada operativamente con el promotor. Un vector de expresión también incluye preferiblemente un origen de replicación. Las señales necesarias de transcripción y traducción también pueden suministrarse por el gen nativo que codifica una enzima de veneno de Polistinae y/o sus regiones flanqueantes. Los sistemas potenciales de hospedador-vector incluyen, pero sin limitación, sistemas de células de mamífero infectados con virus (por ejemplo, vaccinia virus, adenovirus, etc.); sistemas de células de insecto infectados con virus (por ejemplo, baculovirus); microorganismos tales como levaduras que contienen vectores de levadura; o bacterias transformadas con bacteriófagos, ADN, ADN plasmídico o ADN cosmídico. Los elementos de expresión de los vectores varían en sus intensidades y especificidades. Dependiendo del sistema hospedador-vector utilizado, puede usarse uno cualquiera de varios elementos de la transcripción y la traducción adecuados.

En una realización alternativa, se expresa cromosómicamente una enzima de veneno de Polistinae recombinante de la invención, o un fragmento inmunomodulador, derivado o análogo del mismo, después de la integración de la secuencia codificante de la enzima de veneno de Polistinae por recombinación. A este respecto, puede usarse cualquiera de varios sistemas de amplificación para conseguir altos niveles de expresión génica estable (véase Sambrook et al, 1989, supra, en la sección 16.28).

La célula en la que se introduce el vector recombinante que comprende la molécula de ácido nucleico que codifica la enzima de veneno de Polistinae se cultiva en un medio de cultivo celular apropiado en condiciones que proporcionan la expresión de la enzima de veneno de Polistinae por la célula. La enzima de veneno de Polistinae expresada después puede recuperarse del cultivo de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica. Tales métodos se describen con detalle, infra.

En otra realización, puede expresarse una proteína de fusión de enzima de veneno de Polistinae. Una proteína de fusión de enzima de veneno de Polistinae comprende al menos una porción funcionalmente activa de una enzima de veneno que no procede de Polistinae unida a través de un enlace peptídico a al menos una porción inmunomoduladora de una enzima de veneno de Polistinae. Las secuencias de enzima de veneno que no procede de Polistinae pueden estar en posición amino o carboxi-terminal con respecto a las secuencias de la enzima de veneno de Polistinae. Una molécula de ADN recombinante que codifica tal proteína de fusión comprende una secuencia que codifica al menos una porción funcionalmente activa de una enzima de veneno que no procede de Polistinae unida en fase con la secuencia codificante de una enzima de veneno de Polistinae. Puede codificar un sitio de escisión para una proteasa específica, por ejemplo, factor Xa, preferiblemente en la unión de las dos proteínas.

En otra realización específica, un fragmento de la enzima de veneno de Polistinae se expresa como una proteína libre (no una proteína de fusión).

En una realización específica, la fosfolipasa de veneno de Polistinae, y los fragmentos inmunomoduladores de la misma, se expresan con una secuencia adicional que comprende aproximadamente seis restos de histidina, por ejemplo, usando el vector pQE12 (QUIAGEN, Chatsworth, CA). La presencia de la histidina hace posible el aislamiento selectivo de proteínas recombinantes en una columna de quelación con Ni.

En otra realización, puede producirse una forma periplásmica de la proteína de fusión (que contiene una secuencia señal) para exportar la proteína al periplasma de Escherichia coli. La exportación al periplasma puede promover un plegamiento apropiado de la proteína expresada.

Para construir vectores de expresión que contengan un gen que consta de señales de control de la transcripción/traducción y secuencias codificantes de proteínas apropiadas, puede usarse cualquiera de los métodos descritos previamente en la Patente Nº 5.593.877. Estos métodos pueden incluir técnicas de ADN recombinante y de síntesis in vitro y recombinantes in vivo (recombinación genética). La expresión de la secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima de veneno de Polistinae, o un fragmento inmunomodulador de la misma, puede regularse positivamente por una segunda secuencia de ácido nucleico de forma que la proteína o péptido de enzima de veneno de Polistinae se exprese en un hospedador transformado con la molécula de ADN recombinante. Por ejemplo, la expresión de una proteína de veneno de Polistinae puede controlarse por cualquier elemento promotor/potenciador conocido en la técnica, pero estos elementos reguladores deben ser funcionales en el hospedador seleccionado para la expresión. Los promotores que pueden usarse para controlar la expresión del gen de la enzima de veneno de Polistinae incluyen, pero sin limitación, el promotor temprano inmediato de CMV, la región promotora temprana de SV40 (Benoist y Chambon, 1981, Nature 290:304-310), el promotor contenido en la repetición terminal larga 3' del virus del sarcoma de Rous (Yamamoto, et al., 1980, Cell 22:787-797), el promotor de la timidina quinasa de herpes (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445), las secuencias reguladoras del gen de la metalotioneína (Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42); vectores de expresión procarióticos tales como el promotor de \beta-lactamasa (Villa-Kamaroff, et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731); o el promotor tac (DeBoer, et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25); véase también "Useful proteins from recombinant bacteria" en Scientific American, 1980, 242:74-94; elementos promotores de levadura u otros hongos tales como el promotor de Gal 4, el promotor de la ADC (alcohol deshidrogenasa), promotor de PGK (fosfoglicerol quinasa), promotor de la fosfatasa alcalina, y las regiones de control de la transcripción animal, que presentan especificidad de tejidos y se han utilizado en animales transgénicos.

Una vez identificada y aislada una molécula de ADN recombinante particular, pueden usarse varios métodos conocidos en la técnica para propagarla. Una vez establecido el sistema hospedador y las condiciones de crecimiento adecuadas, pueden propagarse y prepararse en cantidad vectores de expresión recombinantes. Como se ha explicado previamente, los vectores de expresión que pueden usarse incluyen, pero sin limitación, los siguientes vectores o sus derivados: virus humanos o animales tales como vaccinia virus o adenovirus; virus de insecto tales como baculovirus; vectores de levadura; vectores de bacteriófagos (por ejemplo, lambda) y vectores de ADN plasmídico y cosmídico, por nombrar algunos.

Además, puede elegirse una cepa de célula hospedadora que module la expresión de las secuencias insertadas, o modifique y procese el producto génico de la manera específica deseada. Las diferentes células hospedadoras tienen características y mecanismos específicos para el procesamiento y la modificación traduccionales y post-traduccionales (por ejemplo, glicosilación, escisión [por ejemplo, de la secuencia señal]) de proteínas. Pueden elegirse líneas celulares o sistemas hospedadores apropiados para asegurar la modificación y el procesamiento deseados de la proteína extraña expresada. Por ejemplo, puede usarse expresión en un sistema bacteriano para producir un producto proteico de núcleo no glicosilado. Sin embargo, es posible que la enzima expresada en bacterias no se pliegue de manera apropiada. La expresión en levaduras puede producir un producto glicosilado. La expresión en células de insecto puede usarse para aumentar la probabilidad de glicosilación "nativa" y plegamiento de una enzima de veneno de Polistinae heteróloga. Además, diferentes sistemas de expresión de vector/hospedador pueden afectar a las reacciones de procesamiento, tales como escisiones proteolíticas, en diferente medida. Es interesante indicar que se ha observado que la glicosilación y el replegamiento apropiado no son esenciales para la actividad inmunomoduladora de un alergeno de veneno de Polistinae, ya que el alergeno producido por bacterias es activo en un ensayo de proliferación de células T.

Los vectores se introducen en las células hospedadoras deseadas por métodos conocidos en la técnica, por ejemplo transfección, electroporación, electrotransferencia, microinyección, transducción, fusión de células, DEAE dextrano, precipitación con fosfato cálcico, lipofección (fusión de lisosomas), uso de una pistola génica o un transportador de vectores de ADN (véase, por ejemplo, Wu et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:963-967; Wu y Wu, 1988, J. Biol. Chem. 263:14621-14624; Hartmut et al., Solicitud de Patente Canadiense Nº 2.012.311, presentada el 15 de marzo, 1990).

Son vectores preferidos, particularmente para la producción de proteínas in vivo, vectores virales tales como lentivirus, retrovirus, herpes virus, adenovirus, virus adeno-asociados, vaccinia virus, baculovirus y otros virus recombinantes con tropismo celular deseable. De esta manera, puede introducirse un vector que codifica una enzima de veneno de Polistinae in vivo o ex vivo usando un vector viral o por medio de la introducción directa de ADN. La expresión en los tejidos dirigidos puede realizarse dirigiendo el vector transgénico a células específicas, tal como con un vector viral o un ligando de receptor, usando un promotor específico de tejido, o de las dos maneras. En la Publicación de Patente Internacional WO 95/28494, publicada en octubre de 1995, se describe el suministro de genes dirigidos.

Son vectores virales usados comúnmente para procedimientos de dirección y expresión in vivo o ex vivo vectores basados en ADN y vectores retrovirales. En la técnica se conocen métodos para construir y usar vectores virales (véase, por ejemplo, Miller y Rosman, BioTechniques, 7:980-990, 1992). Preferiblemente, los vectores virales presentan defectos en la replicación, es decir, son inadecuados para replicarse de forma autónoma en la célula diana. Preferiblemente, el virus defectuoso en la replicación es un virus mínimo, es decir, retiene sólo las secuencias de su genoma que son necesarias para la encapsidación del genoma para producir partículas virales.

Los vectores virales de ADN incluyen un virus de ADN atenuado o defectuoso, tal como, pero sin limitación, el virus herpes simplex (VHS), papilomavirus, virus de Epstein Barr (EBV), adenovirus, virus adeno-asociado (AAV), vaccinia virus y similares. Los ejemplos de vectores particulares incluyen, pero sin limitación, un vector de herpes virus 1 (HSV1) defectuoso (Kaplitt et al., Molec. Cell. Neurosci. 2:320-330, 1991; Publicación de Patente Internacional Nº WO 94/21807, publicada el 29 de septiembre de 1994; Publicación de Patente Internacional Nº WO 92/05263, publicada el 2 de abril de 1994); un vector de adenovirus atenuado, tal como el vector descrito por Stratford-Perricaudet, et al., (J. Clin. Invest. 90:626-630, 1992; véase también La Salle, et al., Science 259:988-990, 1993); y un vector de virus adeno-asociado defectuoso (Samulski, et al., J. Virol. 61:3096-3101, 1987; Samulski, et al., J. Virol. 63:3822-3828, 1989; Lebkowski, et al., Mol. Cell. Biol. 8:3988-3996, 1988).

Diversas compañías producen vectores virales en el mercado, incluyendo pero sin limitación Avigen, Inc. (Alameda, CA; vectores AAV), Cell Genesys (Foster City, CA; vectores retrovirales, adenovirales, AAV y lentivirales), Clontech (vectores retrovirales y de baculovirus), Genovo, Inc. (Sharon Hill, PA; vectores adenovirales y AAV), Genvec (vectores adenovirales), IntroGene (Leiden, Países Bajos: vectores adenovirales), Molecular Medicine (vectores retrovirales, adenovirales, AAV, y de herpes virus), Norgen (vectores adenovirales), Oxford BioMedica (Oxford, Reino Unido; vectores lentivirales), y Transgene (Strasbourg, Francia; vectores adenovirales, vaccinia, retrovirales y lentivirales).

En otra realización, el vector puede introducirse in vivo por lipofección, como ADN desnudo, o con otros agentes para facilitar la transfección (péptidos, polímeros, etc.). Pueden usarse lípidos catiónicos sintéticos para preparar liposomas para la transfección in vivo de un gen que codifique un marcador (Felgner, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 84:7413-7417, 1987; Felgner y Ringold, Science 337:387-388, 1989; véase Mackey, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 85:8027-8031, 1988; Ulmer et al., Science 259: 1745-1748, 1993). En las Publicaciones de Patente Internacionales WO95/18863 y WO96/17823, y en la Patente de Estados Unidos Nº 5.459.127 se describen compuestos lipídicos y composiciones útiles para la transferencia de ácidos nucleicos. Los lípidos se pueden acoplar químicamente a otras moléculas para conseguir la dirección (véase Mackey, et al., supra). Los péptidos dirigidos, por ejemplo hormonas o neurotransmisores, y proteínas tales como anticuerpos, o moléculas no peptídicas pueden acoplarse a los liposomas por medio químico.

También son útiles otras moléculas para facilitar la transfección de un ácido nucleico in vivo, tal como un oligopéptido catiónico (por ejemplo, Publicación de Patente Internacional WO95/21931), péptidos derivados de proteínas de unión al ADN (por ejemplo, Publicación de Patente Internacional WO96/25508), o un polímero catiónico (por ejemplo, Publicación de Patente Internacional WO95/21931).

Como alternativa, pueden introducirse vectores de ADN no viral para terapia génica en las células hospedadoras deseadas por métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, electroporación, microinyección, fusión celular, DEAE dextrano, precipitación con fosfato cálcico, uso de una pistola génica (transfección balística, véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 5.204.253, Patente de Estados Unidos 5.853.663, Patente de Estados Unidos Nº 5.885.795 y Patente de Estados Unidos Nº 5.702.384 y véase Sanford, TIB-TECH, 6:299-302, 1988; Fynan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 90:11478-11482, 1993; y Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 87:1568-9572, 1990), o el uso de un transportador de vectores de ADN (véase, por ejemplo, Wu, et al., J. Biol. Chem. 267:963-967, 1992; Wu y Wu, J. Biol. Chem. 263: 14621-14624, 1988; Hartmut, et al., Solicitud de Patente Canadiense Nº 2.012.311, presentada el 15 de marzo, 1990; Williams, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 88: 2726-2730, 1991). También pueden usarse estrategias de suministro de ADN mediado por receptores (Curiel, et al., Hum. Gene Ther. 3:147-154, 1992; Wu y Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432, 1987). Las Patentes de Estados Unidos Nº 5.580.859 y 5.589.466 describen el suministro de secuencias de ADN exógenas, sin agentes para facilitar la transfección, en un mamífero. Recientemente se ha descrito una técnica de transferencia de ADN in vivo de alta eficacia, con un voltaje relativamente bajo, denominada electrotransferencia (Mir, et al., C.P. Acad. Sci., 321:893, 1998; documentos WO 99/01157; WO 99/01158; WO 99/01175).

Pueden clonarse y expresarse tanto secuencias de ADNc como secuencias genómicas.

Además, se contempla que las enzimas de veneno de Polistinae de la presente invención, o fragmentos, derivados o análogos de las mismas, pueden prepararse de forma sintética, por ejemplo, por síntesis de péptidos en fase sólida.

Aislamiento y Purificación

Una vez identificada la enzima de veneno de Polistinae recombinante, puede aislarse y purificarse por métodos convencionales incluyendo cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico, afinidad y cromatografía en columna de exclusión molecular), centrifugación, solubilidad diferencial o por cualquier otra técnica convencional para la purificación de proteínas.

En una realización particular, puede modificarse por ingeniería genética una enzima de veneno de Polistinae y fragmentos de la misma para incluir aproximadamente seis restos histidilo, lo cual hace posible el aislamiento selectivo de la proteína recombinante en una columna de quelación de Ni. En un aspecto preferido, las proteínas se purifican adicionalmente por cromatografía de fase inversa.

En otra realización, en la que la enzima de veneno de Polistinae recombinante se expresa como una proteína de fusión, la porción de enzima de veneno que no es de Polistinae de la proteína de fusión puede dirigirse para purificación por afinidad. Por ejemplo, el anticuerpo específico para la porción de enzima de veneno que no es de Polistinae de la proteína de fusión puede inmovilizarse en un soporte sólido, por ejemplo, Sepharose activada por bromuro de cianógeno, y usarse para purificar la proteína de fusión. En otra realización, una molécula de unión de la porción de enzima de veneno que no procede de Polistinae de la proteína de fusión, tal como un receptor o ligando, puede inmovilizarse y usarse para purificar por afinidad la proteína de fusión.

En otra realización, se usa una proteína de fusión de enzima de veneno de Polistinae, preferiblemente purificada, sin modificación adicional, es decir, sin escindir o eliminar de otra manera la porción de enzima que no procede de veneno de Polistinae de la proteína de fusión. En una realización preferida, la proteína de fusión de enzima de veneno de Polistinae puede usarse terapéuticamente, por ejemplo, para modular una respuesta inmune.

En otra realización, la proteína de fusión purificada se trata para escindir la enzima de veneno no procedente de Polistinae o una porción de la misma de la enzima de veneno de Polistinae. Por ejemplo, cuando la proteína de fusión se ha preparado para incluir un sitio de escisión sensible a proteasa, la proteína de fusión puede tratarse con la proteasa para escindir el sitio específico de proteasa y liberar la enzima de veneno de Polistinae.

En una realización particular de la presente invención, tales enzimas de veneno de Polistinae recombinantes incluyen, pero con toda certeza no se limitan a las que contienen, como secuencia de aminoácidos primaria, todo o parte de la secuencia de aminoácidos substancialmente representada en las figuras 1 (SEC ID Nº: 2) o 4 (SEC ID Nº: 4), así como fragmentos y otros derivados y análogos de la misma.

Derivados y Análogos de Enzimas de Veneno de Polistinae

La invención además se refiere a derivados y análogos de enzimas de veneno de Polistinae. Dentro del alcance de la presente invención se incluye la producción y uso de derivados y análogos relacionados con enzimas de veneno de Polistinae. El derivado o análogo es inmunomodulador, es decir, capaz de modular una respuesta inmune específica de antígeno. Además, también pueden usarse análogos o derivados de enzimas de veneno de Polistinae, particularmente fosfolipasa e hialuronidasa de Polistes annularis, para tratar enfermedades o trastornos relacionados con el sistema inmune, o un síntoma asociado con los mismos. En otra realización, el derivado o análogo puede unirse a una inmunoglobulina específica de enzima de veneno de Polistinae, incluyendo IgG e IgE. Los derivados o análogos de enzima de veneno de Polistinae pueden ensayarse con respecto a la actividad inmunomoduladora deseada por procedimientos conocidos en la técnica, incluyendo pero sin limitación los ensayos descritos más adelante.

En particular, pueden obtenerse derivados de enzima de veneno de Polistinae alterando las secuencias de ácido nucleico de la invención por substituciones, adiciones o deleciones. Debido a la degeneración de las secuencias codificantes de nucleótidos, en la práctica de la presente invención pueden usarse otras secuencias de ADN que codifiquen substancialmente la misma secuencia de aminoácidos que un ácido nucleico que codifica una enzima de veneno de Polistinae. Éstas incluyen, pero sin limitación, secuencias de nucleótidos que comprenden todo o partes de un gen que codifica la enzima de veneno de Polistinae que están alteradas por la substitución de diferentes codones que codifican el mismo resto aminoacídico dentro de la secuencia, produciendo de esta manera un cambio silencioso. De forma similar, los derivados de la invención incluyen, pero sin limitación, los que contienen, como secuencia de aminoácidos primaria, todo o parte de la secuencia de aminoácidos de una enzima de veneno de Polistinae, incluyendo secuencias alteradas en las que restos de la secuencia se han substituido por estos aminoacídicos funcionalmente equivalentes dando como resultado una substitución de aminoácidos conservativa. Por ejemplo, uno o más restos aminoacídicos dentro de la secuencia pueden substituirse por otros aminoácidos de polaridad similar que actúan como equivalentes funcionales, dando como resultado una alteración silenciosa. Los substitutos de un aminoácido dentro de la secuencia pueden seleccionarse entre otros miembros de la clase a la que pertenece el aminoácido. Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina. Los aminoácidos polares neutros incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina. Los aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina. Los aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido
glutámico.

Los derivados o análogos de enzima de veneno de Polistinae incluyen, pero sin limitación, los que son substancialmente homólogos a una enzima de veneno de Polistinae o fragmentos de la misma, o aquellos cuyo ácido nucleico codificante es capaz de hibridar con una molécula de ácido nucleico que codifica una enzima de veneno de Polistinae. La hibridación puede realizarse en condiciones de moderadamente rigurosas a muy rigurosas, dependiendo del grado de similitud de secuencia, como es bien conocido en la técnica.

Los derivados y análogos de la invención pueden producirse por diversos métodos conocidos en la técnica. Las manipulaciones que tienen como resultado su producción pueden realizarse a nivel del gen o de la proteína. Por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico de la enzima de veneno de Polistinae clonada puede modificarse por cualquiera de numerosas estrategias conocidas en la técnica (Maniatis, T., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York). La secuencia puede escindirse en sitios apropiados con endonucleasas de restricción, seguido de una modificación enzimática adicional, si se desea, aislamiento y unión in vitro. En la producción del gen que codifica un derivado o análogo de una enzima de veneno de Polistinae, debe tenerse cuidado de asegurarse de que el gen modificado permanece dentro de la misma fase de lectura de traducción que la enzima de veneno de Polistinae, sin interrupción por señales stop de la traducción.

Además, el gen que codifica una enzima de veneno de Polistinae puede mutarse in vitro o in vivo, para crear y/o destruir las secuencias de traducción, iniciación y/o terminación, para crear variaciones en regiones codificantes y/o formar nuevos sitios de endonucleasas de restricción o destruir los preexistentes, o para facilitar la modificación adicional in vitro. Puede usarse cualquier técnica para mutagénesis conocida en la técnica, incluyendo, pero sin limitación, mutagénesis de localización dirigida in vitro (Hutchinson, C., et al., 1978, J. Biol. Chem. 253:6551; Zoller y Smith, 1984, DNA 3:479-488; Oliphant et al., 1978, Gene 44:177; Hutchinson et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 83:710), uso de enlazadores TAB® (Pharmacia), etc. Se prefieren las técnicas de PCR para mutagénesis de localización dirigida (véase Higuchi, 1989, "Using PCR to Engineer DNA", en PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H. Erlich, ed., Stockton Press, Capítulo 6, pág. 61-70).

También pueden realizarse manipulaciones de la enzima de veneno de Polistinae recombinante a nivel de la proteína. Dentro del alcance de la invención se incluyen fragmentos de enzima de veneno de Polistinae recombinante u otros derivados o análogos que se modifican de diferente forma durante o después de la traducción, por ejemplo, por glicosilación, acetilación, fosforilación, amidación, reducción y carboximetilación, derivatización por grupos protectores/bloqueantes conocidos, escisión proteolítica, unión a una molécula de anticuerpo o a otro ligando celular, etc. Puede realizarse cualquiera de numerosas modificaciones químicas por técnicas conocidas, incluyendo pero sin limitación escisión química específica por bromuro de cianógeno, tripsina, quimotripsina, papaína, proteasa de V8, NaBH_{4}; acetilación, formilación, oxidación, reducción; síntesis metabólica en presencia de tunicamicina; etc.

En una realización particular, la enzima de veneno de Polistinae o su fragmento inmunomodulador se expresa en un sistema de expresión de células de insecto, por ejemplo usando un vector de expresión de baculovirus. Como se ha indicado anteriormente, esto debe producir una glicosilación y estructura "nativa", particularmente la estructura secundaria y terciaria, del polipéptido expresado. La glicosilación y estructura nativa del polipéptido expresado puede ser muy importante para usos de diagnóstico, ya que los anticuerpos específicos de enzima detectados en ensayos de diagnóstico serán específicos para la enzima nativa, es decir, introducida por una picadura de un véspido.

Ensayos de Actividad con Péptidos de la Invención

En inmunología se conocen numerosos ensayos para evaluar la actividad inmunomoduladora de un antígeno. Por ejemplo, en ensayos de diagnóstico para enfermedades alérgicas, que se describen con detalle más adelante, pueden usarse las enzimas de veneno de Polistinae producidas por expresión de las moléculas de ácido nucleico de la invención. En general, tales proteínas pueden ensayarse con respecto a la capacidad de unirse a anticuerpos específicos para la enzima. Preferiblemente, tales anticuerpos que se detectan en el ensayo de diagnóstico son de la clase IgE. Sin embargo, es importante indicar que se han encontrado anticuerpos específicos de alergeno naturales que se unen débilmente a alergenos de veneno de véspido desnaturalizados. Las enzimas de veneno de Polistinae producidas en sistemas de expresión eucarióticos, y particularmente sistemas de expresión de células de insecto, pueden tener la estructura correcta para la unión de anticuerpos. Las enzimas de veneno de Polistinae expresadas en sistema de expresión bacterianos pueden no tener esta estructura y, de esta manera, requerirían el replegamiento antes del uso en un ensayo de diagnóstico para la unión de anticuerpos.

En otra realización, las proteínas de la invención pueden ensayarse en un ensayo de proliferación para respuestas de células T. Para tales ensayos de respuestas de células T, el sistema de expresión usado para producir la enzima no parece afectar a la actividad inmunomoduladora de la proteína. En general, se obtienen linfocitos de un hospedador sensibilizado. El hospedador puede ser un ratón que se ha inmunizado con una enzima de veneno de Polistinae, tal como una fosfolipasa de veneno de Polistinae que se ha producido de forma recombinante de acuerdo con la presente invención.

En una realización preferida, se obtienen leucocitos de sangre periférica a partir de un ser humano que es sensible a veneno de véspido. Usando técnicas que son bien conocidas en la técnica, puede medirse in vitro la respuesta de linfocitos T a la proteína. En una realización específica, infra, las respuestas de células T se detectan midiendo la incorporación de ^{3}H-timidina, que aumenta con la síntesis de ADN asociada con la proliferación.

La proliferación celular también puede detectarse usando un ensayo MTT (Mossman, 1983, J. Immunol. Methods 65:55-63; Niks y Otto, 1990, J. Immunol. Methods 130:140-151). Con la enzima de Polistinae producida de acuerdo con la presente invención puede usarse cualquier método para detectar la proliferación de células T, conocido en la técnica.

De forma similar, pueden ponerse en práctica ensayos de producción de linfoquinas de acuerdo con la presente invención. En una realización, la producción de linfoquinas puede ensayarse usando ensayos inmunológicos o de co-estimulación (véase, por ejemplo, Fehlner et al., 1991, J. Immunol. 146:799) o usando la técnica ELISPOT
(Czerkinsky, et al., 1988, J. Immunol. Methods 110:29). Como alternativa, puede detectarse el ARNm para linfoquinas, por ejemplo, por amplificación (véase Brenner, et al., 1989, Biotechniques 7:1096) o hibridación in situ (véase, por ejemplo, Kasaian y Biron, 1989, J. Immunol. 142:1287). Son de un interés particular los individuos cuyas células T producen linfoquinas asociadas con sucesos de cambio de isotipo de IgE, por ejemplo, IL-4 e IL-5 (Purkeson e
Isakson, 1992, J. Exp. Med. 175:973-982). También son de interés los fragmentos polipeptídicos de la enzima de veneno de Polistinae que contienen epítopos reconocidos por células T implicadas en sucesos de cambio de IgE.

De esta manera, en un aspecto preferido, las proteínas producidas de acuerdo con la presente invención pueden usarse en ensayos in vitro con linfocitos de sangre periférica o, más preferiblemente, líneas celulares derivadas de linfocitos de sangre periférica, obtenidas a partir de individuos sensibles a enzimas de veneno de véspido para detectar la secreción de linfoquinas asociadas normalmente con respuestas alérgicas, por ejemplo, IL-4. Tales ensayos pueden indicar el componente o componentes del veneno que son responsables del estado alérgico. Lo que es más importante, pueden ensayarse los fragmentos de la enzima de veneno de Polistinae. De esta manera, pueden identificarse epítopos específicos responsables de respuestas de células T asociadas con respuestas alérgicas. Las secuencias de tales epítopos pueden compararse con otras enzimas de veneno de véspido y con proteínas ambientales o autólogas para determinar si hay similitudes de secuencia que sugieran una posible reactividad cruzada. Los péptidos pueden ensayarse con respecto a la capacidad de inducir anergia de células T, por ejemplo, por la administración de megadosis, modificación para producir un antagonista de epítopo, administración en ausencia de las señales coestimuladoras apropiadas, y otros métodos que se considera que producen anergia de células T. Los péptidos que contienen tales epítopos son candidatos ideales como agentes terapéuticos.

En otra realización, los polipéptidos de la invención pueden usarse directamente en ensayos para detectar el grado de reactividad cruzada con otras proteínas ambientales y/o proteínas homólogas, con las que comparten similitud de secuencia. En particular, los fragmentos de las enzimas de veneno de Polistinae que tienen similitud de secuencia con tales proteínas ambientales y, más particularmente, homólogas pueden evaluarse con respecto a la reactividad cruzada con anticuerpos o células T específicas para tales proteínas. En una realización específica, puede evaluarse la reactividad cruzada de fosfolipasas de veneno de Polistinae con lipasas humanas.

Usos de Diagnósticos y Terapéuticos de los Polipéptidos de Enzima de Veneno de Polistinae

La presente invención proporciona una fuente abundante de una enzima de veneno de Polistinae pura, o fragmentos, derivados o análogos de la misma, producida por técnicas recombinantes. Como alternativa, dada la información de secuencia proporcionada por la presente invención, ventajosamente pueden producirse fragmentos polipeptídicos, derivados o análogos de las enzimas de veneno de Polistinae por síntesis de péptidos.

La invención contempla el uso de enzimas de veneno de Polistinae, o fragmentos inmunomoduladores, derivados o análogos de las mismas para la preparación de composiciones de diagnóstico o terapéuticas para uso en el diagnóstico y terapia de afecciones alérgicas específicas de alergeno de veneno de véspido, en el tratamiento de afecciones alérgicas específicas de alergeno de veneno de véspido, en el tratamiento de afecciones relacionadas con el sistema inmune y en la modulación de la respuesta inmune en un mamífero contra un inmunógeno. En particular, se contempla la fosfolipasa de Polistes, más particularmente la fosfolipasa A_{1} de Pol a, o fragmentos inmunomoduladores, derivados o análogos de fosfolipasa, para uso en el diagnóstico, terapia, tratamiento y modulación de la respuesta inmune de acuerdo con la presente invención.

Métodos de Diagnóstico

Como se usa en este documento, el término diagnóstico incluye ensayos de diagnóstico in vitro e in vivo. En general, tales ensayos están diseñados para medir la actividad de anticuerpos IgE específicos para un alergeno dado. Tales ensayos de diagnóstico dependen en gran medida de la disponibilidad del alergeno puro. Esto ocurre especialmente para determinar la sensibilidad a un componente alergeno específico de un veneno de véspido. Los ensayos de diagnóstico in vitro para la sensibilidad enzimática incluyen radioinmunoensayo (RIA), inmunoensayo inmunorradiométrico (IRMA), ensayos de radio-alergosorbente (RAST), ensayo de inmunoabsorbente unido a enzima (ELISA), ELISPOT, ensayo de alergosorbente magnético, inmunotransferencias, ensayos de liberación de histamina y similares.

En otra realización, la presente invención proporciona la determinación de la presencia de epítopos que son predominantemente reactivos con anticuerpos IgE, o con otros isotipos, por ejemplo IgG. Tales epítopos pueden solapar o ser distintos. En particular, pueden usarse fragmentos de las enzimas de veneno de Polistinae de la invención para identificar tales epítopos de células B específicos. La identificación de epítopos específicos puede proporcionar una base para desarrollar terapias, como se describe más adelante.

La presente invención contempla ensayos de diagnóstico in vitro sobre linfocitos de sangre periférica, como se ha descrito anteriormente. Tales ensayos de diagnóstico pueden proporcionar información detallada sobre las respuestas de células T específicas de enzima, el fenotipo de la respuesta de células T, y preferiblemente el epítopo de células T de la enzima implicada en la respuesta de células T. Puede detectarse el epítopo inmunodominante y el epítopo implicado en sucesos de cambio de clase de isotipo de IgE, si no son iguales. En particular, pueden identificarse los epítopos de células T de enzimas de veneno de Polistinae que estimulan la proliferación y/o secreción de linfoquinas de células T de un fenotipo asociado con sucesos de cambio de clase de isotipo de IgE para un individuo específico, o para una clase de individuos que comparten haplotipo de MHC, una expresión de región variable del receptor de células T predominante, o ambas cosas.

Los ensayos in vivo de alergenicidad generalmente constan de ensayos de sensibilidad a picaduras en la piel, en los que se administran cantidades diluidas en serie de un alergeno por vía subcutánea o intradérmica en la piel de un paciente, y se detectan las reacciones de cerco y eritema. Como ocurre con los ensayos in vitro, la disponibilidad de la enzima de veneno pura aumenta en gran medida el valor de los resultados de los ensayos de diagnóstico in vivo, ya que puede evitarse la reactividad cruzada con impurezas en extractos preparados a partir de sacos de veneno de véspidos.

Métodos Terapéuticos

Las composiciones terapéuticas de la invención (véase más adelante) pueden usarse en inmunoterapia, también denominada terapia de hiposensibilización. La inmunoterapia ha resultado eficaz en enfermedades alérgicas, particularmente alergias a insectos. Los alergenos se administran por vía parenteral durante un largo periodo de tiempo en dosis crecientes gradualmente. Tal terapia puede ser particularmente eficaz cuando el alergeno o alergenos a los que es sensible el paciente se han identificado específicamente y se ha dirigido la terapia contra esos alergenos. De esta manera, la disponibilidad de enzima de veneno de Polistinae pura en grandes cantidades es importante para la inmunoterapia de las alergias.

En otra realización, la presente invención contempla el uso de polipéptidos que comprenden al menos un epítopo de células T inmunomodulador de una enzima de veneno de Polistinae para inducir alergia de células T específica a una enzima de veneno de véspido. La identificación de tales péptidos se ha descrito anteriormente. Más preferiblemente, puede administrarse a un paciente un péptido que comprende tal epítopo de células T y que carece de un epítopo de células B. La presencia de epítopos de células B en un alergeno puede producir una reacción sistémica indeseable cuando se usa el alergeno para inmunoterapia. De esta manera, una ventaja particular de la invención es la capacidad de proporcionar polipéptidos de alergeno que no produzcan efectos sistémicos indeseables.

En una realización, pueden inyectarse por vía subcutánea uno o más fragmentos polipeptídicos para reducir la respuesta de células T a la molécula entera, por ejemplo, como se describe por Brine et al. (1993, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 90:7608-12).

En otra realización, pueden administrarse uno o más fragmentos polipeptídicos por vía intranasal para reprimir respuestas específicas de alergeno en sujetos no tratados anteriormente y sensibilizados (véase, por ejemplo, Hoyne et al., 1993, J. Exp. Med. 178:1783-88).

Es de esperar que la administración de un péptido de enzima de veneno de Polistinae de la invención induzca anergia, dando como resultado el cese de la producción de anticuerpos específicos de alergeno o de respuesta de células T específica de alergeno, o ambas cosas, y por lo tanto tiene un efecto terapéutico.

En un aspecto preferido de la invención, la terapia basada en péptidos para inducir anergia de células T se adapta a cada individuo o grupo de individuos. Usando los métodos de diagnóstico de la presente invención, pueden identificarse el epítopo o epítopos de células T específicos de una enzima de veneno de véspido implicada en la respuesta alérgica. Después pueden usarse péptidos que comprenden estos epítopos en un régimen de inmunoterapia individuali-
zado.

Tratamiento de Enfermedades o Trastornos Relacionados con el Sistema Inmune, o de un Síntoma Relacionado con los Mismos

Como se ha explicado anteriormente, la presente invención se refiere a polipéptidos para tratar enfermedades o trastornos relacionados con el sistema inmune, o para modular la respuesta inmune en un mamífero hacia un inmunógeno, donde los polipéptidos se codifican por moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican enzimas de veneno de Polistinae, tales como fosfolipasa A_{1} de Polistes annularis, por nombrar sólo algunas. En particular, los componentes del veneno de véspidos, particularmente la fosfolipasa y la hialuronidasa, tienen aplicaciones en la modulación de la respuesta inmune de un sujeto a diversos inmunógenos, tales como patógenos y virus, por nombrar sólo algunos. En una realización particular, ciertos componentes de un veneno de Polistinae, y particularmente la fosfolipasa A_{1} de Polistes annularis y variantes conservadas de la misma, fragmentos de la misma o análogos o derivados de la misma modulan el sistema inmune de un sujeto para que tenga mayor capacidad de combatir patógenos y virus incluyendo, pero sin limitación, VIH, virus herpes simplex o papilomavirus. En una realización específica, tal método comprende administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un composición farmacéutica que comprende un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de ADN de la SEC ID Nº: 1, variantes degeneradas de la misma, fragmentos de la misma, o análogos o derivados de la misma, o una molécula de ácido nucleico aislada hibridable con la misma, donde el polipéptido comprende una porción antigénica de un epítopo de células B o una porción inmunomoduladora de un epítopo de células T de la fosfolipasa A_{1} de Polistes annularis.

Además, se ha descubierto que ciertos componentes del veneno de Polistinae, tales como la fosfolipasa A_{1} de Polistes annularis, por nombrar sólo algunos, también tienen aplicaciones en el tratamiento de una enfermedad o trastorno relacionado con el sistema inmune, o un síntoma asociado con dicha enfermedad o trastorno. Como se usa en este documento, la frase "enfermedad o trastorno relacionado con el sistema inmune" se refiere a una enfermedad o trastorno que provoca una respuesta inmune en un sujeto o afecta a la capacidad del sistema inmune de responder a un inmunógeno. Los ejemplos de enfermedades o trastornos relacionados con el sistema inmune que pueden tratarse con agentes y composiciones farmacéuticas de la invención incluyen, pero sin limitación, una enfermedad o trastorno patogénico; una enfermedad o trastorno viral, por ejemplo VIH, virus herpes simplex o papilomavirus; o una enfermedad autoinmune, por ejemplo artritis o lupus. Por lo tanto, la presente invención incluye agentes para tratar una enfermedad o trastorno relacionado con el sistema inmune, o un síntoma relacionado con dicha enfermedad o trastorno, que comprenden en una realización específica un polipéptido aislado codificado por una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de ADN de la SEC ID Nº: 1, variantes degeneradas de la misma, fragmentos de la misma o análogos o derivados de la misma, donde el polipéptido aislado comprende una porción inmunomoduladora de un epítopo de células T o una porción antigénica de un epítopo de células B de la fosfolipasa A_{1} de Polistes annularis.

Por lo tanto, naturalmente, la presente invención incluye composiciones farmacéuticas para tratar una enfermedad o trastorno relacionado con el sistema inmune, que comprende una enzima de veneno de Polistinae, variantes degeneradas de la misma, fragmentos de la misma o análogos o derivados de la misma. Además, la composición farmacéutica de la presente invención es para tratar una enfermedad o trastorno relacionado con el sistema inmune, o un síntoma relacionado con el mismo, y comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica para tratar una enfermedad o trastorno relacionado con el sistema inmune en un sujeto. La frase "cantidad terapéuticamente eficaz" se usa en este documento para hacer referencia a una cantidad suficiente para tratar, y preferiblemente aumentar al menos aproximadamente un 30%, más preferiblemente al menos un 50%, y aún más preferiblemente al menos un 90%, la capacidad del sistema inmune de un sujeto para combatir eficazmente un inmunógeno. Cuando se realicen estudios adicionales, aparecerá más información en relación con los niveles de dosificación apropiados para la modulación de la respuesta del sistema inmune hacia un inmunógeno en diversos pacientes, y el trabajador especialista habitual, considerando el contexto terapéutico, la edad y el estado de salud general del receptor, podrá averiguar la dosificación apropiada. La administración puede ser de la proteína o de un vector de terapia génica. Por lo tanto, por ejemplo, si la enfermedad o trastorno relacionado con el sistema inmune implica VIH, un cambio clínicamente significativo, por ejemplo, implicaría un aumento en el recuento de glóbulos blancos en un sujeto al que se le administra una composición farmacéutica de la invención con respecto al recuento de glóbulos blancos antes de la administración. Al especialista habitual en la técnica se le ocurrirán fácilmente otros ejemplos de control de un cambio clínicamente significativo en un sujeto. Además, cuando se realicen otros estudios, aparecerá información con respecto a los niveles de dosificación apropiados para tratar una enfermedad o trastorno relacionado con el sistema inmune, o un síntoma relacionado con el mismo en diversos pacientes, y el especialista habitual, considerando el contexto terapéutico, la edad y el estado de salud general del receptor, podrá averiguar la dosificación apropiada. Más adelante se describen ejemplos de composiciones farmacéuticamente aceptables.

Composiciones Farmacéuticamente Aceptables

Las composiciones de diagnóstico o terapéuticas in vivo de la invención también pueden contener vehículos, excipientes, diluyentes y adyuvantes farmacéuticamente aceptables y apropiados. Como se usa en este documento, la frase "farmacéuticamente aceptable" preferiblemente significa aprobado por una agencia reguladora de un gobierno, en particular el gobierno federal o un gobierno estatal, o indicado en la Farmacopea de Estados Unidos u otra farmacopea reconocida generalmente para uso en animales, y más particularmente en seres humanos. Se describen vehículos farmacéuticos adecuados en "Remington's Pharmaceutical Sciences" de E.W. Martin.

Tales vehículos farmacéuticamente aceptables pueden ser líquidos estériles tales como agua y aceites, incluyendo los de petróleo, los de origen animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. El agua es un vehículo preferido cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. También pueden emplearse soluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol como vehículos líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen manitol, albúmina de suero humano (HSA), almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, carbonato cálcico, gel de sílice, carbonato de magnesio, estearato de magnesio, estearato sódico, monoestearato de glicerol, talco, cloruro sódico, leche desnatada deshidratada, glicerol, propilenglicol, agua, etanol y similares. Estas composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida y similares.

Tales composiciones contendrán una cantidad de diagnóstico o terapéutica eficaz del compuesto activo junto con una cantidad adecuada de vehículo para proporcionar la forma para la administración apropiada al paciente. Aunque la inyección intravenosa en una forma muy eficaz de administración, pueden emplearse otros modos, tales como por inyección o por administración oral, nasal o parenteral.

La invención se esclarecerá adicionalmente por medio de los siguientes ejemplos, que pretenden ser simplemente ilustrativos de la invención.

Ejemplo 1 Fosfolipasa de avispa de papel

Basándose, en parte, en los métodos y la descripción de la Patente de Estados Unidos Nº 5.593.877, se obtuvieron ácidos nucleicos que codificaban la fosfolipasa de Pol a (avispa de papel). Sin embargo, sorprendentemente, estos ácidos nucleicos incluyen secuencias internas que no codifican una secuencia de aminoácidos considerada esperada en la proteína nativa. Aunque los ácidos nucleicos descritos en este ejemplo son ADNc, y no son genómicos, parecen incluir "intrones".

Materiales y métodos

Los métodos usados son los mismos que se han descrito en la Patente de Estados Unidos Nº 5.593.877 usando RACE.

Resultados

Cuando se examinó el ADNc de la fosfolipasa A_{1} de la avispa de papel producido con RACE, se observó que su longitud era mayor de lo necesario para codificar la proteína fosfolipasa A_{1} de la avispa de papel. Se descubrió que, sorprendentemente, esta mayor longitud era el resultado de los intrones incorporados en el ADNc de la fosfolipasa A_{1} de la avispa de papel. Tal descubrimiento era inesperado en vista de los estudios realizados sobre los ADNc de otros venenos de véspido, que invariablemente no contienen ningún intrón. Por ejemplo, los ADNc de la fosfolipasa de véspulas y avispones no contienen tales intrones.

Debido a esta diferencia importante imprevista entre el ADNc de la fosfolipasa A_{1} de la avispa de papel y otros ADNc de fosfolipasas de veneno de véspidos, se requirieron biotécnicas y etapas especiales para aislar el ADNc de la fosfolipasa A_{1} de la avispa de papel, que no se necesitaban para obtener el ADNc de las fosfolipasas de veneno de otros véspidos, tales como avispón y véspula. En particular, para aislar la secuencia de ADNc que codifica la fosfolipasa A_{1} para la avispa de papel, fue necesario determinar el tamaño y la localización y número de los intrones.

Usando la secuencia de aminoácidos obtenida a partir de la degradación con bromuro de cianógeno de la fosfolipasa A_{1} de la avispa de papel, el código genético, y la secuencia de nucleótidos del ADNc de la fosfolipasa de la avispa obtenido por el protocolo RACE, se descubrieron dos intrones. El primer intrón, denominado en lo sucesivo "intrón 1 de papla" comprende una secuencia de nucleótidos como la indicada en la SEC ID Nº: 5 (figura 2A). El intrón 1 de papla comprende 114 nucleótidos y normalmente está localizado entre los nucleótidos 111 y 112 de la secuencia de ADNc que codifica la fosfolipasa A_{1}, indicada en la SEC ID Nº: 1.

También se descubrió un segundo intrón, denominado en lo sucesivo "intrón 2 de papla". Este intrón comprende una secuencia de nucleótidos como la indicada en la SEC ID Nº: 6 (figura 2B). El intrón 2 de papla contiene 127 nucleótidos y normalmente está localizado entre los nucleótidos 720 y 721 de la SEC ID Nº: 1.

Para aislar la secuencia de ADNc que codificaba la fosfolipasa A_{1} de la avispa de papel (SEC ID Nº:1), estos intrones tenían que retirarse del ADNc de la fosfolipasa A_{1} de la avispa de papel obtenida por RACE sin alterar la fase de lectura de los nucleótidos codificantes. Esencialmente, el ADNc de la fosfolipasa A_{1} de la avispa de papel tuvo que rediseñarse de forma que sólo se incluyeran nucleótidos codificantes. Este proceso de rediseño fue técnicamente muy difícil porque, si se retirara accidentalmente un nucleótido codificante junto con un intrón, o si no se retirara un nucleótido no codificante, se produciría un cambio en la fase de lectura que daría como resultado mutaciones y produciría la terminación prematura de la expresión del ADNc.

En este proceso de rediseño, se sintetizaron químicamente oligonucleótidos diseñados especialmente, cada uno complementario a nucleótidos codificantes localizados en posición 5' y 3' de uno de los intrones. El ADNc de la fosfolipasa A_{1} de avispa de papel amplificado obtenido por RACE después se clonó en un plásmido de un auto-replicación. Este plásmido se desnaturalizó y, en condiciones de baja rigurosidad, se permitió que los oligonucleótidos hibridaran con el ADNc de la fosfolipasa A_{1} de avispa de papel dejando los intrones de una sola cadena. Estos oligonucleótidos después sirvieron como cebadores para la síntesis de ADN, que generó un plásmido bicatenario donde se delecionaron los intrones de una de las cadenas. Después se transfectó una célula con el plásmido usando métodos descritos anteriormente y después se clonó la célula. Como una de las dos cadenas de ADN del plásmido original tenía los intrones delecionados, la mitad de las células transfectadas contenían un plásmido bicatenario en el que se habían eliminado los intrones. Las células clonadas después se seleccionaron para aislar las células que tenían el plásmido que comprendía el ADNc de la avispa de papel que contenía una secuencia de ADN de la SEC ID Nº: 9 (sin intrones). Después se aislaron copias del plásmido particular y se secuenciaron para confirmar la deleción de los intrones. Después se retiró el ADNc de la fosfolipasa A_{1} de la avispa de papel rediseñado del plásmido particular, se secuenció, se amplificó y se clonó en un vector de expresión, usando los procedimientos descritos en el ejemplo 1 y en la Solicitud con el Número de Serie 08/474.853 y en la Patente de Estados Unidos Nº 5.593.877, que se incorporan en este documento como referencia en su totalidad.

Se realizó una comparación de la secuencia de aminoácidos deducida de la fosfolipasa A_{1} de la avispa de papel (SEC ID Nº: 2) con otras fosfolipasas de veneno de véspidos. En particular, la SEC ID Nº: 2 se comparó con la fosfolipasa del avispón de cara blanca (D. maculata) (SEC ID Nº: 7) y la fosfolipasa de véspula (V. vulgaris) (SEC ID Nº: 8). Los resultados de esta comparación de secuencias se muestran en la figura 3.

Ejemplo 2 Hialuronidasa de avispa de papel

Usando los procedimientos descritos en la Patente de Estados Unidos Nº 5.593.877 se aislaron la secuencia de ADNc codificante de la hialuronidasa de la avispa de papel (Pol a) (SEC ID Nº: 3) y su secuencia de aminoácidos correspondiente (SEC ID Nº: 4) y se indican en la figura 4. Los nucleótidos 449 a 536 de la SEC ID Nº: 3 codifican una porción de una secuencia señal. Por lo tanto, el resto aminoacídico en el extremo N de la hialuronidasa de Pol a madura es serina, que se codifica por los nucleótidos 536, 537 y 538.

Sorprendentemente, el ADNc de la hialuronidasa de la avispa de papel producido por el protocolo RACE indicado anteriormente tuvo una longitud mayor que la necesaria para codificar la proteína hialuronidasa de Pol a. Por lo tanto, se concluyó que el ADNc de la hialuronidasa de la avispa de papel contenía al menos un intrón. La presencia de al menos un intrón dentro del ADNc de la hialuronidasa de la avispa era inesperada a la luz de los estudios sobre el ADNc de la hialuronidasa de otros venenos de véspido, tales como véspula y avispón, que no contienen intrones. Como resultado, se requirieron biotécnicas especiales similares a las empleadas para aislar el ADNc de la fosfolipasa A_{1} de la avispa de papel e indicadas en el ejemplo 3 presentado anteriormente, para aislar el ADNc que codificaba la secuencia de la hialuronidasa de la avispa de papel.

Inicialmente, se realizó una determinación en cuanto a la localización y tamaño de los intrones dentro del ADNc de la hialuronidasa de la avispa de papel. Una vez localizados los intrones, tuvieron que retirarse de tal forma que no alteraran ningún nucleótido codificante. Por lo tanto, como ocurre con el ADNc de la fosfolipasa A_{1} de la avispa de papel, fue necesario rediseñar el ADNc de la hialuronidasa de la avispa de papel de forma que sólo se incluyeran nucleótidos codificantes. Este proceso de rediseño fue técnicamente muy difícil porque, si accidentalmente se retirara un nucleótido codificante junto con un intrón, o si no se retirara un nucleótido no codificante, se colocaría un mutación de cambio de fase sin sentido en el ADNc de la hialuronidasa de avispa.

El ADNc que codifica la hialuronidasa de avispa de papel madura (SEC ID Nº: 3) se preparó usando un procedimiento similar al usado para aislar el ADNc que codifica la fosfolipasa A_{1} de la avispa de papel supra. Después se secuenció el ADNc sin intrones, se amplificó y se clonó en un vector de expresión, usando de nuevo los procedimientos descritos anteriormente.

Se descubrió que el ADNc de la hialuronidasa de la avispa de papel contenía un intrón. Este intrón, denominado en lo sucesivo "pahya", tiene una longitud de 94 nucleótidos, y tiene una secuencia de nucleótidos como la indicada en la SEC ID Nº: 9 (figura 5). Normalmente, este intrón se localiza entre los nucleótidos 733 y 734 de la SEC ID Nº: 3.

Se realizó una comparación de la secuencia de aminoácidos de la hialuronidasa de avispa de papel (SEC ID Nº: 4) con otras fosfolipasas de veneno de véspido. En particular, se comparó la SEC ID Nº: 4 con hialuronidasa de veneno de abeja (SEC ID Nº: 10), hialuronidasa de avispón de cara blanca (D. maculata) (SEC ID Nº: 11) e hialuronidasa de véspula (V. vulgaris) (SEC ID Nº: 12). Los resultados de esta comparación de secuencias se muestran en la figura 15.

<110> King, Te Piao

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<120> CLONACIÓN Y PRODUCCIÓN RECOMBINANTE DE ENZIMAS DE VENENO DE VÉSPIDO, TALES COMO FOSFOLIPASA E HIALURONIDASA, Y TERAPIAS INMUNOLÓGICAS BASADAS EN DICHAS ENZIMAS

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<130> 2313/2F138

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<140> No cedido

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<141> 1999-10-01

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<160> 12

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<170> FastSEQ para Windows Versión 3.0

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<210> 1

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<211> 1368

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<212> PRT

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<213> Polistes annularis

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<400> 1

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1

2

3

4

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<210> 2

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<211> 320

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<212> PRT

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<213> Polistes annularis

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<400>2

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5

6

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<210> 3

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<211> 0

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<212> PRT

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<213> Polistes annularis

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<400>3

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7

8

9

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<210> 4

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<211> 367

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<212> PRT

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<213> Polistes annularis

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<400>4

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10

11

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<210> 5

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<211> 114

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<212> ADN

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<213> Polistes annularis

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<400> 5

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12

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<210> 6

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<211> 127

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<212> ADN

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<213> Polistes annularis

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<400> 6

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13

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<210> 7

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<211> 317

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<212> PRT

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<213> Dolichovespula maculata

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<400> 7

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14

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<210> 8

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<211> 300

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<212> PRT

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<213> Vespula vulgaris

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<400>8

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15

16

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<210> 9

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<211> 94

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<212> ADN

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<213> Polistes annularis

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<400> 9

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17

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<210> 10

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<211> 343

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<212> PRT

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<213> Apis melliferis

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<400> 10

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18

19

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<210> 11

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<211> 331

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<212> PRT

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<213> Dolichovespula maculata

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<400> 11

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20

21

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<210> 12

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<211> 331

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<212> PRT

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<213> Vespula vulgaris

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<400> 12

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22

23

Claims

1. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una fosfolipasa A_{1} de veneno de Polistinae que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2, o un fragmento inmunomodulador de la misma, donde dicha molécula de ácido nucleico es adecuada para la expresión de una forma madura de dicha fosfolipasa.

2. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1, que comprende la secuencia de ADN de la SEC ID Nº: 1 o un fragmento de la misma.

3. Una molécula de ácido nucleico aislada que es hibridable con la molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 2, que consta de la secuencia de ADN de la SEC ID Nº: 1 en condiciones de hibridación muy rigurosas que corresponden a una T_{m} mayor o igual a aproximadamente 65ºC.

4. Un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico aislada de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, asociada operativamente con un promotor.

5. Una célula que comprende el vector de expresión de la reivindicación 4.

6. Un método para producir una fosfolipasa de veneno de Polistinae recombinante o un fragmento inmunomodulador de la misma, que comprende:

a) cultivar una célula de la reivindicación 5 de forma que se produzca por la célula la fosfolipasa o el fragmento inmunomodulador de la misma; y

b) recuperar la fosfolipasa o el fragmento inmunomodulador de la misma, producido de esta manera a partir del cultivo, la célula o ambas cosas.

7. Una fosfolipasa de veneno de Polistinae recombinante o un fragmento inmunomodulador de la misma, codificada por la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

8. Una fosfolipasa de veneno de Polistinae recombinante o un fragmento inmunomodulador de la misma, codificada por la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 7, que es una proteína de fusión.

9. La fosfolipasa recombinante o el fragmento inmunomodulador de la misma de las reivindicaciones 7 u 8, expresada por una célula bacteriana o de levadura.

10. La proteína de fusión de la reivindicación 8, donde dicha fosfolipasa de veneno de Polistinae o fragmento inmunomodulador de la misma se fusiona a través de un enlace peptídico con al menos una porción funcionalmente activa de una enzima de veneno no procedente de Polistinae.

11. La proteína de fusión de la reivindicación 10, que comprende además un sitio de escisión para una proteasa específica.

12. La fosfolipasa recombinante, o fragmento inmunomodulador de la misma, de la reivindicación 8, que comprende una secuencia de polihistidina.

13. Una composición farmacéutica para modular una respuesta inmune hacia un inmunógeno en un mamífero, que comprende la fosfolipasa recombinante o el fragmento inmunomodulador de la misma, de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

14. Uso de la fosfolipasa recombinante o de un fragmento inmunomodulador de la misma de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, en la fabricación de un medicamento para modular una respuesta inmune hacia un inmunógeno en un mamífero.

15. La composición de la reivindicación 13 o el uso de la reivindicación 14, donde la respuesta inmune es una afección alérgica específica de alergeno de veneno de véspido.

16. La composición o uso de la reivindicación 15, donde el alergeno de veneno de véspido es fosfolipasa.