JP2002525107A

JP2002525107A - Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素（例えば、ホスホリパーゼおよびヒアルロニダーゼ）のクローニングおよび組換え産生、ならびにそれらに基づく免疫学的治療

Info

Publication number: JP2002525107A
Application number: JP2000572343A
Authority: JP
Inventors: テピアオキング，
Original assignee: Rockefeller University
Current assignee: Rockefeller University
Priority date: 1998-10-01
Filing date: 1999-10-01
Publication date: 2002-08-13
Also published as: US6372471B1; AU760812B2; EP1117769A1; ATE292678T1; EP1528102B9; WO2000018896A1; EP1117769B1; US20040175393A1; DE69924628T2; AU6290699A; ATE346143T1; ES2280059T3; EP1528102B1; DK1528102T3; DE69924628D1; CA2344578A1; US6652851B1; US7060265B2; EP1528102A2; ES2239853T3

Abstract

(57)【要約】Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素の固有のクローン、組換え産生したＰｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素、および組換え酵素を使用する方法を提供する。特定の実施例において、Ｐｏｌｉｓｔｅｓａｎｎｕｌａｒｅｓ由来のホスホリパーゼおよびヒアルロニダーゼの両方のｃＤＮＡは、明白な「イントロン」配列を含む。なおさらなる実施態様において、遺伝子操作により、この「イントロン」配列の構築物から成熟Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素タンパク質の発現のために有用なコード配列を得ることを可能になる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の分野）本発明は、Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液アレルゲン、特にホスホリパーゼおよび
ヒアルロニダーゼのような酵素、またはそれらのフラグメント、このような核酸
分子を含む組換えベクター、ならびに宿主細胞含有組換えベクターをコードする
核酸に関する。本発明は、さらに、ホスホリパーゼもしくヒアルロニダーゼ、ま
たはその組換えフラグメントのような組換えＰｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素を産
生するために、このような核酸分子の発現に関する。このようなアレルゲンおよ
びそのフラグメントは、アレルギーの診断のため、アレルギーの治療的処置のた
め、免疫系に関連した疾患または障害、あるいはそれらに関連した症状の処置の
ため、および免疫源に対する免疫応答の調節のために有用である。

【０００２】（発明の背景）ハチおよびスズメバチ（ｖｅｓｐｉｄ）に対する昆虫刺アレルギー（ｉｎｓｅ
ｃｔｓｔｉｎｇａｌｌｅｒｇｙ）は、よくあることである。スズメバチとし
ては、ホーネット（ｈｏｒｎｅｔ）、イエロージャケット（ｙｅｌｌｏｗｊａ
ｃｋｅｔ）、およびワスプ（ｗａｓｐ）が挙げられる（Ｇｏｌｄｅｎら、１９８
９，Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．２６２：２４０）。感受性の人々は、些細な量
の毒液タンパク質に対する暴露に感作され得る；２〜１０μｇと同じくらい少な
いのタンパク質は、スズメバチによる単回の刺創において、皮膚に注入される（
ＨｏｆｆｍａｎおよびＪａｃｏｂｓｏｎ，１９８４，Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ．
５２：２７６）。

【０００３】北アメリカにおいて、ホーネット（Ｄｏｌｉｃｈｏｖｅｓｐｕｌａ属）、イエ
ロージャケット（Ｖｅｓｐｕｌａ属）、およびワスプ（Ｐｏｌｉｓｔｅｓ属）の
多くの種が存在する（Ａｋｒｅら、１９８０，「Ｙｅｌｌｏｗｊａｃｋｅｔｓ
ｏｆＡｍｅｒｉｃａＮｏｒｔｈｏｆＭｅｘｉｃｏ」，Ａｇｒｉｃｕｌｔ
ｕｒｅＨａｎｄｂｏｏｋ５５２号、ＵＳＤｅｐａｒｔｍｅｔｏｆＡｇ
ｌｉｃａｌｕｔｕｒｅ）。スズメバチは、類似の毒液組成物を有する（Ｋｉｎｇ
ら、１９８７，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１７：５１６５；Ｋｉｎｇら、１９
８３，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：２９７；Ｋｉｎｇら、１９８４，Ａｒｃ
ｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２３０：１；Ｋｉｎｇら、１９８５，Ｊ
．ＡｌｌｅｒｇｙａｎｄＣｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７５：６２１；Ｋｉｎ
ｇら、１９８７，Ｊ．ＡｌｌｅｒｇｙＣｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：１１
３；Ｈｏｆｆｍａｎ，１９８５，Ｊ．ＡｌｌｅｒｇｙａｎｄＣｌｉｎ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．７５：６１１）。それらの毒液は、以下の３つの主な毒液アレルゲ
ンをそれぞれ含む：ホスホリパーゼ（３７ｋＤ）、ヒアルロニダーゼ（４３ｋＤ
）、およびまだ生物学的機能が知られていない抗原５（２３ｋＤ）。米国特許第
５，５９３，８７７号は、スズメバチ毒液アレルゲンであるホスホリパーゼおよ
びヒアルロニダーゼの、クローニングおよび発現を記載する。この特許に記載さ
れるように、この組換えアレルゲンは、免疫治療、診断における用途のための、
そしてＴ細胞アレルゲンおよびＢ細胞アレルゲンの調査のためのそのタンパク質
またはフラグメントの発現を可能にし、スズメバチ毒液酵素をクローニングする
ための原理をより詳細に示す。しかし、固有のスズメバチ毒液ｃＤＮＡは、記載
されていない。

【０００４】上記の昆虫毒液アレルゲンに加えて、異なるイネ科草本（ｇｒａｓｓ）（Ｐｅ
ｒｅｚら、１９９０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１６２１０；Ａｎｓａ
ｒｉら、１９８９，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２６：８６６５；Ｓｉｌｖａｎ
ｏｖｉｃｈら、１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１２０４）、樹木
（ｔｒｅｅ）花粉（Ｂｒｅｉｔｅｎｅｄｅｒ，１９８９，ＥＭＢＯ．Ｊ．８：
１９３５；Ｖａｌｅｎｔａら、１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３：５５７）、
草（ｗｅｅｄ）花粉（Ｒａｆｉｎａｒら、１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２６６：１２２９；Ｇｒｉｆｆｉｔｈら、１９９１，Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌ
ｅｒｇｙＡｐｐｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９６：２９６）、ダニ（Ｃｈｕａら、１
９８８，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６７：１７５）、ネコ鱗屑（Ｇｒｉｆｆｉｔｈ
ら、１９９２，Ｇｅｎｅ．１１３：２６３）、およびカビ（Ａｒｕｄａら、１９
９０，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：１５２９；Ｈａｎら、１９９１，Ｊ．Ａｌ
ｌｅｒｇｙＣｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８７：３２７）由来のいくつかの主な
アレルゲンの完全アミノ酸配列が、過去数年の間に報告されている。これらの主
なアレルゲンは、１０〜４０ｋＤのタンパク質であり、これらは、広範な種々の
生物学的機能を有する。既知の配列のほとんど全てのアレルゲンは、我々の環境
における他のタンパク質と異なる程度の配列類似性を有する。

【０００５】米国特許第５，５９３，８７７号は、スズメバチ毒液酵素（特に、ヒアルロニ
ダーゼおよびホスホリパーゼ）のクローニングおよび発現を提供するが、このよ
うな酵素についての異常な配列および予期されない配列を同定し、そしてこれら
についての有効な発現系を設計する必要が残っている。ペイパーワスプ（ｐａｐ
ｅｒｗａｓｐ）（例えば、Ｐｏｌｉｓｔｅｓａｎｎｕｌａｒｉｓ）のＢ細胞
およびヘルパーＴ細胞のエピトープを描写する特別な必要性が存在する。特に、
主なＰｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液アレルゲンであるホスホリパーゼおよびヒアルロ
ニダーゼは、重要なＢ細胞およびＴ細胞のエピトープを決定するための適切な標
的である。スズメバチアレルゲンに対するアレルギー応答の基礎に完全に取り組
むため、およびアレルゲンに基づく免疫治療を開発するために、いくつかの同種
のアレルゲンのｃＤＮＡおよびタンパク質が、調査される必要がある。さらに、
スズメバチアレルゲンまたはそれらのフラグメントの、細菌細胞および真核動物
細胞における高レベルの発現に適するベクターを開発すべきである。次いで、組
換えスズメバチアレルゲンおよびそれらのフラグメントは、それらのＢ細胞およ
びＴ細胞のエピトープを、マウス系、ならびに、より重要なことに、ヒト系にお
いて、それぞれ、抗体結合試験およびＴ細胞増殖試験によってマッピングするた
めに用いられ得る。

【０００６】マウスにおける寛容の誘導およびヒトにおける寛容の誘導を研究するために、
スズメバチ毒液アレルゲンのＴ細胞またはＢ細胞のエピトープを有するペプチド
を用いる必要もまた当該分野において存在する。

【０００７】改変型ペプチドが、ＭＨＣクラスＩＩ分子に対するアレルゲンＴ細胞エピトー
プ結合を阻害するか、Ｔ細胞アレルギーを誘導するか、またはその両方であるか
どうかを試験する、さらなる必要が存在する。

【０００８】従って、アレルギーの免疫学的調査および免疫学的治療のために、スズメバチ
毒液アレルゲンについての固有の配列情報、ならびにこのようなアレルゲンの多
くの供給源の必要が当該分野に存在する。

【０００９】さらに、世界中での抗生物質の乱用ため、およびＨＩＶ、Ｅｂｏｌｌａなどの
無数のウイルスの伝播のために、新規の「超（ｓｕｐｅｒ）」抗生物質医薬品、
ならびにウイルスに対して活性を有する化合物を産生する努力がなされている。
例えば、ＡＺＴは、プロテアーゼインヒビターと共に、ＨＩＶに罹患している患
者を処置するために開発された。しかし、新規の「超」抗生物質および抗ウイル
ス医薬品の開発費用は、莫大である。

【００１０】それ故、必要とされるものは、免疫系に関連した疾患または障害を処置するた
めの薬剤および薬学的組成物である。それらの活性は、特定のウイルスまたは病
原体と闘うことに必ずしも依存せず、むしろ障害または障害と闘う免疫系の能力
を調節もしくは増強し、それによって疾患または障害、あるいはそれらに関連し
た症状を寛解する。膜翅目の毒液、特にスズメバチの毒液は、米国特許第４，８
２２，６０８号、および同第５，８２７，８２９号に記載されるように、このよ
うな薬剤および薬学的組成物についての、１つの可能な供給源を提供する。

【００１１】本明細書中の参考文献の引用は、このようなものが、本発明に対する先行技術
であることの承認として解釈されない。

【００１２】（発明の要旨）本発明は、Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素をコードする核酸分子、その免疫調
節性フラグメント、あるいはその誘導体またはアナログを提供する。特に、本発
明は、Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液ホスホリパーゼ、およびＰｏｌｉｓｔｉｎａｅ
毒液ヒアルロニダーゼをコードするこのような核酸に関する。特定の実施態様で
は、本発明の核酸分子は、Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素のＴ細胞エピトープの
免疫調節性部分をコードする。別の実施態様では、本発明の核酸分子は、Ｐｏｌ
ｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素のＢ細胞エピトープの抗原部分をコードする。

【００１３】ゲノムでない本発明の核酸は、驚いたことに、１つの実施態様では、非コード
（例えば、イントロン）配列を含むことが見出される。特定の実施態様では、Ｐ
ｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素のｃＤＮＡ分子は、イントロンであると思われるも
のを含む。従って、成熟Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素（例えば、ホスホリパー
ゼまたはヒアルロニダーゼ）をコードする核酸を得るために、これらの「イント
ロン」配列を除去する必要が予想外に判明した。

【００１４】それ故広範に、本発明は、毒液酵素、その保存された改変体、その免疫調節性
フラグメント、あるいはその誘導体またはアナログをコードする単離された核酸
分子に及ぶ。上記のように、核酸分子は、非コード配列（すなわち、５^-および
３^-非翻訳（ＵＴＲ）配列）を含むが、これはゲノム配列ではない。本発明の単
離された核酸分子によりコードされ得るＰｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素の例とし
ては、ホスホリパーゼおよびヒアルロニダーゼが挙げられるが、それらに限定さ
れない。さらに、多数のＰｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液の毒液由来の、酵素、それら
の保存された改変体、それらの免疫調節フラグメント、あるいはそれらのアナロ
グまたは改変体は、本発明の単離された核酸分子によってコードされ得る。特定
の例は、Ｐｏｌｉｓｔｅｓ属のＰｏｌｉｓｔｉｎａｅ、および特にａｎｎｕｌａ
ｒｉｓ種を含む。

【００１５】特定の実施態様では、本発明は、Ｐｏｌｉｓｔｅｓ属およびａｎｎｕｌａｒｉ
ｓ種由来の、ホスホリパーゼＡ₁、その保存された改変体、その免疫調節性フラ
グメント、またはそのアナログもしくは誘導体をコードする単離された核酸分子
に及び、ここで、Ｐ．ａｎｎｕｌａｒｉｓは、配列番号２に示されるアミノ酸配
列を有し、そして、より詳細には、この単離された核酸分子は、配列番号１のヌ
クレオチド配列、その縮重改変体、そのフラグメント、またはそのアナログもし
くは誘導体を有する。

【００１６】別の特定の実施態様では、本発明は、単離された核酸分子に及ぶ。この核酸分
子は、配列番号４のアミノ酸配列を含むＰｏｌｉｓｔｅｓａｎｎｕｌａｒｉｓ
由来のヒアルロニダーゼをコードし、より詳細には、単離された核酸は、配列番
号３のヌクレオチド配列、その縮重改変体、そのフラグメント、またはそのアナ
ログもしくは誘導体、その保存された改変体、その免疫調節性フラグメント、ま
たはそのアナログもしくは誘導体を有する。

【００１７】さらに、本発明は、配列番号１または３のＤＮＡ配列、その縮重改変体、その
フラグメント、あるいはそのアナログもしくは誘導体を含む単離された核酸分子
にハイブリダイズし得る単離された核酸分子に及ぶ。

【００１８】さらに、本発明は、Ｐｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素、または免疫刺激性フラグメ
ント、その誘導体もしくはアナログをコードする単離された核酸分子に、さらに
及び、ここで、この単離された核酸分子は、Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素のＴ
細胞エピトープの免疫調節性部分、またはＢ細胞エピトープの抗原性部分をコー
ドする。同様に、本発明は、Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素のＴ細胞エピトープ
の免疫調節性部分を含む単離されたポリペプチドに及び、ここでこのポリペプチ
ドは、本発明の単離された核酸分子によってコードされる。本発明の単離された
核酸分子がＴ細胞エピトープの免疫調節性部分をコードする、ワスプ毒液酵素の
例としては、ホスホリパーゼおよびヒアルロニダーゼが挙げられるが、必ずしも
それらに限定されない。特定の実施態様では、ホスホリパーゼＡ₁およびヒアル
ロニダーゼは、Ｐｏｌｉｓｔｅｓ属、特に、ａｎｎｕｌａｒｉｓ種に由来する。

【００１９】本発明は、核酸の発現を可能にする、クローニングベクターおよび発現ベクタ
ーをさらに提供する。このようなベクターは、上に示すような本発明の核酸を含
む。発現ベクターの場合、このような核酸は、発現制御配列に作動可能に関連す
る。

【００２０】本発明は、Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液ホスホリパーゼ、その保存された改変体
、その免疫調節性フラグメント、またはそのアナログもしくは誘導体を産生する
方法を有利に提供し、この方法は、本発明により包含され、以下の工程を含む：（ａ）配列番号１のＤＮＡ配列を含み、好ましくは、配列番号１の配列、そ
の縮重改変体、そのフラグメント、またはそのアナログもしくは誘導体を有する単離された核酸分子にハイブリダイズし得る、単離され
た核酸分子を含む発現ベクターを用いて形質転換した宿主細胞を培養する工程で
あって、ここで、この単離された核酸分子は、プロモーターと作動可能に関連し
て、その結果、Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液ホスホリパーゼ、その保存された改変
体、その免疫調節性フラグメント、またはそのアナログもしくは誘導体が、宿主
細胞によって産生される、工程；および（ｂ）培養物、宿主細胞、またはその両方から、そのように産生されたＰｏ
ｌｉｓｔｉｎａｅ毒液ホスホリパーゼ、その保存された改変体、その免疫調節性
フラグメント、またはそのアナログもしくは誘導体を回収する工程。

【００２１】別の方法は、Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液ヒアルロニダーゼ、その保存された改
変体、その免疫調節性フラグメント、またはそのアナログもしくは誘導体を産生
する方法を提供し、この方法は、以下の工程を含む：（ａ）配列番号３のＤＮＡ配列を含むか、あるいは、好ましくは、配列番号
３の配列、その縮重改変体、そのフラグメント、またはそのアナログもしくは誘
導体を有する単離された核酸分子にハイブリダイズし得る、単離された核酸分子
を含む発現ベクターを用いて形質転換した宿主細胞を培養する工程であって、こ
こで、この単離された核酸分子は、プロモーターと作動可能に関連して、その結
果、Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液ヒアルロニダーゼ、その保存された改変体、その
免疫調節性フラグメント、またはそのアナログもしくは誘導体が、宿主細胞によ
って産生される、工程；および（ｂ）培養物、宿主細胞、またはその両方から、そのように産生されたＰｏ
ｌｉｓｔｉｎａｅ毒液ヒアルロニダーゼ、その保存された改変体、その免疫調節
性フラグメント、またはそのアナログもしくは誘導体を回収する工程。

【００２２】特定の実施例では、上記に示す方法は、Ｐｏｌｉｓｔｅｓ属、特に、ａｎｎｕ
ｌａｒｉｓ種由来のホスホリパーゼＡ₁またはヒアルロニダーゼを得、ここで、
このホスホリパーゼＡ₁は、配列番号２のアミノ酸配列、その保存された改変体
、その免疫調節性フラグメント、またはそのアナログもしくは誘導体を含み、そ
してヒアルロニダーゼは、配列番号４のアミノ酸配列、その保存された改変体、
その免疫調節性フラグメント、またはそのアナログもしくは誘導体を含む。

【００２３】本発明はさらに、毒液アレルゲン特異的アレルギー性状態の処置に有効な薬学
的組成物に及ぶ。特に、本発明は、Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素（例えば、ホ
スホリパーゼまたはヒアルロニダーゼ）のＴ細胞の免疫調節部分またはＢ細胞エ
ピトープの抗原性部分をコードする単離された核酸分子によりコードされるポリ
ペプチド、およびそれらの薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物に及
ぶ。結果的に、好ましい実施態様において、本発明の薬学的組成物は、Ｐｏｌｉ
ｓｔｅｓａｎｎｕｌａｒｉｓ毒液ホスホリパーゼＡ₁もしくはヒアルロニダー
ゼの免疫調節性Ｔ細胞エピトープ、またはＰｏｌｉｓｔｅｓａｎｎｕｌａｒｉ
ｓホスホリパーゼＡ₁もしくはヒアルロニダーゼのＢ細胞エピトープの抗原性部
分を含む。

【００２４】当然、本発明は、蜂毒アレルゲン特異的アレルギー性状態を処置するための方
法に及ぶ、この方法は、本発明の薬学的組成物（その例は、上記している）の治
療的有効量を投与する工程を包含する。本発明の薬学的組成物の投与は、非経口
的に、そして具体的には、経口的に、肺内に、経鼻的に、局所的にまたは全身的
に生じ得る。

【００２５】さらに、本発明は、免疫原への免疫応答を調節（例えば、スズメバチアレルギ
ー状態を処置するか、または免疫系関連疾患もしくは障害、または免疫系関連疾
患もしくは障害の症状を処置）するための医薬の製造および関連する方法におけ
る本発明の組換えＰｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素の使用に及ぶ。このポリペプチ
ドは、Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素をコードする単離された核酸分子によりコ
ードされる。ここでこのポリペプチドは、Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素の免疫
調節フラグメントを含む。より詳細には、免疫系関連疾患もしくは障害、または
それらに関する症状を処置するための薬剤は、Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素、
またはＰｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液もしくは酵素のインビボ発現を可能にするベク
ターを含む。

【００２６】特定の実施態様において、このポリペプチドは、配列番号１のＤＮＡ配列、そ
の変性改変体、そのフラグメント、またはその類似体もしくは誘導体にハイブリ
ダイズし得るか、または好ましくはそれらを含む単離された核酸分子によりコー
ドされるホスホリパーゼである。

【００２７】従って、免疫系関連障害もしくは疾患、またはそれらの症状を処置するための
薬剤は、Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液ヒアルロニダーゼ、その保存改変体、その免
疫調節性フラグメント、またはその類似体もしくは誘導体をコードする単離され
た核酸分子によりコードされる単離されたポリペプチドを含む。

【００２８】別の実施態様において、このポリペプチドは、配列番号３のＤＮＡ配列、その
変性改変体、そのフラグメント、またはその類似体もしくは誘導体にハイブリダ
イズし得、そして好ましくはそれらを含む単離された核酸分子によりコードされ
るヒアルロニダーゼである。

【００２９】さらに、本発明は、免疫原への免疫応答を調節（例えば、スズメバチアレルギ
ー状態を処置、または免疫系関連疾患もしくは障害、またはそれらに関する症状
を処置）するための薬学的組成物に及ぶ。ここで、この薬学的組成物は、組換え
Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素およびその薬学的に受容可能なキャリアを含む。

【００３０】免疫系関連疾患または障害を処置するための薬学的組成物の被験体への投与は
、非経口的に、そして具体的には、経口的に、肺内に、経鼻的に、局所的にまた
は全身的に行われ得る。さらに、免疫系に関する多くの疾患または障害が本発明
を用いて処置され得る。例としては、ウイルス疾患または障害のような病原性疾
患または障害（例えば、ＨＩＶ、単純疱疹ウイルス、またはパピローマウイルス
）；自己免疫疾患（例えば、関節炎または狼瘡）；あるいはこのような疾患また
は障害の組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。

【００３１】本発明の特定の目的は、Ｐｏｌｉｓｔｅｓａｎｎｕｌａｒｉｓヒアルロニダ
ーゼをコードする単離された核酸（ｃＤＮＡ）分子、その保存改変体、そのフラ
グメント、またはそれらの類似体もしくは誘導体の意外なＤＮＡ配列を提供する
ことである。

【００３２】本発明のなおさらに別の目的は、Ｐｏｌｉｓｔｅｓａｎｎｕｌａｒｉｓホス
ホリパーゼＡ₁およびヒアルロニダーゼのアミノ酸配列を、その保存された改変
体、そのフラグメントとともに提供することである。これらは、Ｐｏｌｉｓｔｅ
ｓａｎｎｕｌａｒｉｓホスホリパーゼＡ₁およびヒアルロニダーゼ（これらは
、「イントロン性」配列を含むか、またはより好ましくは含まないかのいずれか
である）のＴ細胞エピトープの免疫調節部分およびＢ細胞エピトープの抗原性部
分を含む。Ｐｏｌａ由来のホスホリパーゼＡ₁およびヒアルロニダーゼの推定
アミノ酸配列は、他のスズメバチ由来の類似体酵素に対してその相同性を比較し
得る。この情報は、アレルギー反応および治療処置に重要であり得るアレルゲン
の交差反応性を評価するための基礎を提供する。従って、特定の実施態様におい
て、当業者は、本発明により、環境タンパク質および／または自家タンパク質に
対するＰｏｌａのホスホリパーゼＡ₁およびヒアルロニダーゼの類似性の程度
を決定および評価することが可能になる。このような環境タンパク質、特に自家
タンパク質に対する蜂毒酵素の類似性は、アレルギー性反応に重要な係わりを有
すると考えられる。

【００３３】本発明のなおさらに別の目的は、これらのＰｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素のＴ
細胞エピトープの免疫調節部分またはＢ細胞エピトープの抗原性部分を含むフラ
グメントを含む、ＰｏｌｉｓｔｅｓａｎｎｕｌａｒｉｓホスホリパーゼＡ₁お
よびヒアルロニダーゼをコードする単離された核酸分子を含む発現ベクターおよ
びクローニングベクターを提供することであり、これによりこの単離された核酸
分子は複製されそして発現され得る。

【００３４】本発明のなお別の目的は、ｃＤＮＡクローンにおけるイントロン性配列の存在
にかかわらず、本発明の発現ベクターを用いて、ホスホリパーゼおよびヒアルロ
ニダーゼのようなＰｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素とともに、その保存改変体、そ
の免疫調節フラグメント、またはそれらの類似体もしくは誘導体の産生を含む。

【００３５】本発明のなお別の目的は、被験体において、アレルゲン特異的アレルギー性状
態を処置するための薬剤および薬学的組成物を提供することである。ここでこの
薬剤および薬学的組成物は、特にＰｏｌｉｔｅｓａｎｎｕｌａｒｉｓ由来のＰ
ｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素（例えば、ホスホリパーゼまたはヒアルロニダーゼ
）をコードする単離された核酸分子によりコードされる単離されたポリペプチド
を含む。ここでこのポリペプチドは、ＰｏｌｉｓｔｉｎａｅホスホリパーゼＡ₁
またはヒアルロニダーゼのＢ細胞エピトープの抗原部分、またはＴ細胞エピトー
プの免疫調節部分を含む。

【００３６】本発明のなおさらに別の目的は、被験体における、蜂毒アレルゲン特異的アレ
ルギーを処置するための方法を提供することである。ここでアレルゲン特異的ア
レルギー性状態を処置するための薬学的組成物が被験体に投与される。

【００３７】本発明のなおさらに別の目的は、哺乳動物において、免疫系関連疾患または障
害（例えば、病原性疾患もしくは障害、ウイルス性疾患もしくは障害、自己免疫
疾患もしくは障害、または免疫系関連疾患または障害の組み合わせ）を処置する
ような薬剤を含む薬剤および薬学的組成物を提供することである。

【００３８】本発明のなおまだ別の目的は、哺乳動物において免疫原に対する免疫応答を調
節するための薬剤および薬学的組成物を提供することである。結果として、この
ような薬学的組成物の投与は、免疫原を認識し、そして攻撃する免疫系の能力を
調節する。特定の実施態様において、免疫原を認識し、そして攻撃する哺乳動物
の免疫系の能力は、被験体の免疫系が、本発明の薬学的組成物の投与の前に免疫
原を認識しそして攻撃する能力に比較して薬学的組成物の投与の際に増強される
。

【００３９】（略号）Ｄｏｌｍ：Ｄｏｌｉｃｈｏｖｅｓｐｕｌａｍａｃｕｌａｔａ：ホワイトフ
ェイスホーネット（ｗｈｉｔｅｆａｃｅｈｏｒｎｅｔ）Ｄｏｌａ：Ｄ．ａｒｅｎａｒｉａ：イエローホーネット（ｙｅｌｌｏｗｈ
ｏｒｎｅｔ）Ｐｏｌａ：Ｐｏｌｉｓｔｅｓａｎｎｕｌａｒｉｓ：ワスプ（ｗａｓｐ）Ｐｏｌｅ：Ｐ．ｅｘｃｌａｍａｎｓ：ワスプ（ｗａｓｐ）Ｖｅｓｍ：Ｖｅｓｐｕｌａｍａｃｕｌｉｆｒｏｎｓ：イエロージャケット
（ｙｅｌｌｏｗｊａｃｋｅｔ）Ｖｅｓｖ：Ｖ．ｖｕｌｇａｒｉｓ：イエロージャケットＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応ＲＡＣＥ：ｃＤＮＡ末端迅速増幅ＴＣＲ：抗原に対するＴ細胞レセプター（発明の詳細な説明）本発明は、ホスホリパーゼおよびヒアルロニダーゼのようなＰｏｌｉｓｔｉｎ
ａｅ毒液酵素、それらの免疫調節フラグメント、誘導体または類似体をコードす
る組換え核酸分子、ならびにスズメバチ毒液特異的アレルギーの診断および治療
に有用なこのような核酸分子によりコードされるポリペプチドに関する。特定の
実施態様において、本発明は、Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅホスホリパーゼの免疫調節
フラグメント、詳細には、ＰｏｌａホスホリパーゼＡ₁、その免疫調節フラグ
メント、その類似体または誘導体、ならびにＰｏｌａヒアルロニダーゼ、その
保存性改変体、その免疫調節フラグメント、およびそれらの類似体または誘導体
をコードする組換え核酸分子に関する。

【００４０】本発明は、ＰｏｌａホスホリパーゼおよびＰｏｌａヒアルロニダーゼの両
方をコードするｃＤＮＡの内部非コードセグメントの驚くべきそして全く予期さ
れない発見に、一部は基づく。この発見以前には、スズメバチ毒液酵素のｃＤＮ
Ａは、このような明白な「イントロン性（ｉｎｔｒｏｎｉｃ）」配列を含まなか
った。

【００４１】この発見は２つの重大な意味を有する。第一に、Ｐｏｌｏｓｔｉｎａｅ、そし
てより詳細にはＰｏｌｉｓｔｅｓ、そしてさらにより詳細にはＰｏｌａのｃＤ
ＮＡは「イントロン」を含むらしいということである。従って、Ｐｏｌｉｓｔｉ
ｎａｅｓのこのサブファミリーは、特有のｍＲＮＡを発現し、特有のｍＲＮＡプ
ロセシング能力を有し、そして潜在的に、興味深いスプライシング改変体を示す
。

【００４２】用語「イントロン」は、ホスホリパーゼまたはヒアルロニダーゼをコードする
ｃＤＮＡに存在すると予想されない、そして５’または３’のＵＴＲ配列でない
核酸配列をいう。この配列は、タンパク質の予期されないスプライシング改変体
、ｍＲＮＡの不完全なプロセシング、またはスズメバチのこのサブファミリー、
属および種に見出されるいくつかの調節性特徴を示し得る。

【００４３】これらの「イントロン」配列の存在は、発現ベクターの調製に有意に影響する
。

【００４４】これらのｃＤＮＡによりコードされる特有のポリペプチドを発現することは可
能であるが、別の実施態様において、Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素の成熟形態
（例えば、免疫療法において使用するため）を発現するためにこれらの「イント
ロン」を排除するためには、ｃＤＮＡの予期できない改変が必要である。従って
、Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅホスホリパーゼおよびヒアルロニダーゼのコード配列を
さらに操作することが必要であることが予期せず判明した。一旦、これらの「ニ
トロン」配列が除去されれば、天然のアミノ酸配列を含むホスホリパーゼタンパ
ク質またはヒアルロニダーゼタンパク質が獲得され得る。

【００４５】本発明はさらに、このような核酸分子を含む発現ベクター、ならびにこのよう
な発現ベクターを発現することにより本発明のＰｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素ポ
リペプチドを生成するための方法、および生成したＰｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵
素ポリペプチドを回収する方法に関する。

【００４６】本発明はまた、本発明のポリペプチドを含む、スズメバチ毒液（およびおそら
くは膜翅類の毒液さえ）、アレルゲン特異的アレルギー性状態の処置に有効な薬
学的組成物、ならびに本発明の薬学的組成物の治療的有効量を投与する工程を包
含する、このようなアレルギー性状態を処置する方法を提供する。

【００４７】本発明のポリペプチドはまた、スズメバチ（特にＰｏｌｉｓｔｉｎａｅ）毒液
特異的アレルギー性状態の診断に有用であり得る。

【００４８】さらに、予期せぬことに、Ｐｏｌｏｓｔｉｎａｅ毒液ホスホリパーゼまたはヒ
アルロニダーゼを含む薬学的組成物の投与は、免疫系関連疾患または障害（例え
ば、病原性疾患もしくは障害、ウイルス性疾患もしくは障害、自己免疫疾患もし
くは障害、またはそのような疾患もしくは障害の組み合わせ）を処置するために
用いられることが発見された。

【００４９】従って、本明細書において用いる場合、用語「Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液アレ
ルゲン」とは、感受性の人が昆虫の咬傷への暴露で感作される、ペーパーワスプ
（ｐａｐｅｒｗａｓｐ）（Ｐｏｌｉｓｔｅｓａｎｎｕｌａｒｉｓ）のような
Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅの毒液において見出されるタンパク質をいう。ほとんどの
抗原は、特異的ＩｇＧクラス抗体と反応性であることにより特徴付けられるが、
アレルゲンはＩｇＥ型抗体とも反応性であることにより特徴付けられる。ＩｇＥ
型抗体は、アレルゲン状態の症状、すなわち即時型過敏症を媒介する原因である
。

【００５０】本明細書において用いる場合、用語「スズメバチ（ｖｅｓｐｉｄ）」は、アレ
ルギーの分野におけるそれらの実行に従って用いられ、そしてＶｅｓｐｉｄａｅ
（すなわち、ホーネット（ｈｏｒｎｅｔ）、イエロージャケット（ｙｅｌｌｏｗ
ｊａｃｋｅｔ）およびペーパーワスプを含む世界中の社会性ワスプ）のファミリ
ーに属する昆虫をいう。詳細には、スズメバチのＶｅｓｐｉｎａｅサブファミリ
ーは、ＶｅｓｐｉｎａｅおよびＰｏｌｉｓｔｉｎａｅのサブファミリーを含む。
より詳細には、スズメバチのサブファミリーは、ＶｅｓｐａＬｉｎｎａｅｕｓ
属、ＶｅｓｐｕｌａＴｈｏｍｓｏｎ属、ＤｏｌｉｃｈｏｖｅｓｐｕｌａＲｏ
ｈｗｅｒ属およびＰｏｌｉｓｔｅｓＬａｔｒｅｉｌｌｅ属を含む。Ｖｅｓｐｕ
ｌａおよびＤｏｌｉｃｈｏｖｅｓｐｕｌａは、Ｖｅｓｐａ属（Ｖ．ｃｒａｂｒｏ
（Ｌ）およびＶ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ（Ｌｉｎｎａｅｕｓ）を含むがこれらに
限定されない）中のＶｅｓｐｕｌａ種の属の亜属と考えられ得る。Ｖｅｓｐｕｌ
ａ属中の種は、Ｖ．ｇｅｒｍａｎｉｃａ（Ｆａｂ．），Ｖ．ｓｑｕａｍｏｓａ（
Ｄｒｕｒｙ）、Ｖ．ｍａｃｕｌｉｆｒｏｎｓ（Ｂｕｙｓｓｏｎ）、Ｖ．ｆｌａｖ
ｏｐｉｌｏｓａ（Ｊａｃｏｂｓｏｎ）、Ｖ．ｖｕｌｇａｒｉｓ（Ｌ．）およびＶ
．ｐｅｎｓｙｌｖａｎｉｃａ（Ｓａｕｓｓｕｒｅ）を含むがこれらに限定されな
い。Ｄｏｌｉｃｈｏｖｅｓｐｕｌａ属中の種は、Ｐ．ｄｏｍｉｎｕｌｕｓ、Ｄ．
ｍａｃｕｌａｔａ（Ｌ．）およびＤ．ａｒｅｎａｒｉａ（Ｆａｂ．）を含むがこ
れらに限定されない。

【００５１】Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅサブファミリーは、Ｐｏｌｉｓｔｅｓ属を含む。Ｐｏｌ
ｉｓｔｅｓ属における種としては以下が挙げられるがこれらに限定されない：

【００５２】

【化１】本明細書において用いる場合、用語「ホスホリパーゼ」とは、リン脂質基質上
で、例えば、脂肪酸を加水分解するように作用する酵素のクラスをいう。特定の
実施態様において、ホスホリパーゼは、合成ホスファチジルコリンの１位でアシ
ル基の迅速な加水分解を、そして２位でアシル基の緩徐な加水分解を触媒する。
従って、本発明のスズメバチホスホリパーゼは、ホスホリパーゼ活性のＡ₁型お
よびＢ型の両方を有し得る。本発明のホスホリパーゼは、低レベルのリパーゼ活
性も同様に有し得る。

【００５３】本発明において用いられる場合、用語「ヒアルロニダーゼ」とは、Ｄ−グルク
ロン酸およびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの二糖類単位上で作用する酵素の
クラスをいう。このような酵素は、Ｄ−グルクロン酸およびＮ−アセチル−Ｄ−
グルコサミンを含む、反復する二糖類ポリマーの加水分解を媒介する。このよう
なポリマーの１例は、ヒアルロン酸である。ヒアルロニダーゼは、ヒアルロン酸
からのＮ−アセチルグルコサミンの還元基の遊離を触媒する。

【００５４】「ゲノム」配列は、遺伝子のイントロン５’および３’非翻訳配列、ならびに
５’および３’非転写配列（およびしばしば調節配列）の全てを含む。従って、
コード配列は、それが１つ以上のイントロンならびに５’および３’非転写転写
配列、特に調節配列を欠く場合、ゲノム配列ではない。

【００５５】本明細書で用いる場合、用語「免疫調節」とは、抗原特異的免疫応答を、Ｂ細
胞レベルまたはＴ細胞レベルのいずれかで増大または減弱する能力をいう。免疫
調節活性は、例えば、Ｔ細胞増殖アッセイにおいて、抗体産生、リンホカイン産
生またはＴ細胞応答性の測定により、決定され得る。詳細には、本発明の免疫調
節ポリペプチドは、Ｔ細胞応答への影響に加えて、Ｂ細胞表面上の免疫グロブリ
ン（例えば、抗体）分子に結合し、そしてさらにＢ細胞応答に影響し得る。

【００５６】本明細書で用いる場合、用語「誘導体」とは、Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ、特にＰ
ｏｌｉｓｔｅｓ、ホスホリパーゼまたはヒアルロニダーゼ毒液酵素をコードする
改変核酸をいう。この酵素は、置換、欠失または挿入およびそれらの核酸により
コードされるタンパク質を含む。用語「誘導体」とは、特に、重要なアミノ酸残
基におけるアミノ酸置換を含み、これによりタンパク質の全体的コンフォメーシ
ョンまたは二次構造および三次構造を破壊せずにＩｇＥ結合を減少させる、低Ｉ
ｇＥ結合誘導体（または類似体）をいう。低ＩｇＥ結合誘導体は、ＰＣＴ／ＤＫ
９９／００１３６に記載されている。

【００５７】本明細書において用いる場合、「免疫系関連疾患または障害」とは、被験体に
おいて免疫応答を惹起するか、または免疫系が免疫原に応答する能力に影響する
疾患もしくは障害をいう。従って、免疫系関連疾患または障害の例としては以下
が挙げられる：病原性疾患または障害；ウイルス性疾患または障害、例えば、Ｈ
ＩＶ、単純疱疹ウイルス、またはパピローマウイルス；自己免疫疾患、例えば関
節炎または狼瘡。

【００５８】「核酸分子」とは、一本鎖形態または二本鎖らせんのいずれかの、リボヌクレ
オシド（アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジン；「ＲＮＡ分子」）
またはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、
デオキシチミジン、またはデオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」）のリン酸エステ
ル重合形態をいう。二本鎖ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ、およびＲＮＡ−Ｒ
ＮＡらせんが、可能である。用語、核酸分子および特にＤＮＡ分子またはＲＮＡ
分子とは、分子の一次構造および二次構造のみをいい、そして任意の特定の三次
構造には限定されない。従って、この用語は、とりわけ、直鎖ＤＮＡ分子または
環状ＤＮＡ分子（例えば、制限フラグメント）、ウイルス、プラスミドおよび染
色体において見出される二本鎖ＤＮＡを含む。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造の
考察において、配列は、ＤＮＡの非転写鎖（すなわち、ｍＲＮＡに対する配列相
同性を有する鎖）に沿って５’〜３’方向の配列のみを与える通常の慣例に従っ
て本明細書において記載され得る。「組換えＤＮＡ分子」は、分子生物学操作を
受けたＤＮＡ分子である。

【００５９】核酸分子は、核酸分子の一本鎖形態が、温度および溶液のイオン強度の適切な
条件（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照のこと）下で他の核酸分子にアニーリン
グし得る場合に、別の核酸分子（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮ
Ａ）に「ハイブリダイズ可能」である。温度およびイオン強度の条件は、ハイブ
リダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。相同な核酸分子につい
ての予備的スクリーニングのために、５５°のＴ_mに対応する低ストリンジェン
シーのハイブリダイゼーション条件（例えば、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、
０．２５％ミルク、およびホルムアミドなし；または３０％ホルムアミド、５
×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ）が使用され得る。中程度のストリンジェンシーの
ハイブリダイゼーション条件は、より高いＴ_m（約６０℃）に対応する（例えば
、５×または６×ＳＳＣを伴う４０％ホルムアミド）。高ストリンジェンシーの
ハイブリダイゼーション条件は、最も高いＴ_m（約６５°以上）に対応する（例
えば、５０％ホルムアミド、５×または６×ＳＳＣ）。ハイブリダイゼーショ
ンは、２つの核酸分子が相補的な配列を含むことを必要とするが、ハイブリダイ
ゼーションのストリンジェンシーに依存して、塩基間のミスマッチが可能である
。核酸分子をハイブリダイズさせるための適切なストリンジェンシーは、当該分
野で周知の変数である、核酸分子の長さおよび相補性の程度に依存する。２つの
ヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が高いほど、これらの配列を有
する核酸分子のハイブリッドのためのＴ_mの値がより高くなる。核酸ハイブリダ
イゼーションの相対的な安定性（より高いＴ_mに相当する）は、以下の順番で減
少する：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。１００ヌクレオチ
ド長より長いハイブリッドについて、Ｔ_mを計算するための式が導かれてきた（
Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、９．５０−０．５１を参照のこと）。より短い核酸
分子（すなわち、オリゴヌクレオチド）を用いるハイブリダイゼーションについ
ては、ミスマッチの位置がより重要になり、そしてオリゴヌクレオチドの長さが
その特異性を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、１１．７−１１．８を参照
のこと）。好ましくは、ハイブリダイズ可能な核酸分子についての最低限の長さ
は、少なくとも約１０ヌクレオチド；好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチド
；そしてより好ましくはその長さは少なくとも約２０ヌクレオチド；さらにより
好ましくは３０ヌクレオチド；そして最も好ましくは４０ヌクレオチドである。

【００６０】特定の実施態様において、用語「標準的なハイブリダイゼーション条件」とは
、５５℃のＴ_mをいい、そして上記に示す条件を利用する。好ましい実施態様に
おいて、Ｔ_mは６０℃であり；より好ましい実施態様において、Ｔ_mは６５℃であ
る。

【００６１】ＤＮＡ「コード配列」は、適切な調節配列の制御下に配置された場合に、イン
ビボで転写され、そしてポリペプチドに翻訳される二本鎖ＤＮＡ配列である。コ
ード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシル
）末端の翻訳停止コドンによって決定される。コード配列には、原核生物配列、
真核生物ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳動物）ＤＮＡ由来の
ゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列さえを含み得るが、これらに限定され
ない。コード配列が真核生物細胞における発現を意図される場合、ポリアデニル
化シグナルおよび転写終結配列は、通常コード配列の３’側に位置する。

【００６２】転写制御配列および翻訳制御配列は、ＤＮＡ調節配列（例えば、プロモーター
、エンハンサー、ターミネーターなど）であり、これは、宿主細胞中でのコード
配列の発現を提供する。真核生物細胞において、ポリアデニル化シグナルは、制
御配列である。

【００６３】「プロモーター配列」は、細胞においてＲＮＡポリメラーゼの結合および下流
（３’方向）のコード鎖の転写の開始を可能にするＤＮＡ調節領域である。本発
明を規定する目的のために、プロモーター配列は、その３’末端で転写開始部位
と結合され、そして上流（５’方向）に広がって、バックグラウンドよりも上の
検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小数の塩基またはエレメントを
含む。プロモーター配列中に、転写開始部位（例えば、ヌクレアーゼＳ１を用い
るマッピングによって、簡便に規定される）、およびＲＮＡポリメラーゼ結合の
原因であるタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見出される。真核生
物プロモーターは、しばしば、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックス
を含むが、常にこれらを含むわけではない。

【００６４】ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をｍＲＮＡに転写し、次いで、これがコード
配列によってコードされるタンパク質に翻訳される場合、コード配列は、細胞中
で転写制御配列および翻訳制御配列の「制御下」にある。

【００６５】「シグナル配列」は、コード鎖の前に含まれ得る。この配列は、ポリペプチド
のＮ末端にシグナルペプチドをコードし、シグナルペプチドは、宿主細胞に、そ
のポリペプチドを細胞表面に輸送するか、または培地中にそのポリペプチドを分
泌するように指図し、そしてこのシグナルペプチドは、通常、排出の際に細胞に
よって選択的に分解される。シグナル配列は、原核生物および真核生物に天然で
ある種々のタンパク質と結合して見出され得る。

【００６６】本発明に従って、当該分野の技術範囲内にある従来の分子生物学、微生物学、
および組換えＤＮＡ技術が用いられ得る。このような技術は、文献中に十分に説
明される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ
，「ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ａＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎ
ｕａｌ」、第２版（１９８９）ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂ
ｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ（本明細書中以下、「Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９」）；「ＤＮＡ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ」、第Ｉ巻およ
び第ＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏ
ｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；「Ｎｕｃ
ｌｅｉｃＡｃｉｄＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ
．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８５））；「ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＡｎ
ｄＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉ
ｎｓ編（１９８４））；「ＡｎｉｍａｌＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅ」（Ｒ．Ｉ
．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（１９８６））；「ＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄＣｅｌｌｓ
ＡｎｄＥｎｚｙｍｅｓ」（ＩＲＬＰｒｅｓｓ、（１９８６））；Ｂ．Ｐｅ
ｒｂａｌ、「ａＰｒａｃｔｉｃａｌＧｕｉｄｅＴｏＭｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ」（１９８４）を参照のこと。

【００６７】本発明は、部分的には、Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液ホスホリパーゼおよびヒア
ルロニダーゼのクローニングおよび配列決定に基づく。このＰｏｌｉｓｔｉｎａ
ｅ毒液酵素のクローニングおよび配列決定は、非常に重要である。なぜなら、こ
のｃＤＮＡクローンは、予想外に、ポリペプチドをコードしないようである余分
のヌクレオチド配列を含むからである。スズメバチ（ｖｅｓｐｉｄ）毒液のアレ
ルギー性状態は一般的であり、そしてある感受性の個体においては、アレルギー
反応はアナフィラキシーに進行し得、これは潜在的に致命的である。一般に、ス
ズメバチを用いる場合に、Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液成分は、アレルギンの産生
において重要な役割を果たすようである。従って、Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液ア
レルゲンについてのヌクレオチドおよびアミノ酸配列情報が公知であり、その結
果、アレルギー状態、とりわけ特定のアレルゲン感受性の性質に関する正確な診
断情報が決定され得、そしてアレルギー状態の根底にある有効な治療的処置がも
たらされ得ることは、非常に重要である。ＰｏｌｉｓｔｉｎａｅｃＤＮＡは、
驚くべきことに、非転写配列とともに見出されたので、これは、本明細書中での
予想外の事例（ｃａｓｘｅ）であった。

【００６８】（ワスプ（ｗａｓｐ）毒液酵素をコードする核酸分子の単離）スズメバチ（ｖｅｓｐｉｄ）毒液酵素をコードする核酸分子の単離は、米国特
許第５，５９３，８７７号に十分に記載された。本発明は、Ｐｏｌｉｓｔｉｎａ
ｅｃＤＮＡが「イントロン」を含むという、予想外かつ驚くべき発見に関する
。代表的には、イントロンはｍＲＮＡからスプライシングにより切り出され、従
って、通常ｃＤＮＡには見出されない。その配列は、スプライス改変体を表し得
る。

【００６９】Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素、フラグメント、および融合タンパク質の誘導
体（以下を参照のこと）ならびにそれらをコードする核酸分子は、さらに提供さ
れる。

【００７０】好ましい局面において、本発明は、Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素の完全核酸
配列を提供する。詳細には、本発明は、Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅホスホリパーゼの
核酸配列（特に、Ｐｏｌａ（ペーパーワスプ（ｐａｐｅｒｗａｓｐ））ホス
ホリパーゼＡ₁）、およびヒアルロニダーゼ（特にＰｏｌａヒアルロニダーゼ
）を提供する。

【００７１】特定の実施態様において、Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素をコードする核酸分
子を得るために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が、Ｆｒｏｈｍａｎら（Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９８，８５：８９９８−９００
２；Ｆｒｏｈｍａｎ，１９９０，Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：ＡＦｏｒｕ
ｍｆｏｒＰＣＲＵｓｅｒｓ５：１１もまた参照のこと）によって記載さ
れたｃＤＮＡ末端の迅速増幅（ＲＡＣＥ）技術と組み合わされて、選択の前に、
Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素を含む配列をコードするフラグメントを増幅する
。本発明のＰｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素を表すオリゴヌクレオチドプライマー
は、ＰＣＲにおけるプライマーとして使用され得る。一般的に、このようなプラ
イマーは、合成的に調製される。このようなオリゴヌクレオチドプライマーにつ
いての配列は、アミノ酸配列情報から推定され得る。このようなオリゴヌクレオ
チド配列は、非縮重であり得るが、より頻繁には、その配列は縮重している。よ
り好ましくは、そのプライマーは、本明細書中に開示されるＰｏｌｉｓｔｉｎａ
ｅ毒液酵素についての核酸配列に基づく。そのオリゴヌクレオチドは、供給源（
ＲＮＡまたはＤＮＡ）（好ましくは、潜在的な目的のｃＤＮＡライブラリー）由
来のＰＣＲ配列によって増幅するためのプライマーとして利用され得る。例えば
、ＰＣＲは、Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ酸腺ｃＤＮＡライブラリーからＰｏｌｉｓｔ
ｉｎａｅ毒液酵素コード配列を増幅するために使用され得る。ＰＣＲが、例えば
、Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓサーマルサイクラーおよびＴａｑポリ
メラーゼ（ＧｅｎｅＡｍｐ^TM）の使用によって実行され得る。

【００７２】本発明はさらに、Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅの任意の種由来のＰｏｌｉｓｔｉｎａ
ｅ毒液酵素のホモログを単離することを提供する。例えば、ＰＣＲ反応における
使用のためのいくつかの異なる縮重プライマーを合成することを選択し得る。Ｐ
ｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素のホモログと、本明細書中に開示される特定のＰｏ
ｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素との間のヌクレオチド配列の類似性のより高いかまた
はより低い程度を可能にするために、ＰＣＲ反応の開始の際に使用されるハイブ
リダイゼーション条件のストリンジェンシーを変化させることもまた、可能であ
る。Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素のホモログのセグメントの首尾よい増幅後、
そのセグメントは、クローニングおよび配列決定され、そしてプローブとして利
用されて、完全ｃＤＮＡまたはゲノムクローンを単離し得る。これは、次には、
以下に記載するように、完全ヌクレオチド配列の決定、その発現の分析、および
機能的な分析のためのそのタンパク質産物の産生を可能にする。この様式におい
て、Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素、特に、ホスホリパーゼおよびヒアルロニダ
ーゼをコードするさらなる遺伝子が、同定および発現され得る。

【００７３】別の実施態様において、Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素をコードする遺伝子が
、プローブを用いてスクリーニングすることによって適切なライブラリーから単
離され得る。Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素遺伝子を単離するための有用なプロ
ーブは、本明細書中に提供される配列情報から生成され得る。

【００７４】発現ライブラリーは、当該分野で公知の方法によって構築され得る。好ましく
は、ｃＤＮＡライブラリーは、Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素を発現する細胞ま
たは組織（すなわち、毒液嚢の近くに位置する毒腺由来の細胞）から調製される
。ときどき、毒腺は、酸腺といわれる。例えば、ｍＲＮＡまたは総ＲＮＡが単離
され得、ｃＤＮＡが作製され、そして発現ベクター（例えば、プラスミドまたは
バクテリオファージ誘導体）に連結され、その結果、次いでそれが導入される宿
主細胞によって発現され得る。次いで、種々のスクリーニングアッセイが使用さ
れて、陽性クローンを選択し得る。例えば、本明細書中で提供される配列に基づ
いて合成され得る適切なプライマーを用いるＰＣＲが使用され得る。ＰＣＲは、
増幅産物が（例えば、臭化エチジウム染色によって）直接的に検出され得るので
好ましい。あるいは、本出願の核酸配列由来の標識したプローブは、コロニーを
スクリーニングするために使用され得る。毒（酸）腺は単離するのが困難であり
得、そしてｍＲＮＡの量が問題であり得るが、本発明のプライマーに基づく特異
的ＰＣＲは、痕跡量のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡでさえの特異
的増幅を可能にすることによって、これらの問題を克服し得る。

【００７５】あるいは、この遺伝子の存在は、その発現された産物の、物理的、化学的、ま
たは免疫学的特性に基づくアッセイによって検出され得る。例えば、ｃＤＮＡク
ローン、すなわち適切なｍＲＮＡをハイブリッドで選択するＤＮＡクローン（こ
れは、Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素について公知であるような、例えば、類似
のまたは同一の電気泳動的移動度、等電点電気泳動的挙動、タンパク質分解消化
マップ、または抗原性特性を有するタンパク質を産生する）が選択され得る。

【００７６】細菌によって発現されるいくつかの組換えタンパク質（例えば、Ｐｏｌｉｓｔ
ｉｎａｅ毒液ヒアルロニダーゼ）は、天然のタンパク質に特異的な抗体と反応し
得る。他の細菌によって発現される組換えタンパク質（例えば、毒液ホスホリパ
ーゼ）は、天然のタンパク質に特異的な抗体と反応しないかもしれない。従って
、組換えタンパク質が免疫反応性である場合において、イムノブロットによって
陽性クローンを選択することが可能である。

【００７７】別の実施態様において、酵素の比触媒活性（例えば、発現されたＰｏｌｉｓｔ
ｉｎａｅ毒液ホスホリパーゼのリパーゼ活性）は、選択のために使用され得る。
しかし、細菌によって発現された真核生物タンパク質は、活性なコンホメーショ
ンでホールディングしないかもしれない。

【００７８】一般的には、本発明に従って、陽性クローンをスクリーニングする任意の方法
が使用され得る。

【００７９】Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを単離することの
代替方法には、本明細書中に提供される配列から遺伝子配列それ自体を化学合成
することが含まれるが、これに限定されない。

【００８０】上記の方法は、Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素のクローンが得られ得る方法を
限定することを意味しない。

【００８１】当該分野で公知の多くのベクター宿主系が使用され得る。可能なベクターには
、プラスミドまたは改変されたウイルスが含まれるがこれらに限定されないが、
ベクター系は、使用される宿主細胞と適合可能でなければならない。このような
ベクターには、バクテリオファージ（例えば、λ誘導体）または種々のｐＢＲ３
２２誘導体のようなプラスミド（例えば、ｐＵＣ、ＣＲ、ｐＧＥＸベクター、ｐ
ｍａｌ−ｃ、ｐＦＬＡＧなど）が含まれるが、これらに限定されない。クローニ
ングベクターへの挿入は、例えば、相補的な付着末端を有するクローニングベク
ターにＤＮＡフラグメントを連結することによって達成され得る。本発明の好ま
しい局面において、ＰＣＲ増幅された本発明の核酸分子は、３’突出Ａヌクレオ
チドを含み、そして適合可能なＴヌクレオチド突出を有するｐＣＲベクター（Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）へのクローニン
グのために直接使用され得る。しかし、ＤＮＡをフラグメント化するために使用
される相補的制限部位がクローニングベクター中に存在しない場合、ＤＮＡ分子
の末端は、酵素的に改変され得る。あるいは、任意の所望される部位が、ヌクレ
オチド配列（リンカー）をＤＮＡ末端に連結することによって生成され得る；こ
れらの連結されたリンカーは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする特
定の化学合成されたオリゴヌクレオチドを含み得る。代替的な方法において、切
断されたベクターおよびＰｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素遺伝子は、ホモポリマー
テーリング（ｔａｉｌｉｎｇ）によって修飾され得る。組換え分子は、形質転換
、トランスフェクション、感染、エレクトロポレーションなどを介して宿主細胞
に導入され得、その結果、遺伝子配列の多くのコピーが生成される。

【００８２】特定の実施態様において、単離されたＰｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素遺伝子、
ｃＤＮＡ、または合成ＤＮＡ配列を取り込んだ組換えＤＮＡ分子を用いる宿主細
胞の形質転換は、遺伝子の複数コピーの生成を可能にする。従って、この遺伝子
は、形質転換体を増殖させること、この形質転換体から組換えＤＮＡ分子を単離
すること、および、必要な場合、単離された組換えＤＮＡから挿入遺伝子を回収
することによって、大量に得られ得る。

【００８３】（Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液アレルゲンポリペプチドまたはフラグメントの発
現）上記で指摘したように、Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素（特に、Ｐｏｌｉｓｔ
ｅｓ毒液タンパク質）をコードする単離された核酸分子は、他のＰｏｌｉｓｔｉ
ｎａｅ毒液酵素（例えば、米国特許第５，５９３，８７７号に記載されるような
酵素）に類似のタンパク質をコードするｃＤＮＡについては存在しないはずであ
る予想外の配列を含む。１つの実施態様において、「イントロン」含有核酸は、
さらなる改変なしで発現される。別の実施態様において、その核酸は、本明細書
中に記載され、そして以下に例示されるか、または上記に引用された参考文献（
例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら）において記載されるような技術を使用して改変さ
れて、天然のＰｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素のアミノ酸配列を有するタンパク質
を産生する（しかし、以下に議論するように、そのようなタンパク質は異なる二
次構造もしくは三次構造を有し得るか、またはそれに融合した他のポリペプチド
配列を含み得る）。

【００８４】Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素をコードするヌクレオチド配列、またはその免
疫調節性フラグメント、誘導体、もしくはアナログは、適切な発現ベクター（す
なわち、挿入されたタンパク質コード配列の転写および翻訳のために必要なエレ
メントを含むベクター）に挿入され得る。そのようなエレメントは、本明細書中
では「プロモーター」と呼ばれる。従って、Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素をコ
ードする核酸分子は、必要に応じて、プロモーターと結合される。発現ベクター
はまた、好ましくは、複製起点を含む。必要な転写および翻訳シグナルはまた、
Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素をコードする天然の遺伝子および／またはその隣
接領域によって供給され得る。潜在的な宿主ベクター系には、ウイルス（例えば
、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなど）で感染された哺乳動物細胞系；ウ
イルス（例えば、バキュロウイルス）で感染された昆虫細胞系；酵母ベクターを
含む酵母のような微生物；または、バクテリオファージ、ＤＮＡ、プラスミドＤ
ＮＡ、もしくはコスミドＤＮＡを用いて形質転換された細菌が含まれるがこれら
に限定されない。ベクターの発現エレメントは、それらの強度および特異性にお
いて変化する。利用される宿主ベクター系に依存して、多数の適切な転写エレメ
ントおよび翻訳エレメントのいずれか１つが使用され得る。

【００８５】代替的な実施態様において、本発明の組換えＰｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素、
またはその免疫調節フラグメント、誘導体、もしくはアナログが、組換えによっ
てＰｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素コード配列の組込み後に、染色体性に発現され
る。これに関して、多数の増幅系のいずれかが、高レベルの安定な遺伝子発現を
達成するために使用され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、前出、セクショ
ン１６．２８を参照のこと）。

【００８６】Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素をコードする核酸分子を含む組換えベクターが
含まれる細胞は、細胞によるＰｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素の発現を提供する条
件下で、適切な細胞培養培地中で培養される。次いで、発現されたＰｏｌｉｓｔ
ｉｎａｅ毒液酵素は、当該分野で周知の方法に従って培養物から回収され得る。
このような方法は、以下に詳細に記載される。

【００８７】別の実施態様において、Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素融合タンパク質が発現
され得る。Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素融合タンパク質は、Ｐｏｌｉｓｔｉｎ
ａｅ毒液酵素の少なくとも免疫調節部分へのペプチド結合を介して結合された非
Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素タンパク質の少なくとも機能的に活性な部分を含
む。非Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素配列は、Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素配
列に対して、アミノ末端またはカルボキシル末端であり得る。このような融合タ
ンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子は、Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素につ
いてのコード配列にインフレームに結合された非Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素
の少なくとも機能的に活性な部分をコードする配列を含む。それは、好ましくは
２つのタンパク質の接続点に、特異的なプロテアーゼ（例えば、第Ｘａ因子）に
ついての切断部位をコードし得る。

【００８８】別の特定の実施態様において、Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素のフラグメント
は、遊離の（融合でない）タンパク質として発現される。

【００８９】特定の実施態様において、Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液ホスホリパーゼおよびそ
の免疫調節フラグメントは、約６個のヒスチジン残基を含むさらなる配列ととも
に、例えば、ｐＱＥ１２ベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ
）を用いて発現される。ヒスチジンの存在は、Ｎｉ−キレートカラム上で組換え
タンパク質の選択的単離を可能にする。

【００９０】別の実施態様において、融合タンパク質のペリプラズム形態（シグナル配列を
含む）は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉペリプラズムにタンパク質を搬出
するために産生され得る。ペリプラズムへの搬出は、発現されたタンパク質の適
切なホールディングを促進し得る。

【００９１】ベクターへのＤＮＡフラグメントの挿入について米国特許第５，５９３，８７
７号中に以前に記載された任意の方法が、適切な転写／翻訳制御シグナルおよび
タンパク質コード配列からなる遺伝子を含む発現ベクターを構築するために使用
され得る。これらの方法には、インビトロ組換えＤＮＡ技術および合成技術、な
らびにインビボ組換え体（遺伝子組換え）が含まれ得る。Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ
毒液酵素またはその免疫調節フラグメントをコードする核酸配列の発現は、第２
の核酸配列によって制御され得、その結果、Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素タン
パク質またはペプチドが、組換えＤＮＡ分子で形質転換された宿主中で発現され
る。例えば、Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素タンパク質の発現は、当該分野で公
知の任意のプロモーター／エンハンサーエレメントによって制御され得るが、こ
れらの調節エレメントは、発現のために選択された宿主中で機能的でなければな
らない。Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素遺伝子発現を制御するために使用され得
るプロモーターには、ＣＭＶ前初期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター領
域（ＢｅｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ、１９８１、Ｎａｔｕｒｅ２９０：
３０４−３１０）、ラウス肉腫ウイルスの３’の長い末端反復配列に含まれるプ
ロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９８０、Ｃｅｌｌ２２：７８７−７９７
）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、１９８１、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４１−１４４５）
、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、１９８２、Ｎａｔ
ｕｒｅ２９６：３９−４２）；β−ラクタマーゼプロモーターのような原核生
物発現ベクター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら、１９７８、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７５：３７２７−３７３１）、またはｔ
ａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら、１９８３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２１−２５）；「Ｕｓｅｆｕｌｐｒｏｔｅｉｎ
ｓｆｒｏｍｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｂａｃｔｅｒｉａ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆ
ｉｃＡｍｅｒｉｃａｎ、１９８０、２４２：７４−９４もまた参照のこと；Ｇ
ａｌ４プロモーターのような酵母または他の真菌由来のプロモーターエレメント
、ＡＤＣ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセ
ロールキナーゼ）プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター；および
組織特異性を示し、そしてトランスジェニック動物において利用されている、動
物の転写制御領域が含まれるがこれらに限定されない。

【００９２】一旦特定の組換えＤＮＡ分子が同定され、そして単離されたならば、当該分野
で公知のいくつかの方法が、それを増殖させるために使用され得る。一旦適切な
宿主系および増殖条件が確立したならば、組換え発現ベクターは、量的に増殖さ
れかつ調製され得る。以前に説明したように、使用され得る発現ベクターには、
少し例を挙げれば、以下のベクターまたはそれらの誘導体が含まれるが、これら
に限定されない：ヒトまたは動物ウイルス（例えば、ワクシニアウイルスまたは
アデノウイルス）；昆虫ウイルス（例えば、バキュロウイルス）；酵母ベクター
；バクテリオファージベクター（例えば、λ）、ならびにプラスミドおよびコス
ミドＤＮＡベクター。

【００９３】さらに、挿入された配列の発現を調節するか、または遺伝子産物を所望される
特定の様式で改変およびプロセシングする宿主細胞株を選択し得る。異なる宿主
細胞は、タンパク質の翻訳時および翻訳後のプロセシングおよび修飾（例えば、
グリコシル化、切断［例えば、シグナル配列の切断］）についての特徴的および
特異的機構を有する。適切な細胞株または宿主系は、発現される外来タンパク質
の所望の修飾およびプロセシングを確実にするように選択され得る。例えば、細
菌系における発現を用いて、非グリコシル化コアタンパク質産物を生成し得る。
しかし、細菌において発現される酵素タンパク質は、正しく折り畳まれないかも
しれない。酵母における発現は、グリコシル化産物を生成し得る。昆虫細胞にお
ける発現を用いて、異種Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素の「ネイティブな」グリ
コシル化および折り畳みの尤度を増加させ得る。さらに、異なるベクター／宿主
発現系は、プロセシング反応（例えば、タンパク質分解性切断）に異なる程度に
影響を与え得る。細菌産生アレルゲンがＴ細胞増殖アッセイにおいて活性である
ので、グリコシル化および適切な再折り畳みがＰｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液アレル
ゲンの免疫調節活性に必須ではないことが観察されたことに留意することは興味
深い。

【００９４】ベクターは、当該分野で公知の方法（例えば、トランスフェクション、エレク
トロポレーション、電気移入、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合
、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈澱、リポフェクション（リソソー
ム融合）、遺伝子銃の使用、またはＤＮＡベクタートランスポーター（例えば、
Ｗｕら、１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３−９６７；Ｗｕお
よびＷｕ，１９８８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１−１４６２
４；Ｈａｒｔｍｕｔら、１９９０年３月１５日出願のカナダ国特許出願第２，０
１２，３１１号を参照のこと））によって所望の宿主細胞に導入される。

【００９５】好ましいベクター、特にインビボでのタンパク質産生のために好ましいベクタ
ーは、望ましい細胞向性を有するウイルスベクター（例えば、レンチウイルス、
レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワ
クシニアウイルス、バキュロウイルス、および他の組換えウイルス）である。従
って、Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素をコードするベクターは、インビボでまた
はエキソビボでウイルスベクターを使用してまたはＤＮＡの直接導入によって導
入され得る。標的組織における発現は、例えば、ウイルスベクターもしくはレセ
プターリガンドを用いて、または組織特異的プロモーターを用いることにより、
あるいはその両方によって、トランスジェニックベクターを特定の細胞に標的化
することにより達成され得る。標的化された遺伝子送達は、１９９５年１０月に
公開された国際特許公開第ＷＯ９５／２８４９４号に記載される。

【００９６】インビボまたはエキソビボでの標的化のために通常用いられるウイルスベクタ
ーおよび発現手順は、ＤＮＡに基づくベクターおよびレトロウイルスベクターで
ある。ウイルスベクターを構築および使用するための方法は、当該分野で公知で
ある（例えば、ＭｉｌｌｅｒおよびＲｏｓｍａｎ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
，７：９８０−９９０，１９９２を参照のこと）。好ましくは、このウイルスベ
クターは、複製欠損である、すなわち、これらは、標的細胞において自律複製す
ることができない。好ましくは、複製欠損ウイルスは、最小ウイルスである、す
なわち、複製欠損ウイルスは、ゲノムをキャプシド化してウイルス粒子を生成す
るために必要である、そのゲノムの配列のみを保持する。

【００９７】ＤＮＡウイルスベクターとしては、弱毒化ＤＮＡウイルスまたは欠損ＤＮＡウ
イルス（例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、パピローマウイルス、エプ
スタインバーウイルス（ＥＢＶ）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡ
Ｖ）、ワクシニアウイルスなどであるがこれらに限定されない）が挙げられる。
特定のベクターの例としては、欠損ヘルペスウイルス１（ＨＳＶｌ）ベクター（
Ｋａｐｌｉｔｔら，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２：３２０−３
３０，１９９１；１９９４年９月２９日公開の国際特許公開第ＷＯ９４／２１
８０７号；１９９４年４月２日公開の国際特許公開第ＷＯ９２／０５２６３号
）；弱毒化アデノウイルスベクター（例えば、Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉ
ｃａｕｄｅｔら（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０：６２６−６３０，１９９
２；ＬａＳａｌｌｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５９：９８８−９９０，１９９３
もまた参照のこと）によって記載されるベクター）；および欠損アデノ随伴ウイ
ルスベクター（Ｓａｍｕｌｓｋｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０９６−３１０
１，１９８７；Ｓａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２
８，１９８９；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３９
８８−３９９６，１９８８）が挙げられるがこれらに限定されない。

【００９８】以下を含むがこれらに限定されない種々の会社が、ウイルスベクターを商業的
に産生している：Ａｖｉｇｅｎ，Ｉｎｃ．（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ；ＡＡＶベク
ター）、ＣｅｌｌＧｅｎｅｓｙｓ（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ；レトロウ
イルスベクター、アデノウイルスベクター、ＡＡＶベクターおよびレンチウイル
スベクター）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（レトロウイルスベクターおよびバキュロウイ
ルスベクター）、Ｇｅｎｏｖｏ，Ｉｎｃ．（ＳｈａｒｏｎＨｉｌｌ，ＰＡ；ア
デノウイルスベクターおよびＡＡＶベクター）、Ｇｅｎｖｅｃ（アデノウイルス
ベクター）、ＩｎｔｒｏＧｅｎｅ（Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ；ア
デノウイルスベクター）、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｅｄｉｃｉｎｅ（レトロウイ
ルスベクター、アデノウイルスベクター、ＡＡＶベクターおよびヘルペスウイル
スベクター）、Ｎｏｒｇｅｎ（アデノウイルスベクター）、ＯｘｆｏｒｄＢｉ
ｏＭｅｄｉｃａ（Ｏｘｆｏｒｄ，ＵｎｉｔｅｄＫｉｎｇｄｏｍ；レンチウイル
スベクター）およびＴｒａｎｓｇｅｎｅ（Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ，Ｆｒａｎｃｅ
；アデノウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レトロウイルスベク
ターおよびレンチウイルスベクター）。

【００９９】別の実施態様では、このベクターは、リポフェクションによって、裸のＤＮＡ
として、または他のトランスフェクション促進剤（ペプチド、ポリマーなど）を
用いてインビボで導入され得る。合成カチオン性脂質を用いて、マーカーをコー
ドする遺伝子のインビボでのトランスフェクションのためのリポソームを調製し
得る（Ｆｅｌｇｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ
．８４：７４１３−７４１７，１９８７；ＦｅｌｇｎｅｒおよびＲｉｎｇｏｌｄ
，Ｓｃｉｅｎｃｅ３３７：３８７−３８８，１９８９；Ｍａｃｋｅｙら，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：８０２７−８０３１，
１９８８を参照のこと；Ｕｌｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５９：１７４５−１
７４８，１９９３）。核酸の移入のために有用な脂質化合物および組成物は、国
際特許公開第ＷＯ９５／１８８６３号および同第ＷＯ９６／１７８２３号、なら
びに米国特許第５，４５９，１２７号に記載される。脂質は、標的化の目的で他
の分子に化学的にカップリングされ得る（Ｍａｃｋｅｙら、前出を参照のこと）
。標的化されたペプチド（例えば、ホルモンまたは神経伝達物質）およびタンパ
ク質（例えば、抗体）または非ペプチド性分子がリポソームに化学的にカップリ
ングされ得る。

【０１００】他の分子（例えば、カチオン性オリゴペプチド（例えば、国際特許公開第ＷＯ
９５／２１９３１号）、ＤＮＡ結合タンパク質由来のペプチド（例えば、国際特
許公開第ＷＯ９６／２５５０８号）またはカチオン性ポリマー（例えば、国際特
許公開第ＷＯ９５／２１９３１号））もまた、インビボで核酸のトランスフェク
ションを促進するために有用である。

【０１０１】あるいは、遺伝子治療のための非ウイルスＤＮＡベクターは、当該分野で公知
の、例えば以下の方法によって所望の宿主細胞に導入され得る：エレクトロポレ
ーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン
酸カルシウム沈澱、遺伝子銃の使用（バリスティックトランスフェクション（ｂ
ａｌｌｉｓｔｉｃｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）；例えば、米国特許第５，２０
４，２５３号、米国特許第５，８５３，６６３号、米国特許第５，８８５，７９
５号および米国特許第５，７０２，３８４号を参照のこと、ならびにＳａｎｆｏ
ｒｄ，ＴＩＢ−ＴＥＣＨ，６：２９９−３０２，１９８８；Ｆｙｎａｎら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９０：１１４７８−１１４
８２，１９９３；およびＹａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
Ｕ．Ｓ．Ａ．，８７：１５６８−９５７２，１９９０を参照のこと）、またはＤ
ＮＡベクタートランスポーターの使用（例えば、Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２６７：９６３−９６７，１９９２；ＷｕおよびＷｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２６３：１４６２１−１４６２４，１９８８；Ｈａｒｔｍｕｔら、１９９
０年３月１５日出願のカナダ国特許出願第２，０１２，３１１号；Ｗｉｌｌｉａ
ｍｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：２７２６−２
７３０，１９９１）。レポーター媒介ＤＮＡ送達アプローチもまた使用され得る
（Ｃｕｒｉｅｌら，Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．３：１４７−１５４，１９９
２；ＷｕおよびＷｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２，
１９８７）。米国特許第５，５８０，８５９号および同第５，５８９，４６６号
は、哺乳動物における、トランスフェクション促進剤を用いない、外因性ＤＮＡ
配列の送達を開示する。近年、比較的低い電圧での、効率の良いインビボでのＤ
ＮＡ移入技術（電気移入と呼ばれる）が記載されている（Ｍｉｒら、Ｃ．Ｐ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．，３２１：８９３，１９９８；ＷＯ９９／０１１５７；ＷＯ９９／０１１５８；ＷＯ９９／０１１７５）。

【０１０２】ｃＤＮＡおよびゲノム配列の両方がクローニングおよび発現され得る。

【０１０３】本発明のＰｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素またはそのフラグメント、誘導体もし
くはアナログが、例えば、固相ペプチド合成によって、合成的に調製され得るこ
とがさらに意図される。

【０１０４】（単離および精製）一旦、組換えＰｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素タンパク質が同定されると、これ
は、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティーおよびサイズ分
けカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、差分溶解度（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉ
ａｌｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）を含む標準的方法によって、またはタンパク質の
精製に関する任意の他の標準的技術によって単離および精製され得る。

【０１０５】特定の実施態様では、Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素およびそのフラグメント
を操作して、約６個のヒスチジル残基を含ませて、Ｎｉ−キレート形成カラムで
の組換えタンパク質の選択的単離を可能にし得る。好ましい局面では、このタン
パク質は、逆相クロマトグラフィーによってさらに精製される。

【０１０６】組換えＰｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素が融合タンパク質として発現される別の
実施態様では、この融合タンパク質の非Ｐｏｌｉｓｔｉｎｍａｅ毒液酵素部分の
がアフィニティー精製のために標的化され得る。例えば、融合タンパク質の非Ｐ
ｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素部分に特異的な抗体は、固体支持体（例えば、ブロ
モシアン活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）上に固定され得、そしてこの融合タンパク
質を精製するために用いられ得る。別の実施態様では、融合タンパク質の非Ｐｏ
ｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素部分の結合パートナー（例えば、レセプターまたはリ
ガンド）は固定され得、そしてこの融合タンパク質をアフィニティー精製するた
めに用いられ得る。

【０１０７】１つの実施態様では、Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素融合タンパク質（好まし
くは、精製されている）は、さらに修飾されずに、すなわち、融合タンパク質の
非Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素部分を切断することも他の方法で除去すること
もなく用いられる。好ましい実施態様では、Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素融合
タンパク質は、例えば、免疫応答を調節するために治療的に用いられ得る。

【０１０８】さらなる実施態様では、精製された融合タンパク質は、非Ｐｏｌｉｓｔｉｎａ
ｅ毒液酵素タンパク質またはその一部を、Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素から切
断するために処理される。例えば、融合タンパク質がプロテアーゼ感受性切断部
位を含むように調製されている場合、この融合タンパク質はプロテアーゼ特異的
部位を切断するようにプロテアーゼで処理されて、そしてＰｏｌｉｓｔｉｎａｅ
毒液酵素を遊離し得る。

【０１０９】本発明の特定の実施態様では、このような組換えＰｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵
素としては、一次アミノ酸配列として、図１（配列番号２）または図４（配列番
号４）に実質的に示されるとおりのアミノ酸配列の全てまたは一部、ならびにそ
れらのフラグメントおよび他の誘導体およびアナログを含むものが挙げられるが
これらには確かには限定されない。

【０１１０】（Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素の誘導体およびアナログ）本発明はさらに、Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素の誘導体およびアナログに関
する。Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素に関連する誘導体およびアナログの産生お
よび使用は、本発明の範囲内にある。この誘導体またはアナログは、免疫調節性
である、すなわち、抗原特異的免疫応答を調節し得る。さらに、Ｐｏｌｉｓｔｉ
ｎａｅ毒液酵素のアナログまたは誘導体、特にＰｏｌｉｓｔｅｓａｎｎｕｌａ
ｒｉｓ由来のホスホリパーゼおよびヒアルロニダーゼもまた、免疫系関連疾患も
しくは免疫系関連障害、またはそれらに関連する症状を処置するために用いられ
得る。別の実施態様では、この誘導体またはアナログは、ＩｇＧおよびＩｇＥを
含む、Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素特異的免疫グロブリンに結合し得る。Ｐｏ
ｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素の誘導体またはアナログは、所望の免疫調節活性につ
いて、以下に記載のアッセイを含むがこれに限定されない、当該分野で公知の手
順によって試験され得る。

【０１１１】詳細には、Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素誘導体は、置換、付加または欠失に
より本発明の核酸配列を変更することによって作製され得る。ヌクレオチドコー
ド配列の縮重に起因して、Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素をコードする核酸と実
質的に同じアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列を、本発明の実施において
用い得る。これらとしては、この配列内の同じアミノ酸残基をコードする、従っ
て、サイレントな変化を生じる、異なるコドンの置換によって変更されるＰｏｌ
ｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素をコードする遺伝子の全体または一部を含むヌクレオチ
ド配列が挙げられるがこれらに限定されない。同様に、本発明の誘導体としては
、一次アミノ酸配列として、その配列内の残基が、機能的に等価なアミノ酸残基
で置換されており、保存的アミノ酸置換をもたらす、変更された配列を含む、Ｐ
ｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素のアミノ酸配列の全体または一部を含む誘導体が挙
げられるがこれらに限定されない。例えば、この配列内の１以上のアミノ酸残基
は、機能的等価物として作用する類似の極性の別のアミノ酸によって置換され得
、それにより、サイレントな変化がもたらされる。この配列内のアミノ酸につい
ての置換は、そのアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択され得る。例
えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン
、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが挙
げられる。極性の中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、トレオニン、シス
テイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられる。正に荷電した
（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが挙げられ
る。負に荷電した（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン
酸が挙げられる。

【０１１２】Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素の誘導体またはアナログとしては、Ｐｏｌｉｓ
ｔｉｎａｅ毒液酵素もしくはそのフラグメントに実質的に相同であるもの、また
はそのコード核酸がＰｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素をコードする核酸分子にハイ
ブリダイズし得るものが挙げられるがこれらに限定されない。ハイブリダイゼー
ションは、当該分野で周知のように、配列類似性の程度に依存して、中程度にス
トリンジェントな条件下から高度にストリンジェントな条件下で生じ得る。

【０１１３】本発明の誘導体およびアナログは、当該分野で公知の種々の方法によって生成
され得る。それらの産生をもたらす操作は、遺伝子レベルまたはタンパク質レベ
ルで生じ得る。例えば、クローニングされたＰｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素の核
酸配列は、当該分野で公知の多数のストラテジーのいずれかによって改変され得
る（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，１９９０，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ
，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第２版，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ
ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏ
ｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ）。この配列は、制限エンドヌクレアーゼを用いて適切な
部位で切断され得、続いて所望であればさらに酵素修飾され得、単離およびイン
ビトロで連結され得る。Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素の誘導体またはアナログ
をコードする遺伝子の産生では、改変された遺伝子が、翻訳停止シグナルによっ
て中断されずに、Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素と同じ翻訳リーディングフレー
ム内に残っていることを確実にすることに注意を払うべきである。

【０１１４】さらに、Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素をコードする遺伝子をインビトロまた
はインビボで変異させて、翻訳配列、開始配列、および／もしくは終結配列を作
製および／もしくは破壊し、あるいはコード領域にバリエーションを作製し、お
よび／または新たな制限エンドヌクレアーゼ部位を形成するか、または既存の制
限エンドヌクレアーゼ部位を破壊して、さらなるインビトロでの改変を容易にし
得る。以下を含むがこれらに限定されない、当該分野で公知の変異誘発について
の任意の技術が用いられ得る：インビトロでの部位特異的変異誘発（Ｈｕｔｃｈ
ｉｎｓｏｎ，Ｃ．ら、１９７８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：６５５１；
ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ，１９８４，ＤＮＡ３：４７９−４８８；Ｏｌ
ｉｐｈａｎｔら、１９８６，Ｇｅｎｅ４４：１７７；Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎら
、１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８３：７１
０）、ＴＡＢ（登録商標）リンカーの使用（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）など。ＰＣＲ
技術は、部位特異的変異誘発に好ましい（Ｈｉｇｕｃｈｉ，１９８９，「Ｕｓｉ
ｎｇＰＣＲｔｏＥｎｇｉｎｅｅｒＤＮＡ」，ＰＣＲＴｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒＤ
ＮＡＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｈ．Ｅｒｌｉｃｈ編，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ
Ｐｒｅｓｓ，第６章，６１−７０頁を参照のこと）。

【０１１５】組換えＰｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素の操作はまた、タンパク質レベルで行わ
れ得る。本発明の範囲内に含まれるのは、翻訳の間または翻訳後に、例えば、グ
リコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、還元およびカルボキシメチル化
、公知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解性切断、抗体分子
もしくは他の細胞リガンドへの連結などによって示差的に改変される、組換えＰ
ｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素フラグメントまたは他の誘導体もしくはアナログで
ある。任意の多数の化学的改変が、以下を含むがこれらに限定されない、公知の
技術によって実施され得る：ブロモシアン、トリプシン、キモトリプシン、パパ
イン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ₄による特異的化学切断；アセチル化、ホル
ミル化、酸化、還元；ツニカマイシンの存在下での代謝合成など。

【０１１６】特定の実施態様では、Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素またはその免疫調節フラ
グメントは、昆虫細胞発現系において、例えば、バキュロウイルス発現ベクター
を用いて発現される。上記に指摘されるように、これは、発現されるポリペプチ
ドの「ネイティブな」グリコシル化および構造、特に二次構造および三次構造を
生じるべきである。発現されるポリペプチドのネイティブなグリコシル化および
構造は、診断用途に非常に重要であり得る。なぜなら、診断アッセイにおいて検
出されるこの酵素に特異的な抗体は、すなわち、スズメバチ（ｖｅｓｐｉｄ）か
らの毒針により導入されるような、ネイティブな酵素に特異的であるからである
。

【０１１７】（本発明のペプチドを用いた活性のアッセイ）多数のアッセイが、抗原の免疫調節活性を評価するための免疫学において公知
である。例えば、本発明の核酸分子の発現により生成されるＰｏｌｉｓｔｉｎａ
ｅ毒液酵素タンパク質は、以下で詳細に記載されるアレルギー性疾患についての
診断アッセイにおいて用いられ得る。一般に、このようなタンパク質は、この酵
素について特異的な抗体に結合する能力について試験され得る。好ましくは、診
断アッセイにおいて検出されるこのような抗体は、ＩｇＥクラスの抗体である。
しかし、天然のアレルゲン特異的抗体が、変性したスズメバチ毒液アレルゲンに
弱く結合することが見出されたことに留意することが重要である。真核生物発現
系、特に昆虫細胞発現系において生成されるＰｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素は、
抗体結合について正しい構造を有し得る。細菌発現系において発現されるＰｏｌ
ｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素は、そうでないかもしれず、従って、抗体結合について
の診断アッセイにおける使用の前に再折り畳みを必要とする。

【０１１８】別の実施態様では、本発明のタンパク質は、増殖アッセイにおいてＴ細胞応答
について試験され得る。このようなＴ細胞応答アッセイに関して、酵素を生成す
るために用いられる発現系は、このタンパク質の免疫調節活性に影響を与えない
ようである。一般に、感作した宿主由来のリンパ球が得られる。この宿主は、Ｐ
ｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素（例えば、本発明によって組換えにより生成された
Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液ホスホリパーゼまたはヒアルロニダーゼ）で免疫され
たマウスであり得る。

【０１１９】好ましい実施態様では、末梢血白血球が、スズメバチ毒液に感受性であるヒト
から入手される。当該分野で周知である技術を用いて、このタンパク質に対する
Ｔリンパ球応答がインビトロで測定され得る。以下の特定の実施態様では、Ｔ細
胞応答は、³Ｈチミジンの取り込みを測定することにより検出される。³Ｈチミジ
ンの取り込みは、増殖に関連したＤＮＡ合成に伴って増加する。

【０１２０】細胞増殖はまた、ＭＴＴアッセイ（Ｍｏｓｓｍａｎ，１９８３，Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ６５：５５−６３；ＮｉｋｓおよびＯｔｔｏ，１９９
０，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１３０：１４０−１５１）を用いて
検出され得る。当該分野で公知の、Ｔ細胞増殖を検出するための任意の方法は、
本発明に従って産生されるＰｏｌｉｓｔｉｎａｅ酵素とともに用いられ得る。

【０１２１】同様に、リンホカイン産生アッセイは、本発明に従って実施され得る。１つの
実施態様では、リンホカイン産生は、免疫学的アッセイもしくは同時刺激アッセ
イ（例えば、Ｆｅｈｌｎｅｒら、１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４６：７９
９を参照のこと）を用いて、またはＥＬＩＳＰＯＴ技術（Ｃｚｅｒｋｉｎｓｋｙ
ら、１９８８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１１０：２９）を用いて
アッセイされ得る。あるいは、リンホカインについてのｍＲＮＡは、例えば、増
幅（Ｂｒｅｎｎｅｒら、１９８９，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ７：１０９６
を参照のこと）によって、またはインサイチュハイブリダイゼーション（例えば
、ＫａｓａｉａｎおよびＢｉｒｏｎ，１９８９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２：
１２８７を参照のこと）によって検出され得る。特に興味深いのは、Ｔ細胞がＩ
ｇＥアイソタイプスイッチ事象（例えば、ＩＬ−４およびＩＬ−５（Ｐｕｒｋｅ
ｓｏｎおよびＩｓａｋｓｏｎ，１９９２，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：９７３
−９８２））に関連するリンホカインを生成する個体である。また興味深いのは
、ＩｇＥスイッチ事象に関与する、Ｔ細胞によって認識されるエピトープを含む
、Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素のポリペプチドフラグメントである。

【０１２２】従って、好ましい局面では、本発明によって生成されるタンパク質を、通常ア
レルギー応答に関連するリンホカイン（例えば、ＩＬ−４）の分泌を検出するた
めに、スズメバチ毒液酵素感受性個体から入手した、末梢血リンパ球、またはよ
り好ましくは、末梢血リンパ球由来の細胞株を用いるインビトロアッセイにおい
て用い得る。このようなアッセイは、どの毒液成分がアレルギー状態の原因であ
るかを示し得る。より重要なことには、Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素のフラグ
メントが試験され得る。このようにして、アレルギー応答に関連するＴ細胞応答
を担う特定のエピトープが同定され得る。このようなエピトープの配列は、他の
スズメバチ毒液酵素に対して、および環境タンパク質または自己タンパク質に対
して比較されて、あり得る交叉反応性を示唆する配列類似性が存在するか否かを
決定し得る。このペプチドは、例えば、巨大用量投与（ｍｅｇａ−ｄｏｓｅａ
ｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）によって、エピトープアンタゴニストを生成する
修飾によって、適切な補助刺激シグナルの非存在下での投与によって、およびＴ
細胞アネルギーをもたらすと考えられる他の方法によって、Ｔ細胞アネルギーを
誘導する能力について試験され得る。このようなエピトープを含むペプチドは、
治療のための理想的な候補物である。

【０１２３】さらなる実施態様では、本発明のポリペプチドは、アッセイにおいて直接用い
られて、配列類似性を共有する、他の環境タンパク質および／または相同タンパ
ク質との交叉反応性の程度を検出し得る。詳細には、このような環境タンパク質
、およびより詳細には相同タンパク質と配列類似性を有するＰｏｌｉｓｔｉｎａ
ｅ毒液酵素のフラグメントは、このようなタンパク質に特異的な抗体またはＴ細
胞との交叉反応性について評価され得る。特定の実施態様では、ヒトリパーゼと
のＰｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液ホスホリパーゼの交叉反応性が評価され得る。別の
特定の実施態様では、精子膜タンパク質ＰＨ−２０とのＰｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒
液ヒアルロニダーゼの交叉反応性が評価される。

【０１２４】（Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素ポリペプチドの診断的使用および治療的使用
）本発明は、純粋なＰｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素、または組換え技術により生
成されるそのフラグメント、誘導体もしくはアナログの多数の供給源を提供する
。あるいは、本発明により提供される配列情報を考慮すれば、Ｐｏｌｉｓｔｉｎ
ａｅ毒液酵素のポリペプチドフラグメント、誘導体またはアナログは、ペプチド
合成によって有利に生成され得る。

【０１２５】本発明は、Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素、またはその免疫調節フラグメント
、誘導体もしくはアナログの、診断組成物または治療組成物の調製のための使用
、スズメバチ毒液アレルゲン特異的アレルギー状態の診断および治療における使
用、スズメバチ毒液アレルゲン特異的アレルギー状態の処置、免疫系関連状態の
処置、ならびに免疫原に対する哺乳動物における免疫応答の調節を意図する。詳
細には、Ｐｏｌｉｓｔｅｓホスホリパーゼ（より詳細にはＰｏｌａホスホリパ
ーゼＡ₁）もしくはＰｏｌｉｓｔｅｓヒアルロニダーゼ（詳細にはＰｏｌａヒ
アルロニダーゼ）、またはホスホリパーゼもしくはヒアルロニダーゼの免疫調節
フラグメント、誘導体もしくはアナログは、本発明による免疫応答の診断、治療
、処置および調節における使用が意図される。

【０１２６】（診断方法）本明細書中で使用される場合、用語、診断は、インビトロ診断アッセイおよび
インビボ診断アッセイを含む。一般に、このようなアッセイは、所定のアレルゲ
ンに特異的なＩｇＥ抗体の活性を測定するために設計される。このような診断ア
ッセイは、純粋なアレルゲンのアベイラビリティーに強く依存する。これは、本
質的に、スズメバチ毒液の特定のアレルゲン成分に対する感受性を決定するため
に正当である。酵素感受性についてのインビトロ診断アッセイとしては、ラジオ
イムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫放射イムノアッセイ（ＩＲＭＡ）、放射性アレ
ルゲン吸着法（ＲＡＳＴ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ＥＬＩ
ＳＰＯＴ、磁気アレルゲン吸着アッセイ（ｍａｇｎｅｔｉｃａｌｌｅｒｇｏｓ
ｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ）、免疫ブロット法、ヒスタミン放出アッセイなどが
挙げられる。

【０１２７】さらなる実施態様において、本発明は、ＩｇＥ抗体と優先的に反応性であるか
または他のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ）と優先的に反応性であるエピトープ
の存在を決定することを提供する。このようなエピトープは、重複し得るかまた
は区別され得る。特に、本発明のＰｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素のフラグメント
を使用して、このような特異的Ｂ細胞エピトープを同定し得る。特異的エピトー
プの同定は、下記のように、治療を展開するための基礎を提供する。

【０１２８】本発明は、上記のように、末梢血リンパ球に対するインビトロ診断アッセイを
意図する。このような診断アッセイは、酵素特異的Ｔ細胞応答、Ｔ細胞応答の表
現型、および好ましくは、Ｔ細胞応答に関与する酵素のＴ細胞エピトープについ
ての詳細な情報を与え得る。免疫優性エピトープ、およびＩｇＥアイソタイプク
ラススイッチ事象に関与するエピトープは、それらが同じでない場合に検出され
得る。特に、ＩｇＥアイソタイプクラススイッチ事象に関連する表現型のＴ細胞
の増殖および／またはサイトカイン分泌を刺激する、Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液
酵素のＴ細胞エピトープは、特定の個体について同定され得るか、あるいはＭＨ
Ｃハプロタイプもしくは優先的なＴ細胞レセプター可変領域発現、またはその両
方を共有する個体のクラスについて同定され得る。

【０１２９】アレルゲン性についてのインビボアッセイは、一般に、皮膚プリックテスト感
受性アッセイからなり、このアッセイは、連続的に希釈した量のアレルゲンを、
患者の皮膚へ皮下または皮内のいずれかで投与し、そしてホイール（ｗｈｅｅｌ
）反応および紅斑反応を検出する。インビトロアッセイを用いる場合、純粋な毒
液酵素のアベイラビリティーは、インビボ診断アッセイの結果の値を多いに増加
させる、なぜなら、スズメバチ毒液嚢（ｖｅｓｐｉｄｖｅｎｏｍｓａｃｓ）
から調製された抽出物中の不純物との交叉反応性が回避され得るからである。

【０１３０】（治療方法）本発明の治療組成物（前出を参照のこと）は、免疫療法（脱感作治療ともいわ
れる）において使用され得る。免疫療法は、アレルギー性疾患、特に昆虫アレル
ギーにおいて有効であることを証明した。アレルゲンは、長期間にわたって漸次
的に増加する用量を非経口的に投与される。このような治療は、患者が感受性で
あるアレルゲンが特異的に同定され、そして治療がそれらのアレルゲンに対して
標的化される場合に、特に有効であり得る。従って、大量中の純粋なＰｏｌｉｓ
ｔｉｎａｅ毒液酵素のアベイラビリティーは、アレルギーの免疫療法について重
要である。

【０１３１】別の実施態様において、本発明は、スズメバチ毒液酵素に対する特異的Ｔ細胞
アレルギーを誘導するために、少なくともＰｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素の免疫
調節性Ｔ細胞エピトープを含むポリペプチドの使用を意図する。このようなペプ
チドの同定は、前出に記載される。より好ましくは、このようなＴ細胞エピトー
プを含み、そしてＢ細胞エピトープを欠如するペプチドが、患者に投与され得る
。アレルゲンに対するＢ細胞エピトープの存在は、このアレルゲンが免疫療法に
使用される場合に、望ましくない全身性反応を生じ得る。従って、本発明の特定
の利点は、望ましくない全身性効果を生じないアレルゲンポリペプチドを提供す
る能力である。

【０１３２】１つの実施態様において、１つ以上のポリペプチドフラグメントは、例えば、
Ｂｒｉｎｅら（１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９
０：７６０８〜１２）に記載されるように、分子全体に対するＴ細胞応答を減少
するために皮下に注射され得る。

【０１３３】別の実施態様において、１つ以上のポリペプチドフラグメントは、未処置被験
体および感作された被験体におけるアレルゲン特異的応答を抑制するために鼻内
投与され得る（例えば、Ｈｏｙｎｅら、１９９３、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８
：１７８３〜８８を参照のこと）。

【０１３４】本発明のＰｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素ペプチドの投与は、アネルギーを誘導
することが予測され、アレルゲン特異的抗体産生の休止もしくはアレルゲン特異
的Ｔ細胞応答、またはその両方を生じ、それにより、治療効果を有する。

【０１３５】本発明の好ましい局面において、Ｔ細胞アネルギーを誘導するための、ペプチ
ドに基づく治療は、各々の個体または個体の群についてカスタマイズされる。本
発明の診断方法を使用して、アレルギー性応答に関与するスズメバチ毒液酵素の
特異的Ｔ細胞エピトープが、同定され得る。次いで、これらのエピトープを含む
ペプチドは、個別化された免疫療法レジメンにおいて使用され得る。

【０１３６】（免疫系関連疾患もしくは免疫系関連障害、またはそれらに関連する症状の処
置）上記で説明されるように、本発明は、免疫系関連疾患もしくは免疫系関連障害
を処置するため、または哺乳動物における免疫応答を免疫原に対して調節するた
めのポリペプチドに関し、ここで、このポリペプチドは、ほんのわずかのみを示
すと、Ｐｏｌｉｓｔｅｓａｎｎｕｌａｒｉｓ由来のホスホリパーゼＡ₁および
ヒアルロニダーゼのような、Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素をコードする単離さ
れた核酸分子によってコードされる。特に、スズメバチ毒液の成分、特にホスホ
リパーゼおよびヒアルロニダーゼは、種々の免疫原（例えば、ほんのわずかのみ
を示すと、病原体およびウイルス）に対する被験体の免疫応答を調節することに
おける適用を有する。特定の実施態様において、Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液の成
分、そして特にＰｏｌｉｓｔｅｓａｎｎｕｌａｒｉｓ由来のホスホリパーゼＡ ₁ およびヒアルロニダーゼならびにその保存的改変体、そのフラグメント、また
はそのアナログもしくは誘導体は、被験体の免疫系を調節して病原体およびウイ
ルス（ＨＩＶ、単純ヘルペスウイルスもしくはパピローマウイルスを含むが、こ
れらに限定されない）と闘う能力を増加させた。特定の実施態様において、この
ような方法は、配列番号１〜３のＤＮＡ配列を含む単離された核酸分子、その縮
重改変体、そのフラグメント、またはそのアナログもしくは誘導体、あるいはそ
れにハイブリダイズする単離された核酸分子によってコードされるポリペプチド
を含む、治療的有効量の薬学的組成物を被験体に投与する工程を包含し、ここで
、このポリペプチドは、Ｐｏｌｉｓｔｅｓａｎｎｕｌａｒｉｓホスホリパーゼ
Ａ₁またはヒアルロニダーゼの、Ｂ細胞エピトープの抗原性部分またはＴ細胞エ
ピトープの免疫調節性部分を含む。

【０１３７】さらに、Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液の成分（例えば、ほんのわずかのみを示す
と、ＰｏｌｉｓｔｅｓａｎｎｕｌａｒｉｓのホスホリパーゼＡ₁またはヒアル
ロニダーゼ）はまた、免疫系関連疾患もしくは免疫系関連障害またはそれらに関
連する症状の処置における適用を有する。本明細書中で使用される場合、句「免
疫系関連疾患または免疫系関連障害」は、被験体における免疫応答を誘起するか
または免疫原に応答する免疫系に影響する疾患または障害をいう。免疫系関連疾
患または免疫系関連障害の例としては、病原性疾患または病原性障害；ウイルス
性疾患またはウイルス性障害（例えば、ＨＩＶ、単純ヘルペスウイルスもしくは
パピローマウイルス）；あるいは自己免疫疾患（例えば、関節炎もしくは狼瘡）
が挙げられるが、これらに限定されない。従って、本発明は、免疫系関連疾患も
しくは免疫系関連障害、またはそれらの症状を処置するための薬剤を含み、特定
の実施態様において、本発明は、配列番号１〜３のＤＮＡ配列を含む単離された
核酸分子、その縮重改変体、そのフラグメントまたはそのアナログもしくは誘導
体によってコードされる単離されたポリペプチドを含み、ここで、この単離され
たポリペプチドは、ＰｏｌｉｓｔｅｓａｎｎｕｌａｒｉｓホスホリパーゼＡ ₁ またはヒアルロニダーゼの、Ｔ細胞エピトープの免疫調節性部分またはＢ細胞
エピトープの抗原性部分を含む。

【０１３８】従って、自然に、本発明は、免疫系関連疾患または免疫系関連障害を処置する
ための薬学的組成物に及び、これは、Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素、その縮重
改変体、そのフラグメント、またはそのアナログもしくは誘導体を含む。さらに
、本発明は、免疫系関連疾患もしくは免疫系関連障害、またはそれらの症状を処
置するための方法に及び、これは、免疫系関連疾患または免疫系関連障害を処置
するために、治療的有効量の薬学的組成物を被験体に投与する工程を包含する。
句「治療的有効量」は、処置するため、および被験体の免疫系が免疫原と効果的
に闘う能力を、少なくとも約３０％、より好ましくは約５０％、最も好ましくは
約９０％増加するために十分な量を意味するために、本明細書中で使用される。
さらなる研究が実施される場合、情報は、種々の患者における免疫原に対する免
疫系応答の調節のために適切な投薬量レベルに関して明らかになり、そして当業
者は、治療の状況、レシピエントの年齢および身体全体の健康を考慮して、適切
な用量を確実にし得る。送達は、タンパク質または遺伝子治療ベクターにおいて
であり得る。従って、例えば、免疫系関連疾患または免疫系関連障害はＨＩＶを
含み、臨床的に有意な変化（例えば、投与前の白血球数に対する、本発明の薬学
的組成物が投与された被験体における白血球数の増加）を含む。被験体において
臨床的に有意な変化をモニタリングする他のこのような例は、当業者に容易に明
らかである。さらに、さらなる研究が実施される場合、情報は、種々の患者にお
ける免疫系関連疾患もしくは免疫系関連障害またはそれらの症状を処置するため
に適切な投薬量レベルに関して明らかとなる。そして当業者は、治療の状況、レ
シピエントの年齢および身体全体の健康を考慮して、適切な用量を確実にし得る
。薬学的に受容可能な組成物の例は、以下に記載される。

【０１３９】（薬学的に受容可能な組成物）本発明のインビボ診断組成物またはインビボ治療組成物はまた、適切な薬学的
に受容可能なキャリア、賦形剤、希釈剤およびアジュバントを含む。本明細書中
で使用される場合、句「薬学的に受容可能な」は、好ましくは、政府の監督官庁
、特に連邦政府または合衆国政府、によって承認されているか、あるいは動物、
およびより具体的にはヒトにおける使用について米国薬局方または他の一般に認
識される薬局方に列挙されていることを意味する。適切な薬学的キャリアは、Ｅ
．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉ
ｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ」に記載される。

【０１４０】このような薬学的に受容可能なキャリアは、滅菌液体（例えば、水および油（
石油、動物、植物または合成起源の油（例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油
、ゴマ油など）を含む））であり得る。水は、薬学的組成物が静脈内に投与され
る場合に好ましいキャリアである。食塩水およびデキストロース水溶液およびグ
リセロール水溶液はまた、液体キャリアとして、特に注射用溶液のために使用さ
れ得る。適切な薬学的賦形剤としては、マンニトール、ヒト血清アルブミン（Ｈ
ＳＡ）、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、イ
ネ、フラワー、チョーク、シリカゲル、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネ
シウム、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、滑石、塩化
ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、
エタノールなどが挙げられる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、
カプセル剤、散剤、徐放性処方物などの形態を取り得る。

【０１４１】このような組成物は、適切な量のキャリアとともに診断的または治療的有効量
の活性化合物を含み、患者に対する適切な投与のための形態を提供する。静脈内
注射は、非常に有効な投与形態であるが、一方、他の様式（例えば、注射による
か、または経口、鼻もしくは比経口投与による）が、使用され得る。

【０１４２】本発明は、以下の実施例（これは、本発明の純粋な例示であることが意図され
る）によってさらに明確化される。

【０１４３】（実施例１：ペーパーワスプ（ｐａｐｅｒｗａｓｐ）ホスホリパーゼ）米国特許第５，５９３，８７７号の方法および開示に一部基づいて、Ｐｏｌ
ａ（ペーパーワスプ）ホスホリパーゼをコードする核酸を得た。しかし、これら
の核酸は、驚くべきことに、ネイティブタンパク質に対して予測されるように見
出されるアミノ酸配列をコードしない内部配列を含む。本実施例に記載される核
酸はｃＤＮＡであり、ゲノムではないが、これらは、「イントロン」を含むよう
である。

【０１４４】（材料および方法）使用される方法は、ＲＡＣＥを使用する米国特許第５，５９３，８７７号に記
載される方法と同じである。

【０１４５】（結果）ＲＡＣＥを用いて生成されるペーパーワスプホスホリパーゼＡ₁ ｃＤＮＡを
試験する場合、この長さは、ペーパーワスプホスホリパーゼＡ₁タンパク質をコ
ードするために必要な長さよりも長かったことが、観察された。驚くべきことに
、この増強した長さは、ペーパーワスプホスホリパーゼＡ₁ ｃＤＮＡへ組み込
まれたイントロンの結果であったことが、観察された。このような発見は、他の
スズメバチ毒液のｃＤＮＡで実施した研究（常にいかなるイントロンを含まない
）に鑑みて予想されなかった。例えば、イエロージャケット（ｙｅｌｌｏｗｊａ
ｃｋｅｔ）およびホーネット（ｈｏｒｎｅｔ）のホスホリパーゼｃＤＮＡは、こ
のようなイントロンを含まない。

【０１４６】ペーパーワスプホスホリパーゼＡ₁ ｃＤＮＡと他のスズメバチ毒液ホスホリ
パーゼｃＤＮＡとの間の、不測のこの主要な差異のために、特殊なバイオテクニ
ックおよび工程を要してペーパーワスプホスホリパーゼＡ₁ ｃＤＮＡを単離し
た。この特殊なバイオテクニックおよび工程は、他のスズメバチ（例えば、ホー
ネットおよびイエロージャケット由来の毒液ホスホリパーゼＡ₁を得る必要がな
かった。特に、ペーパーワスプのホスホリパーゼＡ₁をコードするｃＤＮＡを単
離するために、イントロンのサイズおよび位置ならびに数を決定することが、必
要であった。

【０１４７】ペーパーワスプホスホリパーゼＡ₁のブロモシアン分解に由来するアミノ酸配
列を使用して、遺伝コード、およびＲＡＣＥプロトコル由来のペーパーワスプホ
スホリパーゼｃＤＮＡのヌクレオチド配列、２つのイントロンを、発見した。第
１のイントロン（本明細書中以後「ｐａｐｌａｉｎｔｒｏｎＩ」という）は
、配列番号５に示されるようなヌクレオチド配列を含む（図２Ａ）。ｐａｐｌａ
ｉｎｔｒｏｎＩは、１１４のヌクレオチドを含み、そして通常、ホスホリパ
ーゼＡ₁をコードするｃＤＮＡ配列のヌクレオチド１１１と１１２との間に位置
され、これは、配列番号１に示される。

【０１４８】第２のイントロン（本明細書中以後「ｐａｐｌａｉｎｔｒｏｎ２」という
）もまた、発見した。このイントロンは、配列番号６に示されるようなヌクレオ
チド配列を含む（図２Ｂ）。ｐａｐｌａｉｎｔｒｏｎ２は、１２７のヌクレ
オチドを含み、そして通常、配列番号１のヌクレオチド７２０と７２１との間に
位置される。

【０１４９】ペーパーワスプホスホリパーゼＡ₁をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号１）
を単離するために、これらのイントロンを、コードヌクレオチドのリーディング
フレームを破壊することなく、ＲＡＣＥ由来のペーパーワスプホスホリパーゼＡ ₁ ｃＤＮＡから取り出さなければならなかった。本質的に、ペーパーワスプホ
スホリパーゼＡ₁ ｃＤＮＡを再設計し、それによって、コードするヌクレオチ
ドのみを含むようにしなければならなかった。この再設計プロセスは、技術的に
非常に困難であった。なぜなら、１つのコードヌクレオチドを偶発的にイントロ
ンとともに取り出すか、または１つの非コードヌクレオチドを取り出さずに、変
異を生じ、そしてｃＤＮＡの発現の未成熟末端を生じ得るようにリーデングフレ
ームシフトを生成するべきであるからである。

【０１５０】この再設計プロセスにおいて、１つのイントロンの５’および３’に位置する
コードヌクレオチドに各々相補的な、特別に設計したオリゴヌクレオチドを、化
学的に合成した。次いで、ＲＡＣＥ由来の増幅したペーパーワスプホスホリパー
ゼＡ₁ ｃＤＮＡを、自己複製プラスミドへクローン化した。このプラスミドを
変性させ、そして低いストリンジェンシー条件下で、このオリゴヌクレオチドを
ペーパーワスプホスホリパーゼＡ₁ ｃＤＮＡにアニール化させ、イントロン一
本鎖を除いた。次いで、これらのオリゴヌクレオチドを、ＤＮＡ合成のためのプ
ライマーとして用い、これは、二本鎖プラスミドを生成した。ここで、このイン
トロンは、その鎖の１つから欠失した。次いで、細胞を、上記の方法を使用して
プラスミドを用いてトランスフェクトし、次いで、この細胞をクローン化した。
元々のプラスミド中の２つのＤＮＡ鎖の１つが欠失したイントロンを有するので
、トランスフェクトした細胞の半分は、イントロンが除去された二本鎖プラスミ
ドを含む。次いで、このクローン化したものをスクリーニングして、配列番号９
（イントロンを有さない）のＤＮＡ配列を含むペーパーワスプｃＤＮＡを含むプ
ラスミドを有する細胞を単離した。次いで、特定のプラスミドのコピーを単離お
よびスクリーニングして、イントロンの欠失を確認した。次いで、実施例１なら
びに出願番号０８／４７４，８５３および米国特許第５，５９３，８７７号（こ
れらは、その全体において本明細書に参考として援用される）に記載される手順
を使用して、再設計したペーパーワスプホスホリパーゼＡ₁ ｃＤＮＡを、特定
のプラスミドから取り出し、スクリーニングし、増幅し、そして発現ベクターへ
クローン化した。

【０１５１】ペーパーワスプホスホリパーゼＡ₁（配列番号２）の推定アミノ酸配列と、他
のスズメバチ毒液ホスホリパーゼとの比較を、実施した。特に、配列番号２を、
ホワイトフェイスホーネット（ｗｈｉｔｅｆａｃｅｈｏｒｎｅｔ）（Ｄ．ｍ
ａｃｕｌａｔａ）由来のホスホリパーゼ（配列番号７）およびイエロージャケッ
ト（Ｖ．ｖｕｌｇａｒｉｓ）由来のホスホリパーゼ（配列番号８）と比較した。
この配列比較の結果を、図３に示す。

【０１５２】（実施例２：ペーパーワスプヒアルロニダーゼ）米国特許第５，５９３，８７７号に記載される手順を使用して、ペーパーワス
プ（Ｐｏｌａ）ヒアルロニダーゼをコードするｃＤＮＡ配列（配列番号３）お
よびその対応するアミノ酸配列（配列番号４）を単離し、そして図４に示す。配
列番号３のヌクレオチド４４９〜５３６は、シグナル配列の一部をコードする。
従って、成熟ＰｏｌａヒアルロニダーゼのＮ末端のアミノ酸残基はセリンであ
り、これは、ヌクレオチド５３６、５３７および５３８によってコードされる。

【０１５３】驚くべきことに、上記のＲＡＣＥプロトコルから生成されたペーパーワスプヒ
アルロニダーゼｃＤＮＡは、Ｐｏｌａヒアルロニダーゼタンパク質をコードす
るために必要な長さよりも大きな長さを有した。従って、ペーパーワスプヒアル
ロニダーゼｃＤＮＡが少なくとも１つのイントロンを含むことを結論付けた。ワ
スプヒアルロニダーゼｃＤＮＡ内の少なくとも１つのイントロンの存在は、他の
スズメバチ毒液（例えば、イエロージャケットおよびホーネット）由来のヒアル
ロニダーゼｃＤＮＡ（これらは、イントロンを含まなかった）に対する研究に鑑
みて予想されなかった。結果として、ペーパーワスプホスホリパーゼＡ₁ ｃＤ
ＮＡを単離するために使用し、そして実施例３に示される、それらに類似の特定
のバイオテクニック（前出）は、ペーパーワスプヒアルロニダーゼのｃＤＮＡコ
ード配列を単離するために必要であった。

【０１５４】最初に、ペーパーワスプヒアルロニダーゼｃＤＮＡ内のイントロンの位置およ
びサイズについての決定をした。一旦、イントロンを配置すると、これらは、任
意のコードヌクレオチドを破壊しないような様式で除去されなければならない。
従って、ちょうどペーパーワスプホスホリパーゼＡ₁ ｃＤＮＡを用いてのよう
に、ペーパーワスプヒアルロニダーゼｃＤＮＡを再設計し、それにより、コード
配列のみを含む必要があった。この再設計プロセスは、技術的に非常に困難であ
った。なぜなら、１つのコードヌクレオチドを偶発的にイントロンとともに取り
出すか、または１つの非コードヌクレオチドを取り出さずに、ミスセンスフレー
ムシフト変異を、ワスプヒアルロニダーゼｃＤＮＡへ配置するべきであるからで
ある。

【０１５５】成熟ペーパーワスプヒアルロニダーゼをコードするｃＤＮＡ（配列番号３）を
、ペーパーワスプホスホリパーゼＡ₁をコードするｃＤＮＡを単離するために使
用した手順（前出）と同様の手順を使用して調製した。次いで、イントロンを有
さないｃＤＮＡを、再び上記の手順を使用して、配列決定し、増幅し、そして発
現ベクターへクローン化した。

【０１５６】ペーパーワスプヒアルロニダーゼｃＤＮＡが、１つのイントロンを含むことを
見出した。このイントロン（本明細書中以後「ｐａｈｙａ」という）は、９４ヌ
クレオチド長であり、そして配列番号９に記載されるとおりのヌクレオチド配列
を有する（図５）。通常、このイントロンは、配列番号３のヌクレオチド７３３
と７３４の間に配置される。

【０１５７】ペーパーワスプヒアルロニダーゼのアミノ酸配列（配列番号４）と、他のスズ
メバチ毒液ホスホリパーゼとの比較を、実施した。特に、配列番号４を、ミツバ
チ毒液由来のヒアルロニダーゼ（配列番号１０）、ホワイトフェイスホーネット
（Ｄ．ｍａｃｕｌａｔａ）由来のヒアルロニダーゼ（配列番号１１）およびイエ
ロージャケット（Ｖ．ｖｕｌｇａｒｉｓ）由来のヒアルロニダーゼ（配列番号１
２）と比較した。この配列比較の結果を、図１５に示す。

【０１５８】本発明は、本明細書に記載される特定の実施態様によって範囲を限定されない
。なぜなら、そのような実施態様は、本発明の１つの局面のほんの１つの例示と
して意図され、そして機能的に等価である任意の微生物が、本発明の範囲内にあ
るからである。実際に、本明細書中で示されかつ記載される改変に加えて、本発
明の種々の改変は、上述の説明および付随する図面から、当業者に明らかである
。このような改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内にあることが、意図される
。

【０１５９】ヌクレオチドについて与えられた全ての塩基対サイズおよび全ての生体分子に
ついての分子量は、概算であり、そして記述の目的のために使用されることもま
た、理解されるべきである。

【０１６０】種々の特許、参考文献、手順および他の文書が、本明細書に引用され、それら
の開示は、その全体において本明細書中で参考として援用される。

【配列表】

【配列表】【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、Ｐｏｌａ毒液ホスホリパーゼＡ₁をコードするｃＤＮＡヌクレオチ
ド配列（配列番号１）およびＰｏｌａ毒液ホスホリパーゼＡ₁のアミノ酸配列
（配列番号２）を示す。配列番号２の最初の１８アミノ酸残基は、シグナル配列
の一部を表すことに注目のこと。従って、配列番号２のアミノ酸残基１９（グリ
シン）は、成熟ＰｏｌａホスホリパーゼＡ₁中のＮ末端アミノ酸残基である。

【図２】図２は、２つのイントロンを含むＰｏｌａホスホリパーゼｃＤＮＡを示す。
（Ａ）配列番号１のＰｏｌａ毒液ホスホリパーゼＡ₁ｃＤＮＡ中でヌクレオチ
ド１１１と１１２との間に位置するイントロンである、ｐａｐｌａｉｎｔｒｏ
ｎ１のヌクレオチド配列（配列番号５）。（Ｂ）：配列番号１のＰｏｌａ毒液
ホスホリパーゼＡ₁ｃＤＮＡ中でヌクレオチド７２０と７２１との間に位置する
イントロンであるｐａｐｌａｉｎｔｒｏｎ２のヌクレオチド配列（配列番号６
）。

【図３】図３は、スズメバチ毒液ホスホリパーゼ（配列番号７）、イエロージャケット
（ｙｅｌｌｏｗｊａｃｋｅｔ）ホスホリパーゼ（配列番号８）、およびペーパワ
スプ（ｐａｐｅｒｗａｓｐ）ホスホリパーゼＡ₁（配列番号２）の間のアミノ
酸残基配列類似性を示す。

【図４】図４は、Ｐｏｌａ毒液ヒアルロニダーゼをコードするｃＤＮＡヌクレオチド
配列（配列番号３）およびＰｏｌａヒアルロニダーゼのアミノ酸配列（配列番
号４）を示す。配列番号４の最初の２３アミノ酸残基は、シグナル配列の一部を
表すことに注目のこと。従って、配列番号４のアミノ酸残基３０（セリン）は、
成熟ＰｏｌａヒアルロニダーゼのＮ末端アミノ酸残基である。

【図５】図５は、配列番号３のＰｏｌａヒアルロニダーゼｃＤＮＡ中でヌクレオチド
７３３と７３４との間に位置するイントロンである、Ｐａｈｙａのヌクレオチド
配列（配列番号９）を示す。

【図６】図６は、ミツバチ毒液（ｂｖ）ヒアルロニダーゼ（配列番号１０）、Ｄｏｌ
ｍ（ｗｆｈ）ヒアルロニダーゼ（配列番号１１）、Ｖｅｓｖ（ｖｖ）ヒアルロ
ニダーゼ（配列番号１２）およびＰｏｌａ（ｐａ）ヒアルロニダーゼ（配列番
号４）の間のアミノ酸残基配列類似性を示す。

【手続補正書】

【提出日】平成１３年６月１１日（２００１．６．１１）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１６０

【補正方法】変更

【補正内容】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> King, Te Piao <120> CLONING AND RECOMBINANT PRODUCTION OF VESPID VENOM ENZYMES, SUCH
AS PHOSPHOLIPASE AND HYALURONIDASE, AND IMMUNOLOGICAL THERAPIES BASED TH
EREON <130> 2313/2F138-JP0 <140> unassigned <141> 1999-10-01 <160> 12 <170> PatentIn version 3.0 <210> 1 <211> 1048 <212> DNA <213> Polistes annularis <400> 1 atttgcttct tgttagatga ttcgacgaca tttagaaatg gtaccttgaa tagaggcatg 60 tctccggatt gtacttttaa tgagaaagat atagtattct atgtttactc aagggataag 120 cgagatggta ttattcttaa gaaagaaact ttaacgaatt acgatctgtt tacaaagtct 180 acaatatcaa aacaagttgt atttcttata catggtttcc tttcaactgg gaataatgaa 240 aacttcgttg ctatgtcgaa agctttaata gaaaaagatg attttcttgt aatttcggtc 300 gactggaaga agggtgcttg taatgctttt gcttcaacaa aggatgcttt gggttattcc 360
aaagccgttg gaaacacacg tcacgttgga aaatttgtag ctgattttac aaaactactt 420 gtagaaaaat ataaagtgct gatatcaaat atacgattga tcgggcatag tttgggcgcg 480 catacttcag gttttgcggg aaaagaagtt caaaagttaa aattaggaaa atacaaggaa 540 attatcgggc ttgatcctgc tggaccgtat tttcatcgga gtgactgtcc ggacagactt 600 tgcgtaacag acgcagaata tgttcaagtt atacatacat caatcatatt aggagtatat 660 tataatgttg gtagcgttga tttctacgtg aattatggaa aaaatcaacc tggttgcaat 720 gaaccatcct gctctcatac gaaagccgtg aaatatctga ctgagtgcat aaaacatgaa 780 tgttgtttaa ttggaacacc atggaagaaa tatttcagca ctccaaaacc aatttcccag 840 tgcagaggag acacctgtgt ttgcgttgga ttgaatgcaa aaagttatcc tgctagaggc 900 gcattttatg caccggttga agcaaatgca ccttattgcc ataacgaggg gattaaactt 960 taattataaa caaaagtcaa tgtacacaaa aatgtatcta ttgatgaata ttaaatgaat 1020 aaacgaacag tcaaataaaa aaaaaaaa 1048 <210> 2 <211> 320 <212> PRT <213> Polistes annularis <400> 2 Ile Cys Phe Leu Leu Asp Asp Ser Thr Thr Phe Arg Asn Gly Thr Leu 1 5 10 15 Asn Arg Gly Met Ser Pro Asp Cys Thr Phe Asn Glu Lys Asp Ile Val 20 25 30 Phe Tyr Val Tyr Ser Arg Asp Lys Arg Asp Gly Ile Ile Leu Lys Lys 35 40 45 Glu Thr Leu Thr Asn Tyr Asp Leu Phe Thr Lys Ser Thr Ile Ser Lys 50 55 60 Gln Val Val Phe Leu Ile His Gly Phe Leu Ser Thr Gly Asn Asn Glu 65 70 75 80 Asn Phe Val Ala Met Ser Lys Ala Leu Ile Glu Lys Asp Asp Phe Leu 85 90 95 Val Ile Ser Val Asp Trp Lys Lys Gly Ala Cys Asn Ala Phe Ala Ser 100 105 110 Thr Lys Asp Ala Leu Gly Tyr Ser Lys Ala Val Gly Asn Thr Arg His 115 120 125 Val Gly Lys Phe Val Ala Asp Phe Thr Lys Leu Leu Val Glu Lys Tyr 130 135 140 Lys Val Leu Ile Ser Asn Ile Arg Leu Ile Gly His Ser Leu Gly Ala 145 150 155 160 His Thr Ser Gly Phe Ala Gly Lys Glu Val Gln Lys Leu Lys Leu Gly 165 170 175 Lys Tyr Lys Glu Ile Ile Gly Leu Asp Pro Ala Gly Pro Tyr Phe His 180 185 190 Arg Ser Asp Cys Pro Asp Arg Leu Cys Val Thr Asp Ala Glu Tyr Val 195 200 205 Gln Val Ile His Thr Ser Ile Ile Leu Gly Val Tyr Tyr Asn Val Gly 210 215 220 Ser Val Asp Phe Tyr Val Asn Tyr Gly Lys Asn Gln Pro Gly Cys Asn 225 230 235 240 Glu Pro Ser Cys Ser His Thr Lys Ala Val Lys Tyr Leu Thr Glu Cys 245 250 255 Ile Lys His Glu Cys Cys Leu Ile Gly Thr Pro Trp Lys Lys Tyr Phe 260 265 270 Ser Thr Pro Lys Pro Ile Ser Gln Cys Arg Gly Asp Thr Cys Val Cys 275 280 285 Val Gly Leu Asn Ala Lys Ser Tyr Pro Ala Arg Gly Ala Phe Tyr Ala 290 295 300 Pro Val Glu Ala Asn Ala Pro Tyr Cys His Asn Glu Gly Ile Lys Leu 305 310 315 320 <210> 3 <211> 1273 <212> DNA <213> Polistes annularis <400> 3 tatgtgtcat tgtcccccga ctcagtattt aatatcatca ccgatgacat ctcccaccaa 60 attctttcca gatcgaattg tgaaagatcc aaaagaccga aaagggtctt cagcatttat 120 tggaacgttg ctacctttat gtgccaccaa tatggcatga atttcgacga ggtgacagat 180 tttaatatca aacataattc taaggacaat tttcgcggtg aaactatatc aatttattac 240
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Tyr Ser Ile Glu 145 150 155 160 Leu Val Arg Lys Glu His Pro Lys Trp Ser Glu Ser Met Ile Glu Ala 165 170 175 Glu Ala Thr Lys Lys Phe Glu Lys Tyr Ala Arg Tyr Phe Met Glu Glu 180 185 190 Thr Leu Lys Leu Ala Lys Lys Thr Arg Lys Arg Ala Lys Trp Gly Tyr 195 200 205 Tyr Gly Phe Pro Tyr Cys Tyr Asn Val Thr Pro Asn Asn Pro Gly Pro 210 215 220 Asp Cys Asp Ala Lys Ala Thr Ile Glu Asn Asp Arg Leu Ser Trp Met 225 230 235 240 Tyr Asn Asn Gln Glu Ile Leu Phe Pro Ser Val Tyr Val Arg His Glu 245 250 255 Gln Lys Pro Glu Glu Arg Val Tyr Leu Val Gln Gly Arg Ile Lys Glu 260 265 270 Ala Val Arg Ile Ser Asn Asn Leu Glu His Ser Pro Ser Val Leu Ala 275 280 285 Tyr Trp Trp Tyr Val Tyr Gln Asp Lys Met Asp Ile Tyr Leu Ser Glu 290 295 300 Thr Asp Val Glu Lys Thr Phe Gln Glu Ile Val Thr Asn Gly Gly Asp 305 310 315 320 Gly Ile Ile Ile Trp Gly Ser Ser Ser Asp Val Asn Ser Leu Ser Lys 325 330 335 Cys Lys Arg Leu Arg Glu Tyr Leu Leu Asn Thr Leu Gly Pro Phe Ala 340 345 350 Val Asn Val Thr Glu Thr Val Asn Gly Arg Ser Ser Leu Asn Phe 355 360 365 <210> 5 <211> 114 <212> DNA <213> Polistes annularis <400> 5 aggtaataat ctcgattcta tgcgtacgcg attttgttga ttatttttca agaaaatgta 60 agaaaaattt ttaaaaatat attactgaag tatgaaataa aaactttata cttt 114 <210> 6 <211> 127 <212> DNA <213> Polistes annularis <400> 6 ggtaatattt ttatattaaa atgaacaatt ctatggaata gaaatagtac aagcatcgat 60 tatatcctat gccttgttat atgatttcgg agttagacac tattattttt aaataatttt 120 tacatta 127 <210> 7 <211> 317 <212> PRT <213> Dolichovespula maculata <400> 7 Arg Leu Ile Met Phe Val Gly Asp Pro Ser Ser Ser Asn Glu Leu Asp 1 5 10 15 Arg Phe Ser Val Cys Pro Phe Ser Asn Asp Thr Val Lys Met Ile Phe 20 25 30 Leu Thr Arg Glu Asn Arg Lys His Asp Phe Tyr Thr Leu Asp Thr Met 35 40 45 Asn Arg His Asn Glu Phe Lys Lys Ser Ile Ile Lys Arg Pro Val Val 50 55 60 Phe Ile Thr His Gly Phe Thr Ser Ser Ala Thr Glu Lys Asn Phe Val 65 70 75 80 Ala Met Ser Glu Ala Leu Met His Thr Gly Asp Phe Leu Ile Ile Met 85 90 95 Val Asp Trp Arg Met Ala Ala Cys Thr Asp Glu Tyr Pro Gly Leu Lys 100 105 110 Tyr Met Phe Tyr Lys Ala Ala Val Gly Asn Thr Arg Leu Val Gly Asn 115 120 125 Phe Ile Ala Met Ile Ala Lys Lys Leu Val Glu Gln Tyr Lys Val Pro 130 135 140 Met Thr Asn Ile Arg Leu Val Gly His Ser Leu Gly Ala His Ile Ser 145 150 155 160 Gly Phe Ala Gly Lys Arg Val Gln Glu Leu Lys Leu Gly Lys Phe Ser 165 170 175 Glu Ile Ile Gly Leu Asp Pro Ala Gly Pro Ser Phe Lys Lys Asn Asp 180 185 190 Cys Ser Glu Arg Ile Cys Glu Thr Asp Ala His Tyr Val Gln Ile Leu 195 200 205 His Thr Ser Ser Asn Leu Gly Thr Glu Arg Thr Leu Gly Thr Val Asp 210 215 220 Phe Tyr Ile Asn Asn Gly Ser Asn Gln Pro Gly Cys Arg Tyr Ile Ile 225 230 235 240 Gly Glu Thr Cys Ser His Thr Arg Ala Val Lys Tyr Phe Thr Glu Cys 245 250 255 Ile Arg Arg Glu Cys Cys Leu Ile Gly Val Pro Gln Ser Lys Asn Pro 260 265 270 Gln Pro Val Ser Lys Cys Thr Arg Asn Glu Cys Val Cys Val Gly Leu 275 280 285 Asn Ala Lys Lys Tyr Pro Lys Arg Gly Ser Phe Tyr Val Pro Val Glu 290 295 300 Ala Glu Ala Pro Tyr Cys Asn Asn Asn Gly Lys Ile Ile 305 310 315 <210> 8 <211> 300 <212> PRT <213> Vespula vulgaris <400> 8 Gly Pro Lys Cys Pro Phe Asn Ser Asp Thr Val Ser Ile Ile Ile Glu 1 5 10 15 Thr Arg Glu Asn Arg Asn Arg Asp Leu Tyr Thr Leu Gln Thr Leu Gln 20 25 30 Asn His Pro Glu Phe Lys Lys Lys Thr Ile Thr Arg Pro Val Val Phe 35 40 45 Ile Thr His Gly Phe Thr Ser Ser Ala Ser Glu Thr Asn Phe Ile Asn 50 55 60 Leu Ala Lys Ala Leu Val Asp Lys Asp Asn Tyr Met Val Ile Ser Ile 65 70 75 80 Asp Trp Gln Thr Ala Ala Cys Thr Asn Glu Ala Ala Gly Leu Lys Tyr 85 90 95 Leu Tyr Tyr Pro Thr Ala Ala Arg Asn Thr Arg Leu Val Gly Gln Tyr 100 105 110 Ile Ala Thr Ile Thr Gln Lys Leu Val Lys His Tyr Lys Ile Ser Met 115 120 125 Ala Asn Ile Arg Leu Ile Gly His Ser Leu Gly Ala His Ala Ser Gly 130 135 140 Phe Ala Gly Lys Lys Val Gln Glu Leu Lys Leu Gly Lys Tyr Ser Glu 145 150 155 160 Ile Ile Gly Leu Asp Pro Ala Arg Pro Ser Phe Asp Ser Asn His Cys 165 170 175 Ser Glu Arg Leu Cys Glu Thr Asp Ala Glu Tyr Val Gln Ile Ile His 180 185 190 Thr Ser Asn Tyr Leu Gly Thr Glu Lys Thr Leu Gly Thr Val Asp Phe 195 200 205 Tyr Met Asn Asn Gly Lys Asn Gln Pro Gly Cys Gly Arg Phe Phe Ser 210 215 220 Glu Val Cys Ser His Ser Arg Ala Val Ile Tyr Met Ala Glu Cys Ile 225 230 235 240 Lys His Glu Cys Cys Leu Ile Gly Ile Pro Lys Ser Lys Ser Ser Gln 245 250 255 Pro Ile Ser Ser Cys Thr Lys Gln Glu Cys Val Cys Val Gly Leu Asn 260 265 270 Ala Lys Lys Tyr Thr Ser Arg Gly Ser Phe Tyr Val Pro Val Glu Ser 275 280 285 Thr Val Pro Phe Cys Asn Asn Lys Gly Lys Ile Ile 290 295 300 <210> 9 <211> 94 <212> DNA <213> Polistes annularis <400> 9 atttttctac tacagttctt tttatctctc tatcattgat gataaatcgt ttaaatcgat 60 ctattgtaaa ttatctatcg attgtttagg caaa 94 <210> 10 <211> 347 <212> PRT <213> Apis melliferis <400> 10 Asn Asn Lys Thr Val Arg Glu Phe Asn Val Tyr Trp Asn Val Pro Thr 1 5 10 15 Phe Met Cys His Lys Tyr Gly Leu Arg Phe Glu Glu Val Ser Glu Lys 20 25 30 Tyr Gly Ile Leu Gln Asn Trp Met Asp Lys Phe Arg Gly Glu Glu Ile 35 40 45 Ala Ile Leu Tyr Asp Pro Gly Met Phe Pro Ala Leu Leu Lys Asp Pro 50 55 60 Asn Gly Asn Val Val Ala Arg Asn Gly Gly Val Pro Gln Leu Gly Asn 65 70 75 80 Leu Thr Lys His Leu Gln Val Phe Arg Asp His Tyr Ile Asn Gln Ile 85 90 95 Pro Asp Lys Ser Phe Pro Gly Val Gly Val Ile Asp Phe Glu Ser Trp 100 105 110 Arg Pro Ile Phe Arg Gln Asn Trp Ala Ser Leu Gln Pro Tyr Lys Lys 115 120 125 Leu Ser Val Glu Val Val Arg Arg Glu His Pro Phe Trp Asp Asp Gln 130 135 140 Arg Val Glu Gln Glu Ala Lys Arg Arg Phe Glu Lys Tyr Gly Gln Leu 145 150 155 160 Phe Met Glu Glu Thr Leu Lys Ala Ala Lys Arg Met Arg Pro Ala Ala 165 170 175 Asn Trp Gly Tyr Tyr Ala Tyr Pro Tyr Cys Tyr Asn Leu Thr Pro Asn 180 185 190 Gln Pro Ser Ala Gln Cys Glu Ala Thr Thr Met Gln Glu Asn Asp Lys 195 200 205 Met Ser Trp Leu Phe Glu Ser Glu Asp Val Leu Leu Pro Ser Val Tyr 210 215 220 Leu Arg Trp Asn Leu Thr Ser Gly Glu Arg Val Gly Leu Val Gly Gly 225 230 235 240 Arg Val Lys Glu Ala Leu Arg Ile Ala Arg Gln Met Thr Thr Ser Arg 245 250 255 Lys Lys Val Leu Pro Tyr Tyr Trp Tyr Lys Tyr Gln Asp Arg Arg Asp 260 265 270 Thr Asp Leu Ser Arg Ala Asp Leu Glu Ala Thr Leu Arg Lys Ile Thr 275 280 285 Asp Leu Gly Ala Asp Gly Phe Ile Ile Trp Gly Ser Ser Asp Asp Ile 290 295 300 Asn Thr Lys Ala Lys Cys Leu Gln Phe Arg Glu Tyr Leu Asn Asn Glu 305 310 315 320 Leu Gly Pro Ala Val Lys Arg Ile Ala Leu Asn Asn Asn Ala Asn Asp 325 330 335 Arg Leu Thr Val Asp Val Ser Val Asp Gln Val 340 345 <210> 11 <211> 331 <212> PRT <213> Dolichovespula maculata <400> 11 Ser Glu Arg Pro Lys Arg Val Phe Asn Ile Tyr Trp Asn Val Pro Thr 1 5 10 15 Phe Met Cys His Gln Tyr Gly Leu Tyr Phe Asp Glu Val Thr Asn Phe 20 25 30 Asn Ile Lys His Asn Ser Lys Asp Asp Phe Gln Gly Asp Lys Ile Ser 35 40 45 Ile Phe Tyr Asp Pro Gly Glu Phe Pro Ala Leu Leu Pro Leu Lys Glu 50 55 60 Gly Asn Tyr Lys Ile Arg Asn Gly Gly Val Pro Gln Glu Gly Asn Ile 65 70 75 80 Thr Ile His Leu Gln Arg Phe Ile Glu Asn Leu Asp Lys Thr Tyr Pro 85 90 95 Asn Arg Asn Phe Asn Gly Ile Gly Val Ile Asp Phe Glu Arg Trp Arg 100 105 110 Pro Ile Phe Arg Gln Asn Trp Gly Asn Met Met Ile His Lys Lys Phe 115 120 125 Ser Ile Asp Leu Val Arg Asn Glu His Pro Phe Trp Asp Lys Lys Met 130 135 140 Ile Glu Leu Glu Ala Ser Lys Arg Phe Glu Lys Tyr Ala Arg Leu Phe 145 150 155 160 Met Glu Glu Thr Leu Lys Leu Ala Lys Lys Thr Arg Lys Gln Ala Asp 165 170 175 Trp Gly Tyr Tyr Gly Tyr Pro Tyr Cys Phe Asn Met Ser Pro Asn Asn 180 185 190 Leu Val Pro Asp Cys Asp Ala Thr Ala Met Leu Glu Asn Asp Lys Met 195 200 205 Ser Trp Leu Phe Asn Asn Gln Asn Val Leu Leu Pro Ser Val Tyr Ile 210 215 220 Arg His Glu Leu Thr Pro Asp Gln Arg Val Gly Leu Val Gln Gly Arg 225 230 235 240 Val Lys Glu Ala Val Arg Ile Ser Asn Asn Leu Lys His Ser Pro Lys 245 250 255 Val Leu Ser Tyr Trp Trp Tyr Val Tyr Gln Asp Asp Thr Asn Thr Phe 260 265 270 Leu Thr Glu Thr Asp Val Lys Lys Thr Phe Gln Glu Ile Ala Ile Asn 275 280 285 Gly Gly Asp Gly Ile Ile Ile Trp Gly Ser Ser Ser Asp Val Asn Ser 290 295 300 Leu Ser Lys Cys Lys Arg Leu Arg Glu Tyr Leu Leu Thr Val Leu Gly 305 310 315 320 Pro Ile Thr Val Asn Val Thr Glu Thr Val Asn 325 330 <210> 12 <211> 331 <212> PRT <213> Vespula vulgaris <400> 12 Ser Glu Arg Pro Lys Arg Val Phe Asn Ile Tyr Trp Asn Val Pro Thr 1 5 10 15 Phe Met Cys His Gln Tyr Asp Leu Tyr Phe Asp Glu Val Thr Asn Phe 20 25 30 Asn Ile Lys Arg Asn Ser Lys Asp Asp Phe Gln Gly Asp Lys Ile Ala 35 40 45 Ile Phe Tyr Asp Pro Gly Glu Phe Pro Ala Leu Leu Ser Leu Lys Asp 50 55 60 Gly Lys Tyr Lys Lys Arg Asn Gly Gly Val Pro Gln Glu Gly Asn Ile 65 70 75 80 Thr Ile His Leu Gln Lys Phe Ile Glu Asn Leu Asp Lys Ile Tyr Pro 85 90 95 Asn Arg Asn Phe Ser Gly Ile Gly Val Ile Asp Phe Glu Arg Trp Arg 100 105 110 Pro Ile Phe Arg Gln Asn Trp Gly Asn Met Lys Ile His Lys Asn Phe 115 120 125 Ser Ile Asp Leu Val Arg Asn Glu His Pro Thr Trp Asn Lys Lys Met 130 135 140 Ile Glu Leu Glu Ala Ser Lys Arg Phe Glu Lys Tyr Ala Arg Phe Phe 145 150 155 160 Met Glu Glu Thr Leu Lys Leu Ala Lys Lys Thr Arg Lys Gln Ala Asp 165 170 175 Trp Gly Tyr Tyr Gly Tyr Pro Tyr Cys Phe Asn Met Ser Pro Asn Asn 180 185 190 Leu Val Pro Glu Cys Asp Val Thr Ala Met His Glu Asn Asp Lys Met 195 200 205 Ser Trp Leu Phe Asn Asn Gln Asn Val Leu Leu Pro Ser Val Tyr Val 210 215 220 Arg Gln Glu Leu Thr Pro Asp Gln Arg Ile Gly Leu Val Gln Gly Arg 225 230 235 240 Val Lys Glu Ala Val Arg Ile Ser Asn Asn Leu Lys His Ser Pro Lys 245 250 255 Val Leu Ser Tyr Trp Trp Tyr Val Tyr Gln Asp Glu Thr Asn Thr Phe 260 265 270 Leu Thr Glu Thr Asp Val Lys Lys Thr Phe Gln Glu Ile Val Ile Asn 275 280 285 Gly Gly Asp Gly Ile Ile Ile Trp Gly Ser Ser Ser Asp Val Asn Ser 290 295 300 Leu Ser Lys Cys Lys Arg Leu Gln Asp Tyr Leu Leu Thr Val Leu Gly 305 310 315 320 Pro Ile Ala Ile Asn Val Thr Glu Ala Val Asn 325 330

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 37/06 Ｃ０７Ｋ 19/00 37/08 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ０７Ｋ 19/00 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 9/16 Ｄ 1/21 9/26 5/10 15/00 ＺＮＡＡ 9/16 5/00 Ａ 9/26 Ａ６１Ｋ 37/54 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA11 BA12 CA04 CA07 DA01 DA02 DA05 DA11 GA11 4B050 CC01 CC05 DD11 EE01 LL01 LL03 LL05 4B065 AA01X AA58X AA72X AA87X AA90Y AB01 AC14 BA02 CA44 CA46 4C084 AA02 AA13 DC22 MA52 MA56 MA59 NA14 ZB082 ZB132 ZB322 ZB332 ZC552 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 BA41 CA51 DA83 DA89 EA20 EA50 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素をコードする単離された核酸
分子であって、該核酸は、ゲノム配列、または免疫調節性フラグメントもしくは
その誘導体を有さず、該誘導体は、置換、挿入および／または欠失により、該核
酸配列を改変することによって、形成される、単離された核酸分子。
【請求項２】前記核酸分子が、天然のＰｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素をコ
ードする核酸において見出されない内部配列を含む、請求項１に記載の単離され
た核酸分子。
【請求項３】前記Ｐｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵素が、ホスホリパーゼであ
る、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項４】請求項３に記載の単離された核酸分子であって、前記スズメ
バチ毒液酵素が、ｐｏｌｉｓｔｅｓａｎｎｕａｒｉｓ種に由来するホスホリパ
ーゼＡ₁であり、そして配列番号２のアミノ酸配列、またはその免疫調節性フラ
グメントを含む、単離された核酸分子。
【請求項５】前記核酸分子が、配列番号１のＤＮＡ配列、またはその免疫
調節性フラグメントを含む、請求項４に記載の単離された核酸分子。
【請求項６】前記核酸分子が、中程度のストリンジェンシー条件下で、配
列番号１のＤＮＡ配列を有する単離された核酸分子にハイブリダイズし得る、請
求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項７】前記スズメバチ毒液酵素が、ヒアルロニダーゼである、請求
項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項８】請求項７に記載の単離された核酸分子であって、前記スズメ
バチ毒液酵素が、ｐｏｌｉｓｔｅｓａｎｎｕａｒｉｓ種に由来し、該スズメバ
チ毒液酵素は、配列番号４のアミノ酸配列、またはその免疫調節性フラグメント
を含む、単離された核酸分子。
【請求項９】前記単離された核酸分子が、配列番号３のＤＮＡ配列、また
はその免疫調節性フラグメントを含む、請求項８に記載の単離された核酸分子。
【請求項１０】前記核酸分子が、中程度のストリンジェンシー条件下で、
配列番号３のＤＮＡ配列を有する単離された核酸分子にハイブリダイズし得る、
請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項１１】必要に応じてプロモーターと関連する、請求項１〜１０の
いずれか１項に記載の単離された核酸分子を含む、発現ベクター。
【請求項１２】請求項１１に記載の発現ベクターを含む、細胞。
【請求項１３】Ｐｏｌｉｓｉｎａｅ毒液酵素、その保存された改変体、そ
の免疫調節性フラグメント、またはその誘導体を産生するための方法であって、
該方法は以下：（ａ）請求項１２に記載の細胞を培養して、その結果、Ｐｏｌｉｓｉｎａｅ
毒液酵素、その保存された改変体、その免疫調節性フラグメント、あるいはその
アナログまたは誘導体を、該細胞によって産生する、工程；および（ｂ）該培養物、該細胞、またはその両方から産生されたＰｏｌｉｓｉｎａ
ｅ毒液酵素、その保存された改変体、その免疫調節性フラグメント、あるいはそ
のアナログまたは誘導体を回収する、工程、を包含する、方法。
【請求項１４】融合タンパク質である、請求項１に記載の核酸によってコ
ードされる、組換えＰｏｌｉｓｉｎａｅ毒液酵素。
【請求項１５】前記核酸分子が、前記天然のＰｏｌｉｓｔｉｎａｅ毒液酵
素をコードする核酸において見出されない内部配列を含む、請求項１４に記載の
組換えＰｏｌｉｓｉｎａｅ毒液酵素融合タンパク質。
【請求項１６】細菌または酵母細胞により発現される、請求項１４に記載
の組換えＰｏｌｉｓｉｎａｅ毒液酵素融合タンパク質。
【請求項１７】前記酵素が特定のプロテアーゼに関する切断部位をさらに
含む、請求項１４に記載の組換えＰｏｌｉｓｉｎａｅ毒液酵素融合タンパク質。
【請求項１８】前記酵素がポリヒスチジン配列を含む、請求項１４に記載
の組換えＰｏｌｉｓｉｎａｅ毒液酵素融合タンパク質。
【請求項１９】請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の組換えＰｏｌｉ
ｓｉｎａｅ毒液を含む、哺乳動物中の免疫源に対する免疫応答を調節するための
薬学的組成物、および薬学的に受容可能なキャリア。
【請求項２０】哺乳動物中の免疫源に対する免疫応答を調節するための医
薬品の製造における、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の組換えＰｏｌｉ
ｓｉｎａｅ毒液の使用。
【請求項２１】前記免疫応答が、スズメバチ毒液アレルゲン特異的アレル
ギー状態である、請求項１９に記載の組成物、または請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】前記免疫応答が、免疫学的に罹患した疾患または障害もし
くはそれらに関連した症状である、請求項１９に記載の組成物、または請求項２
０に記載の使用。
【請求項２３】前記免疫学的に罹患した疾患または障害が、病原性疾患も
しくは障害；ウイルス感染；自己免疫状態；アレルギー状態；あるいはそれらの
２つ以上の組み合わせである、請求項２２に記載の組成物または使用。
【請求項２４】前記ウイルス感染が、ＨＩＶ、単純疱疹ウイルス、または
パピローマウイルスから選択されたウイルスによるものである、請求項２３に記
載の組成物または使用。
【請求項２５】前記アレルギー状態が、膜翅目の毒液に対するアレルギー
である、請求項２３に記載の組成物または使用。
【請求項２６】経口投与、肺投与、経鼻投与、局所投与、もしくは全身性
投与のための、請求項１９〜２５のいずれか１項に記載の組成物または使用。