CN109182299A - 耐受过氧化氢的枯草芽胞杆菌脂肪酶突变体及其制备方法 - Google Patents

耐受过氧化氢的枯草芽胞杆菌脂肪酶突变体及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了耐受过氧化氢的枯草芽胞杆菌脂肪酶突变体及其制备方法，脂肪酶突变体多肽链的氨基酸序列及其基因序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。本发明还包含了所含的脂肪酶突变基因的重组质粒及转化子。本发明利用ESI‑Q‑TOF‑MS分析脂肪酶经过氧化氢处理前后分子量的变化，确定被氧化氨基酸残基类型；进而利用丙氨酸扫描法确定被氧化氨基酸残基的位置；最后，利用定点突变技术和叠加突变技术，构建并筛选出对过氧化氢有良好耐受能力的脂肪酶突变体。利用本方法构建、筛选的脂肪酶突变体，阳性突变率为75%；其中LipA‑Trp42Ala/Met134Glu耐受过氧化氢的C 50提高了10倍。

Description

耐受过氧化氢的枯草芽胞杆菌脂肪酶突变体及其制备方法
技术领域
本发明涉及耐受过氧化氢的枯草芽胞杆菌脂肪酶突变体及其制备方法，属于基因工程及酶工程技术领域。
背景技术
微生物脂肪酶，是一类能够催化长链甘油三酯水解（或合成）的生物催化剂。除了水解（或酯化）反应外，微生物脂肪酶还能催化酯交换、醇解和氨解等类型的化学反应。微生物脂肪酶催化各类反应，具有良好的底物特异性（对映体选择性、链长选择性和位点选择性等），催化活性不依赖于特定辅助因子等特点。微生物脂肪酶还是一种非水相酶，具有独特的界面激活的催化特性。作为第一个实现商业化生产的工业生物催化剂，微生物脂肪酶已被广泛应用于洗涤剂添加剂、食品加工、生物质能源生产、高分子材料的合成和制药等诸多领域。
除了催化上述各类反应类型外，微生物脂肪酶还具有多功能催化活性。在一定的催化条件下，微生物脂肪酶还可以催化-C-C-键、-C-N-键的合成反应，杂环化合物或汉奇吡啶类化合物的合成反应、过水解反应、Prileshajev氧化反应和Baeyer-Villiger氧化反应等各种反应。微生物脂肪酶在非水相条件下催化Baeyer-Villiger氧化反应的能力，吸引了有机合成化学家的广泛兴趣和深入研究。微生物脂肪酶的多功能催化活性与其催化机制密切相关。已解析的微生物脂肪酶催化水解反应的分子机制表明：丝氨酸、天冬氨酸（或谷氨酸）和组氨酸组成了脂肪酶活性中心的催化三联体。丝氨酸的羟基首先攻击进入活性中心的酯类化合物酯键的羰基碳原子，形成过渡态中间复合物。组氨酸夺取活性中心水分子的质子氢，形成带负电荷的羟基；该活化的羟基进而攻击过渡态中间复合物，酯键断裂，释放出游离的脂肪酸和醇。微生物脂肪酶的活性中心，除了可以活化水分子外，还可以活化H2O2分子，从而表现出催化过水解反应、Prileshajev氧化和Baeyer-Villiger氧化反应等反应的能力。
过氧化氢是一种强氧化剂，能氧化断裂（或破坏）蛋白质内的二硫键及多种氨基酸残基，因此有必要筛选出耐受过氧化氢能力强的脂肪酶突变体，从而为开发出能高效催化Baeyer-Villiger氧化反应的微生物脂肪酶奠定基础。枯草芽胞杆菌脂肪酶LipA分子不含二硫键，其耐受过氧化氢的能力高于目前广泛使用的南极假丝酵母脂肪酶B，在催化Baeyer-Villiger氧化反应方面具有潜在的优势。在以前的实验中，我们发现枯草芽胞杆菌脂肪酶经过氧化氢处理后，分子量增加了64。结合氨基酸残基氧化态结构分析，本申请利用蛋白质工程技术（活性中心丙氨酸扫描、定点突变和叠加突变）成功构建并筛选到具有优良耐受过氧化氢能力的枯草芽胞杆菌脂肪酶A突变体。
发明内容
本发明的目的在于提供耐受过氧化氢的枯草芽胞杆菌脂肪酶突变体及其制备方法，获得比野生型枯草芽胞杆菌脂肪酶具有更好耐受过氧化氢能力的突变体，提高枯草芽胞杆菌脂肪酶催化过水解反应的能力，促进其在油脂加工、环氧化合物的合成等领域的应用。
为实现上述目的，采用以下技术方案：
耐受过氧化氢的枯草芽胞杆菌脂肪酶突变体LipA-Trp42Ala/Met134Glu，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述突变体的编码基因，序列如SEQ ID NO.2所示。
耐受过氧化氢的枯草芽胞杆菌脂肪酶突变体的第42位氨基酸和第134位氨基酸残基同时发生了突变。第42位氨基酸由色氨酸突变为丙氨酸，第134位氨基酸由甲硫氨酸突变为谷氨酸，该脂肪酶突变体耐受过氧化氢的C 50 浓度值提高了10倍（由20 mmol/L增加到200mmol/L）；在4℃ 200 mmol/LH2O2处理条件下，脂肪酶突变体在过氧化氢溶液中的半衰期由25分钟提高到3.8 h，提高了9.1倍。
一种快速构建过氧化氢耐受性枯草芽胞杆菌脂肪酶突变体的方法。 包括下列步骤：
（1）利用一定浓度的过氧化氢处理电泳纯的枯草芽胞杆菌脂肪酶LipA；一定时间后，利用ESI-Q-TOF-MS分析枯草芽胞杆菌脂肪酶LipA经过氧化氢处理前后分子量的变化，确定被氧化氨基酸残基类型；
（2）利用丙氨酸扫描法，确定被氧化的氨基酸残基在脂肪酶LipA多肽链中的位置；
（3）基于氨基酸的结构特点及其耐受氧化剂能力的差异，确定可替换的氨基酸残基类型，利用定点突变技术，筛选出阳性突变体；
（4）利用叠加突变技术，构建并筛选过氧化氢耐受能力进一步提高的脂肪酶突变体。
耐受过氧化氢枯草芽胞杆菌脂肪酶突变体蛋白的具体制备方法如下:
(1) 野生型枯草芽胞杆菌脂肪酶LipA的基因序列及其编码的氨基酸序列如SEQ IDNO. 4、SEQ ID NO. 3所示；所述野生型枯草芽胞杆菌脂肪酶lipA基因为本课题组克隆并保存；
(2) 将编码枯草芽胞杆菌脂肪酶成熟肽的基因插入到经限制性内切酶（E. coRⅠ和Hind Ⅲ）酶切后的pET22b载体中，构建表达质粒（结构特征如图1）；经转化Escherichia coli BL21(DE3)菌株，后筛选重组子（测序验证）；
(3)上述经测序验证阅读框编码正确后，对应转化子利用IPTG诱导携带的外源脂肪酶基因的表达；离心收集细胞，并超声裂解细胞；离心收集上清液，并利用Ni-NTA亲和层析柱纯化重组脂肪酶LipA；SDS-PAGE电泳检测纯度；
(4) 电泳纯的枯草芽胞杆菌脂肪酶LipA经一定浓度的过氧化氢处理一定时间后，超滤移除过氧化氢；利用ESI-Q-TOF-MS分析枯草芽胞杆菌脂肪酶LipA经过氧化氢处理前后分子量的变化（本申请中，分子量变化值为64）；
(5)基于氨基酸的结构特点，可以确定被氧化的氨基酸残基为Met和Trp；
(6) 利用丙氨酸扫描技术对枯草芽胞杆菌脂肪酶分子中的所有Trp和Met进行置换突变，测定突变体耐受过氧化氢的能力，并与野生型枯草芽胞杆菌脂肪酶的耐受能力进行比较，确定被氧化氨基酸残基的位点（本申请中，确定为第42位的Trp和第134位的Met被氧化）；
(7)分析氨基酸的结构特点，从二十种氨基酸残基中，筛选出对过氧化氢具有较好耐受能力的Ile、Val、Asp和Glu作为潜在的置换氨基酸残基，分别替换Trp42和Met134；
(8)利用定点突变技术，分别在脂肪酶基因的对应位置引入突变，构建Mini-突变文库，筛选对过氧化氢具有较好耐受能力的突变体，本申请共获得6个阳性突变体，分别为：LipA-Trp42Ile、LipA-Trp42Asp、LipA-Trp42Glu、LipA-Met134Ile、LipA-Met134Asp和LipA-Met134Val；阳性突变率为75%。
(9) 利用叠加突变技术，将上述42位和134表现优良的突变体进一步进行叠加突变，其中LipA-Trp42Ala/Met134Glu耐受过氧化氢的C 50提高了10倍。
本发明还提供包含所述基因的表达盒、重组质粒和转化子。所述表达盒的启动子为T7启动子，在大肠杆菌菌株中为Ampicillin抗性；所述重组质粒的原始载体为质粒pET22b；所述转化子的宿主细胞为Escherichia coli BL21(DE3)。
本发明的优点在于：
基于实验数据及蛋白质结构特点，快速确定突变位点，并构建微型的Mini突变体文库，筛选出目标突变体。利用本发明提供的方法构建的Mini突变文库，具有极高的阳性突变率，本实验阳性突变频率达到75%，有效降低了筛选突变文库的工作量；快速获得目标目标突变体，突变体LipA-Trp42Ala/Met134Glu耐受过氧化氢的C 50 浓度值提高了10倍；在4℃ 200mmol/LH2O2处理条件下，突变体在过氧化氢溶液中的半衰期提高了9.1倍。耐受过氧化氢脂肪酶突变体的构建，对开发脂肪酶的过水解酶活及其催化环氧化反应能力，扩大脂肪酶在油脂深加工，手性醇拆分，高分子材料的合成等领域的应用，具有重要的意义。
附图说明
图1 重组表达质粒 pET22b-lipA及其基因表达盒。
图2 枯草芽胞杆菌脂肪酶A 3D结构图及其突变位点在3D结构图上的位置。
具体实施方式
以下结合实例来进一步说明本发明。实例所描述的具体反应体系、浓度及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。本发明实施中未注明的实验方法，如感受态细胞制备、转化等参照《分子克隆实验指南》第三版(J.萨姆布鲁克、D.W.拉塞尔著，黄培堂译，科学出版社，2002)中的方法进行。
实施例1、B. subtilis 脂肪酶A编码基因lipA相关载体及表达体系的构建
B. subtilis 脂肪酶A的编码基因lipA由本课题组自主克隆并保存（已提交NCBI核酸数据库，登录号为JX048066），其编码的成熟肽链由181个氨基酸残基组成，脂肪酶LipA的成熟肽链氨基酸残基组成及其编码基因见SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。脂肪酶成熟肽编码基因lipA通过PCR扩增，向其5'端和3'端分别添加E. coRⅠ和Hind Ⅲ酶切位点，并利用此限制性内切酶酶切位点，将脂肪酶基因lipA插入到表达载体pET22b的多克隆位点，构建重组质粒pET22b-lipA。将测序验证读码框后，重组质粒导入到E. coli BL21(DE3) 菌株内，构建重组表达菌株E. coli BL21(DE3) -pET22b-lipA。
实施例2、突变位点的筛选及确定
（1）重组脂肪酶LipA多肽链中被过氧化氢氧化的氨基酸残基范围的筛选
重组菌株E. coli BL21(DE3) -pET22b-lipA经IPTG诱导脂肪酶基因表达后，离心收集细胞，超声裂解细胞，离心收集上清液。上清液利用Ni-NTA亲和层析柱分离纯化出重组的脂肪酶LipA蛋白，SDS-PAGE电泳检测纯度，收集电泳纯的重组脂肪酶LipA溶液。电泳纯的脂肪酶LipA经过氧化氢处理后，移除过氧化氢。利用ESI-Q-TOF-MS测定枯草芽胞杆菌脂肪酶LipA经过氧化氢处理后的分子量，并与未经过氧化氢处理的脂肪酶LipA的分子量进行比较。实验结果表明：经过氧化氢处理后，重组脂肪酶LipA的分子量增加了64。
结合氨基酸残基氧化态和还原态的结构差异，可以推测被氧化的氨基酸残基应该为甲硫氨酸残基或色氨酸残基。进一步分析重组脂肪酶LipA多肽链的氨基酸残基序列，可以判断被氧化的氨基酸残基应该是：Met8、Met78、Met134、Met137、Trp31或Trp42。
（2）利用丙氨酸扫描法，确定重组脂肪酶LipA多肽链中被过氧化氢氧化的氨基酸残基所在的位点
利用定点突变技术，将脂肪酶LipA多肽链中上述氨基酸残基均替换为Ala残基，并测定脂肪酶LipA突变体耐受过氧化氢的能力，并与野生型脂肪酶LipA进行比较，筛选出耐受能力提高的突变体。具体实施方法如下：
利用基因工程技术，向lipA基因中引入突变核苷酸。以pET22b-lipA质粒为模板，进行定点PCR扩增，构建上述氨基酸残基（Met8、Met78、Met134、Met137、Trp31或Trp42）被丙氨酸残基替换的脂肪酶A突变体。PCR扩增体系为20μL，包含：PrimeSTAR HS DNA 聚合酶0.2 μL，1 μL上游引物 (10 μmol/L)，1μL下游引物(10 μmol/L)，1 μL pET22b-lipA质粒模板(100 ng/μL)，2 μLdNTP，4 μL 5×PS buffer，高温灭菌的超纯水补至总体积20 μL。PCR扩增使用的引物对见下表。
突变位点（丙氨酸扫描）使用的PCR扩增引物对及其PCR扩增时使用的退火温度
上述PCR 反应产物用0.3 μL Dpn I 在37 ℃下酶解3 h 以消除模板pET22b-lipA质粒。酶解产物采用热激法转化感受态细胞E. coli BL21(DE3)，转化子液涂布含有氨苄青霉素(50 µg/ µL)的LB固体平板，37 ℃培养12 h。挑取单菌落转化子并测序验证；测序验证正确的重组子进行后续实验。
测序正确的重组大肠杆菌菌株经IPTG诱导脂肪酶基因表达后，离心收集细胞；超声裂解细胞，离心收集上清液，获得脂肪酶LipA突变体粗酶液。粗酶液经一定浓度的过氧化氢处理后，测定其参与酶活；并与野生型脂肪酶LipA进行比较。实验结果表明：上述六个突变体中，仅两个突变体(LipA-Trp42Ala和LipA-Met134Ala)对过氧化氢的耐受性有明显提高（较野生型分别提高了13.3%和18.3%）。由此可以确定：过氧化氢对脂肪酶LipA的氧化破坏主要是氧化了多肽链中第42位的色氨酸残基和第134位的甲硫氨酸残基。
实施例3、Mini突变文库的构建及耐受过氧化氢脂肪酶LipA突变体的筛选
基于氨基酸残基的结构特点，可以分析出：组成蛋白质的20种氨基酸残基中，Asp、Glu、Val和Ile等四个氨基酸残基对过氧化氢不敏感，因此拟对实施例2中确定的两个突变位点（Trp42和Met134）分别通过定点突变技术，置换为Asp、Glu、Val或Ile，形成一个由八个突变体组成Mini突变文库。定点突变及突变文库的构建方法同实施例2，定点突变使用的引物对及PCR扩增使用的退火温度如下表。
构建Mini突变文库使用的PCR扩增引物对及其PCR扩增时使用的退火温度
Mini突变文库重组蛋白经筛选后，上述八个突变体，一共有六个突变体表现为阳性突变（如下表），阳性突变频率达到75%。其中LipA-Trp42I和LipA-Met134E在过氧化氢溶液中，表现出优良的稳定性。
经过氧化氢处理后，脂肪酶突变体残余酶活较野生型脂肪酶提高的比例
#：P<0.05，有显著性差异；*：P<0.01，极显著性差异。
实施例4 叠加突变及重组突变体LipA-Trp42Ala/Met134Glu蛋白的制备及其酶学性质表征
利用定点突变技术，将实施例2中筛选到的第42位的阳性突变体与第134位的阳性突变体进行叠加突变。叠加突变基因的构建方法参照实施例2；PCR扩增引物及退火温度参照实施例3；叠加突变体耐受过氧化氢能力的测定参照实施例1；叠加突变体的纯化参照实施例1进行。
叠加突变体耐受过氧化氢能力的检测结果如下表。从表中可以看出，除少数个别叠加突变体外（如LipA-Trp42Ala/Met134Val），其他叠加突变体均表现出显著性的提高。特别是叠加突变体LipA-Trp42Ala/Met134Glu和LipA-Met134Ala/Trp42Ile，提高幅度分别高达50.7%和48.6%。
经过氧化氢处理后，脂肪酶叠加突变体残余酶活较野生型脂肪酶提高的比例
#：P<0.05，有显著性差异；*：P<0.01，极显著性差异。
对上述叠加突变体中，耐受过氧化氢最为优良的突变体LipA-Trp42Ala/Met134Glu进行分离纯化。重组蛋白的分离纯化参照实施例1。先用ddH2O清洗泵和柱子，然后用5-10个柱体积的平衡缓冲液以平衡HisTrap HP，再以0.5 ml/min的速度上样粗酶液，最后用洗脱缓冲液进行梯度洗脱：流速0.5mL/min，洗脱时间为30 min，每管收集2mL。并进行SDS-PAGE电泳分析。收集电泳纯的重组脂肪酶LipA突变体LipA-Trp42Ala/Met134Glu，其基因序列如SEQ ID NO.2所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
经透析脱盐后测定突变体的C 50和酶学基础常数，并与野生型枯草芽胞杆菌脂肪酶的C 50及酶学常数进行比较。
C 50是指枯草芽胞杆菌脂肪酶残余酶活为50%时对应的过氧化氢浓度。具体实施方法：蛋白终浓度为0.1mg/mL的 B. subtilis 脂肪酶LipA经由终浓度范围为0-500mmol/L的H2O2处理，条件为：置于4℃处理1 h，之后向体系中加入过氧化氢酶消除反应体系中剩余的过氧化氢。测定经过氧化氢处理后的脂肪酶残余酶活。脂肪酶酶活是未经处理的酶活的50%时所对应的过氧化氢浓度即为C 50值。
半衰期的定义：在4℃的条件下，将终浓度为0.1mg/mL的B. subtilis 脂肪酶LipA用终浓度为200 mmol/L的H2O2处理，时间范围：0-6 h。脂肪酶残余酶活是未经过氧化氢处理的酶活的50%时所对应的时间即为半衰期。
叠加突变体LipA-Trp42Ala/Met134Glu经Ni-NTA亲和层析柱纯化后，进一步分析其酶学性质：测定结果表明：其水解pNPL的比活力为107.1 U/mg，较野生型脂肪酶提高了2.3倍；其催化水解反应的催化效率K cat /K m 为12145.4 L·mmol-1·min-1，较野生型提高了2.0倍；其对过氧化氢的C 50 为200 mmol/L，较野生型提高了10倍；其半衰期为3.8小时，较野生型提高了9.5倍。
PrimeStar Max DNA聚合酶、DpnI酶、DNA Marker和蛋白质Marker等均购自TAKARA公司。引入突变位点的寡核苷酸序列均委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。质粒提取、PCR产物回收试剂盒等购自全式金公司。纯化用Ni柱购自GE Healthcare公司。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建师范大学
<120> 耐受过氧化氢的枯草芽胞杆菌脂肪酶突变体及其制备方法
<130> 32
<160> 32
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 181
<212> PRT
<213> 氨基酸序列
<400> 1
Ala Glu His Asn Pro Val Val Met Val His Gly Ile Gly Gly Ala Ser
1 5 10 15
Phe Asn Phe Ala Gly Ile Lys Ser Tyr Leu Val Ser Gln Gly Trp Ser
20 25 30
Arg Asp Lys Leu Tyr Ala Val Asp Phe Ala Asp Lys Thr Gly Thr Asn
35 40 45
Tyr Asn Asn Gly Pro Val Leu Ser Arg Phe Val Gln Lys Val Leu Asp
50 55 60
Glu Thr Gly Ala Lys Lys Val Asp Ile Val Ala His Ser Met Gly Gly
65 70 75 80
Ala Asn Thr Leu Tyr Tyr Ile Lys Asn Leu Asp Gly Gly Asn Lys Val
85 90 95
Ala Asn Val Val Thr Leu Gly Gly Ala Asn Arg Leu Thr Thr Gly Lys
100 105 110
Ala Leu Pro Gly Thr Asp Pro Asn Gln Lys Ile Leu Tyr Thr Ser Ile
115 120 125
Tyr Ser Ser Ala Asp Glu Ile Val Met Asn Tyr Leu Ser Arg Leu Asp
130 135 140
Gly Ala Arg Asn Val Gln Ile His Gly Val Gly His Ile Gly Leu Leu
145 150 155 160
Tyr Ser Ser Gln Val Asn Ser Leu Ile Lys Glu Gly Leu Asn Gly Gly
165 170 175
Gly Gln Asn Thr Asn
180
<210> 2
<211> 543
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gctgaacaca atccagtcgt tatggttcac ggtattggag gggcatcatt caattttgcg 60
ggaattaaga gctatctcgt atctcagggc tggtcgcggg acaagctgta tgcagttgat 120
tttgcagaca agacaggcac aaattataac aatggaccgg tattatcacg atttgtgcaa 180
aaggttttag atgaaacggg tgcgaaaaaa gtggatattg tcgctcacag catggggggc 240
gcgaacacac tttactacat aaaaaatctg gacggcggaa ataaagttgc aaacgtcgtg 300
acgcttggcg gcgcgaaccg tttgacgaca ggcaaggcgc ttccgggaac agatccaaat 360
caaaagattt tatacacatc catttacagc agtgccgatg aaattgtcat gaattactta 420
tcaagattag atggtgctag aaacgttcaa atccatggcg ttggacacat cggccttctg 480
tacagcagcc aagtcaacag cctgattaaa gaagggctga acggcggggg ccagaatacg 540
aat 543
<210> 3
<211> 181
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
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1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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65 70 75 80
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Tyr Ser Ser Gln Val Asn Ser Leu Ile Lys Glu Gly Leu Asn Gly Gly
165 170 175
Gly Gln Asn Thr Asn
180
<210> 4
<211> 543
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gctgaacaca atccagtcgt tatggttcac ggtattggag gggcatcatt caattttgcg 60
ggaattaaga gctatctcgt atctcagggc tggtcgcggg acaagctgta tgcagttgat 120
ttttgggaca agacaggcac aaattataac aatggaccgg tattatcacg atttgtgcaa 180
aaggttttag atgaaacggg tgcgaaaaaa gtggatattg tcgctcacag catggggggc 240
gcgaacacac tttactacat aaaaaatctg gacggcggaa ataaagttgc aaacgtcgtg 300
acgcttggcg gcgcgaaccg tttgacgaca ggcaaggcgc ttccgggaac agatccaaat 360
caaaagattt tatacacatc catttacagc agtgccgata tgattgtcat gaattactta 420
tcaagattag atggtgctag aaacgttcaa atccatggcg ttggacacat cggccttctg 480
tacagcagcc aagtcaacag cctgattaaa gaagggctga acggcggggg ccagaatacg 540
aat 543
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gtcgttgcag ttcacggtat tg 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gtgaactgca acgactggat tg 22
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tatctcaggg cgcatcgcgg g 21
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ttgtcccgcg atgcgccctg 20
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gattttgcag acaagacagg cac 23
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
cttgtctgca aaatcaactg catac 25
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
acagcgcagg gggcgcgaac 20
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
cccctgcgct gtgagcgaca atatc 25
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gccgatgcaa ttgtcatgaa ttac 24
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
acaattgcat cggcactgct g 21
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
gattgtcgca aattacttat caag 24
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
gtaatttgcg acaatcatat cg 22
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
gattttattg acaagacagg cac 23
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
ttgtcaataa aatcaactgc atac 24
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
gattttgttg acaagacagg cac 23
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
ttgtcaacaa aatcaactgc atac 24
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
gattttgatg acaagacagg cac 23
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
ttgtcatcaa aatcaactgc atac 24
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
gattttgaag acaagacagg cac 23
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
ttgtcttcaa aatcaactgc atac 24
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
agcagtgccg atattattgt c 21
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
attcatgaca ataatatcgg c 21
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
agcagtgccg atgttattgt c 21
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
attcatgaca ataacatcgg c 21
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
agcagtgccg atgatattgt c 21
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
attcatgaca atatcatcgg c 21
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
agcagtgccg atgaaattgt c 21
<210> 32
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
aattcatgac aatttcatcg gc 22

Claims (5)

1.耐受过氧化氢的枯草芽胞杆菌脂肪酶突变体LipA-Trp42Ala/Met134Glu，其特征在于：所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2. 权利要求1所述的耐受过氧化氢的枯草芽胞杆菌脂肪酶突变体LipA-Trp42Ala/Met134Glu的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.包含权利要求2所述基因的重组质粒及转化子。
4.耐受过氧化氢的枯草芽胞杆菌脂肪酶突变体LipA-Trp42Ala/Met134Glu的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）利用ESI-Q-TOF-MS分析枯草芽胞杆菌脂肪酶LipA经过氧化氢处理前后分子量的变化，确定被氧化氨基酸残基类型；
（2）利用丙氨酸扫描法，确定被氧化的氨基酸残基在脂肪酶LipA多肽链中的位置；
（3）利用定点突变技术和叠加突变技术，向野生型脂肪酶基因lipA中引入突变；测序验证后，转化大肠杆菌；经诱导表达并、分离纯化、性质测定并筛选出对过氧化氢有良好耐受能力的脂肪酶突变体。
5.根据权利要求4所述的耐受过氧化氢的枯草芽胞杆菌脂肪酶突变体LipA-Trp42Ala/Met134Glu的制备方法，其特征在于：表达载体为pET22b；表达菌株为Escherichia coliBL21(DE3)。
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